资源描述：
《安徽部分地区猪附红细胞体病的分子流行病学调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
：妒）顯，＇＇＇■４■－－？？．：：．：＾；／，：＇＇＇＇＊？？＇＊？■－＾？４ｌ４ｔ：：－Ｚ；ｙＳｉｆｌｋｐｌ４．＼、１＾＇丨参帽－＞ｖ…；：，，；：，Ｖ，＾ｉ．＇；：．；络：％，：＇，ｓ：－＾ｖ：－：＾：－■．－．－－．：ｙ．＼ｖｔ：：ｖｖ；＾＾．．：：；＼ｙｖ＞＾＿雕：擊潘翁士学位论文’？＊’’＇－．？＊？ｆ，“，－、Ｖ＞＇：１ｔｌ／？．ｖｒ？．ｉ：ｒ＞、｛／？二．－，？？、：－？Ｋ＊－＞．：Ｖ＾ｖ＜，，＾；＾ｆ．；．．：｝／（／‘＾安徽部区猪附红细胞体病３＾＃流彳＿＾画：＇＇＾■７－－－．ｘ？ｎ！％ｉ；ｙ／＾．ｖ＾ｖ＾ｒ＇／－’１／、、．？？＇：＊ｊ．：＇、＇私，ｖ、－＞＾ｉ力ｖＶ广Ｋ金＿ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎｏｎＥｅｒｔｈｒｏｚｏｏｎｓｕｉｓｇｇｐｙ＇ａｔｏｍｅＡｒｅａｓｉｎＡｎｈＰｒｏｖｉｎｃｅ；？Ｓｕｉ＾／．ｉｔ－？ｖ＾、＾？－．＊Ｖ＼ｔ／．ｒ，．？ｒ＊＾？７＊ｉ．＇＜Ｎｆ，／、ｖＮＺｆ／切ｆｖ＇＇＇＇？－？－－－．：．：－■＾：：＾＆？＾＊ｖ＇，？ｈｖ■Ｊｒ－＞“？ｆ－１？＾＼ｉｔａ？＞ｒ？ｖ＾ｔｆ．．，，％．／＞＾．…二＾ｙ＞＊１＊、公－＾＾？＊．＊ｆ＾＊ｙ＊／ｙｆ＼、？ｆ．ｆ／，．ｒ：．Ｊｌｒｙ１＼ｙ＿＇心．名／：、．：姓＜刘喆＇士＃Ｗ之＇：４．＾Ｖ导师徐前明副教授＾＂＊Ｗ’＊＊＇＇Ｌ－？？？＊？■■＊－Ｖｊ＊＂，｜＾？？＼，；ＶＶ，Ｗ１＾＿，ｆＭＴ研究校房吟ｖ外导师陈木新副＼：ＨＵ择！Ｋ携■＇：领域名称：＿兽医—２．■．．：％：之％丨＇ｙ．＆％？．：．咖：Ｉ。：ｌ環灣麵德Ｗ：耗猶：ｌ纖＆’．：：：屬务ｉ＿，．．．：薄＞Ｉ辦ＷｌＳ：？：ｖｆ 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，。尽我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构一的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。■研究生签名：时间：＞年１￥月＞日＾关于论文使用授权的声明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权，、保留送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内容论文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。＃“”（请在以上□内划Ｖ）研宄生签名：时间：年Ｓ月＞日Ｌ／一＾：＞第导师签名：＿时间丨年｜月曰７ 中图分类号：Ｓ８５５Ｓ单位代码：１０３６４ＵＤＣ：密级：安徽农业大学专业硕士论文安徽部分地区猪附红细胞体病的分子流行病学调查ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｉｄｅｍｉｏｌｏｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎｏｎＥｐｅｒｔｈｒｏｚｏｏｎｓｕｉｓｐｇｇｙａｔＳｏｍｅＡｒｅａｓｉｎＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅ研究生（学号）？？刘喆（１５７２０３００）导师：徐前明申请学位：硕士所在学院：动物科拮学院专答业辩委（领域）：研究方向：寄生鸟■与奇．生座病学员会主席：￣灰．论文评阅人：２０１７年５月 致谢本研究论文是在我的导师徐前明副教授的悉心指导下完成的。感谢导师两年来对我在学习和生活等方面的关心与照顾。学习中，导师创新的科研思维和严谨的治学作风让我受益匪浅。生活中，平易近人的态度和幽默风趣的谈吐让我若沐春风。值此论文完成之际，向我的导师致以崇高的敬意和诚挚的感谢!在我为期两年的研究生学习和生活中，李培英老师、潘玲老师、李槿年教授、王桂军教授、孙裴副教授、刘雪兰副教授等动科院辛勤付出的老师们，你们的无私奉献才让我不断成长，在此我向她们表示深深的敬意和由衷的感谢。希望老师们身体健康!感谢我所在实验室的师兄、师姐与师弟师妹们，特别是刘文阁师兄、徐晓佩师姐、郑蕾师姐、宁红蕊师姐、方芬师姐、张钦师兄、何帅师兄、孙淼淼师姐对我的关心和帮助。还有师弟汪汕和张衡，师妹陆维和周成艳；室友陈鹏和苗伟在生活及学习上的关心和帮助，在此表示诚挚的谢意。祝愿他们在今后的学习、工作生活中一切顺利。感谢母校安徽农业大学创造良好的学习环境和浓郁的学术氛围，令我在这6年的求学生活中不断成长，锐意进取。最后特别感谢我的家人，是他们对我的理解和肯定，令我顺利完成了学业! 摘要附红细胞体病是由附红细胞体（Eperythrozoon）寄生于多种恒温动物的红细胞等处的一种人兽共患病。目前，对于附红细胞体的生物学分类仍有较大争议，传统的分类法将附红细胞体列为立克次氏体目、附红细胞体属，近年来，分子分类法结果表明，其更接近于支原体，可命名为嗜血支原体（Hemoplasma）。临床症状以高热，贫血，黄疸和繁殖性能下降等主要表现。猪附红细胞体可导致母猪繁殖能力下降，仔猪免疫力下降。附红细胞体是一种原核生物，其外形多数呈球形，但无细胞壁，仅有单层细胞膜，通常其粘附于红细胞表面，常见的为1-2个，多则可达6~7个，被寄生的红细胞其外形常呈星芒状等不规则状。显微镜观察是兽医临床诊断该病最为常用的措施，包含鲜血压片方法和涂片染色方法，因其受操作者的水平以及血液内外渗透压等因素影响，常易导致假阳性的问题。血清学诊断方法包括间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和补体结合试验（CFT）等。由于其抗体水平在菌血症时高，期间出现波动不定或无规律变化，这常给血清学检查造成假阴性的问题。鉴于上述情况，构建快速、特异、敏感的诊断方法是诊断和控制该病的最基本手段，也是十分必要的。本研究首先开展了猪附红细胞体病分子诊断方法的建立，根据Genbank上所报道16SrRNA基因序列（U88565），设计一对特异性引物，然后提取血液全基因组，采用常规PCR技术扩增目的基因，同时开展其特异性试验和敏感性试验。自2016年1月-2016年12月期间，共收集合肥市，芜湖市，阜阳市，黄山市等地区155份血样，运用已建立的PCR诊断方法分子流行病学调查，同时以血涂片作镜检对照，印证符合率，对所得数据进行了统计分析，包括季节，饲养方式等。结果表明：（1）所建立的PCR诊断能够特异性的扩增出目的基因，其大小为703bp，16SrRNA基因序列遗传进化分析可发现：猪附红细胞体与支原体的亲缘关系较近，而与血巴尔通氏体的亲缘关系较远。在特异性方面，该方法不能对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、犬巴贝斯虫、链球菌、巴氏杆菌、弓形虫和羊泰勒虫进行扩增，其特异性较高；在敏感性方面，其检测量最低为0.25µg。（2）运用上述方法对安徽部分地区猪附红细胞体感染情况进行了调查。流行病学调查显示：在155份血样中，姬姆萨染色法检出率仅为40.64%，而PCR检出阳性率高达69.68%，其检出率明显高于姬姆萨染色法。统计分析显示，春夏季节的阳性率偏高，可达73.91%；而秋冬季节的阳性率偏低，检出率是66.28%，同时也发现1-3月的仔猪阳性检出率最高，显示仔猪对该病易感。由此可见，安徽部分地区的猪附红细胞体感染的情况仍比较严重，尤其春夏季节的昆虫媒介传播的I 影响该病的感染仍呈较高趋势。养殖场的管理者应加强对该病的认识，提高饲养管理意识和预防手段，以便更好地控制该病。关键词：猪附红细胞体；PCR诊断方法；分子流行病学调查II AbstractEperythrozoonosisisoneofzoonosiswhichiscausedbyattachingtotheredbloodcellsofmultiplewarm-bloodedanimalswithEperythrozoon.Itstillhasgreatcontroversyonitsbiologicalclassification，intraditionallybiologicalclassificationitwassortedasrickettsia,eperythrozoon.Inrecentyears,molecularclassificationresultsshowthatitisclosertomycoplasma,andnameditashemotropicmycoplasma(Hemoplasma).Themainclinicalsignsinvolveinhighfever,anemia,jaundice,anddecreasingofreproductiveperformance.ToEperythrozoon.suiscancausethedecliningofthesow'sreproductiveabilityanddecreasingoftheimmunityofthepiglet.Eperythrozoonisakindofprokaryote,usuallyitsshapeisspherical,butnocellwall,onlyhassinglecellmembrane,generallythereis1-2onsurfaceofredbloodcells,moreupto6-7,whichcanleadtodeformationoftheparasitedredbloodcellswithstarorirregularshape.Amongthesediagnosemeasures,themicroscopeexaminationisthemostcommonlyusedincludingfreshbloodpressureandsmearstainingmethod,butitistakeneffectbytheoperatorabilityandbloodosmoticpressureinsideandoutside,soitofteneasilytobecausedfalsepositive.ThemethodsofserologicaldiagnosisinvolveinIndirecthemagglutinationassay(IHA),Ensyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)andcomplementfixationtest(CFT),becausethechangeofantibodylevelsisnoregularityornosteadinessduringtheheightofbacillemia,iteasilycausefalsenegativebyserologicalexamination.Giventhesecircumstances,itisnecessarytoestablisharapid,specific,sensitivedetectionmethodtodiagnoseandcontrolthedisease.ThisstudyfirstconductedtheestablishmentofmoleculardetectionforE.suisAccordingtotheeported16SrRNAgenesequencefromGenbank(U88565),thespecificprimerswasdesigned,thenthebloodgenomicDNAwasextracted,theconventionalPCRamplificationwasappliedtodeterminedit,meanwhileitsspecificitytestsandsensitivitytestalsowasmade.DuringfromJanuary2016toDecember2016,all155bloodsampleswerecollectedfromHefeicity,Wuhucity,Fuyangcity,Huangshancity,thentheyweredetectedbytheestablishedPCRmethodtotakeepidemiologyinvestigation,andthebloodsmearstainalsowastakentoconfirmcoincidencerate.Theobtaineddatawasanalyzedincludingseason,feeding,etc.III Theresultsshowedthat:(1)theestablishedPCRspecificallycouldamplifytheaimgene,itssizewas703bp.Thesequencehomologydisplayedthatithighlywassimaritytothereportedmycoplasma(FN436012.1),thehomologywas94.9%.Itsspecificitywasideal,itcan'tamplifyBabesiabovis,Babesiabigemina,Babesiacanis,Streptococcus,Pasteurella,ToxoplasmagondiiandTheileriaovis.Additionally,itssensitivityalsowasbetter,theminimumamountofDNAfordetectionwas0.25µg.