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1、RNAI技术及其应用提要：RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptionalgenesiliencing,PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此
2、种现象,只是机制也更为复杂。RNA干涉(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术通过双链RNA的介导，可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。在肿瘤研究中，通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，各种癌基因都可以成为肿瘤基因治疗的靶点。利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载
3、体的方法转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。作用机制：RNAi的作用机制.RNAi的第一步是,dsRNA（双链RNA）在内切核酸酶(一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶，称为Dicer.)作用下加工裂解形成21～25nt（核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA,即siRNA。果蝇中RNaseIII样核酸酶Dicer含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域.已发现在哺乳动物中也存在Dicer同类物.近年来研究发现,干扰性小RNA(siRNA)是R
4、NA干扰作用(RNAi)赖以发生的重要中间效应分子.siRNA是一类特殊双链RNA(dsRNA)分子,具有特征性结构,即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性;siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基.此外,每条单链的3′端均有2～3个突出的非配对的碱基。细胞中dsRNA的形成是RNAi的第一步.获得dsRNA.主要有三种途径：一：细胞内产生的mRNA在RNA聚合酶的作用下，依一条单链的RNA合成一条双链RNA；二：体外人工合成，原理类似于上；三：有一些长的RNA具有反向互补序列，它会自己和自己互
5、补，产生一个茎环结构，这个结构很容易被核酸内切酶识别，但是核算内切酶只降解单链部分，互补的双链RNA被留下来。在线虫(C.elegans)可以直接注射dsRNA或把线虫浸泡在含dsRNA溶液中等方式引入外源dsRNA,还可以通过喂养表达正义和反义RNA的细菌RNAi的第二步是,siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC(由siRNA中的反义链指导形成)，RISC复合物中含siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶同源RNA链搜索活性等，其中的siRNA解链成为单链，由其中的反义链识别与其同源的靶
6、mRNA，并与靶mRNA配对结合，在mRNA的近中点位置将靶mRNA切割，并由RISC中的酶把靶mRNA降解，从而阻断了mRNA传递遗传信息的功能。siRNA可作为一种特殊引物,在RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA,后者可被降解形成新的siRNA;新生成的siRNA又可进入上述循环.这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(randomdegradativePCR).新生的dsRNA反复合成和降解,不断产生新的siRNA,从而使靶mRNA渐进性减少,呈现基因沉默现象.RdRp一般只对
7、所表达的靶mRNA发挥作用,这种在RNAi过程中对靶mRNA的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能.每个细胞只需要少量dsRNA即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi过程具有生物催化反应的基本动力学特征.（在植物和线虫中存在的信号放大过程，但是在哺乳动物中不存在这种现象,可能与在哺乳动物体中siRNA不能作为RdR的引物有关。）此外，：解开siRNA的双链后，反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物，以mRNA为模板，(RNAdependentRNApolymerases，RdRPs，又称作RDR
8、s)的作用下形成新的dsRNA，并再次被Dicer识别并切断后形成新的siRNA，这种新产生的siRNA(次级siRNA,secondarysiRNA)又可形成更多的RISC复合物并作用于mRNA，使mRNA降解。因此小剂量的dsRNA即可诱导强大的PTGS，即PTGS具有类似于激素作用或PCR那样的级联放大效应。最新的研究进一步揭示,ATP在siRNA介导
