基因工程菌的构建ppt课件.ppt

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1、分子生物学实验一、实验设计二、实验操作指导教师：林凤实验设计基因工程菌的构建载体目的基因酶切PCR扩增，酶切载体片段目的基因片段+连接重组质粒转化重组子阳性鉴定1、载体多克隆位点2、缓冲溶液3、温度4、末端的性质酶切位点设计载体与目的基因的连接1、粘末端2、平末端3、对照实验连接产物的转化1、核酸电泳检测2、对照实验：空白和阳性阳性重组子的鉴定1、限制性酶切法2、α-互补法3、插入失活法4、杂交筛选法constructionofexpressionvectorNcoICCATGGGGTACCXhoICTCGAGGAGCTC实验操作

2、碱裂解法小量制备质粒DNA-pUC18接种子液至75µg/mlAmp的5mlLB培养基37℃，OD6001.0加氯霉素100µg/ml37℃，过夜1.4ml培养液4℃,6000rpm,2min沉淀加100µl冰预冷溶液Ⅰ,剧烈振荡弃去上清，尽可能除净培养液室温，20min200µl新配制溶液Ⅱ，快速颠倒混匀冰浴5min150µl冰预冷溶液Ⅲ，温和振荡冰浴5min上清加入450µl饱和酚，混匀4℃,12,000rpm，2min上清加入450µl氯仿-异戊醇，混匀4℃,12,000rpm，2min上清加入300µl异丙醇，-20℃，3

3、0min4℃,12,000rpm离心5min500µl70%乙醇洗涤沉淀4℃,12,000rpm，2min弃上清，空气干燥10min20µlTE溶解质粒DNA4℃,12,000rpm，5minDNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定DNA的酶切与连接酶切反应体系12ddH2O19μl19μl10×buffer2.5μl2.5μl质粒DNApBR3223μlpUC183μlEcoRI0.5μl0.5μl37℃，1h65℃，10－15min终止反应取4μl样品，加入10×Loadingbuffer0.5μl，核酸电泳连接反应体系ddH2

4、O8.5μl10×buffer4.5μl酶切DNApBR32220μl酶切DNApUC1810μlT4DNAligase1μl16℃，15h取10μl连接产物，核酸电泳（上步剩余酶切产物做对照）其余连接产物用于转化重组DNA的转化（一）CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞0.3ml菌种接种于30mlLB培养基37℃，190rpmOD6000.375，冰浴10min4℃,6000rpm,10min弃上清，加4ml冰预冷0.1MCaCl2冰浴10min，4℃,6000rpm,10min弃上清,加入1ml0.1MCaCl2，分装200μl

5、/管（二）转化反应分别加入连接产物20µl,阳性对照质粒pBR3221µl,阴性对照pUC181µl,空白对照冰浴30min42℃,90s冰浴1-2min弃500µl上清,连接产物取100µl,10µl各涂一平板,空白，阳性对照和阴性对照200µl各涂一平板加入800µlLB培养基37℃水浴5min37℃，缓慢摇，复苏45min37℃，12-16h观察转化子的出现6000rpm,5min转化子DNA的快速鉴定PCR扩增技术