肾宁合剂微生物限度检查方法的验证

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1、肾宁合剂微生物限度检查方法的验证［摘要］目的验证肾宁合剂微生物限度检查方法。方法测定肾宁合剂中5种试验菌的回收率，以大肠埃希菌作为控制菌，金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌，考察控制菌检查的专属性。结果5种试验菌的回收率均达到70%以上，细菌、真菌及酵母菌数测定均可采用常规法进行检验。结论肾宁合剂的微生物限度检查方法可行，能有效控制该制剂质量。［关键词］肾宁合剂；微生物限度检查；验证；大肠埃希菌［中图分类号］R927［文献标识码］A［文章编号］1674-4721(2013)06(b)-0078-02肾宁合剂是本院结合临床研制的医院制剂，由黄茂、益母草、败酱草、川写等组成，具有益气

2、活血、利水消肿、调节免疫功能的功效，用于急慢性肾炎、肾病综合征、糖尿病性肾病、急慢性肾功能衰竭等疾病。据调查目前微生物限度不合格是医院制剂不合格的主要因素Z—［1］,为控制产品质量，本研究按照2010年版《中华人民共和国约典》(简称“中国药典”)附录的相关规定：2］,参考相关文献对肾宁合剂微生物限度检查方法进行了验证［3-4］,以保证患者用药的安全冇效，现报道如下。1仪器与试药1.1供试品肾宁合剂，规格:100ml,由本院制剂室生产；批号：20120413c1.2培养基营养琼脂培养基，批号:110116；营养肉汤培养基，批号:110112；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：1101

3、12；4-甲基伞形酮葡糖昔酸培养基(MUG),批号:100820；pH7.0改良马丁琼脂培养基,批号:101106；无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液，批号：100824。以上培养基均由北京三药科技开发公司提供。1.3验证试验用菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003],大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102],枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501],黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003],白色念珠菌(Candidaalbicans)

4、[CMCC(F)98001]o以上菌种均由中国夯品生物制品检定研究院提供。1.4仪器和设备SHINVA立式压力蒸汽灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)，超净工作台(蚌埠净化设备厂),LRH-250生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，HTY-2000A集菌仪，HTY反复使用集菌培养器(杭州高得医疗器械有限公司)等。2细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证2.1菌液制备接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，经25°C培养18~24h,取1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5,为50-100CFU/ml菌悬液备用。接种金黄色葡萄球菌、人肠埃希菌与

5、枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基上，经35°C培养18〜24h,取1ml加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6-10-7(50〜100CFU/ml)的菌悬液备用。接种黑曲霉菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25°C培养5d,加入0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5ml,将也子洗脱,吸出砲子悬液至无菌试管内，用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每毫升含砲子数50〜100CFU的砲子悬液，备用。将上述5种菌液分别接种至相应的培养基上，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌，35°C培养2d；黑曲霉、

6、白色念珠菌，25°C培养2~3do2.2供试液制备取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液至100ml,制成1：10的供试液。2.3细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证供试品对照组：取1：10的供试液lnil,立即倾注琼脂培养基，凝固后，置规定温度下，细菌培养24〜48h,白念珠菌和黑曲霉菌培养48〜72h,按菌落计数方法测定供试品本底菌数。试验组：取1：10的供试液1ml和50-100CFU/ml试验菌，分别注入平皿屮，倾注营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基，5种试验菌株每株试验菌分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。菌液组：取各试验菌50-100CFU注入平

7、曲中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，凝固后,置规定温度下,细菌培养24〜48h,白色念珠菌和黑曲霉菌培养48〜72h,测定所加入的实验菌数。试验组回收率计算：冋收率二（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数x100%o验证结果提示，5株试验菌人工染菌回收率达到70%以上，表明采用常规法做验证试验，方法可行（表1）。3控制菌检查方法的验证（常规法）试验组：取1：10的供试液10ml和小于100CFU/ml大肠埃希菌试验菌液加到100ml胆盐乳糖増菌培养基中，35°C培养24〜48h。取