牛干扰素单克隆抗体的制备与初步鉴定.pdf

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1、动物医学进展。2010，31(4)：53—56ProgressinVeterinaryMedicine牛干扰素单克隆抗体的制备与初步鉴定李超，林祥梅，余多慰，李全芬，李桂芬，韩雪清。(1．南京师范大学生命科学学院，江苏南京210046；2．中国检验检疫科学研究院，北京100029)摘要：通过IPTG诱导的大肠埃希菌表达重组牛干扰素一7融合蛋白(BovIFN一7)，利用GlutathioneSepharose4FastFlow亲和层析柱进行融合蛋白的纯化，纯化后的融合蛋白BovIFN一了作为抗原免疫B

2、alb／c小鼠，经5次免疫后，取小鼠脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行细胞融合，间接ELlSA筛选，有限稀释法克隆亚克隆获得分泌BovlFN一单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并通过ELISA方法对其抗体效价、特异性、亚类及稳定性进行鉴定。获得一株稳定分泌BovIFN一7单克隆抗体的杂交瘤细胞株A12E9，细胞培养上清和腹水效价可达1：3200和1：160000。关键词：牛干扰素；单克隆抗体；鉴定中图分类号：$852．43文献标识码：A文章编号：10075038(2010)04—0053—0420世纪30年代

3、，人们发现机体感染某一病毒的结核菌素皮试检测相比，抗原特异性IFN一7试验后，会对另一种抗原性毫无关系的病毒产生干扰现不仅简单、快速、灵敏、特异，而且由于减少了前者试象。直到1957年，英国科学家Isaacs和Linden—验中操作和解释上的主观性，使结果更为客观、可mann利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时才靠。这一检测方法的大范围田问试验己在世界上许了解到病毒感染的细胞能产生一种因子，这种因子多国家(包括澳大利亚，爱尔兰、比利时、新西兰、阿作用于其他细胞，干扰病毒感染的复制，因此而得名根廷、西

4、班牙、意大利和美国)完成，并在澳大利亚、干扰素(interferon，IFN)E13。．-y干扰素(IFN一7)是机爱尔兰和新西兰被批准为正式试验检测方法。近年体内具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细来，我国奶牛结核病发病呈上升趋势，而传统的结核胞因子，主要由激活的T细胞、NK细胞和巨噬细菌素皮试检测对动物刺激大、操作复杂、与环境分支胞产生[2]。评价IFN一7在机体内的动态变化水平指杆菌间存在非特异性反应等缺点，但目前商品化的标，可为了解传染性疾病的发生、发展、转归情况及试剂盒都为国外公司生产

5、，样本的检测费用达数十其机体保护性免疫反应动态规律提供较大帮助。因元，不适合我国国情。所以，开发具有自主知识产权此，建立评价IFN一-／在机体中水平变化的检测方法的新型单克隆抗体诊断方法对于我国牛结核病的根对动物疾病的诊断显得十分重要。除具有深刻的现实意义与广阔的应用前景。IFN一牛结核病(Bovinetuberculosis)是由牛分支杆的免疫学检测是在IFN一丫McAb的基础上建立的，菌(Mycobacteriumboris)引起的一种牛的慢性消因此，制备IFN一7McAb变得尤其重要。耗性传染

6、病，该病能够通过病畜传染给人类或其他1材料与方法动物，该病的流行与传播不仅严重影响畜牧业的发1．1材料展，更威胁到人类的健康。因此，结核病被世界动物1．1．1实验动物6周龄～8周龄雌性Balb／c小卫生组织(0IE)规定为必须强制报告的疫病]。一鼠，8周龄雌性昆明鼠，经产Balb／c鼠均购自中国人直以来，牛结核病在世界范围内均有发生，在我国流民解放军军事医学科学院实验动物中心。行历史悠久，预防和监测牛结核病是一项严峻的任1．1．2免疫原重组菌BI21pGEX6P一1-BovIFN一．y务。近年来兴起

7、的IFN一的免疫学检测在动物疫病购自扬州大学，经IPTG诱导后，超声裂解菌体取其检测中具有重要的价值。WoodPR等j最先将抗上清，按照GlutathioneSepharose4FastFlow亲和原特异性IFN一-／试验用于牛结核病的检测。与传统层析柱说明书，进行融合蛋白的纯化，纯化后的融合收稿日期：2009一l2—24基金项目：质检公益项目(2007GYJ018)作者简介：李超(1985一)，女，山东德州人，硕士研究生，主要从事单克隆抗体制备的研究。*通讯作者54动物医学进展2010年第31卷第

8、4期(总第201期)蛋白GST-BovlFN一7作为免疫原。7融合蛋白的菌体裂解液上清作为包被抗原，同时1．1．3试剂无水乙醇和二甲基亚砜(DMSO)由辅以BL21／pGEX一6P-1经IPTG诱导后的超声裂解北京化学试剂公司生产；胎牛血清、Hyclone、USA、液的上清，建立平行对照_7J。福氏完全佐剂(CFA)、福氏不完全佐剂(IFA)由用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆以及Sigma公司生产；DMEM培养基、PEG1500亚克隆，直至筛选结果100阳性为止。