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《辽西地区动物寄生蜱及蜱传人畜共患病携带情况调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
Ｉ１０１６０＋单ｋ代码：Ａ类号Ｓ８５５．９９￣２０１３２００６０学号：？辟叫證科乂變硕±学位论文题目；迂西地区动物寄生婢及婢传人畜共患病携带情况调查Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｔｈｅａｎｉｍａｌｐａｗｓｉｔｉｃｔｉｃｋｓａｎｄ－ｔｎｉｎｓｉｔｕａｉｏｉｉｓｅａｓｅｃａｒｒｔｉｃｋｂｏｍｅｚｏｏｎｏｔｃｄｙｇｎｗｅｓｔｅｒｎｏｆＬｉａｏｎｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅｉｇ研究生：王振导师：于金冷学科专业；微生物学一２０１６２０１４年４月年３月论文课题起止时间：２０１６：年３月论文完成时间 锦州医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加从标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含一同为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表不谢焉。一申请学位论文与资料若有不实乏处，本人承担切相关责任。论文作者签雀：主扳日期：和、锦州医科大学研究生学位论文版权使用授校书本人完全了解巧工宁医学院有关保护知识产权的规定，目Ｐ：研究生在攻读学位期间论文作的知识产权单位属迂宁医学院。本人保证毕业且离校后，发表论文或使用论文工作成果时署著单位為巧宁医学院，导师为通讯作者，通讯作者单位亦署葦为巧宁医学院。学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查岡和借阅。学校可１＾乂公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），Ｌ乂采用影印、缩印或其他手段保存论论文。文作者签名：王才指导教师签名：冷，＇也 目录一、摘要中文论著摘要…………………………………………………………………1英文论著摘要…………………………………………………………………4二、英文缩略语………………………………………………………………………8三、论文前言……………………………………………………………………………9实验材料与方法……………………………………………………………10结果…………………………………………………………………………17讨论……………………………………………………………………………29结论……………………………………………………………………………34四、本研究创新性的自我评价……………………….........…………………………35五、参考文献…………………………………………………………………………36六、附录综述……………………………………………………………………………40在学期间科研成绩…………………………………………………………50致谢……………………………………………………………………………51个人简历...………………………………………………………………………52 ·中文论著摘要·辽西地区动物寄生蜱及蜱传人畜共患病携带情况调查目的调查辽西地区（凌海、义县、太和区、兴城、绥中5个县（市）区）放牧牛羊及犬（家养犬和牧羊犬）体表寄生蜱的感染情况，同时对该地区蜱传人畜共患病的携带情况进行调查研究，为我省相关部门防控蜱及蜱传人畜共患病工作提供科学依据。方法选择辽西地区凌海、义县、太和区、兴城、绥中5个县（市）区为调查点，以放牧牛羊和犬（家养犬和牧羊犬）3种动物为采蜱对象，在蜱流行季节（5-9月）随机进行蜱的采集工作，每月采集一次，共采集5次，保证每个调查点牛羊采集蜱的数量都在100个以上，犬采集蜱的数量都在30个以上，5个调查点共采集新鲜活蜱1646个，采用传统的形态学鉴定方法，鉴定蜱的种类并统计数量，确定优势蜱种。完成分类鉴定的蜱按不同动物、不同蜱种进行分组处理后-80℃保存，待下一步做蜱传人畜共患病的病原学检测。根据国内蜱传人畜共患病的流行与危害情况，选择蜱传人畜共患病中的7种重要人畜共患病：森林脑炎（TBE）、新布尼亚病毒（SFTS）、新疆出血热（CCHF）、斑点热（SF）、Q热(Qfever)、巴贝斯虫病（Babesiosis）、莱姆病（Lymedisease）为研究对象，采用聚合酶链反应（PCR）方法对7种蜱传人畜共患病的携带情况进行检测。针对检测出来的蜱传人畜共患病（阳性样本）的部分基因进行测序，应用Blast软件与相关蜱传人畜共患病的基因序列相似性进行比对，根据分析结果进行进一步验证，最后确定辽西地区动物寄生蜱携带蜱传人畜共患病的种类。1 结果1、动物寄生蜱感染情况调查结果发现辽西地区放牧牛羊和犬寄生蜱5种，分别隶属于1科4属，分别为革蜱属的森林革蜱、血蜱属的长角血蜱和二棘血蜱、硬蜱属的全沟硬蜱、璃眼蜱属的残缘璃眼蜱。其中长角血蜱占34.7%（571/1646）、森林革蜱占26.2%（431/1646)、全沟硬蜱占16.0%（264/1646）、二棘血蜱占14.8%（243/1646）、残缘璃眼蜱占8.3%（137/1646）。长角血蜱和森林革蜱为辽西地区放牧牛羊和犬的优势蜱。2、7种蜱传人畜共患病的PCR检测结果在辽西地区90组蜱样本中检测到斑点热立克次体和Q热立克次体2种蜱传人畜共患病，没有检测到森林脑炎、新布尼亚病毒病、新疆出血热、巴贝斯虫病、莱姆病；在绥中县的2种2组蜱样本中（第18组长角血蜱、第39组森林革蜱）检测到2株斑点热立克次体；在义县的1种1组蜱样本中（第4组长角血蜱）检测到1株Q热立克次体。3、2种蜱传人畜共患病的部分基因测序结果检出的2株斑点热立克次体分别命名为SZX-BD18和SZX-BD39，检出的1株Q热立克次体命名为YX-Q4。测序结果表明，2株斑点热立克次体（SZX-BD18和SZX-BD39）基因序列完全相同，大小均为640bp，Q热立克次体基因序列大小为260bp，均与预期片段大小相一致。4、部分基因相似性分析结果检测到的2株斑点热立克次体（SZX-BD18、SZX-BD39）的部分基因序列与基因库中的FUJ98(AF169629)、HlR/D91（KC888951）、QHD-1(HQ651815)、QHD-2(HQ651816)、SHHMU-5（JX841232)、SHHMU-3（JX841230）6个斑点热立克次体部分基因序列相似性达到99%，同时与HL-93(AF179364)的相似性为95%、与JL-02(AY093696)的相似性为93%，比对分析结果表明，在辽西地区检测到的SZX-BD9和SZX-BD13确为斑点热立克次体。检测到的1株Q热立克次体（YX-Q4）与基因库中的Namibia(CP007555)、CbukQ154(CP001020)、TW-1（EU000273）、Yunnan-1（KR697576）、IE5（DQ379976）的5个Q热立克2 次体部分基因序列相似性均为100%，与IS111a（M80806)的部分基因序列相似性达到99%。比对分析结果表明，在辽西地区检测到的YX-Q4确为Q热立克次体。结论1、通过对辽西地区动物寄生蜱感染情况的调查，发现该地区放牧牛羊和犬寄生蜱有5种，分别隶属于1科4属：革蜱属的森林革蜱，血蜱属的长角血蜱和二棘血蜱，硬蜱属的全沟硬蜱，璃眼蜱属的残缘璃眼蜱。其中长角血蜱和森林革蜱为优势蜱种。2、通过7种蜱传人畜共患病携带情况调查，发现辽西地区动物寄生蜱体内携带斑点热立克次体和Q热立克次体2种蜱传人畜共患病，斑点热立克次体只从绥中县检测到，Q热立克次体只从义县检测到。在辽西地区没有检测到森林脑炎、新疆布尼亚病毒、新疆出血热、莱姆病和巴贝斯虫。3、研究结果表明，辽西地区动物寄生蜱体内携带斑点热立克次体和Q热立克次体2种蜱传人畜共患病，人类存在一定的感染风险，应引起相关部门的高度重视，在加强动物寄生蜱防治工作的同时，也要加强人群蜱传人畜共患病宣传和干预工作。