禽流感病毒单克隆抗体的研制.pdf

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1、第31卷第5期家畜生态学报Vo1．31NO．52010年9月ActaEcologiaeAnimalisDomasticiSep．2010禽流感病毒单克隆抗体的研制黄庆华，张果平，胡北侠，黄艳艳，王可(山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南250100)[摘要]用低致病性禽流感病毒H9N2亚型(MildlyPathogenicAvianInfluenzaVirus，MPAIV)F株全病毒作为抗原，制备能够用于建立ELISA检测AIV的特异性单抗；以间接ELISA和HI试验筛选出阳性克隆，并经有限稀释法三次亚克隆之后，共获

2、得三株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，在Dot—ELISA试验中三株单抗中的两株与13个AIVHN国内分离株、4个AIVHN国内分离株都反应，而与10个NDV国内分离株，IBV、IB—DV、EDSV一76、SPF鸡胚尿囊液不反应。一株与13个AIVH。N国内分离株反应，与4个AIVH5N1分离株、NDV、IBV、IBDV、EDSV一76、SPF鸡胚尿囊液不反应。[关键词]禽流感；单克隆抗体；间接ELISA；HI试验[中图分类号]$811．5[文献标识码]A[文章编号]1004—5228(2010)05—0099—

3、04禽流感(AvianInfluenza，AI)是由A型流感病弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、高糖型DMEM毒引起的禽类感染和疾病的总称。鸡、火鸡、鸭、鹌粉、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和IgM抗体、鹑等家禽和野禽均可感染。目前在全世界各种家禽单克隆抗体亚类鉴定试剂盒、丙烯酰胺均为Sigma和野生禽类中，已分离到上千株禽流感病毒，并已证公司产品；甲叉双丙烯酰胺、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核明家禽或舍饲禽类在感染后，可表现为亚临床症状，苷和L一谷氨酰胺为Fluka公司产品；氨基喋呤为轻度呼吸系统疾病，产蛋量降低或急性致死性疾Gib

4、ico公司产品；显色底物OPD、DAB为华美公司病[1]。AI对世界养禽业构成了威胁。世界动物进口分装；灭菌小牛血清为郑州佰安生物公司产品；卫生组织(0IE)将高致病性禽流感(HPAI)列为A低分子量标准蛋白为上海东风丽珠公司产品；其余类传染病。HPAI感染引起的死亡率很高，低病性常规试剂为国产分析纯试剂。禽流感(MPAI)感染造成的损失也相当严重]。1．1．4仪器设备Millipore超纯水仪、50ml细胞培养瓶、细胞培养板(Costar，Nunclon公司)，DG一1材料和方法5031型酶联反应检测仪(华东电子管厂)

5、、750A型1．1材料紫外分光光度计、高速冷冻离心机(CR21日立公1．1．1毒株本试验所用病毒有13个AIVH。N。司)、CO。培养箱(Forma公司)、电泳仪及转印装置分离株和4株AIVHN。分离株，1O个新城疫分离(Bio—Red公司)。株，IBV、IBDV、EDSV-76病毒均由扬州大学保存。1．2方法1．1．2试验动物及细胞系等BALB／C小鼠，ICR1．2．1杂交瘤细胞系的建立小鼠购自中国科学院上海实验动物中心；骨髓瘤细1．2．1．1动物免疫免疫程序参考有关文献的方胞系SP2／O—Ag-14由本室保存；抗禽流

6、感高免血清法_5]。取AIVH。N。粗提蛋白与等量的弗氏完全由扬州大学自制。佐剂充分乳化后，腹腔注射8周龄BALB／c小鼠1．1．3主要试剂药品融合用PEG(MW4000)、200Fg，2周后取AIV粗提蛋白与等量的弗氏不完[收稿日期]2O1O一04—01，修回日期：2010一O4—19[作者简介]黄庆华(1979一)，男。山东济南人，助理研究员，硕士，主要从事动物疾病方面的研究工作。E-mail：huangqih@163．corn100家畜生态学报第31卷全佐剂充分乳化后，腹腔注射200g，4周后尾静脉观察，适时换液和

7、检测。注射相同剂量的纯化抗原，不加佐剂，3d后融合。1．2．1．3阳性克隆的筛选和克隆参考文献方法1．2．1．2细胞融合按文献方法进行]。尾静进行l_5]。阳性克隆的筛选采用间接ELISA和脉追加免疫3d后取BALB／c小鼠的脾细胞与处于HI试验。间接ELISA：首先以方阵法测得AIV对数生长期SP2／O细胞在PEG(MW4000)作用下H。抗原、SPF鸡胚尿囊液的最佳包被浓度，然后将融合，取ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融抗原用碳酸盐包被缓冲液(pH9．6)稀释至20g／合好的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板

8、，置mL，尿囊液稀释至10t*g／mL，分别包被酶标板，每37℃、6CO2培养箱内培养，5d后用HT换去一孔50L，4℃过夜，PBST(PBS+0．5％Tween)洗半HAT培养基，7～10d后改用HT培养基，定期涤；用封闭液(PBST+10FCS)4。C封闭24h，PB表1三株单抗特异性鉴定结果Table1TheS