橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析.docx

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1、橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析橡胶树白粉菌(OidiumheveaeBA.Steinmann)是橡胶树白粉病的病原菌,具有专性寄生的特性,对天然橡胶的产量有极大的影响。橡胶白粉菌的相关研究主要集中在病原菌和寄主细胞学观察、病害预测防治方面,而关于分子方面的研究,致病性相关基因及其功能鲜有报道。为验证橡胶树白粉菌致病过程中基因的表达差异和调控机制,本实验在橡胶树白粉菌HO-73菌株基因组和与橡胶品系7-33-97互作转录组的基础上,筛选到致病和MAPK信号途径相关基因,监测其在橡胶树白粉菌致病过程中的表达差异,为进一步验证其

2、具体功能提供理论基础。主要研究结果如下：1、用HO-73菌株接种寄主培养12d新鲜孢子接种在抽芽7-10d叶龄橡胶叶片上,分别培养至1d、3d、30d,提取RNA。在橡胶白粉菌基因组测序(未发表)基础上,通过GO注释,选取其中11个和致病性相关的基因(GO：0009405),进行克隆、qRT-PCR扩增,分析其在致病过程中的表达差异,并与转录组相对应。结果表明：在1dpi(daypastinfection),初次侵染器官附着胞、吸器等发育完成,Oh-Imp、Oh-hypotheticalprotein-4为上调基因,其可能与侵染初期侵染器官的生长相关；3

3、dpi菌丝体生长时期,代谢基因Oh-PC2、Oh-Gproteinbetasubunit/AC1、Oh-EKA,生长基因Oh-AAAperoxin,Oh-RNP和Oh-Imp;假定蛋白Oh-hypotheticalprotein-1,2,3,为上调基因,这些基因可能与菌丝生长密切相关；30dpi产生新生分生孢子阶段,代谢基因Oh-PC2,生长基因Oh-RNP,假定蛋白Oh-hypotheticalprotein-1,2,3为上调基因,这些基因可能与分生孢子产生有关。2、利用橡胶白粉菌基因组数据库和小麦白粉菌(Blumeriagraminis)的同源序列进

4、行比对,获得25个MAPK信号途径相关基因。并运用蛋白质结构域及聚类分析,构建橡胶树白粉菌中的MAPK级联途径简图,共发现了1个MAPK基因、1个MAPKK基因和3个MAPKKK基因,为继续探究植物病原真菌MAPK信号途径基因的功能奠定了基础。橡胶白粉菌在parafilm表面培养0-24hpi(hourspostinoculation)的侵染发育可大致归纳为未萌发(0hpi)、萌发(4hpi)、附着胞形成(6、8hpi)和次生附着胞(16、24hpi)等4个形态发育阶段；在此基础上检测MAPK信号途径相关的基因在parafilm表面的表达差异情况。在4h

5、pi芽管生成时,全部基因为上调,上调倍数较大的基因有20892、18727、8311和4961,证明MAPK途径的Fus3andKss1pathway在芽管生成时发挥主要作用；8hpi附着胞形成时,全部基因也都为上调基因,上调倍数明显增大的为基因1505、4241、4865、5368、18727、20892,证明MAPK信号途径中的MEK1、Bkk1、Bck1和Wis4在附看胞形成过程中起主要作用；16hpi吸器形成时,4961为下调基因,剩余为上调基因,明显上调的基因为1505、4241、9052、20892,证明在吸器形成时,MAPK途径中的Hog1

6、MAPKpathway起主要作用；24hpi菌丝生成时,全部基因为上调,明显上调的基因为4241、4961、8311、18727、9052和20892,证明在此阶段起主要作用的为MAPK途径中的Hog1pathway。用MAPK信号途径特异性外源抑制剂——U0126处理,促使白粉菌在非诱导琼脂表面萌发并形成附着胞。在1.0%琼脂培养介质中加入浓度为10μmol/L-30μmol/L浓度梯度的U0126。结果表明,随抑制剂U0126的浓度增加,孢子萌发率明显下降,且与未加入抑制剂的对照有显著差异(P<0.05)。24hpi时,10μmol/L最终萌发

7、率为57%,20μmol/L最终萌发率为57.33%,30μmol/L最终萌发率为33.33%,均低于对照,其最终萌发率83.33%。说明MAPK途径相关基因参与了O.heveae的萌发过程。