关键词蜱；感染情况；人畜共患病；携带情况；调查；辽西地区3 ·英文论著摘要·Investigationontheanimalparasiticticksandtick-bornezoonoticdiseasecarryingsituationinwesternofLiaoningProvinceObjectiveThesurveyinvestigatethegrazingcattle,sheepangdogs(domesticdogsandshepherddogs)parasiticticksandtick-bornezoonoticdiseasecarryingsituationinwesternofLiaoningprovince,soastoprovidefortherelevantdepartmentsoftheprovincewithscientificbasisofthetickandtick-bornezoonosespreventionandcontrolmeasures.MethodsBasedonthegeographycharacteristicsofwesternLiaoningprovince,Linghai,Yixian,Taihedistrict,Xingcheng,Suizhongwerechosenasthesurveypointsandgrazingcattlesheepanddogs(domesticdogsandshepherddogs)asminingticksobjects.Tickswerecollectedrandomlyonceamonthinthepopulartickseason(MaytoSeptember),ensuringthateachsurveypointthenumberoftickscollectedfromcattleandsheeparemorethan100,whiledogticksover30and1646newfreshtickswerecollectedfromthefivesurveypoints.Traditionalmorphologicalidentificationmethodwasusedtoidentifythespeciesofticksandstatisticalintensityofinfectionandadvantageticksweredetermined.Tickswerepreservedat-80℃afterclassifiedbydifferentanimalsandtickspecies,afterwhichthetick-bornepathogendetectionofzoonoticdiseaseswascarriedout.4 Accordingtothedomesticepidemicoftick-bornezoonosesandhazardsituation,7kindsofimportanttick-bornezoonoses:tick-borneencephalitis(TBE),severefeverwiththrombocytopeniasyndrome(SFTS),CrimeanCongohemorrhagicfever(CCHF),spottedfever(SF),Qfever(Qfever),babesiosis(Babesiosis),Lymedisease(Lymedisease)wereselectedastheresearchobjects,andmethodofpolymerasechainreaction(PCR)wasadoptedtotestthetick-bornezoonosescarryingcases.Inviewofthedetectedthetick-bornezoonoses(positivesamples)partofthegenesequencing,withthecomparisonoftick-bornezoonosesgenesequencessimilaritybyBlastsoftware,accordingtotheanalysisresultsforfurthervalidation,animalparasitictickscarryingspeciesofthetick-bornezoonoseswasfinallyconfirmedinwesternofLiaoningProvince.Results1.AnimalsparasiticticksinfectedsurveyresultsAfteridentification,the1646animalparasitictickssurveyedinwesternofLiaoningProvince(LingHai,Yicounty,Taihedistrict,Xingcheng,Suizhong)belongedto4generaand5species:Dermacentorsilvarum,Haemaphysalislongicornis,Haemaphysalisbispinosa,Ixodespersulcatus,Hyalommadetritum.InwhichHaemaphysalislongicornisaccountedfor34.7%(571/1646),Dermacentorsilvarumaccountedfor26.2%(431/1646),Ixodespersulcatusaccountedfor16.0%(264/1646),Haemaphysalisbispinosaaccountedfor14.8%(243/1646),Hyalommadetritumaccountedfor8.3%(137/1646).Afterdataanalysis,itisconcludedthatHaemaphysalislongicornisandDermacentorsilvarumareadvantagetickspeciesincattle,sheepanddogsofwesternLiaoningProvince.2.PCRresultsofsevenkindsoftick-bornezoonoses5 SpottedfeverrickettsiaandQfeverrickettsiaarecarriedbytheticksinwesternofLiaoningProvince.90groupticksamples,tick-borneencephalitis,severefeverwiththrombocytopeniasyndrome,CrimeanCongohemorrhagicfever,babesiosis,Lymediseasewasnotdetected.InSuizhongcountytwokindsofticksintwogroupsofsamples(the18thgroupHaemaphysalislongicornis,the39thgroupDermacentorsilvarum)weredetectedtwoindividualplantsspottedfeverrickettsia,Inyixiancountyakindofticksinagroupofsamples(the4thgroupHaemaphysalislongicornis)wasdetectedoneindividualplantQfeverrickettsia.3.Partialgenesequencingresultsoftwokindsoftick-bornezoonosesTwoindividualplantsspottedfeverrickettsiadetectionwerenamedrespectivelySZX-BD18andSZX-BD39.AnindividualplantQfeverrickettsiadetectedwasnamedYX-Q4.Sequenceanalysisshowedthattwoindividualplantsspottedfeverrickettsia(SZX-BD18andSZX-BD39)areexactlythesamegenesequenceandthesizeofitsgenesequenceis640bp,whilethegenesequencesizeofQfeverrickettsiais260bp.Theyareconsistentwiththeexpectedfragmentsize.4.PartialgenesimilarityanalysisDetectedtwoindividualplantsspottedfeverrickettsia(SZX-BD18,SZX-BD39)ofpartofthegenesequencewiththegenelibraryFUJ98(AF169629),HlR/D91(KC888951),QHD-1(HQ651815),QHD-2(HQ651816),SHHMU-5(JX841232),SHHMU-3(JX841230)6individualplantsspottedfeverrickettsiaofthegenesequencesimilarityis99%,SimultaneouslywiththeHL-93(AF179364)similarityis95%,withtheJL-02(AY093696)similarityis93%.ComparativeanalysisshowedthatinwesternofLiaoningProvincedetectedSZX-BD9andSZX-BD13indeedarespottedfeverrickettsia.Detecteda6 