(2)Epidemiologicalinvestigationshowedthatthedetectionrateof155samplesfromAnhuiprovincewas69.68%,butthedetectionratewasonly40.64%byGiemsaStaining,itsdetectionratewashigherthanthatofGiemsaStaining.Statisticsanalysisshowedthatthepositiveratewas73.91%inspringandsummerseason,butitwaslowerintheautumnandwinter,thepositiverateonlyis66.28%;Inmonthage,thepositivedetectionrateofthepigletswasthehighestin1-3months,itindicatedthatthepigletwasmoresusceptibletothedisease.Inaconclusion,itstillwasmoreseriousatsomepigfarmersinAnhui,especiallyinthespringandthesummer,itmaybecouldbetransformedbyinsect.Thesuggestionwasgiventhatitshouldarisetotheawarenessofthediseaseandimprovetheadministrationmeasurestopreventandcontrolit.Keyword:E.suis;PCRdiagnosticmethod;MolecularEpidemiologicalinvestigationIV 目录摘要..............................................................................................................IAbstract......................................................................................................III目录.............................................................................................................V插图和附表清单......................................................................................VII中英文符号表.........................................................................................VIII文献综述......................................................................................................1引言..............................................................................................................81材料方法.....................................................................................................................91.1材料..........................................................................................................................91.1.1样品来源........................................................................................................91.1.2质粒和菌株....................................................................................................91.1.3主要试剂与仪器............................................................................................91.1.4主要溶液的配置..........................................................................................101.2方法.......................................................................................................................111.2.1形态学观察........................................................................................................111.2.1.1鲜血压片观察..........................................................................................111.2.1.2姬姆萨染色检查......................................................................................111.2.2E.suis16SrRNAPCR诊断方法的建立...........................................................111.2.2.1猪附红细胞体模板的提取......................................................................111.2.2.2猪附红细胞体的16SrRNA的引物设计...............................................121.2.2.3扩增体系及反应条件...............................................................................121.2.2.4扩增产物的纯化与回收..........................................................................131.2.2.5PCR产物的克隆......................................................................................131.2.2.6重组质粒的pMD18T-E.suis16SrRNAPCR鉴定................................141.2.2.7序列同源性和遗传性分析......................................................................151.2.2.8重组质粒pMD18T-E.suis16SrRNA的提取.......................................151.2.2.9所建立的E.suisPCR方法特异性试验.................................................151.2.2.10所建立的E.suisPCR方法敏感性试验................................................151.2.3安徽部分地区猪附红细胞体的分子流行病学调查.........................................152结果...........................................................................................................................162.1附红细胞体形态学检查结果................................................................................162.1.1鲜血压片观察结果.....................................................................................16V 2.1.2吉姆萨染色观察结果.................................................................................162.2E.suis16SrRNA基因PCR诊断方法的建立.....................................................172.2.1PCR扩增E.suis16SrRNA基因结果.......................................................172.2.2PCR鉴定重组质粒pMD18T-E.suis16SrRNA结果...............................172.2.3E.suis16SrRNA基因PCR产物测序结果...............................................182.2.4序列同源性比较和遗传进化分析.............................................................182.2.5特异性试验结果..........................................................................................202.2.6敏感性试验结果.........................................................................................202.3安徽部分地区E.suis的分子流行病学调查结果...............................................212.3.1PCR检测待检血样的E.suis......................................................................212.3.2不同规模猪场E.suis调查结果................................................................222.3.3两种方法对E.Suis的检出情况................................................................232.3.4不同地区E.suis检出情况.........................................................................232.3.5不同季节猪场E.suis检出率.....................................................................242.3.6不同来源仔猪检出阳性率.........................................................................242.3.7不同日龄猪只检出阳性率.........................................................................253.