免疫印迹20100712.ppt

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1、吴　砂smu_imm@yahoo.cn基础医学院免疫学教研室2011.6免疫印迹(Immunoblot/Westernblot)1免疫印迹(immunoblot/westernblot)又称蛋白质印迹凝胶电泳和固相免疫测定技术结合起来的一种免疫生化技术。借助特异性抗体鉴定抗原2在电场作用下将电泳分离的蛋白由凝胶转移至固相载体，用识别此多肽的抗体进行检测基本原理3★WB的灵敏度可达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需对靶蛋白进行放射性标记。★此方法可检测出1-5ng中等大小的待检蛋白。4基本步骤561.检测样品中的蛋白。基于：被测蛋白与抗

2、体的特异性结合以及蛋白质的相对分子量2.未知抗原与已知蛋白的关系3.评价新抗体的特性4.蛋白质酪氨酸残基是否发生磷酸化5.不能用于检测蛋白质的生化特性、化学修饰或半寿期应用7主要内容一、概述二、基本原理三、应用四、基本流程五、实验步骤六、常见问题及解决策略8基本流程1.将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离SDS-PAGE2.将分离的组分转印到印迹膜转印3.对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测杂交显色9第一部分：SDS-PAGE将玻璃板洗净擦干(水幕流下)2)按下表配制10％的分离胶，充分混匀后沿两板夹层滑动均匀倒入，距短板上沿3c

3、m左右时停止，滑动加入少许去离子水覆盖胶面，室温聚合30～60min。1.制胶具体步骤：10分离胶(8ml)待分离蛋白质的分子量（KD）溶液>5030～4020～30<20丙稀酰胺/双丙稀酰胺的总百分数8％10％12％15％30：0.8丙稀酰胺/双丙稀酰胺2.13ml2.67ml3.20ml4.00ml去离子水3.87ml3.33ml2.80ml2.00mlTris.HCl/SDSpH8.8（4×）2.00ml2.00ml2.00ml2.00ml10％过硫酸铵(APS)45ul100ul45ul45ul四甲基乙二胺(TEMED)12ul1

4、2ul12ul12ul加胶至距短板上沿2.5cm,加水至短板上沿引发剂增速剂11积层胶3)倒去顶层水，用滤纸吸去表面水分，插入梳子(可在加满积层胶后再使用-建议）4)按下表配制积层胶，混匀后用1ml移液器加入，室温聚合30min左右。积层胶（3.9％丙稀酰胺）30：0.8丙稀酰胺/双丙稀酰胺0.65mlTris.HCl/SDSpH6.8（4×）1.25ml去离子水3.05ml10％过硫酸铵50ulTEMED10ul12制胶★不连续电泳:使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳浓缩胶(积层胶)的作用:使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带;便

5、于分离以及得到漂亮的蛋白条带.分离胶的作用:分离分子量不同的蛋白质亚基(分子筛效应)SDS－PAGE原理13SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.SDS作用14+15带负电荷的SDS-蛋白复合体+16大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只

6、与多肽的大小相关。1718水的作用压平隔氧:大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。19没有滑动加样或未加水20常见问题两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?1)玻璃没有洗干净，应该要洗得非常干净！2)过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。3)加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。4)稍微注意手法，均匀加入。5)灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面21胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破

7、损，尤其和胶条接触的地方。3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面的胶条注意不要老化22胶不凝1）试剂过期：重新配制2）APS,TEMED过少：加倍(胶脆，后期操作易碎)3）配液PH值不对：重新加4)环境温度过低：25度左右较好。23具体步骤样品的处理：30ul小鼠血清＋30ul2×SDS上样缓冲液，混匀后100℃煮沸3～5min。用1×SDS电泳缓冲液加满电泳槽的上下槽，小心拔出梳子，用移液器将处理过的样品液加入到孔中，约15-20ul/孔。2.上样24蛋白质

8、样品的制备样品的制备快冷蛋白酶抑制剂25样品处理液还要加入1/4体积左右的上样Buffer，然后放在沸水浴中加热3-4min使蛋白变性，方可作为样品点样。★在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要