乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明

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1、------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxx乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明【精品文档】LDH法细胞毒性检测：　　原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率LDH（乳酸脱氢酶）是一

2、种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细

3、胞培养液中LDH的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的LDH活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。该实验方法操作简便、快速，可应用于CTL和NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有LDH法测定CTL活性的试剂盒。同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶【精品文档】【精品文档】操作

4、流程：设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×）设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×）设立背景对照组：100μl培养基250g离心4分钟37℃孵育4小时离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组250g离心4分钟取上清50μl转移至另

5、一孔板（可选）于独立的孔中加50μlLDH阳性对照（1：5000）于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物室温避光孵育30分钟添加50μl终止溶液490nm测吸收值1.靶细胞接种数目的优化1.1.设立检测板【精品文档】【精品文档】1.1.1.准备靶细胞：调整细胞浓度0,5,000,10,000,20,000/100μl，使用与细胞毒分析相同的培养基及孔板终体积。例如，若以50μl/孔的靶细胞及50μl/孔的效应细胞接种，则以100μl/孔梯度稀释。1.1.2.设置不含细胞的背景对照组1.1.3.可选:验证LD

6、H阳性对照。使用涡旋混匀器轻轻混匀LDH阳性对照液，以1：5000稀释（稀释方法：取2μl原液至10ml的PBS+1%BSA）。使用与实验孔相同的体积。1.2.细胞裂解及收获上清1.2.1.裂解细胞每100μl培养基加10μl裂解溶液（10×）1.2.2.37℃，5%CO2孵育45分钟.250g离心4分钟1.3.LDH检测.转移50μl上清至另一孔板.解冻检测缓冲液，取12ml（避光），将剩余的迅速冻存（可以使用37℃水浴解冻，但不可放置过长时间）。将12ml检测缓冲液添加到一瓶底物混合液（可用于两个96孔板

7、）中，倒置混匀。稀释后，避光、迅速添加。.50μl/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30分钟（未使用的稀释后底物混合物液放于-20℃保存6-8周）.添加50μl终止溶液.将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值（490或492nm）.至少检测两次吸收值接种靶细胞（100μl/孔）至96孔板【精品文档】【精品文档】加入裂解液（或冻存-解冻）250g离心4分钟取上清50μl转移至另一孔板用检测缓冲液稀释底物混合物添加底物混合物50μl/孔室温避光孵育30分钟添加50μl终止溶液490nm测吸收值2.1.设立检

8、测板.1.效应细胞自发释放组设立不同浓度的效应细胞自发释放组，终体积与实验孔一致.2.实验组加入相同数目的靶细胞，按照不同效靶比加入效应细胞，补足培养基（最小体积：100μl/孔）。.3.靶细胞自发释放组加入最优化的靶细胞数，补足终体积.4.靶细胞最大释放组加入最优化的靶细胞数，补足终体积。.5.体积校正对照组100μl培养基中加入10μl的裂解液，用于校正由于加入裂解液而引起的体积变化（体积改变影