讨论...........................................................................................................................263.1猪附红细胞体诊断方法.......................................................................................263.2猪附红细胞体病流行病学...................................................................................273.3猪附红细胞体病的防治.......................................................................................274.结论...........................................................................................................................29参考文献....................................................................................................30附录............................................................................................................35VI 插图和附表清单表1采样猪场的背景资料....................................................................................9表2主要试剂........................................................................................................9表3主要仪器与设备..........................................................................................10表4PCR扩增体系...........................................................................................12表5PCR反应条件..........................................................................................12表6菌液PCR扩增体系....................................................................................14图1血液压片检查（400×）..............................................................................16图2血液压片检查（1000×）............................................................................16图3姬姆萨染色血涂片（1000×）....................................................................16图4姬姆萨染色血涂片（1000×）....................................................................16图5猪附红细胞体PCR扩增结果....................................................................17图6重组质粒PCR鉴定结果............................................................................17图7所得基因的同源性分析..............................................................................19图8对所得基因作遗传进化分析结果..............................................................19图9PCR反应的特异性试验...........................................................................20图10PCR反应的敏感性试验.........................................................................21图11不同规模猪场猪场检出阳性率................................................................21图12不同规模猪场猪场E.suis的阳性检出率...............................................22图13不同方法对E.suis检出情况比较............................................................22图14部分样本DNA的PCR结果....................................................................23图15不同地区E.suis检出情况........................................................................23图16不同季节检出情况....................................................................................24图17不同来源仔猪检出阳性率........................................................................24图18猪只不同日龄检出阳性率........................................................................25表7不同规模猪场E.suis调查结果...............................................................35表8两种方法检出E.suis的阳性率...............................................................35表9不同地区检出E.suis的统计表...............................................................35表10不同季节检出E.suis的统计表................................................................35表11仔猪不同来源检出E.suis的统计表........................................................36表12不同日龄检出E.suis的统计表................................................................36VII 中英文符号表缩略词/符号英文名称中文名称LBLyriabrothLB培养基pHPotentialofHydrogen酸碱值mlmilliliter毫升minminute分钟hhour小时dday天rpmrotateperminute转/分钟ssecond秒℃Centigrade摄氏度PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应DNAdeoxyribonuleotideacid脱氧核糖核酸PBSphosphate-bufferedsodium磷酸盐缓冲液TAEtris-aceticacid-EDTAbufferTris-乙酸-EDTA电泳缓冲E.suisEperythrozoonsuis猪附红细胞体VIII 文献综述1.附红细胞体病的起源和发现附红细胞体病（Eperythrozoonosis）是由嗜血寄生物—附红细胞体（Eperythrozoon，EP）寄生于红细胞表面或游离于血浆、组织液或脑脊液中引起的人兽共患传染性疾病，以发热、溶血性贫血和黄疸为主要表现[1]。1928年报道由Schilling首次在啮齿动物的血液中发现了球状附红细胞体（E.coccoides），同年报道Dinger也在其中发现了附红细胞体[2]。1934年Neite[1，4]等发现在绵羊的红细胞周边有多种形状的微生物，并命名为绵羊附红细胞体，同年Adie等在牛体内发现了相似的球状微生物，命名为温氏血虫体，与此同时Kinsely等根据临床症状和调查曾报道的猪类鞭虫科微生物极可能就是附红细胞体。[1,4,5]。1938年Tyzzes等初次报道在啮齿动物间能够传播嗜血寄生物，并在1942年开展了Granamnele，Haeroµbtonella和Eperythrogoa等3种病原在小型啮齿动物体内的感染情况进行了调查研究[6]。1950年，Splitter证明了猪附红细胞体能导致发病猪出现黄疸性贫血，并将其命名为猪附红细胞体[7]。随后在全球多个国家和地区相继报道了多种动物和人类的血液中有附红细胞体存在。在国内上个世纪80年代末对附红细胞体的报道逐渐增多，晋希民在1981年通过显微镜检初次确认附红细胞体寄生在家兔红血球上，初步认为该病原体主要感染1-2月龄的幼兔，而成年兔多呈带虫免疫状态，哺乳幼兔因母源抗体存在降低了其致病性[8]。