蛋白质印迹(Western blot)实验方案.doc

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1、蛋白质印迹（Westernblot）实验方案溶液和试剂裂解缓冲液这些缓冲液可在 4℃ 下保存数周，或者以分装形式在 -20℃ 下保存长达 1 年。Nonidet-P40 (NP40)缓冲液150 mM NaCl1.0% NP40（可用 0.1%TritonX-100替代）50 mM Tris-HCl pH8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）150 mM NaCl1.0%NP-40或0.1%TritonX-1000.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl pH8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl 缓冲液

2、20 mM Tris-HCl pH7.5蛋白酶抑制剂电泳、转膜、封闭缓冲液Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004%溴酚蓝0.125M Tris-HCl测定 pH 并调节至 pH6.8。电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。转膜缓冲液（湿转）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.

3、1%的 SDS。转膜缓冲液（半干转）48 mM Tris39 mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液5%奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。实验步骤样品裂解1. 制备细胞培养物裂解物.将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。.吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100mm培养皿/150 cm2 培养瓶加入 1 ml；每 5×106 细胞/60mm培养皿/75 cm2 培养瓶加入 0.5 ml）。.用预冷的塑料细胞刮

4、棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。.在4℃ 下持续搅拌 30分钟。.在4℃预冷的离心机中以16,000×g的转速离心20分钟。.轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。2.制备组织裂解物.用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。.将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在-80℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约5mg的组织，向离心管中快速加入约300μL裂解缓冲液，然后用电动匀浆

5、器进行匀浆，用另外300μL裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4℃下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2小时。.4℃下在微型离心机中以16,000×g离心20分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。样品制备.取出小部分(50μL)裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2×Laemmli样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。.还原和变性：在100℃下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸5分钟，并进行分装。

6、在-20°C下保存裂解物。注意：分装细胞裂解物(50-100μL)，避免反复冻融循环。.在37℃下解冻装有细胞裂解物的离心管。在微型离心机中以16,000×g离心5分钟。上样和电泳.将等量的蛋白质和分子量标准上样到SDS-PAGE凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为20-30μg，纯化蛋白的上样量为10-100ng。.在100V下电泳1至2小时。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。应使用还原型凝胶，除非抗体数据表中推荐使用非还原性条件。凝胶百分比取决于蛋白质的大小：4-40kDa20%12-45kDa15%10-

7、70kDa12.5%15-100kDa10%25-200kDa8%将蛋白质从凝胶转移到膜上如下制备转移堆叠体：膜可以是硝酸纤维素或 PVDF，两者各具优点。用甲醇“活化”PVDF 1 分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。可能需要对时间和电压进行一些优化。我们推荐按照制造商的说明进行操作。可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。所得膜可用于抗体染色。抗体染色.用5% 封闭溶液在室温下封闭膜 1 小时，或在 4℃ 下封闭过夜。.用适当稀释度的一抗在 5%或2% 封闭溶液中 4℃ 过夜孵育膜，或在室温下孵育 2小时。.用 TBST 洗涤膜3 次，每次 

8、5分钟。.用推荐稀释度的