现代动物生物化学课件.ppt

《现代动物生物化学课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、现代动物生物化学硕士研究生课程第一讲蛋白质化学一、蛋白质的一级结构（一）蛋白质的构件分子20种氨基酸都属于α-氨基酸，按侧链的极性和有无电荷分为非极性侧链氨基酸、不带电荷的极性侧链氨基酸、带电荷的极性侧链氨基酸。含特异遗传密码，也称编码氨基酸。非编码氨基酸是在蛋白质合成后或合成过程中由相应的氨基酸残基经修饰而成的。（二）肽键与肽链蛋白质是由构件分子氨基酸通过肽键连接而成的多聚生物大分子多肽。肽键—CO—NH—（酰胺键）水解肽键的酶有内肽酶和外肽酶两类，内肽酶对氨基酸的种类有选择性；而外肽酶对氨基酸的种类无选择性。10个以下的肽称寡肽，10个以上的肽称多

2、肽。一条多肽链有一个C末端和N末端。二硫键是蛋白质结构中常见的一种共价键。多肽与蛋白质的区分通常以50-100个氨基酸为界，但并非绝对。（三）蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定是蛋白质高级结构和酶活性部位研究的前提。一级结构测定的基本战略是用两套断链方法分别将纯化的蛋白质肽链裂解成肽段，再将各个肽段分离纯化，并测定每个肽段的顺序，然后比较两套肽段氨基酸顺序以排定蛋白质一级结构。1、一级结构测定前的准备1）蛋白质的纯化纯度必须达到98%以上。常用的纯化方法有SDS-PAGE，高效液相层析（HPLC）。纯度的鉴定常用电泳和层析法2）蛋白质分子量的测定

3、常用凝胶过滤、SDS-PAGE、超速离心、毛细管电泳、质谱等。3）蛋白质多肽链数目和大小的测定用还原性SDS-PAGE分析，若分子量变小，则说明此蛋白质由2条以上多肽链组成，然后将每条多肽链分离出来，分别测定其一级结构。4）封闭自由巯基游离的巯基必须封闭，否则在纯化肽段时易氧化为多种产物。常用碘代乙酸烷化法。5）去除N末端封闭的基团N-末端有时会被封闭，除去N-末端封闭基团。2、氨基酸组成的测定1）蛋白质的水解将蛋白质水解成游离的氨基酸，水解的方法有酸水解、碱水解和酶水解。常用的是酶水解。酸水解色氨酸全部破坏，应添加巯基乙醇作保护剂。2）氨基酸的组成经

4、典的氨基酸组成分析法是茚三酮法。用自动氨基酸分析仪经离子交换层析相继分离，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色化合物，然后在570nm及440nm波长测定光吸收，计算出氨基酸的含量。3、链的拆离与纯化由几条肽链组成的蛋白质，须将不同的蛋白质肽链拆开，并分离纯化。1）二硫键的拆开氧化法：过甲酸还原法：巯基乙醇、巯基乙酸等2）共价键的拆开改变pH值：蛋白质解离的临界pH值为3-4、9-10。强变性剂：尿素和盐酸胍与巯基乙醇共用。3）肽链的分离纯化4、末端氨基酸的测定测定末端氨基酸可确定蛋白质分子中多肽链的数目。1）N-末端的测定常用2、4-二硝基氟苯（DNFB）

5、法、二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）法、异硫氰酸苯酯（PTH）法等。2）C-末端的测定常用的方法有：肼解法、羧肽酶法、还原氨基醇法等。5、肽链的专一性裂解与肽段的分离纯化1）肽链的专一性裂解化学裂解法：专一性化学试剂：溴化氰裂解法；酸水解；碱水解酶水解法：胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶等，每一种酶都有一个专一的切点。2）肽段的分离纯化可用层析和电泳的方法分离提纯。6、肽段氨基酸排列顺序的测定常用化学法：Edman降解法；蛋白质序列测定仪可自动检测氨基酸的性质、含量和氨基酸序列。7、蛋白质一级结构的建立氨基酸排列顺序测定出来以后，将小肽段重新构成大肽

6、段或蛋白质的一级结构。1）肽段重叠：将断裂的许多肽段的氨基酸按顺序排列，最后用重叠的方法确定整个多肽或蛋白质的氨基酸排列顺序。原则：将一段一段小肽按一定顺序排列，将各个样品中相同的氨基酸残基位置对准重叠排列。2）二硫键位置的确定：将完整的蛋白质分子不经任何处理，直接用酶或酸水解，用凝胶过滤或离子交换层析等方法及二硫键鉴定的显色反应，分离检出其中含有二硫键的肽段，将肽的二硫键拆开，分别测定两个肽段的顺序，将两个肽的结构与已测定的蛋白质一级结构进行比较，找出相应的二硫键位置。A-1AFA-2AFGRB-1GRLYB-2LYKWA-3KWB-3WHSA-4H

7、SAFGRLYKWHS二、蛋白质一级结构与功能的关系（一）同源蛋白质一级结构差异与分子进化同源蛋白质：在不同生物种属中执行同一功能的蛋白质。不同生物体的同源蛋白质一级结构在氨基酸组成和顺序上不同，存在种属差异。同源蛋白质一级结构的差异可反映种属间的亲缘关系，但不影响其生物学功能。1．胰岛素不同种属哺乳动物胰岛素的功能相同，但其一级结构不同。胰岛素由A、B两条链组成，不同种属动物A链第8、9、10三个氨基酸残基和B链C-末端第30个氨基酸残基有差别，这4个氨基酸残基对胰岛素的生物活性不起决定性作用。胰岛素结构中有20个氨基酸保持不变，是胰岛素生物活性所必

8、需的。2．细胞色素C带有一个血红素辅基的一条多肽链。不同动物细胞色素C氨基酸除了不变的残基外，