张汝勇等（1981）通过对马属动物以及牛、羊、兔、鸡、鼠和人的血液进行血涂片染色检查和诊断性治疗，确定附红细胞体在上述动物的体内感染[9]；崔君兆等也在1982年期间发现在人体、老鼠、库蚊血液内有一种基本形态特征类似于附红细胞体的微生物和小游生物[10]，华修国1991年7月在上海地区通过症状和电镜观察首次发现犬附红细胞体病并确诊[11]；此后的研究也不断证实了人类感染附红细胞体的情况发生[12-15]。1986年Puntaric对人附红细胞体病进行系统地描述。自80年代起，国内外对人畜感染附红细胞体感染情况的调查越来越多[16]。猪附红细胞体病最早于1932年由Doyle在印度猪只体内发现的，他首次报道了本病为猪立克次氏体病或类微粒抱子虫病[17]。Splitter和Williamson于1950年也从猪体内发现附红细胞体(E.wenyoniE.Ovis，并将其命名为猪附红细胞体[7]。我国在80年代在开始在东部沿海地区报道了猪附红细胞体，许耀成等（1980）在江苏射阳地区发现猪的红皮病，该病在全县传播较广，发病率在7%，平均死亡率为1%，根据病原体体形态及流行病学特征初步认定为猪附红细胞体病[18]；随后，栾景辉等于1983年在河北灵寿县高热病猪中发现猪的附红小体，1 其对仔猪的致死率为100%，对母猪致死率为36%，怀疑蚊蝇为主要的传播媒介[19]；罗杏芳等于1981-1983年先后在广州、顺德和台山等地通过临床症状、病理剖检和组织观察、扫描电镜观察等方法，在41头病猪血液中发现了附红细胞体[2]；赵汝敏等1989年在河北乐亭县通过症状和染色镜检在三头母猪及其所生24头刚出生仔猪体内均能检出附红细胞体，认为母猪为主要带虫者，怀疑其可通过胎盘或乳汁垂直传播给仔猪[20]；华修国等1991年在上海地区首次在奶牛、仔猪和犬血液中发现该病原体，并对附红细胞体病原体、流行病学、临床症状、病理、诊断和预防进行了系统阐述[21]；李锦春等2004年在安徽地区部分地市做以染色镜检为手段流行病学调查[22]，以后不断有附红细胞体病感染的报道。迄今为止，附红细胞体被报道在我国大多数省市有感染的情况发生，且十分广泛。2.附红细胞体的病原学研究对于附红细胞体的分类存在争议。根据国际上认同1984年的《伯杰细菌鉴定手册》将附红细胞体归于立克次氏体目（Rickettsiaies）、无定形体科（Anaplasmataceae）、附红细胞体属（Eperythrozoon）[21]。但Messick等（1999，2002）[23]，Rikihisa.Y等（2001）[24]根据16SrRNA基因的序列进行系统发育分析认为附红细胞体在分类上应该更接近于支原体属（Mycoplasma），又因为其寄生于血液的特性可称其为嗜血性支原体（Hemoplasma）。所以猪附红细胞体依据特性和分类可称为为猪嗜血性支原体（MycoplasmaHaemosµis）。附红细胞体是一种典型的原核生物，外形有球形、半月状、星形[12]，直径为0.2-2.6µm，无细胞壁，常呈圆盘状，外面有单层细胞膜包裹，内部有拟核，无明显细胞器。附红细胞体粘附在红细胞表面，常为1-2个，也有多达6-7个的情况发生，被粘附的红细胞变形为菠萝状，星芒状和不规则的椭圆状[15]。房春林等人运用透射电镜和扫描电镜观察到未成熟附红细胞体直径小于成熟附红细胞体，一般为0.2-1.0µm。同时可见红细胞上的附红细胞体通过纤丝与另一相邻近红细胞相连接，进而怀疑附红细胞体的繁殖方式应该是无性繁殖且与原虫的出芽生殖类似。猪附红细胞体呈球形或卵圆形，粘附于红细胞表面，大小在0.2-1.5µm之间，单个红细胞所附着的多可达5-6个，可以导致红细胞变形，观察为锯齿状或星芒状，边缘有突起，红细胞发生扭曲[26]。3.流行病学研究附红细胞体在我绝大多数省份均有发生且分布广泛。附红细胞体对宿主的选择并不严格，所以附红细胞体的宿主众多，因其寄生宿主的不同而命名，如牛温氏附红细胞体（E.wenyonii），牛附红细胞体（E.teganodes），绵羊附红细胞体（E.ovis），山羊附红细胞体（E.lirci），犬附红细胞体（E.cains），兔附红细胞体（E.lepus），猪附红细胞体（E.suis），猪小附红细胞体（E.parvum）和2 人附红细胞体（E.hµmanus）。对于附红细胞体是否有宿主特异性，文献报道持有不同的观点，多数报道认为附红细胞体具有宿主的特异性。但是对人附红细胞体调查数据显示，与动物紧密接触的人群感染率高于非密切接触人群[27]。对于猪附红细胞体是否具有明显的种间特异性仍存在争议。通过血清学方法对家猪和野猪检测时，结果野猪都为阴性，而家猪是感染猪附红细胞体的[28,29]。在美国肯塔基发现被E.suis感染的羊驼表现为精神不佳，消瘦、嗜睡喜卧、被毛粗乱、贫血，但没有出现黄疸，机体随着寄生虫血症出现而表现出低血糖症，这一发现表明E.suis还可以寄生于其他动物[30]。附红细胞体病的传播途径目前主要有三种可能，垂直传播，血源传播和昆虫媒介传播。（1）垂直传播母体曾经感染了附红细胞体，变成了带虫宿主，然后在其妊娠和分娩期间将病原体传播给胎儿。刘兴发等报道表明卵生动物中鸡的附红细胞体不能垂直传播，而胎生动物中的奶牛和猪可以通过胎盘经垂直传播。而人的母体在垂直传播附红细胞体时，母代到子代，感染程度由重到轻[15]。王永等通过对附红细胞体感染途径的研究，发现垂直传播确实可以，但是感染率降低，作者认为垂直传播既是途径之一，同时胎盘又有一定的屏障作用[31]。（2）血源传播附红细胞体通过共用器具如去势时的手术刀、注射疫苗时的针头、人工授精的胶管等方式感染其他动物，此外，其还可以通过呼吸道、消化道、皮下注射等摄入病原体进而感染[31,32]。（3）昆虫媒介传播国内外学者均报道了附红细胞体病的发生均有明显的季节性，也有人认为该病一年四季均可发生，但不可否认吸血节肢动物是该病的主要传播媒介，这是目前公认的主要的传播方式之一。本病多发生在夏秋季节和雨水较多的季节，此时正值蚊蝇活动繁殖的高峰期[33]。英国兽医工作者报道虱和疥螨可传播该病，PrullageJB等认为蚊蝇确实是传播附红细胞体的重要媒介[34]。Braverman等认为猪附红细胞体也可通过蚊虫的叮咬方式来进行传播的[35]。然而附红细胞体的生活史至今没有公认的报道，但是越来越多的资料指明吸血昆虫是传播该病的的媒介[36]。本病多数时候为在动物体内呈隐性感染，但温度变化、更换饲料、脾脏切除等应激条件均可致使宿主免疫下降，进而引起感染的动物呈急性发作而表现出明显的症状[37]。3 4.致病性附红细胞体寄生在红细胞膜上、血浆、骨髓中。电镜观察显示在感染早期的未成熟附红细胞可导致宿主被附着的红细胞膜增厚，但并未造成机械性的损伤；一旦未成熟附红细胞体在细胞膜上成熟后致使红细胞膜凹陷或凸起，损伤细胞膜，这样增加了细胞膜的通透性和脆性，使红细胞易于溶解和破裂，进而发生贫血的症状。当体内爆发虫血症时导致红细胞大量的破裂，发生溶血性贫血[38]。柴方红指出猪附红细胞体病对仔猪的红细胞C3b受体抑制作用，其免疫相关的细胞转化率都下降，故认为猪附红细胞体对仔猪的免疫水平有明显的抑制作用[39]。冯立明的报道指出附红细胞体可在红细胞膜表面粘附并使之破洞、破裂，并造成全身性的功能障碍[40]。红细胞被附红细胞体粘附后，其细胞膜的弹性消失，脆性增加，红细胞膜被破坏而溶血[41]。Heinritzi等认为红细胞被附红细胞体附着后导致细胞膜的抗原蛋白发生改变，膜上的抗原被裸露，进而被自身的免疫系统清除，导致溶血性贫血[42]。观察到这些附红细胞体寄生时需要消耗葡萄糖，感染强度增大时，其在红细胞上呈堆积状态，这样需要更多的葡萄糖满足和维持其代谢活动，附红细胞体感染程度越重则病畜自身的血糖浓度越低，感染强度与血糖浓度呈反比，在这种代偿机制下常表现出低血糖症[7,43]。Messick表示猪附红细胞体可导致母猪的效率低下和仔猪免疫力下降[44]。附红细胞体对宿主免疫功能的抑制，诱导其他疾病的继发感染，若治疗不及时或病程延长，病情会加重，甚至可导致死亡。附红细胞体临床感染多为混合感染，单一感染少见，通常与其他细菌或病毒的混合感染，如大肠杆菌和传染性胃肠炎等，临床表现呈多样性，不易于对该病进行防控[45]。5.附红细胞体的临床症状猪附红细胞体以急性黄疸性贫血，高热、精神沉郁和繁殖能力下降为特征。其特点是体温升高、贫血、黄疸、红细胞、红细胞压积、血红蛋白、淋巴细胞均低于正常值。不同的动物感染症状不尽相同，犬感染附红细胞体表现体温升高，呼吸、心率加快，红细胞数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、血红蛋白降低，白细胞数上升，贫血，精神沉郁[46]。侯顺利表明家兔有共济失调等神经症状[47]。牛感染温氏附红细胞体大多呈隐性感染不表现临床症状。但是出现类似布氏杆菌感染状况，公牛阴囊肿大、温度升高，尿色偏黄且影响其繁殖功能[48]。人感染附红细胞体一般有发热、贫血，四肢乏力，肝脾肿大，淋巴结肿大还可出现关节痛、肌痛，咳嗽、腹泻、心悸等[49]。仔猪多发生急性病例，常见是断奶后仔猪，表现为体温高达42℃以上，耳廓边缘发绀或发紫，食欲不振，治愈后易变僵猪。成年猪多呈慢性感染，稽留热，体表呈现大片紫红色斑，食欲下降或废绝，或有血尿、气喘。母猪表现为厌食，黏膜苍白或黄染，繁殖障碍为流产、死胎或屡配4 不产，产奶量少。一般在进产房后3天左右发病，泌乳不良进而导致新生仔猪的生长受影响[50]。6.猪附红细胞体的病理变化在发热期间采集E.suis感染的猪的外周血时血液稀薄，血液颜色正常；血红蛋白含量降低，血糖浓度下降和胆红素uDP-葡萄糖醛羧基转移酶含量短时间内上升。感染该病的猪发热，表现出贫血症状，同时伴随着PCV、HB和RBC显著降低。感染猪白细胞数量增加，且单纯携带E.suis的猪红细胞数量增加更为明显[51]。急性死亡猪表现为高热，，血液凝固障碍；黏膜苍白或黄染；皮下水肿、脂肪黄染，淋巴结肿胀，心包积液，心脏冠状脂肪黄染或液化；脾显著肿大，肝质地软；肠道溃疡有出血点。慢性死亡猪多存在混合感染，所以情况复杂，报道指出肌肉组织中散布有出血点，心内外膜有出血点或出血斑，肾脏表面有色素沉着或出血点；肝脏肿大，呈土黄色，有白色病灶；肺脏部分为苍白色、间质增宽、有水肿，个别病例在肺尖叶部有实变[52]。7.猪附红细胞体的诊断方法已建立的诊断方法包括形态学诊断，血清学诊断和分子生物学诊断方法。形态学观察目前，常用是显微镜检查法（鲜血压片法、染色镜检法）。鲜血压片：静脉采血1滴于载玻片上，加等量生理盐水稀释，在400倍或1000倍下镜检，在红细胞表面看到有圆形的小体附着，且在1000倍下红细胞红细胞翻滚时小体可以并不脱落且会导致红细胞的形状发生变化，呈星芒状、放射状等（康世良，2003）[53]。姬姆萨染色：采静脉血液后，滴一滴血液与载玻片一端推片，自然干燥，甲醇固定，染液浸染40min，用蒸馏水轻冲洗，干燥后镜检。若见到红细胞表面附着有紫褐球状小体且红细胞形态变形为星芒状等，可怀疑是阳性。吖啶橙染色：玻片甲醇固定，加适量吖啶橙染色，在荧光显微镜下观察，在红细胞边缘出现淡绿色荧光小体为阳性[54]。血清学诊断在血清学诊断方面已建立了间接血凝试验（IHA）、补体结合试验（CF）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法。在间接血凝试验检测方面，Smith等用纯化的抗原和从免疫E.suis猪体内收集的IgM和IgG进行HIA试验，结果显示接种猪血清效价达1:40以上，可以确定阴阳性，从而确定了检测血清抗体在猪群检测中的意义[55]。补体结合试验：Splitter（1958）首先应用补体结合试验诊断猪附红细胞体病，结果表明发病三天内可测得血清抗体呈阳性，随后15天血清中抗体滴度下降逐5 渐转为阴性，但该方法的敏感性有待进一步提升[56]。Hsu等（1992）对ELISA方法与IHA方法检测猪附红细胞体敏感性方面作了对比试验，结果表明上述两种方法检出率存在差异极显著，且ELISA检测方法明显地敏感性高于IHA[57]。秦建华（2004）建立的羊附红细胞体病ELISA检测方法，对羊附红细胞体的最小检出量为50µg/ml[58]。血清学方法适宜大量的样本检测，但是该种方法与样本数量增多的关联性不强，仅与个体的抗体水平有关，个体的抗体水平有差异性，对血清学方法使用是有限制性的（Heinritzi，1990）[59]，同时个体内的抗体滴度在虫血症期间维持较高水平，其余时间的滴度较低。慢性感染的病例更不能维持高水平，所以在潜伏期对该病不能很好地作出判断，是因为假阴性问题是常见的。