稳定表达EGFP-LC3蛋白的HeLa细胞系的构建.pdf

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1、第48卷第1期南开大学学报(自然科学版)VoI．48N_O12015年2月ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNankaiensisFeb．2015文章编号：0465—7942(2015)01—0021—05稳定表达EGFP—LC3蛋白的HeLa细胞系的构建兰蓓，万雅娟，王雨，杨寅，张翠竹(南开大学生命科学学院，天津300071)摘要：自噬是指细胞自身将细胞质蛋白或细胞器经溶酶体降解的一种过程．微管相关蛋白1轻链3(LC3)是自噬的标志蛋白，利用荧光显微镜观察EGFP—LC3荧光蛋白是否聚集成点状是检测自噬的方法之一．首先构建了表达EGFP—LC3蛋

2、白的真核表达质粒，其具有荧光和药物筛选双标签．转染到HeLa细胞中，利用药物初步筛选后，再稀释到96孔板中筛选出有荧光的单细胞克隆，得到稳定表达EGFP～IC3蛋白的HeLa单克隆细胞系．该细胞系在饥饿诱导条件下EGFP—LC3蛋白可聚集成点状，验证了该细胞系能够用于指示自噬，为今后自噬研究奠定了基础．关键词：自噬；EGFP—IC3；HeLa细胞；稳定细胞系中图分类号：TQ93文献标识码：A0引言自噬是细胞的“自食(self—eat)”现象，是指细胞将自身的细胞器或者蛋白质包裹进入一个双层膜结构的自噬小体，再与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，最后将所包裹的内容物降解的过程n]．最近的研究表明，

3、自噬与癌症]，神经退行性疾病[3]，人体免疫与病毒感染_4等多种疾病相关，因此成为近年来研究的热门领域．自噬一般分为大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaper—one—mediatedautophagy，CMA)，通常所说的自噬就是指大自噬¨】]．自噬的过程主要分4步：(1)分隔膜形成：在一些刺激条件下，如饥饿、病毒入侵，就会诱发细胞产生自噬，逐渐形成双层膜结构的分隔膜，包裹着被降解物．该过程主要有两个调控机制，包括mTOR去磷酸化与PI3K活化；(2)自噬小体的形成：分隔膜逐渐延伸，最后形成自噬小体．该过程依赖于两个泛

4、素样结合系统：Atg5一Atgl2一Atgl6和LC3结合系统；(3)自噬小体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体；(4)自噬溶酶体中来自溶酶体的酶把自噬小体中包裹的物质降解，产物释放到细胞质中，被细胞重新利用E5-6]LC3，全称为微管相关蛋白1轻链3(microtubule—associatedprotein1lightchain3)，为自噬的标志蛋白．翻译后首先形成LC3前体蛋白，随后Atg4蛋白酶切割LC3前体蛋白c端，暴露出甘氨酸位点，形成LC3一I蛋白．当自噬发生时，LC3一I蛋白经过修饰，与亲脂性的磷脂酰乙醇胺结合，形成LC3一Ⅱ蛋白并定位在自噬小体上[7]．LC3蛋白的荧光检测方法

5、主要依据LC3一I蛋白与LC3一Ⅱ蛋白在细胞中的定位不同，LC3一I蛋白弥散在细胞内，而LC3一Ⅱ蛋白则定位在自噬小体上．荧光染色内源LC3蛋白或者转染GFP—LC3蛋白，通过荧光显微镜观察，弥散在细胞中的为LC3一I蛋白，呈点状则为LC3一Ⅱ蛋白并且指征着自噬小体，因此LC3点越多，代表自噬水平越强_8J．为了方便运用LC3蛋白荧光检测方法，将EGFP—LC3构建到具有Blasticidin抗性基因的真核表达质粒plenti6／V5中，并构建了稳定表达EGFP—LC3蛋白的HeLa单克隆细胞系．此细胞系在饥饿条件下可明显形成EGFP—LC3点，证明该细胞系可用于检测自噬，进而为自噬研究提

6、供了基础．收稿日期：2014—05—15基金项目：国家重点基础研究发展计划(2O12CB9172O4)作者简介：兰蓓(1983一)，女，天津人，博士研究生．通讯作者：张翠竹(1973一)，女，天津人，副教授，研究方向：分子免疫学．E—mail：czz912@aliyun．corn·22·南开大学学报(自然科学版)第48卷1材料与方法1．1材料HeLa细胞为本实验室保存．pEGFP—LC3质粒由Berkeley大学QingZhong教授赠予，plenti6／V5质粒购自美国invitrogen公司．NheI、却＆I、PI、BamHI和SalI限制性内切酶与T连接酶购自美国NewEngland

7、Biolabs公司．质粒提取试剂盒购自中国天根生化科技有限公司．DNA快速纯化／回收试剂盒购自中国鼎国生物技术有限公司．干粉DMEM培养基购自美国Gibco公司．Blasticidin购自美国invit—rogen公司．Hank’SBalancedSaltSolution(HBSS)溶液配方：8g／LNaC1，0．4g／LKCI，6Omg／LKHPO，47．5mg／LNaHPO，1g／L葡萄糖，调节pH至7．2，其中化学