鼠抗人cKit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

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1、鼠抗人cKit单克隆抗体的制备及其特性鉴定作者:刘虹辰，毛朝明，苏晓瑜，阮铮，丁秋兰，王学锋，王鸿利，奚晓东【摘要】目的：鼠抗人CKit单克隆抗体（mAb）的研制及其生物学特性的鉴定。方法：利用PCR技术获得人cKit的胞外免疫球蛋口区编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体PQE30,构建出重组表达质粒PQE30hKitD45o测序鉴定IE确后转化M15,经IPTG37°C诱导4h后，SDSPAGE显示融合蛋白（表达产物）以包涵体形式存在。用鎳柱对融合蛋白进行纯化，将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠，采用B淋

2、巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，经流式细胞术（FCM）分析和多次克隆化培养，筛选出特异分泌鼠抗人cKit分了mAb的朵交瘤细胞株。采用Westernblot、Ig亚型快速定性试纸法、FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定。结杲：成功表达及纯化了人cKit重组蛋白，并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人cKitmAb的杂交瘤细胞株，命名为SRJloELTSA和Westernblot、FCM结果显示了该株mAb能够识别Kasumi口血病细胞株表面表达的天然的cKit分子，并与人正常外周血细胞无交叉反应。值得注意的是，Ka

3、sumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群，虽然其表达cKit（Ab81mAb的结合正常）。结论：成功构建了原核表达载体PQE30Kit45,并获得高纯度的人PQE30Kit45重组蛋白；成功制备了1株特异性的鼠抗人cKitmAb杂交瘤。其所分泌的抗体能特异地识别人cKit分子，并且可能成为区分细胞表血表达不同cKit分子的潜在检测工具。【关键词】CKit;原核重组蛋白；杂交瘤；单克隆抗体；白血病[Abstract]AIM:ToprepareanticKitmonoclonalantibodiesandc

4、haracterizetheirspecificityofepitoperecognition.METHODS:cDNAencodinghumancKitextracellulardomainwasconstructedintoaprocaryoticexpressionvectorpQE30andthecorrectnessofthereconstructedplasmidpQE30KitD45wasverifiedbysequencing・TheplasmidwastransformedintoE.c

5、oliMl5strain.Recombinant6XHispQE30KitD45wasexpressedafterinductionbyTPTGfor4h.ThenSDSPAGEresultssuggestedthattheproductsmainlyformedinelusionbodies・ThefusionproteinwasfurtherpurifiedwithNiNTAHisaffinitychromatographyandthenusedtoimmunizeBALB/cmice・Thehybr

6、idomaswereachievedbyfusingtheimmunizedspleencel1swiththeSp2/0myelomacel11ine・ThepositivecloneswerescreenedbyFCMwithCIIOhKitcells・HybidomaclonessecretinganticKitantibodieswerefurthersubclonedandinvestigatedfortheirbiologicalactivitiesbyWesternblot,rapidiso

7、typinganalysisandFCM.RESULTS:RecombinanthumancKitfusionproteinswereinvitroexpressedandpurifiedtobeusedasimmunogen.Onestablehybridomacel1line,whichcontinuouslysecretsspecificanticKitmonoclonalantibody((SRJ1))wasestablished・Thebiologicalactivitystudiesshowe

8、dthatthemonoclonalantibodyrecognizedthenaturalcKitexpressedontheKasumileukemiacellline,butfailedtobindtothenormalhumanperipheralbloodcel1s・Interestingly,thismonoclonalantibodyfailedtorecognizeasubpopulationofKasumic