分子生物学诊断分子生物学诊在断兽医临床诊断上的应用越来越多，该方法也被运用于诊断猪附红细胞体病。OberstR.D等（1990）首先建立了DNA探针杂交技术，他们从疑似感染E.suis动物的血液中提取DNA，以32P标记的探针，可以区别猪是否被E.suis感染[60]，且它可以用于各种样品的检测。Messick等（1999）首次利用E.suis的16SrRNA基因保守区及其上的多变区设计通用引物，同时再设计一对特异性引物，类似套氏的方法进行扩增从而证实了其准确性[61]。张浩吉等（2007）以猪附红细胞体和多种血营养菌16SrRNA基因的保守区设计合成引物HM-f/HM-r。在反向引物的5′端用生物素标记。以猪附红细胞体广东株16SrRNA基因的多变区序列设计种特异性寡核苷酸探针，探针的5′端用地高辛标记，成功地建立了猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法。集合了PCR、核酸杂交技术、酶免疫三种优点，其敏感性比常规的PCR方法提高了近100倍。且它与猪的多种细菌病和温氏附红细胞体没有交叉反应，可对待检样品进行定量检测[62]。8.猪附红细胞体的预防和治疗目前，对传播途径的没有明确的肯定，可从接触、媒介、垂直、血源等方面加以控制，做好饲养管理。加强水源、饲料，畜舍的消毒工作。用拟菊酯类药物（如溴氰菊酯）对畜舍周围的灌木，污水源等昆虫媒介生活繁殖的地方进行消毒，消除蜱虫，蚊蝇等传播的可能；畜舍用0.3%-0.5%的过氧乙酸消毒液进行消毒；保持共用器具不会间接传播病原体（手术刀、注射针头等），用高热蒸气灭菌、长时间煮沸或75%乙醇浸泡[22,63]。做好猪附红细胞体病的预防就是个企业创造利益和价值。具体方法：对种猪实行定期监控，对外来的引进仔猪要保证全进全出，6 并对其产地检疫进行调查。定期驱虫，并可预防性在饲料里加入土霉素进行控制[64]。向阳等报道在猪附红细胞体病流行地区，饲料中添加200-800mg/kg土霉素，连喂15-30天，能够很好地预防该病的发生[65]。目前用于治疗附红细胞体的药物主要有四环素、砷制剂和贝尼尔等多种，其中贝尼尔和长效土霉素的效果较好，且土霉素同时可以抑菌和驱虫配合贝尼尔可很好地防控本病。治疗该病的种类虽然很多，但尚未有特效药能将虫体完全清除,附红细胞体可以在骨髓增殖，所以药物只能指标不能治本。其原因有药物本身对附红细胞体只有抑制作用，且一般药物易出现耐药性，很大的原因在于没有发现药物靶点对治疗该病有特别的效果，对一些长期隐性感染的病畜建议淘汰处理[22,61]。7 引言猪附红细胞体病（E.suis）最初由Doyle发现的，鉴于当时条件，认为其是一种立克次氏体病或微粒孢子虫病。我国于上个世纪80年代左右在部分地区开始出现该病的报道。猪附红细胞体病其特点是体温升高、溶血性贫血、黄疸为主要特征同时红细胞、红细胞压积、血红蛋白、淋巴细胞均低于正常值。在安徽地区从2000年开始陆续对本地区的附红细胞体有报道，2001年李治悦对阜阳市人畜被感染附红细胞体的情况进行了报道，其中牛、猪的感染率高于其他动物，分别为95%和50%[66]。2007年李锦春对安徽地区E.suis作了较为详细的报道，认为在安徽部分区域猪附红细胞体的感染率高达90%，主要通过鲜血压片镜检、涂片镜检可观察到附红体进行流行病学调查[22]。2014年曹华对山西长治地区E.suis进行了流行病学调查，发现该地区猪感染率高达80%，最低的感染率也有68%，且在夏秋季节较高，均可达70%以上。通过建立了PCR诊断方法及应用，有效的避免了假阳性的发生，提高了诊断的特异性和敏感性，且认为该病感染主要以隐性感染为主，散养户较规模户感染率高[67]。该病不仅危害动物的生产，同时也威胁人类的生命安全。急性的病例可表现明显的临床症状甚至死亡；慢性的病例繁殖能力下降，生长发育缓慢。该病常给养猪业带来了较为严重的经济损失。同时该病存在极高的隐性感染率，隐性感染的人、畜免疫力下降，易发生细菌和病毒的继发感染和混合感染，难于控制[68]。调查中发现在很多小型猪场的生产管理中存在诸多问题，包括意识淡薄，手段缺乏等，同时，目前仍缺乏快速且准确的诊断方法。鉴于上述情况，建立快速，高效的诊断方法是控制该病的必备条件。本研究开展了猪附红细胞体PCR诊断方法，这为本地区防控该病提供最基本手段。于2016年期间对疑似感染病例进行了血样的采集，针对其16SrRNA基因设计引物，进行PCR扩增和序列测定，并作遗传进化树分析，同时开展了该方法的特异性、敏感性试验，构建了敏感性高、特异性强的PCR诊断方法。对来自不同阶段猪群和不同规模猪场的感染状况进行了调查，对安徽部分县市11个猪场的血样进行检测，获得安徽部分地区的E.suis的阳性率和猪场感染情况进行分析，进而为安徽省地区养猪业防治该病提供科学依据。8 1材料方法1.1材料1.1.1样品来源自2016年1月-2016年12月期间，共收集合肥市，芜湖市，阜阳市和黄山市等地区155份血样，3~8月为春夏季节，1~2月，9~12月为秋冬季节。表1.采样猪场的背景资料Table1Backgroundinformationonthesamples时间地区编号猪场规模血样数来源日龄20160217合肥市HF-2171502送检；自繁自养1720160314合肥市HF-3142003送检；自繁自养4020160325合肥市HF-3253003送检；自繁自养6720160511合肥市HF-51160032采样；引进仔猪7020160605合肥市HF-6057002送检；自繁自养2620160611黄山市HS-61150029采样；自繁自养6020160923黄山市HS-70350018采样；自繁自养10020160926合肥市HF-92610004送检；自繁自养1020161018合肥市HF-10181501送检；自繁自养10020161118芜湖市WH-111880032采样；自繁自养12020161230阜阳市FY-123040029采样；自繁自养801.1.2质粒和菌株PCR产物的克隆载体购自TaKaRa公司，大肠杆菌DH5α为本实验室保存。1.1.3主要试剂与仪器表2.主要试剂Table2.Themainreagents试剂（reagent）生产厂家（Manufacturer）蛋白酶K生工生物工程(上海)有限公司DNAMarkerDL2000生工生物工程(上海)有限公司9 溴化乙锭(EB)生工生物工程(上海)有限公司酵母提取物生工生物工程(上海)有限公司氯化钠(NaCl)国药试剂有限公司琼脂粉国药试剂有限公司枸橼酸国药试剂有限公司胰蛋白胨国药试剂有限公司琼脂糖国药试剂有限公司冰醋酸国药试剂有限公司95%乙醇国药试剂有限公司甲醇国药试剂有限公司瑞氏染液国药试剂有限公司表3.主要仪器与设备Table3.Themainapparatusandequipments仪器(Instrument)型号(Model)生产厂家(Manufacturer)PCR扩增仪MYCyclerTMTmermalCyclerBIO-RAD公司电泳仪DYY-11北京六一仪器厂公司凝胶成像系统µV3000珠海黑马医学仪器有限公司冷冻高速离心机TGL-18R珠海黑马医学仪器有限公司超净工作台SW-CJ-IF苏州安泰空气技术有限公司电热恒温水槽DK-8D上海精宏试验设备有限公司恒温振荡培养箱KYC-100C上海福玛实验设备有限公司电子天平TD-1102北京赛多利斯仪器系统有限公司-20℃冰箱DW-YW358A中科美菱低温科技有限公司1.1.4主要溶液的配置10％枸橼酸钠抗凝剂：10g枸橼酸，100ml蒸馏水混合，经121℃，15min高压灭菌后备用。姬姆萨染液的配制：取姬姆萨染料0.6g加于50ml甘油中，置55~60℃水浴中2h后，加入甲醇50ml，静置1d以上，经过纱布滤过即成姬姆萨染色原液，并保留于棕色瓶中。临用前，以1:10的比例加入蒸馏水，即姬姆萨工作染色液。LB培养基:酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，NaCl10g，用ddH2O定容至10 1L，调至7.0。50×TAE缓冲液（贮存液）：Tris碱242g，57.0mL冰醋酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，磁力搅拌器上搅拌溶解后，定容至1000mL，常温保存备用。贮存液按1:50稀释后即为工作液（1×TAE）。1%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖粉末1.0g，使其溶于100mL1×TAE溶液中，并加热煮沸至完全溶解后，待温度降到60℃左右，加入5.0μLEB溶液，充分振荡混匀，使其终浓度为0.5μg/mL。PCR反应试剂：ExTaqDNA聚合酶(5µ/μL)配有dNTP(2.5mmol/l)、MgCl2+2(25mmol/l)、10×TaqBuffer(Mgfree)、10×GlycerolDNALoadingBuffer购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。1.2方法1.2.1形态学观察1.2.1.1鲜血压片观察滴加1滴待检血液于载玻片上，加上等量的生理盐水混合，在显微镜下观察。1.2.1.2姬姆萨染色检查采集猪的新鲜血液，立即制作鲜血涂片，自然干燥后，滴加甲醇固定3~5min，滴加姬姆萨工作液染色作用1h左右，冲洗，晾干后镜检。1.2.2E.suis16SrRNAPCR诊断方法的建立1.2.2.1猪附红细胞体模板的提取猪附红细胞体DNA的提取（根据Messick(1999)等报道的方法并作改进）：200µl抗凝血加入1.5ml的EP管中，12000rpm离心10min，弃上清；沉淀中加入200µl的TE溶解，然后加入10µl溶菌酶(50mg/mL)涡旋混匀，37℃下孵化1h。加入70%10µlSDS,10µl蛋白酶K(20mg/mL保存)，65℃下孵化10min,加入100µlNaCI5mol/L，160µl的5%CTAB，65℃下孵化10min，加入等体积的酚仿抽提，12000r/min，离心10min，两倍体积的无水乙醇和1/10体积的2mol/L的NaAc，-20℃沉淀30min,40℃12000r/min离心10min,70%乙醇洗涤一次。自然干燥，用30µlTE溶液溶解，-20℃保存备用。11 1.2.2.2猪附红细胞体的16SrRNA的引物设计根据GenBank.U88565用Primer5.0设计引物P1：5'-CAATGGACGAAAGTCTGATGGAG-3'；P2：5'-CATCTCAAGACACGAGCTGACGA-3'。预计扩增的片段为703bp，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成1.2.2.3扩增体系及反应条件表4PCR扩增体系Table4PCRamplificationsystemPCR反应体系体积/µl模板2上游引物(10µM)1下游引物(10µM)1dNTPMix(2.5mmol/l)210×ExTaqBuffer2.5ExTaqDNA酶0.2ddH2O16.3总计25表5PCR反应条件Table5PCRreactionconditions反应步骤温度时间预变性95℃5min变性95℃45s复性52℃1min35个循环延伸72℃1min延长72℃7min保存4℃∞12 1.2.2.4扩增产物的纯化与回收对经琼脂糖电泳鉴定后PCR产物进行纯化与回收。（1）准备：实验开始前应先用酒精棉球擦拭照胶板，更换电泳液，称取2mL空的离心管并标记，备用。将电泳仪中的TAE换成新的TAE。（2）加样与电泳：将所有待回收产物与10×LoadingBuffer按照4:1混匀后全量加入1%的琼脂孔中，且最好与Marker孔相距一孔（便于切割），80V，1h。结束后用手术刀切下目的条带。（3）尽量少切除多余凝胶，切将切下的凝胶至于称过的EP管中，称重后根据试剂盒说明书加入一定量的BindingBuffer（XP2），60℃水浴锅中7min直到凝胶全部溶解为止，漩涡震荡。（4）把HiBindDNA柱子安装在收集管中。（5）取（3）中全部的溶解物于HiBindDNA中，10000rpm，1min离心。（6）弃收集管中的液体，将HiBindDNA再次安装在收集管中。