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1、酵母双杂交技术研究进展提要酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统，它自建立以来经过了不断的改进与完善，不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性，而且在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。这些都将对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到促进作用。0引言 随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，大量关于基因结构的信息不断涌现，对这些信息进行系统研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。这不仅需要利用计算机进行生物信息学的
2、分析和预测，而且必须结合生物学实验获取证据。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的发展趋势，已出现了很多新技术，如DNA微阵列技术（DNAmicoarry）,基因表达的系列分析（SAGE）,肽质谱分析法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交技术（YeastTwo-HybridSystem）等。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。 1酵母双杂交技术的基本原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物
3、的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-bindingdomain，BD）与转录激活域（Transcriptionalactivationdomain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与B
4、D形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要
5、分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。2酵母双杂交技术的应用现状 酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能
6、推测该新基因的功能。3常见问题的解决与改进 酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。
7、另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析： (1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。 （2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。 （3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假
8、阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。 在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检
