水稻丙酮酸脱氢酶激酶1多克隆抗体的制备.pdf

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1、一l4一江苏农业科学2010年第2期谭才邓，李静，周玲艳，等．水稻丙酮酸脱氢酶激酶1多克隆抗体的制备[J]．江苏农业科学，2010(2)：14—16水稻丙酮酸脱氢酶激酶1多克隆抗体的制备谭才邓，李静，周玲艳，李峰，庄楚雄(1．广东轻工职业技术学院，广东广州510300；2．华南农业大学生命科学学院，广东广州510642)摘要：水稻丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)基因位于水稻基因组的第7条染色体上，其cDNA全长为1498bp，编码有363个氨基酸残基的多肽链，主要在叶片中表达。为进一步研究该基因编

2、码蛋白的生物学功能及其分子作用机制，本研究构建水稻PDK1的原核表达载体，重组质粒转化大肠杆菌诱导表达，得到分子量大概在41ku的重组蛋白，经纯化后免疫新西兰大白兔成功制备水稻PDK1多克隆抗体。关键词：水稻；PDK1(丙酮酸脱氢酶激酶1)；多克隆抗体中图分类号：$511．01文献标志码：A文章编号：1002—1302(2010)02—0014—03线粒体是细胞物质与能量代i射的核心，是细胞的“动力载体，利用纯化的重组蛋白制备了可以识别水稻PDK1蛋白工厂”。在细胞的生命代谢和应对外界环境刺激的

3、过程中，的多克隆抗体。线粒体代谢调节起着重要作用。近年研究发现，丙酮酸脱氢1材料与方法酶系(pyruvatedehydrogenasecomplex，PDC)催化丙酮酸反应生成乙酰辅酶A和NADH，此反应使葡萄糖及其前体减少，是1．1材料糖转化为脂肪贮能或有氧氧化供能的必经之路，是线粒体合植物材料：粳稻(OryzasativaL．)品种中花11号；动物材成ATP时选择能源底物的闸门。除了受NADH和乙酰辅酶料：雄性新西兰大白兔，购于广东省实验动物中心；原核表达A的调节外，PDC的活性主要通过磷酸

4、化／去磷酸化调节，丙载体：pET一23d，由华南农业大学遗传工程实验室保存；原核酮酸脱氢酶激酶(pyruvatedehydrogenasekinase，PDK)则是磷表达用菌株：BI21(DE3)，由华南农业大学遗传工程实验室酸化PDC的酶，使PDC磷酸化而失去活性，因而PDK在高等保存；水稻PDK1基因编码序列全长，由李峰博士提供。生物的能量代谢调节中起着重要的作用“。。基于哺乳动物1．2方法PDK的研究，现已克隆到多种植物PDK的eDNA。水稻有21．2．1PDK1原核表达载体的构建水稻PD

5、K1基因和质粒个PDK基因，其中PDK1位于水稻基因组的第7条染色体pET一23d分别用内切酶SalI和HindIII进行双酶切，酶切产上，其eDNA全长为1498bp，编码有363个氨基酸残基的多物用T4连接酶进行连接，连接产物电击转化到大肠杆菌肽链，主要在叶片中表达。研究表明，与玉米、拟南芥、人BI21(DE3)中，用质粒提取试剂盒(U—gene)抽提质粒，送上的PDK1比对，其核酸序列同源性分别为82％、75％和海生工生物工程有限公司测序。42％。为了更深入地研究PDK1蛋白在能量调节方面

6、的1．2．2PDK1蛋白原核表达及表达形式的确立分别挑取生物学功能及其作用机制，本研究构建水稻PDK1原核表达含有目的基因的菌体和含有空载体的菌株于LB液体培养基(含Amp100Ixg／mL)中培养至D一O．5，加入IPTG至终收稿日期：2009—08—12浓度为1mmol／L，诱导3h，获得菌体后用超声波处理，沉淀作者简介：谭才邓(1980～)，男，广东台山人，硕士，讲师，研究方向为和上清分别进行SDS—PAGE电泳分析。植物基因工程。E—mail：tedeng@126．eom。通信作者：庄楚

7、雄(1964一)，男，博士，研究员，博士生导师。1．2．3PDK1多克隆抗体的制备E—mail：zhuangex@scau．edu．en。1．2．3．1PDK1蛋白的纯化诱导100mL菌液，离心收集菌(上接第13页)脂肪酸结合蛋白基因多态性的研究[J]．畜牧兽医学报，2003，[14J钟金城，马志杰，陈智华，等．牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(日一34(5)：422—426．FABP)基因的克隆及序列分析[J]．中国农业科学，2006，39[19]周国利，朱奇，郭善利，等．鲁西黄牛H—FABP基因的多态

8、性(8)：1639一l650．及其与肉质性状关系的分析[J]．西北农业学报，2005，14(3)：5[15]GerbensF．AdimorphicmicrosatelliteintheporcineH—FABP—7．geneatchromosome6[J]．AnimalGenetics，1998，29(5)：408—[20]李文娟，李宏宾，文杰，等．鸡H—FABP和A—FABP基因表410．达与肌内脂肪含量相关研究[J]．畜牧兽医学报，2006，37(5)：[16]GerbensF，deKoni