（7）加300µLHiBindBuffer（XP2）到柱中，10000rpm室温离心1min。（8）加700µLSPWWashBuffer于柱中，10000rpm，室温离心1min。（9）弃液体，13000rpm，室温离心2min。（10）干燥后把柱子置于1.5mL的EP管中，加预热过的30µL的EB，于室温静置3min，13000rpm，室温离心1min后保存于-20℃冰箱中保存备用。胶回收完成后，取3µL回收产物进行电泳鉴定。1.2.2.5PCR产物的克隆1.感受态的准备：（1）吸取保存的DH5α菌100µL于含有5mLLB液体培养基的离心管中，37℃震荡培养过夜。（2）吸取200µL震荡培养的菌液于含有5mL的LB培养基中，震荡培养3~4h直至出现絮状细胞即可。（3）吸取2mL的菌液于EP管中，12000rpm，4℃离心2min后去上清（4）用冰冷的1mL的0.1molCaCl2洗涤（5）按照上述条件离心后去上清，重新加入100µL或者200µL的LB培养基混匀，于4℃冰箱中保存，用于转化。13 2.连接模板（胶回收）3.5µlSolutionⅠ5µlddH2O1µlPMD-18T0.5µl于4℃冰箱过夜连接。3.转化（1）全量取连接产物于100µL新制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。（2）转到42℃水浴锅中反应90sec，迅速冰浴冷却1~2min。（3）每管加入1mL提前预热的LB培养基，37℃摇床上震荡培养1h。（4）12000rpm离心2min，丢弃上清，加100µL的LB重悬。（5）取转化菌液涂布氨苄LB平板，静置，待菌液风干后于37℃培养箱中倒置培养，12~16h后观察结果。1.2.2.6重组质粒的pMD18T-E.suis16SrRNAPCR鉴定在培养皿中挑取2个菌落，每个菌落加入到一个含有AMP+液体LB试管中，并置于37℃，150r/min摇床中培养3h，分别利用相应的引物进行扩增，鉴定菌液。扩增体系和反应条件中模板由DNA换成菌液。反应条件同表4。表6重组质粒pMD18T-E.suis16SrRNAPCR扩增体系Table6ThePCRamplificationsystemofpMD18T-E.suis16SrRNArecombinedplasmidPCR反应体系体积/µl模板1上游引物(10µM)1下游引物(10µM)1DNTPMix(2.5mmol/l)210×ExTaqBuffer2.5ExTaqDNA酶0.2ddH2O17.3总计2514 1.2.2.7序列同源性和遗传性分析测定序列用在线的BLAST软件首先进行同源性的比较分析，然后将测序结果用DNAStar软件进行多序列的同源性分析和遗传进化分析。1.2.2.8重组质粒pMD18T-E.suis16SrRNA的提取1）吸取1-2ml的阳性菌液放入EP管中，离心，10000rpm，1min，弃上清。2）重悬：加入250µlSolutionⅠ，并上下吹打。3）加入250µlSolutionⅡ轻混匀，通过颠倒数次直至出现清晰的溶菌物（避免剧烈的摇晃）。静置2min，且不要超过5min。4)加入350µlSolutionⅢ，立即上下颠倒，直至出现白色絮状物。（加入后立即混匀，不要产生沉淀），离心12000rpm，10min。5）吸取上清液移于HIBind柱中，套上2ml的收集管，确保不要吸取沉淀，离心，10000rpm，1min。6)弃收集管液体，重新加入500µl的BufferHB洗脱柱子，离心，10000rpm，1min。7）弃收集管液体，加入700µl的DNAWashBuffer（用乙醇稀释过），离心，10000rpm，1min。8）弃收集管液体，空柱离心13000rpm，2min。放于超净台自然干燥，5min。9）HIBind柱置于干净的1.5mlEP管中，加入30µlElutionBuffer（预热），室温静置2min，离心，13000rpm，1min。凝胶电泳鉴定，于-20℃下保存、备用。1.2.2.9所建立的E.suisPCR方法特异性试验使用E.suis16SrRNA阳性质粒作阳性对照，同时以牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯、犬巴贝斯、链球菌、巴氏杆菌、弓形虫和羊泰勒虫作模板，按相同的反应参数和体系进行PCR扩增，琼脂糖电泳分析PCR扩增结果。1.2.2.10所建立的E.suisPCR方法敏感性试验用分光光度计测定E.suis16SrRNA阳性质粒的浓度，然后作1:10倍连续稀释，对稀释产物按照同样的PCR反应体系和参数进行扩增，电泳分析结果，以分析该PCR反应方法的敏感性。1.2.3安徽部分地区猪附红细胞体的分子流行病学调查采用已建立的PCR方法对临床所收集155份猪血样进行E.suis检测，同时以姬姆萨染色法作对照，以便评价两种的方法的敏感性。并对所得数据进行统计分析，包括不同规模和饲养方式，不同季节、不同月龄和不同地区等情况作统计分析。15 2结果2.1附红细胞体形态学检查结果2.1.1鲜血压片观察结果采集的新鲜全血经压片后，在显微镜下观察时发现血液红细胞外形发生不同程度的改变，其中部分呈星芒状（见图1和图2）。图1.血液压片检查（400×）图2.血液压片检查（1000×）Fig1.ThecheckofBloodpressuretablets（400×）Fig2.ThecheckofBloodpressuretablets（1000×）2.1.2姬姆萨染色观察结果将采集的血液制成血涂片，经过姬姆萨染色后，在油镜下观察时发现发现红细胞变为不规则形状呈星芒状和锯齿状，表面的突起被染成蓝紫色。图3.姬姆萨染色血涂片（1000×）图4.姬姆萨染色血涂片（1000×）Fig3.ThebloodsmearbyGiemsastain(1000×)Fig4.ThebloodsmearbyGiemsastain(1000×)16 2.2E.suis16SrRNA基因PCR诊断方法的建立2.2.1PCR扩增E.suis16SrRNA基因结果用自行设计并由上海英潍捷基生物技术有限公司合成的一对引物，对待检血液DNA进行E.suis16SrRNA基因进行扩增，所扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。由图可见，图中泳道3中出现703bp大小基因片段，与预期相一致（图5）。图5.猪附红细胞体PCR扩增结果Fig5.TheamplificationresultsofE.SuisbyPCRM：2000bpMarker；2：阴性对照；3：猪附红细胞体扩增产物2.2.2PCR鉴定重组质粒pMD18T-E.suis16SrRNA结果图6.重组质粒pMD18T-E.suis16SrRNAPCR鉴定结果Fig6.TheidentificationresultofrecombinedplasmidpMD18T-E.suis16SrRNAbyPCRM：2000bpMarker；2:菌液1；3：菌液217 重组质粒pMD18T-E.suis16SrRNA经PCR鉴定后，可明显发现有目的片段，大小约为703bp，与预期相一致（见图6）。2.2.3E.suis16SrRNA基因PCR产物测序结果CAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATACCACGTGAACGATGAAGGTCTTCTGAATGTAAAGTTCTTTTATTTAGGAAAAAAAGCGCGACAGGAAATGGTCGCGCCCTGATTGTACTAATTGAATAAGTGACAGGTAACTATGTGCAAGCAGCTGGGGTAAAACATAGGTCACGAGCATTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGAAGCGTAAGCTGAAGTGTGTATCCATTGTTAAAAGTACTTGCTTCACAGGTGTTCGCGGTGGAGATTACACTGATCGAATAGATTAGAGGGCACTGGAATTCAATGTGTAGTGGTTGGAATACGTCATATATTGAGGAACACCAGAGGCTAAGGCGAGAGCCTGGGTCATAATTGAGCCTGAGGCTTGAAAGCGTGGGTAGCAAATGGGATTAGTTACCGCAGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGGTATTAGTCATTTGAATTTAAGTTGAGTGATGTAGCTAACGCGTTAAATACGCCGCCTGGGTAGTATATATGCTAATATGAAACTCAAGACAATTGACGGGGACATGATCAAGTGCTGGAGCATGTTGCATAATTCGATCATAGACGCAAAACTTTACGAAGGCTTGCATTCTTCTGCAAAGCTATAGAAATATAGTGGAGGCTATCAGAATGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCTTGAGATG所得序列长度为703bp，与预期相符。2.2.4序列同源性比较和遗传进化分析同源性分析：通过载体连接、质粒提取、测序表明含有703个核苷酸。本研究获得E.suis的基因序列。该基因核苷酸序列和Genbank上选取的18种相关性强的序列利用DNAstar软件的MegAlign程序中的SequenceDistances进行同源性比较，通过比较可发现其与已报道E.suis(U88565)氨基酸相似度为95.3%；与Mycoplasmasuis(EU603330.1)、(FN436010.1)、(FN436014.1)、(FN436012.1)氨基酸相似度为92.9%-94.9%。与E.wenyonii(AF016546.1)氨基酸相似度为87.2%，Haemobartonellasp(AF178677.1)、(AF197337.1)、(U82963.1)氨基酸相似度为79.2%-80.1%（见图7）。18 图7.所得基因的同源性分析Fig7.Homologicalanalysisoftheobtainedgene遗传进化分析：应用MegaAlign软件的phylogenetictree程序，将获得的E.suis序列和18种相关性强的序列进行比较，构建遗传进化的关系。根据16SrRNA基因序列分析显示猪附红细胞体与支原体的亲缘关系较近，而与血巴尔通氏体的亲缘关系较远（见图8）。图8.所得基因遗传进化分析Fig8.Phylogentictreeanalysisoftheobtainedgene19 2.2.5特异性试验结果按PCR扩增体系和反应条件，使用最适复性温度进行PCR扩增时，只有E.suis16SrRNA阳性参照模板可扩增出703bp大小的目条带，而用牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、犬巴贝斯虫、链球菌、巴氏杆菌、弓形虫、羊泰勒虫的基因组均未能见到扩增出目的片段（如图9）。图9PCR反应的特异性试验Fig9.TheSpecificityanalysisofPCRM：2000DNAmarker；1：阳性质粒Positiveplasmid;2：牛巴贝斯虫Babesia.bovis；3：双芽巴贝斯虫Babesia.bigemina；4：犬巴贝斯虫Babesia.canis；5：链球菌Streptococcus；6：巴氏杆菌Pasteurella；7：弓形虫Toxoplasmagondii；8：羊泰勒虫；Theileria.ovis2.2.6敏感性试验结果经紫外分光光度计测定，E.suis16SrRNA阳性质粒含量为0.25×103µg/ml。按1：10连续稀释，结果表明稀释到1×103，能扩增出目的片段，其后稀释比例扩增不出目的条带，分析E.suis16SrRNA阳性质粒的最低检测量为0.25µg/ml（见图10）。20 图10.PCR反应的敏感性试验Fig10.TheresultofsensitivityanalysisM：2000bpDNAMarker；1：1×101倍稀释2：1×102倍稀释3：1×103倍稀释4：1×104倍稀释5：1×105倍稀释6：1×106倍稀释7:1×107倍稀释2.3安徽部分地区E.suis的分子流行病学调查结果2.3.1PCR检测待检血样的E.suis图11.