PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt

PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt

ID:57401520

大小:2.26 MB

页数:48页

时间:2020-08-18

PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt_第1页
PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt_第2页
PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt_第3页
PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt_第4页
PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt_第5页
资源描述:

《PCR引物设计及相关软件使用课件.ppt》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库

1、PCR引物设计及相关软件使用重庆大学生物工程学院杨应斌主要内容背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件PrimerPremier5.0介绍Oligo6.22介绍在线Primer3介绍PCR聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR引物设计是PCR技术中至

2、关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱,等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。影响因素如引物长度(primerlength),产物长度(productlength)序列Tm值(meltingtemperature)引物与模板形成双链的稳定性(interna

3、lstability,用∆G值反映),形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构(duplexformationandhairpin)的能值在错配位点(falseprimingsite)的引发效率引物及产物的GC含量(composition),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。一般原则引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱

4、基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。一般原则3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。一般原则4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)

5、+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。一般原则6.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。一般原则7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。一般原则8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载

6、体的相应序列而确定。常用的引物设计软件Oligo6(引物评价)*PremierPrimer(自动搜索)*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3(在线服务)*PrimerPremier5.0的使用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核(CiliateMacronuclear)2、无脊椎动物线粒体(InvertebrateMitochondrion)3、支原体

7、(Mycoplasma)4、植物线粒体(PlantMitochondrion)5、原生动物线粒体(ProtozoanMitochondrion)6、一般标准(Standard)7、脊椎动物线粒体(VertebrateMitochondrion)8、酵母线粒体(YeastMitochondrion)PrimerPremier5.0使用介绍(1)PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobut

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。