individualplantQfeverrickettsia(YX-Q4)withthegenelibraryNamibia(CP007555),CbukQ154(CP001020),Yunnan(EU000273),TW-1(KR697576),IE5(DQ379976)5ndividualplantsQfeverrickettsiapartofthegenesequencesimilarityis100%,withtheselectedprimersIS111a(M80806)geneticsimilarityis99%.ComparativeanalysisshowedthatinthewesternofLiaoningprovincedetectedYX-Q4indeedisQfeverrickettsia.Conclusions1.Throughtheinvestigationofanimalparasiticticksfromgrazingcattle,sheepanddogsinfectedinthewestofLiaoningprovince,itwasfoundthattheticksbelongedtofourgeneraonefamily,thegenuswhicharerespectivelyDermacentorsilvarum,Haemaphysalislongicornis,Haemaphysalisbispinosa,Ixodespersulcatus,Hyalommadetritum,HaemaphysalislongicornisandDermacentorsilvarumareadvantagetickspecies.2.Throughsevenkindsoftick-bornezoonoses-carryingsurvey,rickettsiaspottedfeverandQfeverrickettsiaarefoundinanimalparasiticticksinwesternLiaoningProvince.SpottedfeverrickettsiasaredetectedfromSuizhongCounty,QfeverrickettsiaisdetectedfromYixian.Tick-borneencephalitisseverefeverwiththrombocytopeniasyndrome,CrimeanCongohemorrhagicfever,babesiosis,Lymediseasearenotdetected.3.ResearchindicatesthatanimalparasiticticksinvivocniarryingrickettsiaspottedfeverandQfeverrickettsiatwokindsoftick-bornezoonosesinwesternofLiaoningProvince,therelevantdepartmentsshouldpaycloseattentiontoit,atthesametimeofstrengtheningpreventionandcontrolingofanimalparasitictickswork,alsowanttostrengthenthecrowdtick-bornezoonosespropagandaworkandintervention.KeywordsTicks;infection;zoonoses;carryingcase;investigation;westernofLiaoningProvince7 ·英文缩略语表·英文缩写英文全称中文译名Bpbasepair碱基对OmpAoutermembraneproteinA外膜蛋白A基因DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RNAribonucleicacid核糖核酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应LBLuria-BertaniculturemediumLB培养基Rpmrevolutionsperminute每分钟转数局部相似性基本查询工BLASTBasicLocalAlignmentSearchTool具NJneighborjoiningmethod邻位相连法TBETickborneencephalitis森林脑炎CCHFCrimeanCongohemorrhagicfever新疆出血热Severefeverwiththrombocytopenia发热伴血小板减少综合SFTSsyndrome征SFspottedfever斑点热ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定法RFLPRestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP限制性酶切技术RAPDrandomamplifiedpolymorphicDNA随机扩增多态性DNA8 ·论文·辽西地区动物寄生蜱及蜱传人畜共患病携带情况调查前言蜱是一种体外寄生的节肢动物，根据Barker等[1]的分类体系，蜱虫属于动物界节肢动物门、蛛形纲、螨亚纲、寄螨目、蜱总科，目前世界上已发现了3科(硬蜱科、软蜱科和纳蜱科)18属899种，2007年统计，国内蜱的种类有2科10属119种[2]，蜱的宿主包括200多种哺乳动物、120种鸟类、少数爬行类和两柄类动物，亦可侵袭人体[3]。蜱是一种吸血的节肢动物，引起动物贫血、消瘦、生长缓慢，严重时蜱毒素引起动物瘫痪死亡[4]，另外蜱比其他节肢动物的吸血量大，获得的能量多，也因此提高了其传播人畜共患病的潜力[5]。蜱在给动物严重危害的同时，蜱又是多种人畜共患病的重要传播媒介，经蜱传播的人畜共患病目前已知有80多种，国内现已知有60种可携带病原体，36种蜱虫已经鉴定出病原体[6]，其中对人类危害严重且最为常见的有森林脑炎、新疆出血热、巴贝斯、斑点热、Q热等[7-9]。近年来，全国多个省份发生了蜱虫咬人致死事件，引起了人们对蜱传人畜共患病的广泛关注，尤其是2010年9月，山东、河南等多个省份发生了蜱虫咬人致死事件，经研究后确诊为蜱虫传播的新布尼亚病毒感染，更加引起了人们对蜱传人畜共患病的高度重视。刘芸等2012年从辽宁省发热伴出血征候群人血液样本分离出12株新布尼亚病毒[10]，但辽宁省蜱体内感染情况无相关研究报道。而森林脑炎、新疆出血热、斑点热和Q热等在全国各地及辽宁省相邻省份蜱体内均有发现，辽宁省目前也没有相关的报道。蜱虫广泛存在于山区、草地等场所，造成放牧牛羊、牧羊犬及野生动物大量感染，进入山区、草地等场所及与牛羊、野生动物密切接触的人群也极易感染，所以蜱在危害动物的同时，蜱传人畜共患病也对人类健康构成了严重威胁。随着畜牧业和旅游业的快速发展，蜱虫携带的多种人畜共患传染病对动物和人类健康的危害也越来越明显，加强蜱及蜱传人畜共患病方面的研究工作，对保障畜牧业9 的健康发展和公共卫生安全都具有重要意义。