BPG层析柱标准装柱流程规范

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1、--操作标准目的：为了使BPG300层析柱装柱过程可重复，并能够得到较好的柱效，故建立此操作规。围：配合ÄKTAprocess系统进行有效的蛋白质纯化操作。责任人：层析工序操作人员标准操作程序：1基本术语概念填料因子（PackingFactor,PF）：指在在装柱过程中，用低流速（如60cm/h）对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度（柱高）的比值，GEHC生产的各种常见填料的PF参见《GEHCAxiChrom300-1000columnsUserManual28-9562-8

2、9EditionAA》；线性流速（linearflowrate）：单位时间液体流经的直线距离，常用cm/h表示；体积流速（volumeflowrate）：单位时间液体流经的空间容积，常用ml/min表示；-.可修编.--换算：2准备工作2.1检查层析柱的完整性，所带配件，是否水平（用水平仪矫正），是否清洁（如有污染应进行清洗）。2.2确定所用填料及其特性、浓度等以DEAESepharoseFastFlow填料为例，其填料因子（PF）为1.15，新填料（slurry）浓度为75%（保存于20%乙醇

3、中），耐压3bar。2.3确定放大后的工艺参数以XX生化制药股份的放大工艺为例，中试工艺参数：柱高h=10cm；体积流速v1=3ml/min；柱径d=1.6cm.即，线性流速v2=v1/s柱=3/(3.14×0.82)cm/min=1.5cm/min；样品与填料接触时间t=h/v2=10/1.5min=6.67min；在工艺的线性放大中h、v2和t均不变，则可保证样品出峰的位置（洗脱时间）和形状不变。使用BPG300层析柱进行放大的工艺参数：装柱体积V柱=S柱h=3.14×1.52×1L=7L；

4、装柱需要slurry体积Vslurry=V柱×PF/Cslurry以DEAESepharoseFastFlow为填料，则，Vslurry=7×1.15/0.75L=10.73L；装入柱中的slurry高度Lslurry=Vslurry/S柱=10.73/(3.14×1.52)dm=1.52dm=15.2cm.3管路安装3.1层析柱管道和配件安装3.1.1卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈，旋松密封调节器，用纯水或20%乙醇充分浸润柱壁和柱头O型圈；3.1.2-.可修编.--用扳手对称卸下支持杆连接到法

5、兰的螺丝，并通过旋转高度调节手柄将柱头旋至最高处，在柱头顶部依次安装压力表和四路二通阀，在柱底安装四路二通阀；3.1.3在顶部四路二通阀上横向连接一根细管，另一端连至ÄKTAprocess上端连接口COLUMNTOP，同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至ÄKTAprocess的下端连接口COLUMNBOTTOM。图1、BPG300层析柱安装示意图3.2层析柱下端筛网排气泡3.2.1连接两根足够长的细管到ÄKTAprocess进样泵的A1和B1进口，两管另一端均放入纯水中；3.2.2从A1泵入纯

6、水：打开UNICORN软件，在systemcontrol窗口点击-.可修编.--manual→valves→InletA，选择inletA1，insert；InletB，选择closed，insert；Column，选择upflow，insert；Pump→Flow，设定流速60L/h，点击execute运行程序充水至BPG柱中2-3cm左右，pause，清除下端筛网中的空气，用注射器吸出筛网中残留的气泡。4装填料4.1准备填料所用填料为DEAESepharoseFastFlow，装置的是保存于

7、20%乙醇中的新slurry；4.2卸下柱头，用搅拌棍引流加入混匀的slurry至15.2cm处，再加入纯水至40cm左右，充分搅拌混匀，同时避免挤压筛网和柱壁，静置使填料界面至少低于38cm；4.3在systemcontrol窗口点击manual→valves→InletA，选择inletA1，insert；InletB，选择closed，insert；Column，选择downflow，insert；Pump→Flow，设定流速60L/h，点击execute运行程序将柱头上端筛网充满水以除去

8、气泡，再装上柱头，用密封调节器固定柱头，拧紧螺丝；4.4在systemcontrol窗口点击manual→Pump→Flow，设定流速为42L/h（60cm/h），进行填料的沉降，待填料高度降至14cm左右，将密封调节器旋至全松，将柱头快速调至距离填料3-4cm处，将密封调节器旋至半松，将柱头快速调至滤网距离填料1-2cm，旋紧密封调节器，再设定高流速（如150L/h），继续压缩填料，最后再调节柱头至10cm。整个过程一直有流速，泵速不能停。5柱效测定-.可修编.--图2、柱效测定示意图5.1平