基因工程期末复习.doc

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1、基因工程第一章：1.基因工程：在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。(工具酶也是必备元件)基本用途：大规模生产生物活性物质，设计、构建生物的新性状甚至新物种。2.基因工程研究的主要内容：目的基因的分离与制备，DNA片段和载体的连接，外源DNA片段引入受体细胞，选择目的基因，目的基

2、因表达。3.基因工程的意义：大规模生产生物分子，设计构建新物种，搜寻、分离和鉴定生物体。发展前景：农林牧渔业中的应用，工业中的应用，在医学中的应用。第二章：（结合课本划线内容）1.限制性核酸内切酶的发现及其生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链，主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵；（发现的现象：寄主细胞的限制和修饰作用。）hsdR：编码限制性核酸内切酶，hsdM：编码限制性甲基化酶，hsdS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达。（限制核酸内切酶类型：I型，II型，I

3、II型；）2.属名种名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株先后分离出3种限制酶：HindIHindIIHindIII，EcoRI在抗药性R质粒上发现的第一个酶。同尾酶：识别不同的序列，能产生相同的黏性末端的酶；同位酶：不同微生物来源的酶，能识别相同的序列，切割方式相同或不相同。3.II型限制性核酸内切酶的切割方式：在识别序列的对称轴上同时切割形成平末端如EcoRV;在识别序列的双侧末端进行切割，若于对称轴5‘端突出的末端如EcoRI;反之产生3’端突出的末端如PstI。限

4、制性核酸内切酶反应的注意事项：限制性核酸内切酶为浓缩酶；浓缩的酶液要用核酸内切酶缓冲液稀释，（不能用水稀释，以免酶变性）；核酸内切酶在含有50%甘油的缓冲液中，于-20度稳定保存；反应中尽可能少加水，使反应体积减到最小；延长反应时间，使所需酶量减少。影响限制性核酸内切酶活性的因素：DNA样品的纯度；DNA样品的甲基化程度；核酸内切酶的缓冲液性质；4.DNA连接酶基本性质：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；连接多个平头双链DNA分子。（注意：DNA连

5、接酶所连接的是DNA分子上相邻核苷酸之间的切口，即Nick链接，不能链接两条单链DNA或环化的单链DNA分子。）DNA连接酶的种类：T4噬菌体DNA连接酶（最常用）、大肠杆菌DNA连接酶（最常见）、T4噬菌体RNA连接酶。5.DNA聚合酶：⑴大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：5‘→3‘的DNA聚合酶活性；5‘→3‘的核酸外切酶活性；3‘→5‘的核酸外切酶活性。用途：主要用于杂交探针的制备。切口平移法是目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。⑵Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经

6、枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶；Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端；DNA片段的同位素末端标记；cDNA第二链的合成；双脱氧末端终止法测定DNA序列。⑶T4-DNA酶的基本特性：5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性；在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切；在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；

7、在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端（注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多）；DNA片段的同位素末端标记。⑷反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链；双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链6.核酸酶:⑴单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII），大肠杆菌的核酸外切酶VII反应不需要Mg2+。双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII），大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切。单

8、、双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo），l核酸外切酶特异性地从5‘端外切。⑵单链核酸内切酶：S1核酸酶，来自稻谷曲霉菌。基本特性：降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍，是降解单链RNA的核酸内切酶，反应条件：Zn2+必需，最适pH范围为4.0-4.3，需要NaCl10-300mM。S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA。⑶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶，来自艾氏交替单胞菌。基本用途：诱发DN