基因工程菌构建.ppt

《基因工程菌构建.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建生物技术1101班李娟1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产周期长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此，利用基因工程技术构建高产菌株备被认为是今后的发展方向。1，3．丙二醇简介1，3-丙二醇性质物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一种无色无味透明的液

2、体，易溶于水、乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相对密度为1．053g／cm3，熔点．27℃，沸点211℃，自燃温度为400℃。化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。1，3-丙二醇用途可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、化妆品和制药等行业14j。1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品，

3、产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克隆1．16kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建了重组菌iJM109(pEtac—dhaB—tac-yqhD)构建重组载体pUC．tac．dhaT，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac．dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线(

4、1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建重组菌EcoliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考察其转化甘油的能力。(2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac—dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。(3)在摇瓶水平，对已构建的产1，3．丙二醇重组菌EcoliJMl09

5、发酵条件的初步研1，3．丙二醇生物合成途径l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3一丙二醇。一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达1，菌株、质粒及基因片断：大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠杆菌和克雷伯氏菌中克隆得

6、到。2，主要试剂：质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化试剂盒；工具酶、抗生素；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、材料（一）、质粒DNA的提取(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培养过夜。(2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／min离心5min。(3)弃去上清，加入溶液I100“L重悬菌体。(4)加入溶液II150“L，轻柔混匀。(5)加入溶液III150此，倒转混匀，8000r／min，离心10min。(6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤5中的上清加入离心吸附柱中混匀，6000r

7、／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。（7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。(8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1．5mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000r／min离心2min。(9)取5“L酶切后电泳鉴定。(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备(1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过夜。

8、(2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃振荡培养至OD值O．3—0．4。(3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌液迅速冷却约10分钟。(4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。(5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预