pcr扩增和扩增产物克隆

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1、PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35

2、轮循环就可使DNA扩增达106倍。详细实验方法·PCR扩增和扩增产物克隆实验材料·模板DNA试剂、试剂盒·KCl·Tris·Cl·TritonX-100·MgCl2·dNTP·TaqDNA聚合酶·T4DNA连接酶·pUC质粒·矿物油·琼脂糖·TBE·无水乙醇·70％乙醇·酚·氯仿·异戊醇仪器、耗材·移液器·移液器吸头·PCR小管·DNA扩增仪·电泳槽·电泳仪·台式高速离心机PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：

3、目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。一、PCR反应中的主要成份1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择

4、目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(3)四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)在引物内，尤其在3'端应不存在二级结构。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补，以防出现引

5、物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。(9)简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met，3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1

6、.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计，可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：Xmol/L＝OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X：引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmo

7、l/L。理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。3、Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度

8、。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。4、模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以