辽西地区位于东经118.5°～126°，北纬38°～44°，区域内包括阜新、锦州、葫芦岛、朝阳、盘锦5个地级市，东接辽东经济区，西接河北，南邻渤海湾，北靠地域辽阔、资源丰富的内蒙腹地，该地区气候半湿润半干旱，自然类型多样，包括平原、丘陵、峡谷等，有着丰富的森林树木和草原植被，生态环境良好。该地区的环境气候条件有利于各种蜱虫的生长，是辽宁省蜱的重要流行区域。目前该区域内动物寄生蜱及蜱传人畜共患病的流行情况还未见有专门的研究报道，本研究的目的是为了阐明我省辽西地区动物寄生蜱种类和蜱传人畜共患病的携带情况、地域分布及分子流行病学规律，为辽西地区动物寄生蜱及蜱传人畜共患病的监测预警和防控工作提供科学依据。实验材料与方法一、实验材料（一）研究对象的选择根据辽西地区地理位置特点，由东至西选择凌海、义县、太和区、兴城、绥中5个县（市）区为调查基点，5个调查基点在地理位置上连接成一条直线，确定调查基点内放牧牛羊和犬（家养犬或牧羊犬）3种动物为采蜱对象。对其蜱寄生情况进行调查研究。从辽西地区3种动物体表采集蜱共计1646个，其中绥中县牛寄生蜱167个、羊寄生蜱149个、犬寄生蜱32个；兴城市牛寄生蜱135个、羊寄生蜱139个、犬寄生蜱31个；义县牛寄生蜱140个、羊寄生蜱136个、犬寄生蜱31个；太和区牛寄生蜱163个、羊寄生蜱186个、犬寄生蜱30个；凌海市牛寄生蜱145个、羊寄生蜱131个、犬寄生蜱31个。根据国内蜱传人畜共患病的流行与危害情况，选择蜱传人畜共患病中的7种重要人畜共患病为研究对象：森林脑炎（TBE）、新布尼亚病毒病（SFTS）、新疆出血热（CCHF）、斑点热（SF）、Q热(Qfever)、巴贝斯虫病（Babesiosis）、莱姆病（Lymedisease）。（二）主要试剂2×TaqMasterMix（含染料）、DL2000DNAMarker、通用基因组DNA/RNA10 提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，RNA反转录试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司，GIAGEN胶回收试剂盒购于北京诺博莱德科技有限公司，质粒小量提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，pGM-T载体连接试剂盒购买于北京天根生化科技有限公司，酒精、10%的KOH、二甲苯等常规化学试剂由辽宁医学院畜牧兽医学院微生物学实验室提供。（三）主要仪器奥林巴斯电光源解剖显微镜：日本奥林巴斯公司，型号为BX51微量移液器：上海，大龙牌干燥器：YHW-2中国厦门医疗电子仪器厂高速冷冻离心机：德国Thermo，Z323K微量高速离心机：北京京立离心机仪器有限公司，TG16-W型超净工作台：SW-CJ-1FD净化工作台，苏州净化设备有限公司梯度PCR仪：北京瑞尔欣德科技有限公司，TC-412电脑三恒多用电泳仪：DYY-12，北京市六一仪器厂-20℃冷冻冰柜：海尔公司产品-80℃超低温冰箱：海尔，DW-86L828W以上仪器设备由辽宁省科技厅重点实验室“辽宁医学院畜产品质量与安全工程实验室”提供。其他仪器：载玻片、盖玻片、眼科镊子、尺、镊子、解剖针、酒精灯、三脚架、培养皿等由辽宁医学院畜牧兽医学院兽医寄生虫学实验室和微生物学实验室提供。二、实验方法（一）蜱虫的采集选择辽西地区的绥中县、兴城市、义县、太和区、凌海市5个县市区为调查点，选择该区域内放牧牛、羊和家犬（家养犬或牧羊犬）3种动物为采蜱对象，在蜱流行季节（5-9月）进行蜱的采集工作，每月采集一次，共采集5次，保证每个调查点牛羊采集蜱的数量都在100个以上，犬采集蜱的数量都在30个以上，5个调查点11 共采集新鲜活蜱1646个，采集的蜱虫（主要为半饱血活蜱和饱血活蜱，少部分为未饱血蜱）要尽量保证结构的完整性（尤其是要保证假头的完整性），具体做法是：在牛羊、犬体表发现蜱以后，用胶头吸管吸取煤油后滴在动物皮肤蜱叮咬处，沿着假头与皮肤垂直方向，用尖头镊子轻缓地将其从皮肤中取出，避免口器折断保证蜱虫标本的形态结构完整[11]。再将蜱虫装入经处理过带有针眼的50ml的大离心管中，并标明采集的时间、地区和寄生动物种类，再将这些试管放入带有冰袋的保温泡沫箱中运送到实验室进行鉴定。（二）蜱虫的鉴定及处理1、蜱的鉴定选择未饱血的雌蜱和雄蜱，采用体视电光源解剖显微镜观察蜱的盾板、假头基、须肢、肛沟、缘垛、生殖孔等形态特征，参照《中国重要医学昆虫分类学与鉴别》[12]，依照分属检索表和分种检索表进行蜱种鉴定，以确定蜱的种类。2、蜱的处理由于有些蜱体积较小，单个样本检测困难，所以本实验尽量选择体型较大的饱血蜱为检测对象，同时对样本数量充足的蜱种采用10个同种蜱为1组进行检测，对样本数量不充足的蜱种采用5个同种蜱为1组进行检测。通过选择和处理后，根据蜱的种类和数量将样本分成90组，放入-80℃冰箱中保存，待下一步做蜱传人畜共患病病原学检测。（三）7种蜱传人畜共患病的病原体的检测1、核酸（DNA或RNA)的提取针对90组蜱样本分别进行检测，用无菌蒸馏水清洗样本后，用灭菌过的滤纸吸干，样本放入无菌研钵中，倒入适量的液氮立即反复研磨后，取200mg研磨后的研磨物转入试管中，用灭菌蒸馏水按1:1的比例稀释，按DNA或RNA提取试剂盒说明书提取总基因。2、RNA的反转录在无菌和冰浴的条件下，RNA总基因取10μL，加入1μL的oligo(dT)1812 primer，再加入11μL的Waternuclease-free，混合轻离心，65℃水浴5min，再加入4μL的5×Reactionbuffer，1μL的RNase，2μLdNTPMix,1μL的RevertAidM-MuLVRT，共20μL，混匀轻离心，将其放入PCR仪器的RT42反应程序中42℃60min,72℃10min进行反转录，反应完成后得到cDNA基因组，将cDNA基因组保存于–20℃备用。3、引物的选择针对上述7种蜱传人畜共患病，参照国内外相关文献选择需要的引物，引物选择详见表1。13 表1PCR扩增的目的基因及其引物序列类引物名称5′至3′产物退火目的基参考别大小温度因文献/bp/℃QCB-1GACGCCGGTGACATTAAAAAC28550htpB[13]热CB-2CTCAACTTCCACTGAATCIS111F1TACTGGGTGTTGATATTGC48552IS111a[14]IS111R1CCGTTTCATCCGCGGTGISF2GTAAAGTGATCTACACGA26048ISR2TTAACAGCGCTTGAACGTCoxp4TTAAGGTGGGCTGCGTGGTGATGG44858.5IS111[15]Coxm9GCTTCGTCCCGGTTCAACAATTGC牛P1CCGGAATTCAAATGGTGTCTTTTAAC79852MSA-巴P2ACCTCGAGCTACCATTAGTTATTA2c贝PZ1GCGGCTTCCAGAGCGCCAATGCCAG69361MSA-斯PZ2CTCGAAGATCAAAGAGACGGCAACT2cSP1CTTAGTATAAGCTTTTATACAGC33760nss-rDSP2ATAGGTCAGAAATTGAATGATACANAPIRO-AAATACCCAATCCTGACACAGGGG43858nss-rDPIRO-BTAAAATACGAATGCCCCCAACNA莱BGP1CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC555S-23[16]姆BGP2TAAGCTGACTAATACTAATTACCCS病BGIP1TCCTAGGCATTCACCATA26055rRNABGIP2GAGTTCGCGGGAGAOspC1ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG74063OspC[17]OspC1TTAAGGTTTTTTTGGACTTTCTGSR1GCGGCAGAGTAGGTTATT240545S-23[18]SSR2CTAGGCATTCACCATAGACTrRNA森TV1BATGCCCCACAATGGGACCTGC78156.4E蛋白[19]林TV1PAGAGAACGCWACTTCCATGAC基因脑TV2BTTGTGCCTGGCTCCGGTTTAT147056.9炎TV2PCAGAAGGAAGCTCATGGACAT新CCHFF2TGGATACTTTCACAAACTC41550S[20]疆CCHFR2GACAAATTCCCTGCACCA出CCHFF3GAGTGTGCCTGGGTTAGCTC26250血热CCHFR3GACATTACAATTTCGCCAGG斑OmpAFATGGCGAATATTTCTCCAAAA64053OmpA[21]点OmpARGTTCCGTTAATGGCAGCATCT热新SFTSFCTGGTTGAGAGGGCAGAGAC100145S[22]布SFTSRTCCACAGGATAACAAAAGGC尼SFTSP1GAGCCAGCAAGACAGAAGTT64050亚SFTSP2GAAGCCATAGAGAAGCGAAG14 4、PCR检测斑点热立克次体、Q热立克次体、莱姆病、巴贝斯虫病的病原体基因是DNA，因此PCR检测这4种病原体以提取的DNA为模板。