线粒体nad5基因在隐藏管状线虫及四翼无刺线虫的序列变异研究.pdf

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1、·42·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第6期线粒体nad5基因在隐藏管状线虫及四翼无刺线虫的序列变异研究杨言川，李作磊。，张念章，刘光学，朱兴全，孙晓林(1．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070；2．中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃兰州730046)摘要：本试验首次研究了小鼠隐藏管状线虫及四翼无刺线虫在线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)的种间及种内变异。通过对甘肃兰州地区实验小鼠体内分离的蛲虫样品(LY1—20、LS

2、1—22)nad5基因pnad5进行PCR扩增、克隆及测序分析，研究其遗传变异情况。结果表明，获得隐藏管状线虫pnad5有效序列753bp，通过序列比对发现来自LY和LS2家实验动物中心的22个隐藏管状线虫样品之间只存在3个碱基的差异，序列相似性99．6o。获得四翼无刺线虫pnad5有效序列865bp，2大动物中心20个四翼无刺线虫样品之间没有碱基的差异，序列相似性100。用软件ClustalX1．83截取2种鼠蛲虫nad5基因长度共同的序列，通过比对发现2种鼠蛲虫种间差异为53．64，种间差异显著。研究结果表明，线粒体nad5基因在鼠蛲虫种内相对保守

3、，但种问有着较高的突变率，可作为鼠蛲虫种间鉴定、诊断的遗传标记。关键词：蛲虫；线粒体DNA；nad5基因；PCR；序列分析中图分类号：Q319文献标识码：A文章编号：1671—7236(2014)06—0042-04鼠蛲虫病主要是由四翼无刺线虫(Aspiculuris2013)，但关于鼠蛲虫mtDNA的研究鲜有报道。本tetraptera)与隐藏管状线虫(Syphaciaobvelata)寄研究旨在阐明小鼠隐藏管状线虫及四翼无刺线虫在生于鼠大肠引起的一种线虫病(Baker等，1998；Ba—线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚zzano等，2

4、002；Hasegawa等，2008；Pritchett—Cor—单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)的种间及种内ning等，2009；Chen等，2011；McInnes等，2O11)。变异，明确鼠蛲虫线粒体had5基因序列能否作为蛲虫是中国《实验动物寄生虫学等级及监测》国家标鼠蛲虫种间鉴定、诊断的理想遗传标记。准(GB14922．1—2001)中应排除的寄生虫之一。1材料与方法蛲虫病呈世界性分布，实验鼠感染蛲虫后，对试验的1．1虫体样品本试验42个鼠蛲虫虫体样品分别准确性和可靠性将会产生影响，因此对鼠蛲虫病的从甘肃2家实验动物中心(LS和L

5、Y)小鼠体内分离研究具有重要意义。准确的鉴定、诊断鼠蛲虫是防获得，样品代码分别为LY1-20、LS1—22。虫体用控鼠蛲虫病的基本前提。以PCR为基础的分子生70酒精固定备用。物学技术已成为鼠蛲虫鉴定、诊断的新方法(Parel1．2主要试剂DL2000DNAMarker购自Gen—等，2008；Dole等，2011)，这些方法以鼠蛲虫核基因star公司；TIANampGenomieDNAKit购自组的核糖体DNA序列作为遗传标记。目前已有的TIANGEN公司；蛋白酶K、IPTG、X-gal、rTaq酶、研究结果表明，线粒体DNA(mtDNA)是研究寄生

6、PCR试剂(包括Buffer、Mgel和dNTPs)均购自虫种间、种内遗传变异及种系发育关系的良好遗传TaKaRa公司。标记(Hu等，2004；Jia等，2010；Liu等，2011，1．3样品DNA的制备从70酒精保存液中挑2012，2013)，特别适合作为相近种或隐藏种鉴定的取单个蛲虫虫体，用双蒸水反复吹打冲洗2～3次遗传标记(Blouin，2002；Liu等，2011，2012，后，置于一新的1．5mLEppendorf管中，用灭菌的微型剪刀将虫体组织剪碎，加入200L的GA收稿日期：2013-11-26作者简介：杨言川(1988)，男，甘肃人，

7、硕士生，研究方向：兽医Buffer混匀，再加20L蛋白酶K，再次吹打混匀寄生虫病学。后，置于56℃恒温水浴箱中消化4h(每60min混通信作者：孙晓林(1963)，男，教授，硕士生导师，研究方向：兽匀1次)。消化好的虫体悬液按DNA提取试剂盒医公共卫生学。E—mail：sunxl@gsau．edu．cn使用说明进行虫体DNA提取，将提取的DNA放基金项目：甘肃省创新研究群体计划项目(1210RJIA006)；现代农业人才支持计划项目。4℃冰箱保存备用。中国畜牧兽医2014年第41卷第6期生物技术·45·rymiceinsouthernChina[J]．

8、LabAnim，2011，45(1)：58~60．andinsightsintonematod