原核表达载体

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1、原核表达体系的构建刘华彬，董浚键一、实验材料（1）植物材料：拟南芥（2）载体及菌株：克隆及测序用载体为pMD18-T，购自Takara公司。宿主菌DH5α。原核表达载体（pET30c？）。（3）PCR引物：登陆GeneBank查找目的基因序列，以目的基因序列为模板设计引物。（4）药品试剂：反转录试剂盒（TaKaRa），质粒小提试剂盒（TIANGEN），胶回收试剂盒，TaqDNA聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKaRa），限制性内切酶（TaKaRa），T4连接酶（TaKaRa），各种DNA和蛋白marker，各种抗生素类，二、方法（1）目的基因的获得（RT-PCR）：

2、拟南芥叶片→mRNA→逆转录→cDNA→PCR→基因（详见王希朝那份）；PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离。先设计好PCR的引物和PCR的反应程序。（2）克隆载体的构建：Ⅰ.目的基因的切胶回收：①在紫外灯下迅速用干净的手术刀切下含目的基因的琼脂糖凝胶块，放入已称重的离心管中，在保证目的基因全部回收的同时，应尽量减少胶的体积。②计算凝胶重量（100mg相当于100μl），加入3倍体积solutionDE-A，75℃水浴6-8分钟，其间轻柔地颠倒离心管至胶完全融化。③加入2倍体积solutionDE-B，颠倒混匀，将溶液转移到吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心1m

3、in。④取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入600μlWashsolution，室温12000rpm离心30s。⑤重复步骤④一次。⑥取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000rpm离心1min。⑦将吸附柱放入新的1.5mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入30μl75℃预热的ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min。离心管中的液体即为回收的目的基因片段，可立即使用或保存于-20℃备用。Ⅱ.目的片断与克隆载体pMD18-T连接：pMD19-TSimpleVector（T载体，小纸盒子中）1ulInsertDNA2ul5uldH2O2ulSolutionI（冰中

4、融化，小纸盒子中，跟T载体一起）5ul（等量）16℃反应30minⅢ.E.coliDH5α感受态细胞的制备：①将E.coliDH5α在LB平板上划线培养过夜。次日，挑取单克隆，接种到5mLLB培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜。②将过夜培养的菌液1mL加入到100mLLB培养基中(1:100)，培养2-3h至OD600=0.5，转入预冷的无菌离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下3000rpm离心10min。③弃去上清，用预冷的0.05mol/L的无菌CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下3000rpm离心10min。④弃去上清，加入

5、4mL预冷的含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。⑤感受态细胞分装成100μl的小份，于冰上备用，或液氮速冻贮存于-80℃。Ⅳ.重组质粒转化E.coliDH5α（热击法）连接产物加至感受态E.coliDH52（200ul）或（100ul）【非连接载体加2ul】【加入后离火远点轻轻用手拨】↓冰上放置20min↓42℃水浴热击90s↓立即放置冰上2min（勿震荡）↓于超净工作台加800ulLB培养液↓37℃，150rpm预培养50min↓6000rpm离心1min，吸除800ul上清；剩余液体用来悬浮沉淀↓涂布LB+

6、Amp平板上，37℃倒置培养12h（于超净工作台吹干液体）。Ⅴ.挑取白色单克隆菌落，重悬于5μlddH2O中，取其中1μl用于PCR鉴定。PCR反应体系和反应程序同上面获取目的基因的PCR一样。Ⅵ.重组质粒的提取（TIANGEN质粒小提试剂盒，方法可以看试剂盒说明书）①将以上剩余的4μl菌液接种到5mL含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。②取3mL菌液，室温12000rpm离心1min。③弃上清，加入250μlSolutionI，重悬菌体细胞。④加入250μlSolutionⅡ，轻柔颠倒离心管4-6次。⑤加入350μlSolutionⅢ，轻柔颠倒离心管6-

7、8次，此时应出现白色絮状沉淀，室温12000rpm离心10min。⑥取上清（注意不要吸到蛋白），转入吸附柱，室温放置1min，12000rpm离心1min。⑦取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，加入500μlWashSolution，室温12000rpm离心1min。⑧重复步骤⑦一次。⑨取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，室温12000rpm离心1min。⑩将吸附柱放入新的1.5mL灭菌离心管中，在柱膜中央加入60μl75℃预热的ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min。离心管中的液体即为质粒。可立即使用