森林脑炎、新疆布尼亚病、新疆出血热病的病原体基因是RNA，因此PCR检测这3种病毒以RNA反转录成的cDNA为模板。5、PCR反应体系PCR反应体系由模板3μL，上下游引物各1μL，2×TaqMasterMix10μL，ddH2O15μL组成，共是30μL。6、PCR反应参数PCR反应参数是：95℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度见表1、30s，70℃延伸90s，35个循环，70℃保温7min。7、电泳反应完成后，取5μLPCR产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过紫外透射仪观察并记录结果。得到目的条带的是PCR阳性产物，没有条带的是阴性。8、PCR阳性产物纯化回收按照如下步骤胶回收：（1）称重，称量灭菌的1.5EP离心管的重量。（2）切胶，用手术刀在紫外透射仪操作台中快准细的切下目的条带，放入称量好的离心管中捣碎。（3）算出胶的重量，称量胶和管总重量减去管的重量得到胶重量。（4）回收，加入与胶对应体积的Bindingbuffer,充分混匀，60℃水浴10min使其完全溶解；取750μLDNA-琼脂糖溶液转入HiBindDNA柱子，室温10000rpm离心1min，弃液；加300μLBindingBuffer洗柱，室温10000rpm离心1min，弃液；700μLSPWbuffer室温10000rpm离心1min，弃液，重复该步一次；空柱子室温10000rpm离心1min，弃液；把柱子装入一个新的灭菌1.5mL离心管，加入洗脱液50μL室温10000rpm离心1min，收集DNA。15 使用上述得到的DNA作为模板，按照原PCR反应参数与体系再次进行PCR扩增，取5μLPCR产物以1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过紫外透射仪观察，得到纯化后阳性PCR产物-20℃保存。9、大肠杆菌感受态制备将受体菌培养好后在无菌和冰浴的条件下，利用CaCl2法完成制备感受态细胞悬液，感受态细胞每100μL分装在小EP管，-80℃保存。10、目的基因与T-载体的连接纯化回收的目的DNA片段与pGM-TVector连接，连接反应体系是纯化回收的PCR产物5μL，pGM-TVector1μL,10×T4DNALigationBuffer1μL,T4DNALigase1μL,ddH2O2μL，共10μL。混匀轻离心转化，37℃过夜。11、质粒的转化按照如下步骤操作：（1）取80μL连接产物加入到从-80℃冰箱中取出后刚刚解冻状态下的大肠杆菌感受态细胞中，混匀轻离心，冰浴30min。（2）42℃水浴90s,冰浴3min。（3）加500μL37℃预热的不含抗生素的LB液体培养基，150rpm37℃摇床中振荡培养45min。（4）混匀离心管中菌液，吸取100μL加入到含有抗生素的LB固体培养基上，涂板，待平板干燥后，倒置放入37℃恒温箱过夜培养。12、质粒的提取和鉴定质粒提取步骤如下：（1）取5mL过夜培养菌液加入离心管，12000rpm离心30s,收集沉淀弃上清液。（2）向沉淀中加入250μLBufferP1,混匀。（3）加入250μLBufferP2，温和混匀至菌液裂解，溶液变得清亮粘稠。（4）加入350μLBufferN3，温和混匀到出现白色沉淀，12000rpm离心5min。（5）取上清液转移到吸附柱中，12000rpm离心30s，弃液。16 （6）加入150μLBufferPB,12000rpm离心30s,弃液。（7）加入400μLBufferPW,12000rpm离心1min，弃液。（8）将吸附柱注入新的离心管，加入80μLBufferEB,静置2min,12000rpm离心1min,弃柱，-20℃保存。质粒的鉴定：使用上述得到的质粒作为模板，按照原PCR反应参数与体系再次进行PCR扩增。取鉴定正确的菌株各50μLPCR质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。13、病原体基因序列分析比对针对检测出来的蜱传人畜共患病（阳性样本）的部分基因进行测序，选择NCBI中已公布的部分基因序列，应用BLAST在线软件与相关蜱传人畜共患病的部分基因序列进行相似性比对分析，根据分析结果进行进一步验证，最后确定辽西地区动物寄生蜱携带蜱传人畜共患病的种类。结果一、动物寄生蜱感染情况调查结果（一）种类和分布从辽西地区（绥中县、兴城市、义县、太和区、凌海市）放牧牛羊和犬3种动物体表采集的蜱共1646个，通过蜱种类鉴定发现这些蜱虫隶属于4属5种：分别为革蜱属的森林革蜱、血蜱属的长角血蜱和二棘血蜱、硬蜱属的全沟硬蜱、璃眼蜱属的残缘璃眼蜱。其中革蜱属的森林革蜱占26.2%（431/1646)、血蜱属的长角血蜱占34.7%（571/1646）、血蜱属的二棘血蜱占14.8%（243/1646）、硬蜱属的全沟硬蜱占16.0%（264/1646）、璃眼蜱属的残缘璃眼蜱占8.3%（137/1646）。经过数据分析得出长角血蜱和森林革蜱为辽西地区的优势蜱种，分别占34.7%和26.2%，残缘璃眼蜱所占比例最少，为8.3%，5个地区3种动物采集蜱的种类和数量情况见表2。17 蜱种类数量绥中县兴城市义县太和区凌海市牛羊犬牛羊犬牛羊犬牛羊犬牛羊犬森林革蜱431553702712114134957631338295长角血蜱571625725535817484215285617413616全沟硬蜱2641823727320192503427024280二棘血蜱24321180221832018732190262910残缘璃眼蜱13711140619012170122101690合计16461671493213513931140136311631863014513131表2不同地区3种动物采集蜱的种类和数量情况（二）5种蜱的形态学特征描述1、森林革蜱森林革蜱属革蜱属，呈卵圆形，假头短，雄蜱全长4.5mm，宽约2.9毫米，雌蜱饱血虫体达13.5mm×10mm（包括假头）。假头基的宽大于长，雄蜱假头基宽大约是长的1.5倍，雌蜱假头基宽为约长的2倍；雌蜱孔区较大，呈卵圆形，前端向外斜置，盾板呈卵圆形，有珐琅斑，颈沟短而深陷，雄蜱中垛比较窄，雌蜱颈沟周围及其后方有2对明显的条状褐斑，盾板侧缘有褐斑，气门板雄蜱逗点状雌蜱卵圆形，气门板背突较窄末端达到盾板边缘；肛门前端平均约为其他部分宽度的1.3倍；须肢粗短，第Ⅱ节背面后缘有突起；有4对足基节，是区分雄雌蜱的一个特征，雄蜱第1对足基节外距明显短于内距，背距发达呈三角形。雌蜱第1对足基节外距近似等于内距，背距突出；雄蜱第4对在足胫节、前跗节、跗节内缘有3个较小的齿突，雌蜱无。2、长角血蜱长角血蜱属血蜱属，呈卵圆形，雄蜱体长平均是2.28mm（2.10mm-2.38mm），宽是1.29-1.57mm，雌蜱体长平均是2.75mm(2.52mm-3.01mm)，宽平均是1.68mm(1.57mm-1.75mm)。假头基多呈矩形，两侧缘几乎平行；雄蜱的基突大呈三角形、末端尖，长与宽大约相等，雌蜱基突短而尖，长小于宽；雌蜱孔区卵圆形，盾板卵圆形，刻点粗细中等，分布稠密均匀；雄蜱缘垛明显窄而长；雄蜱颈沟短，雌蜱颈沟长；须肢向外侧突出，雄蜱呈钝角，雌蜱呈锐角状；背腹部具有刚毛；气门板卵圆形，背突短钝，雄蜱腹缘近乎平行于背缘，雌蜱腹缘圆角状突出，肛沟围绕在肛口之后,有明显缘垛；须肢中等粗细，各转节腹距呈脊状短小。