部分样本DNA的PCR结果Fig11.ThedetectionresultofsomesamplesbytheestablishedPCRM：2000DNAmarker1-10：部分待测样本21 2.3.2不同规模猪场E.Suis检出阳性率统计结果图12.不同规模猪场猪场检出阳性率Fig12.Thedetectionratefromdifferentscalepigfarm图13.不同规模猪场E.suis的检出阳性率Fig13.DetectionrateofE.suisindifferentscalepigfarm不同规模猪场样品检测情况，将所采集的样品按照猪场养殖规模进行统计，分为500头以上猪场和100头至500头猪场进行比较。其中猪场检出率均较高，500头猪场以上为83.33%，100-500头猪场为100%（见附表7，图12）。不同猪场的猪只检出阳性率，500头以上猪场感染率达66.67%，而100-500头猪场感染率为78.95%（见附表7，图13）。22 2.3.3两种方法对E.Suis的检出情况比较运用姬姆萨染色镜检和PCR扩增的方法进行检测并比较。结果显示：在155份待检血样中，姬姆萨染色镜检阳性为63份，其阳性率为40.64%；而PCR阳性为108份，阳性率为69.68%（见附表8，图14）。图14.两种方法对E.suis的检出情况比较Fig14.TwomethodscomparethecaseofE.suis2.3.4安徽不同地区E.suis检出情况合肥、阜阳、黄山的猪场所采血样阳性率均超过70%，源于合肥猪血样中的阳性率为最高的75.86%，源于芜湖猪血样中的阳性率为56.25%（见附表9，附图15）。图15.安徽不同地区E.suis检出情况Fig15.ThedetectionrateofE.suisfromdifferentregionsinAnhuiprovince23 2.3.5不同季节安徽部分地区猪场E.suis检出阳性率按照所分的季节阶段，春夏季节阳性率偏高为77.42%。秋冬季节阳性率相对较低，仅为63.83%（见附表10，附图16）。图16.不同季节E.Suis检出阳性率Fig16.ThedetectionrateofE.Suisfromdifferentseasons2.3.6对所调查的不同来源仔猪检出阳性率根据仔猪来源情况的不同进行分析，自繁自养和引进猪种的阳性率相差不明显，在70%左右（见附表11和附图17）。图17.不同来源仔猪检出阳性率Fig17.ThedetectionrateofPigletsfromdifferentsources24 2.3.7对所调查的不同日龄猪只检出阳性率根据所调查的仔猪日龄分成1月龄以下、1-3月、3-6月。1月龄以下检出阳性率为50%，1-3月仔猪的检出阳性率最高为77.08%（见附表12和图18）。图18.不同日龄猪只检出阳性率Fig18.Thedetectionrateofpigindifferentage25 3.讨论3.1猪附红细胞体诊断方法附红细胞体分类：关于附红细胞体的分类，这些年来一直存在争议，过去根据附红细胞体的细胞结构，形态，传播途径，染色特性，以及临床症状的相似性，把它划分到立克次氏体目。16SrRNA基因序列分析用于细菌系统同源性关系的确定是近些年采用比较多的方法之一，尤其适合于附红细胞体类似的在体外培养比较困难的病原菌的分类鉴定。一些学者对多种动物的血营养菌的基因研究认为附红细胞体和血巴尔通氏体应该划分到支原体属。另外,附红细胞体还有许多特性与支原体相似,如无细胞壁,对四环素敏感,不易培养,较小的基因组,基因组的含量较低等。鉴于上述原因,等提议应将附红细胞体归属为支原体。通过对猪附红细胞体的基因序列的分析证实了与其他血营养菌在同一个分支内且和支原体的亲缘关系比较近，与血巴尔通氏体体较远。关于国内外报道附红细胞体病的诊断方法主要包括镜检法鲜血压片法、染色检查等、血清学检查、动物试验以及分子生物学方法等。在国内，对该病的诊断以显微镜检查最为常用,因其主要存在于红细胞表面和血浆中,易引起红细胞的变形,但红细胞的变形可受所因素影响,如涂片技术、渗透压的扩张等,因此导致误判问题,认为其感染率较高,临床上常引起误诊。同时，由于抗体水平的变化没有规律，附红细胞体在菌血症期间易在外周血涂片上能看到虫体，其余时间看到虫体较少，所以又有较高的假阴性率。而直接涂片染色主要瑞氏染色和姬姆萨染色法,尤其瑞氏染色时易出现染料颗粒附着,故在观察视野中常可见到染色颗粒散在分布。但制作染液时用纱布过滤，静置待用，且操作简单，染色迅速，适合在基层大规模推广。涂片染色只能初步判断疑似的病例，所以需要准确性高，敏感性强的诊断方法。猪附红细胞体病的PCR诊断方法的特异性和敏感性问题：要求在引物设计时充分考虑到它的特异性，本试验根据已报道猪附红细胞体基因序列（U88565）作模板,设计一对种特异性引物,扩增片段大小为703bp,所建立了猪附红细胞体的PCR诊断方法具有良好的特异性，不能在牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯、犬巴贝斯、链球菌、巴氏杆菌、弓形虫、羊泰勒虫基因组模板中扩增出片段，这样克服了误诊问题。敏感性试验显示该试验能检测模板最低量为0.25ng，由此可见，所建立的PCR方法具有特异性好，敏感性高，可以用于猪的附红细胞体病的兽医临床检测。26 3.2猪附红细胞体病流行病学赵驻君于2012年对河北省保定市相关猪场作了该病流行病学调查，选择了该市6个县区多个猪场，采集不同年龄阶段猪血液样品2040份，结果显示该区域猪感染附红细胞体比例为74.25%；不同年龄阶段和不同季节的猪均可感染附红细胞体，临床治疗以盐酸多西环素效果最好[69]。2010年李月梅应用PCR技术对东北三省的600份猪血样本进行了检测，以16SrRNA作为靶基因。结果表明，在黑龙江省，猪附红细胞体感染率为93.5%（187/200），辽宁省感染率为89.5%（179/200），吉林省为91.5%（183/200），说明东北地区猪附红细胞体感染情况十分严重[70]。自2016年1月-2016年12月，对安徽部分地区猪场的猪只采血样进行猪附红细胞分子流行病学调查。共采集血样155份，其中检出阳性数为103份，检出阳性率为69.68%。这103份血样共来自11个猪场，猪场阳性率为90.90%。表明安徽部分地区猪场出现了较高的感染率。其中500头以上规模的猪场检出率为66.67%，100头-500头规模的猪场检出率为78.95%。结果说明大规模猪场饲养管理水平虽较高但是本病存在持续感染，且难以根除，一旦感染传播广而持久；小规模猪场饲养条件差，疾病预防意识淡薄，管理水平低，对于该病更是防治不力。PCR诊断检出阳性率为69.68%，确实高于染色镜检的检出率，且对于隐性感染没有显现临床症状的猪能够较好的检测。不同季节阳性检出率也有差异，春夏检出率为73.91%，高于秋冬的66.28%。气候有一定的影响但是影响不大，符合猪附红细胞体的传播情况。不同日龄的猪只，在1-3月龄时检出率最高为77.08%，显示该病主要侵袭这阶段的仔猪，并容易继发其他疾病的混合感染，导致消瘦，甚至死亡，该阶段的仔猪病死率较高可能和没有母源抗体自身免疫力弱以及应激反应导致免疫下降进而被病原体侵入，导致疾病发生和死亡。此外，不同地区检出率以阜阳地区最高，高达75.86%；其次是合肥地区为74.46%、黄山地区为70.21%；芜湖地区最低，仅为56.25%。3.3猪附红细胞体病的防治在所采样的猪场内，猪场管理人员对该病都没有相关的了解，配套的预防和治疗基本是没有收到很好的效果。本病在猪场中可通过接触、血源、垂直和昆虫媒介传播。所以猪场内的注射用的针头，去势所用的手术刀，打扫所用的工具，以及饲养人员的鞋和衣服都有可能传播。加强饲养管理，定期消毒，做好水源、饲料，畜舍的消毒工作。用拟菊酯类药物（如溴氰菊酯）对畜舍周围的灌木，污水源等昆虫媒介生活繁殖的地方进行消毒，消除蜱虫，蚊蝇等传播的可能；控制27 和减少应激因素；驱除体内外寄生虫。其中有些猪场的饲养条件差，饲料、环境相关管理缺乏，没有做好冬季的保温和疫苗免疫不及时以及免疫方法存在错误等情况导致猪群免疫力下降引起本病的爆发，加剧了对健康水平的侵害，进而继发细菌性或病毒性疾病，混合感染后猪场的发病率和死亡率明显上升。运用大剂量的青链霉素进行控制，效果不佳，死亡率继续升高。病程发展到一定阶段才寻求更科学准确的防治方法，为本病的传播提供了条件，为本病的防治增加了难度。根据治疗结果的追踪，贝尼尔和长效土霉素对该病的治疗效果尚佳，同时配合阿米卡星注射液收效甚好。28 4.结论1.成功地建立了猪附红细胞体16SrRNA基因PCR诊断方法，且敏感性高，特异性强。2.采用所建立的PCR诊断方法，对安徽部分地区不同来源的猪群155份血样进行检查，总的感染率为69.68%，100~500头小规模猪场感染率明显高于500头以上猪场；在月龄方面，以1-3月仔猪感染率最高；在季节方面，以春夏季节感染率最高。29 参考文献[1]尚德秋.附红细胞体病研究进展[J].中华流行病学杂志,1994,15(04):234-240.[2]罗杏芳,林森源,林彰毓,等.猪附红细胞体的发现与诊断[J].兽医科技杂志,1984,(07):47-48.[3]吴雅玲.附红细胞体病[J].青海畜牧兽医杂志,2001,31(04):47-48.[4]BuchananRE,GibbonsNE.Bergey'smanualofdeterminativebacteriology[M].Thewillams&WikinsCoBaltlwore,1974,9-12.[5]董梅.猪附红细胞体病血液学指标及病理学研究[D].延吉:延边大学,2003.[6]舍英,侯金凤,陈必珍,等.附红细胞体病的研究现状[J].中国人兽共患病杂志,1995,11(01):49-50.[7]SplitterEJ,WdiamsonRL.Eperythrozoonosisinswine.Apreliminaryreport[J].JAmVetMedAssoc.1950,116(878):360-364.[8]晋希民.家兔附红细胞体的发现及临床病状初步观察[J].兽医科技杂志,1981,(04):14-15+68.[9]张汝勇,罗富贵,黄桂英,等.马、牛、羊附红细胞体的发现与虫体检验法[J].兽医科技杂志,1983,(09):26-29+2.[10]崔君兆,陆宙光,张丽华,等.在人和动物血液内发现一种不明微生物[J].兽医科技杂志,1982,(02):55-56+67.[11]华修国.附红细胞体及附红细胞体病的研究现状和展望[J].上海农学院学报,1992,10(02):171-178.[12]赵丽颖,白建文.人附红细胞体的电镜观察及临床特征研究[J].内蒙古医学杂志,2001,33(02):108-111.[13]邰秀珍,杨殿相,秦林金,等.人类附红细胞体形态学特点[J].中国人兽共患病杂志,1998,14(05):83-84+86.[14]李秀敏.人畜共患附红细胞体病的研究现状[J].当代畜牧,1998,(01):3-4.[15]刘兴发,田红,侯顺利,等.附红细胞体人畜感染及传播途径的调查[J].中国兽医杂志,1997,23(10):23-24.[16]PuntaricV,BorcićD,VukelićD,etal.Eperythrozoonosisinman[J].Lancet,1986,2(8511):868.[17]DoyleLP.Arickettsia-likeoranaplasmosis-likediseaseinswine.[J]JAmVetMedAss.1932,8:668--671[18]许耀成,张万帮,向炳尧,等.红皮病猪血液内发现大量附红血球细胞体初30 报[J].兽医科技杂志,1982,(02):34-37.[19]栾景辉,王连云.猪的高热病——附红小体的初步调查[J].兽医科技杂志,1984,(02):36-37.[20]赵汝敏,李志萍,晁书芝,等.猪附红细胞体病的治疗[J].中国畜禽传染病,1990,(02):33-34.[21]华修国.上海首次发现仔猪附红细胞体病[J].上海畜牧兽医通讯,1992,(04):10-11.[22]李锦春,周庆新,雷彬,等.安徽地区猪附红细胞体病的诊治[J].养殖技术顾问,2007,(05):58-59.