外周血单个核细胞分离方法探讨

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1、外周血单个核细胞分离方法探讨作者：韩亚萍刘源章莉莉刘婷李军黄祖瑚【关键词】羟乙基淀粉【摘要】目的探讨外周血单个核细胞（PBMC）的不同分离方法对分离效果、贴壁能力以及淋巴细胞的增殖活性的影响。方法取肝素抗凝血，分别用羟乙基淀粉（hydrixyethylstarch，HES）自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法三种方法分离单个核细胞，直接进行贴壁计数及多种细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-inducedkiller，CIK）培养。结果HES自然沉降法、HES离心沉淀法、Ficoll密度梯度离心法分离的PBMC回收率分

2、别为86.4%、86.0%、85.1%。结论羟乙基淀粉离心沉淀法可有效地分离PBMC。关键词羟乙基淀粉淋巴细胞分离液单核细胞.【Abstract】ObjectiveToinvestigatethedifferenceamongthreeprotocolsofisolatingperipheralbloodmononuclearcells（PBMCs）throughobservingtherecoveryrate，theadherentabilityandlymphocytesproliferationacˉtivityoftheisolated

3、PBMCs.MethodsUsethreedifferentisolationprotocols，HES（hydrixyethylstarch）sedimentationmethod，HEScentrifugationmethodandFicolldensitygradientcentrifugation，toisolatePBMCsfromhealthydonors.ThenparetheseisolationprotocolsthroughobservingtherecoveryrateofPBMCs，thenumberofplastic-

4、adherentcellsandthecytokine-inducedkillercellsproliferation.ResultsTherecoveryrateofPBMCsis86.4%byHESsedimentationmethod，83.7%byHEScentrifugationandsedimentationmethodand85.1%byFicolldensitygradientcentrifugation［method］separately.ConclusionOurobservationprovideevidencethatH

5、EScentrifugationmethodcouldefficientlyisolatePBMCsfromhumanperipheralblood.Keyonocyte外周血单个核细胞分离效果直接影响细胞培养结果，经典的Ficoll密度梯度常用于少量血液分离，而在血液较多时则须分成许多离心管，重复地开放操作增加了污染机会。为此，我们用HES离心沉淀法代替Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，对不同方法获取PBMC的贴壁能力和CIK细胞增殖活性等作一较为系统的探讨。1材料和方法1.1材料外周血:健康成人外周血10份。Ficoll:上海试剂二厂

6、，分子量400000。6%HES:DUPONT公司生产，分子量480000。1.2方法1.2.1外周血单个核细胞的分离HES自然沉降法［1］:即肝素抗凝血与6%HES按5:1混合，自然沉降60min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两遍备用。HES离心沉淀法:分别将抗凝血与HES12:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1，使HES终浓度为0.5%、0.85%、1.0%、1.2%、2.0%和3.0%条件下20℃60×g离心10min，取上层液400×g离心10min，以RPMI1640洗两次备用。Ficoll密度梯度离

7、心法［2］:肝素抗凝血先与RPMI1640培养液1:1混合，再加等量淋巴细胞分离液600×g离心20min，小心吸取单个核细胞层，以RPMI1640洗两遍备用。1.2.2PBMC的处理将不同分离方法获取的PBMC计数后重悬于完全培养基中，分别加入24孔培养板，每孔4×106细胞，37℃，5%CO2培养2h后吸取培养上清，用RPMI1640轻轻洗涤培养孔3次以去除非贴壁细胞。收集贴壁细胞计数并用荧光素标记的单克隆抗体通过荧光激活细胞分离器（FACSVantageSE）鉴定。悬浮细胞用完全培养基调整细胞浓度至1×106/ml，补充适量的CD3单抗、

8、rh-IFN、IL-2等，共同培养多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），每3天换液1次并计数，第10天收获细胞，计算增殖倍数，同时以荧光素标记的单克隆