18 3、全沟硬蜱全沟硬婢属硬蜱属，呈卵圆形，雄蜱体长宽约为2.45mm×1.33mm（包括假头），雌蜱未吸血时体长宽约为3.36mm×1.75mm（包括假头），中后部最宽，雄蜱缘褶窄小，耳状突出明显呈钝齿状；雄蜱假头基宽短，雌蜱呈五边形；基突短不明显；雌蜱孔区近三角形；雄蜱盾板中部微隆起，肩突短钝，缘凹窄小，颈沟浅，刻点浅分布均匀；雌蜱盾板中部最宽，肩突粗短，缘凹宽浅，颈沟浅窄，刻点分布均匀，在后部最为明显；气门板近圆形，气门斑大位于中部偏前，胚沟马蹄形，肛板后端最宽，似拱形；生殖孔位置雄蜱位于基节III后缘水平，雌蜱位于基节IV的水平；雄虫的内距略微超过基节Ⅱ前缘，雌蜱第1对足基节具一细长的内距，雌虫足基节Ⅰ内距的末端达基节Ⅱ的前1/3。4、残缘璃眼蜱残缘璃眼蜱属璃眼蜱属，体型较大，呈卵圆形，体色赤褐至暗褐，雄蜱长约4.9mm-5.5mm（包括假头），宽约为2.4mm-2.8mm雌蜱未吸血时体长约为5.2mm-5.5mm（包括假头），宽约为2.4mm-2.6mm。假头长，假头基两侧缘在须肢连接处最宽；基突粗短；盾板表面平滑有光泽，有稀少刻点；雄蜱头部近卵圆形,颈沟深长到盾板中部，背突渐细，末端圆顿，中垛明显，后中沟深，后缘达到中垛，腹面有呈长三角形肛侧板略宽，前端较尖，后端圆钝，副肛侧板末端圆钝，体后有1-2对短小的肛下板或付缺，气门板大，曲颈瓶形，背突窄长，顶突达到盾板边缘；雌蜱颈沟深长到盾板边缘，背面侧沟不明显，气门逗点形，背突向背方明显伸出，末端渐窄而稍向前，背缘有几丁质增厚部；足细长。5、二棘血蜱二棘血蜱属血蜱属，躯体呈黄褐色，雄蜱体长宽约为1.96mm×1.26mm（包括假头），雌蜱长宽约为2.38mm×1.40mm（包括假头）。假头基呈矩形，雄蜱宽约为长的1.6倍，侧缘先前略外斜，后缘平直；雌蜱宽约为长的1.8倍，侧缘和后缘直，表面有细刻点；基突雄蜱发达，长约等于宽，雌蜱大呈三角形、长略小于宽；雌蜱孔区长圆形；盾板卵圆形，刻点较少，细而浅，分布不均，雄蜱有长胜于宽的明显缘垛；气门板呈亚卵圆形，背突短小．圆钝。须肢粗细中等，转19 节腹距不一样，雄蜱转节I腹距三角形，转节II-IV腹距按节序渐小，雌蜱转节I腹距圆钝，转节II-IV腹距不明显。图1辽西地区5个调查点采集的部分蜱样本图2对蜱大小的测量20 图3长角血蜱的假头及假头基图4长角血蜱后缘的缘垛二、7种蜱传人畜共患病携带情况调查结果（一）7种蜱传人畜共患病携带情况检测结果1、在辽西地区90组蜱样本中检测到斑点热立克次体和Q热立克次体2种21 蜱传人畜共患病，其他引物对应的蜱组中没有检测到森林脑炎、新布尼亚病毒病、新疆出血热、巴贝斯虫病、莱姆病。2、斑点热立克次体的检测结果：在绥中县的2种2组蜱样本中（长角血蜱第18组、森林革蜱第39组）检测到斑点热立克次体。残缘璃眼蜱、全沟硬蜱和二棘血蜱3种蜱样本中均未检测到斑点热立克次体。兴城、义县、太和区、凌海4个县市区所有蜱样本中均未检测到斑点热立克次体。3、Q热立克次体的检测结果：在义县的1种1组蜱样本中（长角血蜱第4组）检测到Q热立克次体。森林革蜱、残缘璃眼蜱、全沟硬蜱和二棘血蜱4种蜱样本中均未检测到Q热立克次体。绥中县、兴城、太和区、凌海4个县市区所有蜱样本中均未检测到Q热立克次体。90组待检蜱按不同地区、不同蜱种分组编号情况详见表3。不同地区、不同蜱种斑点热立克次体和Q热立克次体核酸阳性情况详见表4、表5。蜱中斑点热立克次体PCR检测结果详见图5，蜱中Q热立克次体PCR检测结果详见图6。表390组待检蜱按不同地区、不同蜱种分组编号情况蜱名称分组义县（号）兴城（号）绥中县（号）太和区（号）凌海市（号）长角血蜱306（1-6）8（7-14）7（15-21）5（22-26）4（23-30）森林革蜱204（31-34）4（35-38）5（39-43）4（44-47）3（48-50）全沟硬蜱153（51-53）3（54-56）2（57-58）4（59-62）3（63-65）二棘血蜱154（66-69）3（70-72）3（73-75）3（76-78）2（79-80）残缘璃眼蜱103（81-83）2（84-85）2（86-87）2（88-89）1（90）合计（组）90202019181322 表4不同地区、不同蜱种斑点热立克次体检测结果蜱名称分组义县兴城市绥中县太和区凌海市长角血蜱306（－）8（－）7（18“＋”）5（－）4（－）森林革蜱204（－）4（－）5（39“＋”）4（－）3（－）全沟硬蜱153（－）3（－）2（－）4（－）3（－）二棘血蜱154（－）3（－）3（－）3（－）2（－）残缘璃眼蜱103（－）2（－）2（－）2（－）1（－）合计（组）9020（－）20（－）17（－）、2（＋）18（－）13（－）注：“＋”为阳性、“－”为阴性表5不同地区、不同蜱种Q热立克次体检测结果蜱名称分组义县兴城市绥中县太和区凌海市长角血蜱306（4“＋”）8（－）7（－）5（－）4（－）森林革蜱204（－）4（－）5（－）4（－）3（－）全沟硬蜱153（－）3（－）2（－）4（－）3（－）二棘血蜱154（－）3（－）3（－）3（－）2（－）残缘璃眼蜱103（－）2（－）2（－）2（－）1（－）合计（组）9019（－）、1（＋）20（－）19（－）18（－）13（－）注：“＋”为阳性、“－”为阴性23 ←640bp图5蜱中斑点热立克次体PCR检测结果电泳图注：M:Marker；1：绥中县样本SZX-BD18；2：绥中县样本SZX-BD39；3-4：阴性对照←260bp图6蜱中Q热立克次体PCR检测结果电泳图注：M:Marker；1：义县样本YX-Q4；2：阴性对照（二）2种蜱传人畜共患病部分基因的测序结果检测到的2株斑点热立克次体分别命名为SZX-BD18和SZX-BD39，检测到的1株Q热立克次体命名为YX-Q4，3个菌株质粒分别送上海生工生物工程技术24 服务有限公司进行部分基因测序。测序结果表明，2株斑点热立克次体（SZX-BD18和SZX-BD39）的部分基因序列完全相同，大小均为640bp，Q热立克次体的部分基因序列大小为260bp，均与预期片段大小一致。SZX-BD18和SZX-BD39的部分基因测序结果和波峰图详见图7、图8，Q热立克次体的部分基因测序结果和波峰图详见图9、图10。TATGGCGAATATTTCTCCAAAATTATTTCAAAAAGCAATACAACAAGGTCTTAAAGCCGCTTTATTCACCACCTCAACCGCAGCGATAATGCTGAGTAGTAGTGGGGTACTCGGTGTTGCTGCAGGTGTTATTGCTACTAATGATGATGCAGCATTTAGTAATGATGCTGAGGCCAATAATTGGGATGAGATAACGGCTGAAGGGGTAGCTAATGGTATTCCTGCTGGCGGTCCTCAAAACAATTGGGCATTTACTTACAGTGCTGATTATACTATCACTGCAGATGTAGTCGATCGTATTATTACGGCTATAAATGTTGCGGGTACTACTCCCGTAGGTCTAAATATTGCTCAAAATACCGTCGTTGGTTCGATTATAACTAGAGGTAACTTGTTGCCTGTTACTATTGCTGGCAAAAGCTTAACTTTAAACGGTACTAATGCTGTTGCTGCAAATCATGGTTTTGATGCTCCGGCCGATAATTATACAGGTTTAGGAAATATAACCTTAGGGGGAGCGAATGCTGAATTAATTATACAATCTGCAACCCCGGCAAAGATAACACTTGCAGGAAATATAGATGGAGGAGGTATAATAACTGTCAAGACAGATGCTGCCATTAACGGAACA图7SZX-BD18和SZX-BD39的部分基因测序结果注：碱基颜色部分表示上、下游引物位置25 图8SZX-BD18和SZX-BD39的部分基因测序波峰图TGTAAAGTGATCTACACGAGACGGGTTAAGCGTGCTCAGTATGTATCCACCGTAGCCAGTCTTAAGGTGGGCTGCGTGGTGATGGAAGCGTGTGGAGGAGCGAACCATTGGTATCGGACGTTTATGGGGATGGGTATCTCAACGCAGTTGATCAGTCCGCAGCACGTCAAACCGTATGTCAAAAGTAACAAGAATGATCGTAACGATGCGCAGGCGATAGCTGAAGCGGCTTCCCGCGCCTCGATGCGGTTTGTGCGGGGTAAAACGGTGGAACAACAAGACGTTCAAGCGCTGTTAAA图9Q4的部分基因测序结果注：碱基颜色部分表示上、下游引物位置图10SZX-BD18和SZX-BD39的部分基因测序波峰图26 （三）2种蜱传人畜共患病部分基因的序列相似性比对分析结果1、斑点热立克次体SZX-BD18株与SZX-BD39株的基因片段序列完全相同，共计640bp。