PCR扩增产物的分析方法.doc

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1、PCR扩增产物的分析方法·微孔板夹心杂交法·颜色互补分析法·PCR-ELISA法·PCR-OLA法·PCR-打点杂交法 微孔板夹心杂交法：　　该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的

2、危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点：①前者易操作；②固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需要时间较长；③本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封闭过程。另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。　　微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。DNA的固定　　在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同来源的微孔

3、板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度（0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促进DNA固定的作用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于300bp，否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适

4、的盐浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。　　待固定DNA100℃加热5min变性并立即冷却。　　与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后，终浓度为最适固定浓度）。　　用胶布封好，浸于37℃水浴2h。　　用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。　　立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。杂交　　可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。显色　　根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波长。颜色互补分析法(

5、A)　　颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见一条红绿互补的黄色条带。　　该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转

6、位和病原微生物。这种情况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM等）。PCR-ELISA法：(A)　　本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。　　链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显著。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140

7、mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。用PBS液漂洗。　　扩增产物与包被板的结合：PCR产物1μl用50μ1PBS-Tween液稀释后加入包被孔内。室温下作用30min。用PBS-Tween液漂洗6次，去除未掺入的荧光引物。