环丙沙星单克隆抗体的制备及其特性分析.pdf

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1、第33卷第2期福建水产Vo1．33NO．22011年6月JOURNALOFFUJIANFIsHERIESJun．2011文章编号：1006—5601(2011)02-0001-05环丙沙星单克隆抗体的制备及其特性分析樊海平，杨燕燕，辛志明，吴斌，曾占壮，余培建(1．福建省淡水水产研究所，福建福州350002；2．福建农林大学动物科学学院福建福州350002)摘要：以人工合成的牛血清白蛋白环丙沙星抗原(CPFX—BSA)免疫Balb／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗CPFX—BSA的McAb，获得1株稳定分泌针对CPFX药物的单克隆抗体细胞株5G4，腹水

2、效价达1．28×10一；SDS—PAGE电泳分析CPFXMcAb5G4蛋白重链和轻链的分子量约为50KD和25KD；抗体亚型为IgG3。根据ie—ELISA标准工作曲线，Ic50值为192．44ng／mL，最低检测限为16．29ng／mL，与恩诺沙星交叉反应率为62．45％。制备的环丙沙星单克隆抗体为试剂盒的研制、组装奠定了基础。关键词：环丙沙星；单克隆抗体；间接竞争ELISA环丙沙星(cipmfloxacin，CPFX)属于第三药残免疫学快速检测技术的核心是制备出待检药代氟喹诺酮(fluoroquinolones，VQs)类药物。水物的特异性单克

3、隆抗体(monoclonalantibody，产养殖业中，由于CPFX在肌肉和肝脏中残留时McAb)J。研究利用福建省淡水水产研究所合成间久，消除速度缓慢，易引起水产品中的药物残的环丙沙星牛血清白蛋白载体完全抗原(CPFX—留H]。为了保障水产品的质量安全，必须加强水BSA)为免疫原，制备出环丙沙星单克隆抗体，产品中CPFX残留的检测和监测。目前，CPFX的并进行特性鉴定与分析，为进一步研制快速、简残留检测方法主要为仪器法，包括液相色谱、质便的环丙沙星免疫学检测试剂盒奠定基础。谱以及液相质谱连用等，OlutosinR等利用高效1材料与方法液相色谱荧

4、光检测方法测定了牛乳及血浆中的环丙沙星及恩诺沙星(Enm)，牛奶中定量限1．1试剂与培养基(LOQ)达到2ng／mL，血浆中定量限(LOQ)达盐酸环丙沙星(CPFX)标准品，含量到lng／mL-3J，RalphKrebber等应用液质连用分99．8％(中国兽医药品监察所)；CPFX—BSA和析法测定了组织样品中的恩诺沙星及环丙沙星，环丙沙星卵白蛋白载体完全抗原(CPFX—OVA)检测限达到251a~／kg，不同组织的平均回收率为(福建省淡水水产研究所水生动物病害防控研究室72～105％-4。仪器法检测药物残留结果准确、稳制备)；抗体亲和纯化试剂盒(

5、Pierce公司)；羊定、可靠，但是仪器设备与试剂价格昂贵、样品抗鼠过氧化物酶标记抗体(武汉博士德生物技术前处理复杂，分析耗时较长，不利于养殖现场及有限公司)；弗氏不完全佐剂、HT培养基、HAT基层水产技术部门应用。培养基、牛血清白蛋白(Sigma公司)；改良型利用免疫学方法检测水产品中的药物残留，RPMI一1640培养基(Thermo公司)；其它试剂均进行水产品初筛，具有快速简便、灵敏度高、特为国产。异性强等优点，实用价值大，应用前景广阔。1．2试验动物免疫基金项目：福建省属公益类科研院所基本科研专项(闽科技[20o9]46号)；科技平台建设(闽

6、科计[2009]37号)；福建省海洋与渔业重点项目(闽海渔[2010]2—27号)。作者简介：樊海平(1967一)，男，研究员，主要从事水产养殖动物病害研究。Tel：0591—83796968；E—mail：fanhaipingl6@163．COrn2福建水产2011焦Balb／c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限个浓度的CPFX药物标准品的鳗鲡肌肉样本。按责任公司)实验室暂养1w后进行免疫。2mg／mL建立的回归方程计算药物含量和添加回收率。加CPFX—BSA与弗氏完全佐剂等量乳化后进行首次标样品的回收率计算公式：免疫；首免后第14d，CPFX—B

7、SA与等量弗氏不完全佐剂混合乳化二免；以后每2w进行一次加强回收率(％)=鬻免疫，不加佐剂，于五免后进行细胞融合。1．10抗体的特异性(交叉反应)l-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选与克隆化用系列浓度稀释的甲磺酸培氟沙星、盐酸二根据文献-8进行CPFX—BSA单克隆抗体杂氟沙星、盐酸沙拉沙星、甲磺酸达氟沙星、氧氟交瘤细胞株的筛选、单克隆化，建立、保存单克沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、硫酸链霉素、硫酸隆抗体杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体细胞株小庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸卡那霉素、强力霉鼠腹水。阳性细胞孔筛选按照结合了间接ELISA素、氟苯尼考、隐性孔雀石绿等

8、药物进行ic—(iELISA)法和间接竞争ELISA(ic—ELISA)法ELISA实验，测定CPFX单抗与其它药物之间的