【毕业设计-医学论文】地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研究.doc

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1、地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研究作者：金红艳欧阳铭戴莫斌【关键词】地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2摘要：目的：探讨地塞米松引起体外纯化培养的大鼠大脑皮质星型胶质细胞凋亡的机制。方法：不同浓度的地塞米松（浓度为10-5.10-4.10-3mol/L）与纯化培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞共同孵疔24小时后，用免疫细胞化学方法检测P53、BaxBcl2在星型胶质细胞内的表达情况，表达的强弱用平均光密度表示。结果：P53和Bax的表达随着地塞米松浓度的升高而增强，与对照组比较，各组均有极显著性差异（P关键词：地塞米

2、松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2在哺乳动物的屮枢神经系统内约有一千亿个神经元，而在这些神经元的周I韦I乂约有I•倍以上的胶质细胞存在，其屮以星型胶质细胞数量最多。传统观点认为，星型胶质细胞只对神经元起结构和功能上的支持作用，但近年来越来越多的证据表明，星型胶质细胞在屮枢神经系统内扮演着更为积极和更为重要的角色，这也是胶质细胞成为神经领域研究热点的一个岚接原因。糖皮质激索（glucocorticoid,GC）是一类具有神经活性的缶体激索，已有许多实验证实GC对神经元的生长、分化和凋亡都起重要的调节作用，但对胶质细胞的影响报道不多

3、。已有报道证实大剂量的地塞米松可诱导体外培养的星型胶质细胞凋亡[1],为进一步探讨其机制，我们做了如下研究。1材料和方法11材料新生Wistar大鼠6只（由华屮科技大学同济医学院实验动物屮心提供）；DMEM/F12培养基（G1BC0公司）；胎牛血清和小牛血清（GIBC0公司）;L谷氨酰胺（上海伯奥生物科技有限公司）;地塞米松（湖北恒生制药有限公司）;兔抗p53、Bax^Bcl2抗体（santacruz公司）;SABC免疫组化试剂盒及DAB试剂盒（北京屮山公司）;24孔培养板（Corning公司）；HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告分析

4、系统（同济千屏影像公司）；SL2300-氧化碳培养箱（美国Sheldon公司）;UFX1I光学显微镜（日本Nikon公司）。12方法121星形胶质细胞的纯化培养将出生广2天的新生Wistar大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用DHanks液清洗并剔除脑膜和血管，取犬脑皮质，将组织剪碎为lmm3大小，用0.125%胰蛋白酶37°C消化数分钟,过滤（200目）,离心（lOOOrpm5min）,去上清，加入DMEM/F12完全培养基（其屮含5%胎牛血•清，10%小牛血清，L谷氨酰胺2mmol/L,青霉素100u/ml,链霉素0

5、.lmg/ml）制成细胞悬液。计数后按5X104/cm2接种于培养瓶,加入DMEM/F12完全培养基，在37°C、5%C02培养箱屮培养9天（每3天更换培养液一次），第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上（240rpm）,摇18小时，去掉含有悬浮细胞的培养液，MJDllanks液清洗3次，进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞［2］。经免疫细胞化学方法检测，95%以上的细胞GFAP免疫反应为阳性。122实验分组在24孔培养板的每一孔内放入一张lcm2消毒过的玻片，涂上多聚赖氨酸，然麻将星型胶质细胞分组种在玻片上（细胞爬片）。纯化的星形胶质细胞被分成1个

6、对照纽.和3个实验组，每组3个样本。对照组不加地塞米松，其它3组分别加入终浓度为10-5.10-4.10-3mol/L的地塞米松。在37°C、5902条件下，继续培养24小时，然后作免疫细胞化学分析。123免疫细胞化学染色将备纽细胞爬片进行SABC法免疫细胞化学染色。每一培养孔屮的细胞爬片经固定、封闭非特界性抗原和消除内源性过氧化物酶等处理后,首先加入特异性抗体（P53、Box、Bcl2）,4°C孵育72h。然后依次加入生物素化羊抗兔IgG,37°C、lh；SABC复合物,37°C、lh；DAB显色5mino每步间均用PBS充分洗涤。所有爬片

7、经脱水、透明、中性树胶封片麻，光镜下观察、摄片。以正常兔血清和PBS缓冲液替代一抗作对照染色，结果为阴性。124图像分析川IIPIAS1000高清晰图像分析系统进行阳性细胞计数及平均光密度分析。所得数据应用SPSS统计软件，以方差分析讲行统计分析，P<0.05定为羌异有显著性，数据以均数土标准差（土s）表示。2结果21形态学观测结果P53对照组：可见少数免疫反应阳性细胞，反应产物呈棕黄色，主要见于胞核（图1）。10-5组：免疫反应阳性细胞增多，反应产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆淡染（图2）。10-4组：免疫反应阳性细胞明显增多，反应产物呈棕黄色

8、，见于胞核，胞浆也有表达（图3）010-3组：大多数细胞呈免疫反应阳性，反应产物呈棕褐色，胞核胞浆界限不清（图4）。Bax对照组：细胞大小形态一致，核膜看色呈棕黄色