猪伪狂犬病病毒福建株gB、gD基因的克隆和序列分析.pdf

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1、·62·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第5期猪伪狂犬病病毒福建株gB、gD基因的克隆和序列分析张新平，刘建奎，魏春华，戴爱玲，李晓华，杨小燕(1．福建农林大学动物科学学院，福建福州350002；2．龙岩学院生命科学学院，预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建龙岩364000)摘要：参照已发表的扩增伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，PRV)gB和gD表位基因的PCR扩增引物合成2对引物，以福建分离株(LY株)提取的DNA为模板，得到目的片段gB、gD基因的长度分别为578和653bp，并进行了克隆和测序，然后与国内外其他分离株进行了核苷酸序列及推导的氨基

2、酸序列的同源性分析，并构建了遗传进化关系图。结果表明，LY株与GenBank中收录的国内外有代表性的标准参考分离株相比，gB、gD基因核苷酸序列的同源性分别为74．9～98．8、97．2～98．1％；氨基酸序列的同源性分别为62．9～96．4、94．5～96．8％。进化分析结果表明，LY株与目前国内流行的毒株在同一个进化分支内，和Ea株(湖北)、LA株(山东)亲缘关系最近，与国外分离株有一定差异。关键词：伪狂犬病毒；gB基因；gD基因；序列分析中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：167卜7236(2014)05—0062-04伪狂犬病毒(pseudorabiesVirUS，PR

3、V)归属于株进行了同源性比对，旨在了解龙岩地区PRV的流胞疹病毒科(HerpesvIridae)，一疱疹病毒亚科(A1一行病学和毒株来源，为进化的研究积累资料，也为以phaherpesvirinae)，为线状双链DNA，大小约后的病原学研究和PRV的有效防制提供参考。150kb，G+C含量高达73以上，编码7O～100种1材料与方法蛋白(Iglesias等，1992)。PRV由独特的长区段1．1病料采集与处理病料来自于龙岩地区某规(UL)和短区段(US)及位于US两侧的重复序列模化养殖场疑似伪狂犬的发病仔猪，无菌采集脑部、(TR)和内部重复序列(IR)组成(曾显成等，2011)。脾脏、

4、淋巴结，用血液／~tt胞／组织基因组DNA提取到目前为止，该病毒表面有11种糖蛋白已被鉴定，试剂盒提取病毒基因组DNA。其中gB、gD是PRV主要的糖蛋白。糖蛋白gB(g1．2主要试剂10×ExBuffer、dNTPs、ExTaq1I)在病毒感染细胞的过程中不可缺少，参与病毒在DNA聚合酶、pMD18一T载体、限制性内切酶、DNA细胞之间的传播，促进病毒囊膜与细胞膜之间的融Marker均购自TaKaRa公司；组织基因组DNA提合，并诱导机体产生中和抗体(Favoreel等，2002)。取试剂盒购自北京天根生物有限公司。糖蛋白gD(gp50)为病毒增殖所必需，在病毒粒子侵1．3引物设计参

5、考陈义平等(2009)、罗飞等袭宿主细胞中发挥着重要的作用，也是病毒粒子与(2011)合成gB、gD基因的特异性引物，预计扩增宿主细胞膜发生不可逆的吸附中必不可少的糖蛋白片段长度为600、677bp。引物序列为：gB上游引物(洪文洲等，2005)，同时糖蛋白gD也是PRV主要的Pl：5GGATCCGCGCACGTGAACGACAT3，下免疫原性蛋白，能刺激动物机体产生中和抗体(Rauh游引物P2：5，_AAGCTTGAGCGCGTGCAGCTG—等，1991)。本试验通过对龙岩地区疑似猪伪狂犬的GTT一3；gD上游引物pl：5f_GGATCCATGCTGC—病料进行PCR扩增及gB、g

6、D基因的核苷酸序列和TCGCAGCGCTAT一3，下游引物p2：5，_AAGCTT—氨基酸序列分析，同时与GenBank中PRV的参考毒GTCAGGAATCGCATCACGT一3。引物由大连宝生物有限公司合成。1．4PCR扩增PCR反应体系25L：10×Ex收稿日期：2014—01—09作者简介：张新平(1987)，女，河南人，硕士生，研究方向：动物Buffer2．5L，dNTP2taL，上、下游引物各0．5L，传染病。DNA模板1L，ExTaqDNA聚合酶0．25L，通信作者：杨小燕(1961)，女，福建人，教授，研究方向：畜禽传ddHO补足25L。试验采用降落PCR的方法，反染病。

7、E—mail：lyyxy1988@126．corn基金项目：福建省区域科技重大项目(2009N3013)；龙岩市科技应条件为：95℃预变性5rain；95℃变性45S，63℃创新平台(2013IY07)。退火45S，72℃延伸45S，5个循环；之后预变性、延·64·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第5期同源性(％)234567l95。399．嚣96355．4g孳99．心Bartha．seq2418_95岛95．嚣62．995巷96．42L