选择NCBI中已公布的斑点热立克次体基因片段序列，通过BLAST在线分析，结果表明，SZX-BD18株/SZX-BD39株与基因库中的FUJ98(AF169629)、HlR/D91（KC888951）、QHD-1(HQ651815)、QHD-2(HQ651816)、SHHMU-5（JX841232)、SHHMU-3（JX841230）6个斑点热立克次体的部分基因序列相似性达到99%，同时与HL-93(AF179364)的相似性为95%、与JL-02(AY093696)的相似性为93%。根据以上比对分析结果证实检测到的SZX-BD18株与SZX-BD39株确为斑点热立克次体。选择的比对基因情况详见表6。2、Q热YX-Q4菌株IS111a部分基因测序结果为260bp。选择NCBI中已公布的Q热立克次体部分基因片段序列，通过BLAST在线分析，结果表明，检测菌株（YX-Q4株）与基因库中的Namibia(CP007555)、CbukQ154(CP001020)、TW-1（EU000273）、Yunnan-1（KR697576）、IE5（DQ379976）的Q热立克次体部分基因相似性为100%，与IS111a（M80806)的部分基因序列相似性达到99%。根据以上比对分析结果证实检测到的YX-Q4株确为Q热立克次体。选择的比对基因情况详见表7。27 编号名称登陆号地域分布相似性1FUJ98AF169629福建99%2HlR/D91KC888951韩国99%3QHD-1HQ651815河北秦皇岛99%4QHD-2HQ651816河北秦皇岛99%5SHHMU-3JX841230北京99%6SHHMU-5JX841232北京99%7JL-02AY093696吉林93%8HL-93AF179364黑龙江95%9SZ-BD18中国辽宁绥中县10SZ-BD39中国辽宁绥中县表6SZX-BD18/39与NCBI中公布的斑点热立克次体部分基因序列对比分析结果表7YX-Q4与NCBI中公布的Q热立克次体部分基因序列对比分析结果编号名称注册号分布文内符号1CbukQ154CP001020美国100%2TW-1EU000273台湾100%3NamibiaCP007555德国100%4Yunnan-1KR697576中国云南100%5IE5DQ379976埃及100%6Cb175HG825990拉丁美洲99%8IS111aM80806南美99%9YX-Q4中国辽宁义县28 讨论1、关于辽宁西部地区动物寄生蜱的种类目前世界上已发现蜱的种类有3科18属899种，2007年统计，国内蜱的种类有2科10属117种[2]，蜱的宿主范围包括200多种哺乳动物、120种鸟类、少数爬行类和两栖类动物[3]，关于国内动物寄生蜱调查的相关文献较多，吕锡宏等[23]采集松江地区动物体表蜱共266只，隶属于1科2属2种，分别为血红扇头蜱88.72%、长角血蜱11.28%。余向华[24]等对温州市放牧黄牛、猎狗、野猪和鼠形动物体表寄生蜱进行分类鉴定，蜱共353只，隶属于1科4属7种，分别为长角血蜱49.86%、粒形硬蜱18.69%、微小牛蜱16.71%，豪猪血蜱9.63%、北岗血蜱和台湾革蜱2.27%、卵形硬蜱0.57%。呼满霞[25]应用布旗法调查绥芬河口蜱种，共捕获799只，隶属于1科3属4种，分别为全沟硬蜱71.8%、嗜群血蜱20.8%、日本血蜱5.8%、森林革蜱1.7%。姜晓琳[26]等采集山东蓬莱、莱州2市动物体表蜱虫140只，隶属于1科2属3种，分别为长角血蜱91.4%，森林革蜱5%、血[27、28]红扇头蜱3.6%。刘孝刚等对辽宁省部分地区放牧绒山羊和牛体表寄生蜱进行了调查，发现蜱5种，隶属于1科4属，分别为长角血蜱97.1%、残缘璃眼蜱76.5%、全沟硬蜱31.4%、血红扇头蜱22.5%、森林革蜱11.8%。综合分析上述研究结果可以发现，随着地理位置、生态环境、气候条件等因素的不同动物寄生蜱的感染种类和区系分布出现很大的差异，尤其在地理位置方面差异表现更加明显。本研究从辽西地区牛羊、犬3种动物体表采集蜱虫1646只，经鉴定隶属于1科4属5种，其中长角血蜱34.7%（571/1646）、森林革蜱26.2%（431/1646)、全沟硬蜱16.0%（264/1646）、二棘血蜱14.8%（243/1646）、残缘璃眼蜱8.3%（137/1646），研究结果与刘孝刚等报道的结果相近，不同之处是本次调查没有发现血红扇头蜱，而发现了二棘血蜱。蜱是危害放牧动物的一种重要寄生虫病，同时还能传播多种人畜共患病，研究不同地区蜱的感染种类和区系分布情况，对科学防治蜱及蜱传人畜共患病具有29 重要意义，本研究阐明了辽宁西部地区动物寄生蜱的种类和优势与蜱种，为该地区蜱的防治工作和蜱传人畜共患病的防控工作奠定了基础。2、关于7种蜱传人畜共患病的流行情况经蜱传播的人畜共患病目前已知有80多种[6]，本研究只选择了其中的7种蜱传人畜共患病作为本次调查研究的对象，主要是考虑了如下几个因素，一是比较常见而且对人类危害较大，相关文献显示蜱传播的人畜共患病中有森林脑炎、新疆出血热、巴贝斯虫、斑点热、Q热等对人类危害严重且最为常见[29-31]，另外近年来，全国多个省份发生了蜱虫咬人致死事件，经病原学诊断确诊为发热伴血小板减少综合，简称新型布尼亚病毒[32]，该病为一种新发的蜱传人畜共患病，引起人们的广泛高度关注，所以该病被列入本次研究对象，而莱姆病已经在辽宁临近的吉林省和黑龙江省蜱体内检测到[33,34]，综合上述情况，本研究选择森林脑炎、新布尼亚病毒病、新疆出血热、斑点热、Q热、巴贝斯虫病、莱姆病7种蜱传人畜共患病为研究对象。3、关于辽西地区蜱传人畜共患病的检测结果关于本研究选择的7种蜱传人畜共患病的流行和分布情况。赵俊伟等[35]对2012年以前我国7种蜱传人畜共患病的流行和分布情况进行了归纳和总结：蜱传森林脑炎在我国的流行和分布主要在内蒙古自治区、黑龙江、吉林等地区，全沟硬蜱为主要的传播媒介；新疆出血热流行和分布主要在黑龙江、吉林、安徽、青海、四川省等地区；蜱传新布尼亚病毒是主要流行于我国中东部地区；蜱传斑点热的流行和分布主要在我国的黑龙江、内蒙古、云南、福建等全国大部分地区；蜱传Q热的流行和分布主要在我国的云南、北京、河北、内蒙古、黑龙江、西藏等地区；蜱传巴贝斯原虫的流行和分布主要在我国的黑龙江、西藏、内蒙古、青海等地区；HaoQ等[36]从河北、湖南、新疆、宁夏等11个省市采集到的蜱虫中分离得到莱姆病病原体（伯氏疏螺旋体）。关于7种蜱传人畜共患病在辽宁省流行和分布情况。通过本次调查研究，在辽宁西部地区绥中县蜱样本中检测到斑点热立克次体，在义县蜱样本中检测到Q热立克次体，没有检测到森林脑炎、新布尼亚病毒病、新疆出血热、巴贝斯虫病、30 莱姆病5种蜱传人畜共患病，7种蜱传人畜共患病在辽宁省的流行和分布情况详见图11。研究结果填补了辽宁省本领域的研究空白，在科学防控蜱传人畜共患病，保障人类健康方面具有重要意义。本次研究结果提示，辽宁西部地区斑点热和Q热2种蜱传人畜共患病存在很高的人群感染风险，是防治的重点，其他5种蜱传人畜共患病本次调查虽然没有发现，但辽宁周边地区已经存在，尤其是新布尼亚病毒病在辽宁省东部山区的人体内已经发现[10]，该病毒为新发现的病毒，其传播途径、致病机制等尚不清楚，但已经有人传人的报道[37-39]，随着动物商品交易的日益频繁，异地传播的风险也很大，相关部门也应该加强监测预警和防控工作。关于斑点热和Q热2种蜱传人畜共患病在辽西地区的地域分布问题。本次调查研究结果显示，斑点热立克次体只在绥中县的蜱样本中检测到，而其他4个县市区（兴城、义县、太和区、凌海）所有蜱样本中均未检测到斑点热立克次体，Q热立克次体只在义县的蜱样本中检测到，从地理位置看从西至东依次为绥中县→兴城→太和区→凌海→义县，2种蜱传人畜共患病的分布均呈点式分布，相邻的调查点均没有发现，其中的原因有待于进一步研究。