实验1外周血单个核细胞的分离.ppt

《实验1外周血单个核细胞的分离.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验1外周血单个核细胞的分离——Ficoll密度梯度离心法实验目的掌握外周血单个核细胞分离的原理和实际操作方法掌握离心机及显微镜等仪器的使用实验原理外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。实验原理外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001(PBMC)1.0921500rpm,20℃,30minPBMC红细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll

2、稀释的血浆、血小板材料与器材肝素抗凝的外周血淋巴细胞分离液（Ficoll）：低温避光保存稀释液：Hanks液倒置显微镜、离心机华氏管、吸管、吸球、微量移液器、血球计数板及盖玻片实验步骤1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）3.离心：18℃~22℃，1500rpm，30min实验步骤4.将最上层血浆层吸弃，沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中实验步骤5.加足量稀释液充分洗涤，1800rpm，离心10min，弃上清6.重复洗涤一次，1400rpm，

3、离心10min，弃上清7.适量的培养基重悬细胞注意事项每毫升外周血大约可获1×106单个核细胞Ficoll应适量，外周血应充分稀释温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染等实验要求华氏管中加入血样后，用记号笔作好标记实验完毕后，请清洗试管、吸管和计数板思考题分离获得的PBMC如何进行计数？从PBMC中进一步分离T、B淋巴细胞，可采用哪些方法？