[23]MessickJB.Hemotrophicmycoplasmas(hemoplasmas):areviewandnewinsightsintopathogenicpotential[J].VetPath,2004,33(1):2.[24]RikihisaY,SatoM,FujiharaM,etal.DifferentialdetectionofhemotropicmycoplasmaspeciesincattlebymeltingcurveanalysisofPCRproducts[J].JVetMedSci,2010,72(12):77-79.[25]华修国,陈士友,李宏全.动物附红细胞体形态结构的研究[J].上海农学院学报,1998,16(03):184-188.[26]房春林,杨光友,古小彬,等.猪和兔附红细胞体的形态学及生殖方式观察[J].中国兽医科技,2005,35(06):455-460.[27]尚德秋.附红细胞体感染人畜的流行病学调查(Ⅲ)[J].中华流行病学杂志,1997,18(03):150-152.[28]斯特劳,猪病学[M].赵德明,张中秋,沈建忠主译(第八版).北京:中国农业大学出版社,2000,425-444.[29]BuchananRE,GibbonsNE.Bergey'smanualofdeterminativebacteriology[M].Thewillams&WikinsCoBaltlwore,1974,719.[30]McLaughlinBG,EvansCN,McLaughlinPS,etal.AnEperythrozoon-likeparasitein1lamas[J].JAmVetMedAssoc,1990,197(9):1170-1175.[31]王永.奶牛附红细胞体感染途径及敏感药物体外筛选的研究[D].泰安:山东农业大学,2007.[32]其田三夫.绵羊附红细胞体病的研究[J].日本兽医师会杂志，1977,30(7):371-379.[33]NichollsTJ,VealePI.TheprevalenceofEperythrozoonovisinfectioninweanerandadultsheepinnortheasternVictoria[J].AustralianVeterinaryJournal,1986,63(4):118-120.[34]PrullageJB,WilliamsRE,GaafarSM,etal.Onthetransmissibilityof31 EperythrozoonsuisbyStomoxyscalcitransandAedesaegypti.[J]JVetparasito1,1993,50(2):125-135.[35]BravermanY.Nematocera(Ceratopogonidae,Psychodidae,SimuliidaeandCulicidae)andcontrolmethods.[J]RevsciTech,1994,13(4):1175-1199.[36]张浩吉.我国猪附红细胞体病的流行现状与防治策略[J].中国动物保健,2008,(08):31-33.[37]查红波,刘尚高.猪附红细胞体病的研究进展[J].畜牧兽医科技信息,2002,(09):6-9.[38]HeinritziK,PlankG.TheeffectofEperythrozoonsuisinfectionontheosmoticfragilityoferythrocytes[J].BerlMunchTierarztlWochenschr,1992,105(11):380-383.[39]柴方红.猪附红细胞体对仔猪免疫水平的影响[D].延吉:延边大学,2005.[40]冯立明,张之南.附红细胞体病[J].疾病监测,1992,7(05):135-139.[41]邰秀珍,杨殿相,苏秀兰,等.人附红细胞体电镜下的形态特点[J].内蒙古医学院学报,1998,20(02):59-60.[42]HeinritziK.ThediagnosisofEperythrozoonsuisinfection[J].TierärztlichePraxis,1990,18(5):477-481.[43]ZacharyJF.ImmuneresponsesandhematologicalterationsinsplenectomizedpigsexperimentallyinfectedwithEperythrozoonsuis:Apossibleanimalmodelforcoldagglutinindiseaseinman[J].1982,43(3):378.[44]MessickJBSmithG,BerentL,etal.GenomesizeofEperythrozoonsuisandhybridizationwith16SrRNAgene[J].CanJMicrobiol,2000,46(11):1082—1086.[45]张守发.附红细胞体对仔猪免疫水平的影响[A].中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会.中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集[C].中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会,2004:3.[46]董君艳,王力光,张守发,等.附红细胞体感染犬主要血液生理生化指标[J].中国兽医学报,2004,24(01):34-36.[47]侯顺利.家兔附红细胞体病及其防治[J].中国养兔杂志,1997,(01):11-12.[48]WellesEG,TylerJW,WolfeDF,etal.Eperythrozooninfectioninyoungbullswithscrotalandhindlimbedema,aherdoutbreak[J].Theriogenology,1995,43(3):557-567.[49]梁文杰,李继红,朱学梅,等.国内人附红细胞体病64例文献分析[J].中国病原生物学杂志,2011,6(5):371-374.32 [50]许正宽.猪附红细胞体病的发病症状及治疗[J].安徽农业科学,2003,31(5):826-827.[51]DipeoluOO,OtesileEB,FagbemiBO,etal.PathogenicityofEperythrozoonsuisaloneandwhenmixedwithBabesiatrautmanniinexperimentally-infectedpigs.[J].VetParasitol.1983,13(2):127-134.[52]刘小燕.猪附红细胞体病临床调查与诊断分析[D].北京:中国农业大学,2004.[53]康世良,武瑞.国内草食家畜附红细胞体病的研究动态[J].中国草食动物,2003,23(02):40-41.[54]郑丽艳,张衍俊,常维山.附红细胞体病瑞氏、姬姆萨、吖啶橙染色法及PCR检测法的比较研究[J].中国人兽共患病学报,2006,22(03):243-245.[55]SmithAR,RahnT.AnindirecthemagglutinationtestforthediagnosisofEperythrozoonsuisinfectioninswine.[J].JAmVetRes,1975,36(9):1319-1321.[56]SplitterEJ.Thecomplement-fixationtestindiagnosisofEperythrozoonosisinswine[J].JAmVetMedAss,1958,132(2):47-49.[57]HsuFS,LiuMC,ChouSM,etal.Evaluationofanenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectionofEperythrozoonsuisantibodiesinswine[J].JAmVetRes,1992,53(3):352-354[58]秦建华,杨鹏华,刘占民,等.舍饲小尾寒羊附红细胞体病的流行病学调查[J].河北农业大学学报,2004,27(01):86-88.[59]HeinritziK.ThediagnosisofEperythrozoonsuisinfection[J].TierarztlPrax.1990,18(5):477-481.[60]OberstRD.GwaltnaySM.ExperimentalinfectionsandnaturaloutbreaksofeperythrozoonosisinpigidentifiedbyPCR-DNAHybridizations[J].JVetDiagn.Invest,1993,5(3):351-358.[61]MessickJB,CooperSK,HuntleyM.Developmentandevaluationofaploymerasechainreactionassayusingthe16srRNAgenefordetectionofEperythrozoonsuisinfection[J].JVetDiagnInvest,1999,11(3):229-236.[62]张浩吉,谢明权,张健騑,等.猪附红细胞体PCR-微孔板杂交-酶免疫检测方法的研究[J].畜牧兽医学报,2007,(02):184-189.[63]陈声国.羊附红细胞体PCR诊断方法的建立和猪附红细胞体病的治疗试验[D].武汉:华中农业大学,2007.[64]郭小清,钟建新,唐莉苹,等.猪附红细胞体病的诊断与控制[J].中国兽医寄生虫病,2004,12(02):43-45.33 [65]向阳,向明轩.猪附红细胞体和伪狂犬病病毒混合感染[J].中国兽医杂志,2003,39(06):50.[66]李治悦,王振海,杨玉芝,等.阜阳市人畜附红细胞体病调查报告[J].中国公共卫生,2001,17(01):50.[67]曹华.山西长治地区猪附红细胞体病的流行病学调查及分子诊断[D].晋中:山西农业大学,2014.[68]刘小燕.猪附红细胞体病临床调查与诊断分析[D].北京:中国农业大学,2004.[69]赵驻军,蒋禄峰,秦建华.猪附红细胞体病流行病学调查及不同药物治疗效果[J].动物医学进展,2012,33(12):111-115.[70]李月梅.东北三省猪附红细胞体病分子流行病学调查及LAMP检测方法的建立[D].延吉:延边大学,2010.34 附录表7不同规模猪场E.suis调查结果Table7.DifferentscalepigfarmsE.suissurveyresults猪场规模检出阳性场数/猪场数猪场检出率检出阳性数/样品数检出阳性率500头以上5/683.33%78/11766.67%100-500头5/5100%30/3878.95%合计10/1190.90%108/15569.68%表8两种方法检出E.suis的阳性率Table8.TwomethodscomparethecaseofE.suis方法血样数阳性数阳性率镜检1556340.64%pcr15510869.68%表9.不同地区检出E.suis的统计表Table9ThedetectionrateofE.suisfromdifferentregionsinAnhuiprovince地区收集血样份数阳性份数阳性率合肥市473574.46%芜湖市321856.25%阜阳市292275.86黄山市473370.21%总计15510869.68%表10不同季节检出E.suis的统计表Table10ThedetectionrateofE.Suisfromdifferentseasons季节血样数阳性数阳性率春夏695173.91%秋冬865766.28%35 表11仔猪不同来源检出E.suis的统计表Table11ThedetectionrateofPigletsfromdifferentsources仔猪来源血样份数阳性数阳性率自繁自养1238569.10%引进仔猪322371.88%表12不同日龄检出E.suis的统计表Table12Thedetectionrateofpigindifferentage日龄血样数阳性数阳性率一个月以下8450.00%1-3个月967477.08%3-6个月513058.82%36
