rnai技术专辑之五

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1、RNAi技术专辑之五在植物、昆虫、原生动物体内都发现了自然存在的RNAi现象，实验表明通过目的基因序列的双链RNA可以诱导产生基因沉默现象。要制备较长的dsRNA，最简单的方法就是体外转录合成双向的RNA。如果研究对象不是哺乳动物细胞，那要开展RNAi的实验就要简单很多。因为可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象，而无需制备特定的siRNA。在这里生物通将介绍几个制备长链dsRNA的试剂盒。（值得注意的是在哺乳动物细胞内，大于29nt的双链RNA引发的是非特异基因沉默，21nt大小的双链RNA，也就是我们前面所说的

2、siRNA能有效引发特异的基因沉默。由于体外转录很难合成25nt以下的短链RNA，生物通在前面为大家介绍了一些利用试剂盒或者质粒合成siRNA的产品。参考相关文章）MEGAscript™RNAiKit   合成大量纯净的双链RNA是RNAi实验成功的关键。这个基于专利的转录高产技术的产品正是为大量合成用于RNAi实验的dsRNA而优化的。试剂盒要求用两端带有T7启动子序列的目的基因作为模板（200nt以上，模板可以是质粒载体上的，也可以是用带有T7序列的引物扩增的PCR产物，另外也可以选用一个叫Lig’nScribe

3、Kit可以将T7Prometor序列直接连接到DNA片断的两端），将模板和试剂盒提供的dNTP、酶等混合，根据模板的长短进行体外转录反应。每次反应可以合成50ug—100ug甚至更多的dsRNA(800nt以上的需要先加热变性并褪火形成双链)，产量是常规的10—50倍，整个试剂盒总产量可达2mg（20次反应，每次100ug）。合成的产物经过DNaseI消化去除DNA模板，再经过特殊的单链RNase（试剂盒里提供，后文介绍）除去单链的RNA，最后经过柱纯化就得到纯的双链RNA，即可用于RNAi实验。由于这个试剂盒提供全

4、套产品，使用相当方便。SilencingofDrosophilahrp48andU2AF50ProteinbydsRNA.A.SpecificReductionofExpressionLevels.1x106Schneider’sDrosophilamelanogasterL2cellsweregrownin6-wellplatesinserum-freemediumandtreatedwith10nMofdsRNAspecificforeitherhrp48orU2AF50.dsRNAwerepreparedwit

5、htheMEGAscriptRNAiKitandpost-transcriptionallylabeledwithCy3usingtheSilencersiRNALabelingKitwhenindicated(+).Cellswereharvested72hoursposttreatmentandthesilencingeffectwasanalyzedbyWesternblotwithanti-hrp48(48kDa,migratesasadoublet)andanti-U2AF50(50kDa)antibodi

6、es.AnantibodydirectedagainstPab1(lowerpanel)wasusedasasecondnegativecontrol.B.Dose-sensitiveReductionofProteinExpressionLevels.dsRNA-triggeredsilencingofhrp48wasanalyzedasinFigure2ausingtheindicatedconcentrationsofhrp48dsRNAmadewiththeMEGAscriptRNAiKit.Westerna

7、nalysiswasalsoperformedwiththeanti-U2AF50(bottompanel)andPab1(datanotshown)antibodiesasnegativecontrols.　HiScribe™RNAiTranscriptionKit   RNA干涉（RNAinterference)是近年产生的研究转录后剪切的一种实验方法。它将目的基因所对应的双链RNA导入生物体，导致相应的mRNA降解。和反义技术不同的是,在基因表达恢复之前，RNA干涉现象将持续多个细胞分裂周期，因而它是一种有力的

8、研究基因功能的工具。它不是传统的在DNA水平基因敲除，而是通过RNA干涉，在RNA水平上去除目的RNA。这样大量基因功能可以快速经济地进行检测。   HiScribe™RNAiTranscriptionKit也是一个体外合成双链RNA进行RNA干涉实验的试剂盒。不同于前者的是，这个试剂盒提供质粒作为载体，方便了以后的扩增和复制。LITMUS™载