31 图11调查区域及蜱传人畜共患病分布情况注：代表调查区域；表斑点热检出地区；代表Q热检出地区4、关于SZX-BD18／39和YX-Q4的基因序列相似性比对结果通过NCBI中BLAST在线分析，SZX-BD18株/39株与FUJ98(AF169629)、HlR/D91（KC888951）、QHD-1(HQ651815)、QHD-2(HQ651816)、SHHMU-5（JX841232)、SHHMU-3（JX841230）6个斑点热立克次体的相似性达到99%，同时与HL-93(AF179364)的相似性为95%、与JL-02(AY093696)的相似性为93%。YX-Q4株与Namibia(CP007555)、CbukQ154(CP001020)、TW-1（EU000273）、Yunnan-1（KR697576）、IE5（DQ379976）5个Q热立克次体的相似性为100%，与IS111a（M80806)的相似性达到99%。本研究通过基因序列相似性比对分析结果，证实了在辽西地区检测到的SZX-BD18株/39株确为斑点热立克次体。检测到的YX-Q4株确为Q热立克次体。32 关于本次检测到的SZX-BD18株/39株和YX-Q4株与上述NCBI中公布的斑点热立克次体和Q热立克次体的遗传进化关系还有待于进一步研究。5、关于不同蜱种对蜱传人畜共患病的易感性问题不同蜱种对蜱传人畜共患病的易感性是否存在差异问题，目前国内外还没有专门的研究报道，冯立等[40]的研究表明在森林革蜱、嗜群血蜱、日本血蜱、全沟硬蜱4种蜱中均检测到斑点热立克次体，森林革蜱的检出率最高，张芳等[41]的研究表明，检测中华革蜱、森林革蜱、银盾革蜱、残缘玻眼蜱、盾糙璃眼蜱、日本血蜱、嗜群血蜱、草原革蜱、青海血蜱、鼢鼠硬蜱、草原硬蜱11种蜱，在森林革蜱、银盾革蜱、残缘玻眼蜱、盾糙璃眼蜱、日本血蜱、嗜群血蜱、草原革蜱、青海血蜱8种蜱体内检测到Q热立克次体。二者均没有发现不同蜱种对蜱传人畜共患病的易感性存在差异，而叶晓东等[42]却认为在动物、蜱与立克次体三者的生态循环中，蜱既是重要的传播媒介又是保菌宿主，蜱传人畜共患病和蜱的种属之间可能具有一定的特异性，他在总结已有的文献中发现有些种类如康氏立克次体仅局限于扇头蜱属种类，而有些种类如非洲立克次体、斯洛伐克立克次体可由花蜱属、革蜱属和硬蜱属种类传播。本研究结果显示，在绥中县的5种蜱样本检测工作中，在长角血蜱和森林革蜱中检测到斑点热立克次体，而残缘璃眼蜱、全沟硬蜱和二棘血蜱3种蜱样本中均未检测到斑点热立克次体。在义县的5种蜱样本检测工作中，在长角血蜱中检测到Q热立克次体，而在森林革蜱、残缘璃眼蜱、全沟硬蜱和二棘血蜱4种蜱样本中均未检测到Q热立克次体。检测结果没有体现出一定的规律性，也不能说明不同蜱种对蜱传人畜共患病的易感性是否存在差异这个问题，所以不同蜱种对蜱传人畜共患病的易感性是否存在差异问题还有待于进一步研究。33 结论1、通过对辽西地区动物寄生蜱感染情况的调查，发现该地区放牧牛羊和犬寄生蜱有5种，分别隶属于1科4属：革蜱属的森林革蜱，血蜱属的长角血蜱和二棘血蜱，硬蜱属的全沟硬蜱，璃眼蜱属的残缘璃眼蜱。其中长角血蜱和森林革蜱为优势蜱种。2、通过7种蜱传人畜共患病携带情况调查，发现辽西地区动物寄生蜱体内携带斑点热立克次体和Q热立克次体2种蜱传人畜共患病，斑点热立克次体只从绥中县检测到，Q热立克次体只从义县检测到。在辽西地区没有检测到森林脑炎、新疆布尼亚病毒、新疆出血热、莱姆病和巴贝斯虫5种蜱传人畜共患病。3、研究结果表明，辽西地区动物寄生蜱体内携带斑点热立克次体和Q热立克次体2种蜱传人畜共患病，人类存在一定的感染风险，应引起相关部门的高度重视，在加强动物寄生蜱防治工作的同时，也要加强人群蜱传人畜共患病宣传和干预工作。34 ·本研究创新性的自我评价·1、本研究首次确定了辽西地区放牧牛羊及犬3种动物感染蜱的种类和优势蜱种，感染蜱的种类为5种，分别为革蜱属的森林革蜱、血蜱属的长角血蜱和二棘血蜱、硬蜱属的全沟硬蜱和璃眼蜱属的残缘璃眼蜱，森林革蜱和长角血蜱是优势蜱种。研究结果为该地区相关动物寄生蜱的防治工作提供了科学依据。2、本研究首次在辽西地区动物寄生蜱中检测到斑点热立克次体和Q热立克次体2种蜱传人畜共患病，在同期检测工作中没有检测到森林脑炎、新布尼亚病毒、新疆出血热、莱姆病和巴贝斯虫5种蜱传人畜共患病。研究结果填补了辽宁省本领域的研究空白，在科学防控蜱传人畜共患病，保障人类健康方面具有重要意义。3、研究成果发表论文1篇，《辽西地区蜱斑点热立克次体的携带情况》发表于《畜牧与兽医》2015年4期。本论文获中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第13次学术研讨会优秀论文3等奖。35 ·参考文献·1姜东续,李娟,吕敏娜,等.广东省牛体寄生蜱种及携带病原情况调查.畜牧与兽医,2012,47(2):95-98.2ChenZ,YangX,BuF,etal.Ticks(Acari:Ixodoidea:Argasidae,Ixodidae)ofChina.ExperimentalandAppliedAcarology,2010,51(4):393-404.3MansBJ,NeitzAW.Adaptationoftickstoablood-feedingenvironment:evolutionfromafunctionalperspective.InsectBiochemMol,2004,34(1):1-17.4SocolovschiC,DoudierB,PagesF,etal.Ticksandhumantick-bornediseasesinAfrica.MedecineTropicale,2008,68(2):119-133.5汪明.兽医寄生虫学·第三版·北京:中国农业出版社,2003:342.6YuZJ,WangH,WangTH,etal.Tick-bornepathogensandthevectorpotentialofticksinChina.Parasites&Vectors,2015,8(1):24-32.7ChenZ,LiuQ,LiuJQ,etal.Tick-bornepathogensandassociatedco-infectionsintickscollectedfromdomesticanimalsincentralChina.Parasites&Vectors,2014,7(1):237-244.8刘琪,王伟利,孟庆峰.蜱及蜱传病的研究进展.安徽农业科学,2013,41(3):1107-1109.9代旭磊,宝福凯,柳爱华,等.新发蜱媒传染病的国内外研究概况.寄生虫与医学昆虫学报,2013,20(3):202-209.10刘芸,姚文清,耿英芝,等.辽宁省首次发现的新布尼亚病毒其培养特性的研究.中国人兽共患病学报,2012,28(3):237-240.11代艳艳,周桐,罗福江,等.新疆南疆地区牛羊寄生蜱类调查.新疆农垦科技,2015,38(3):40-42.12RoyMK,KuwabaraY,HaraK,etal.PeptidesfromtheNterminalendofborinelactoferrininduceapoptosisinhumanleukemic(HL.60)ceils.JDairySci,2002,85(9):2065-2074.13YuasaY,YoshiieK,TakasakiT,etal.RetrospectivesurveyofchronicQfeverinJapanbyusingPCRtodetectCoxiellaburnetiiDNAinparaffin-embeddedclinicalsamples.JClinMicrobiol,1996,34(4):824–827.36 14Fournier,Pierre-Edouard,RaoultDidier.ComparisonofPCRandserologyassaysforearlyofacuteQfever.JClinMicrobiol,2003,41(11):5094–5098.15浦昀,李娟,宋秀环,等.吉林口岸地区主要蜱类及蜱媒病原检测分析.寄生虫与医学昆虫学报,2009,16(4):228-232.16付钰广.莱姆病两种检测方法的建立:［硕士学位论文].北京:中国农业科学院,2011.17黄海楠,丁壮,何静,等.吉林林区动物莱姆病螺旋体感染的调查研究.中国人兽共患病学报,2006,22(8):785-788.18何浩,郝琴,呼满霞,等.黑龙江省东部边境口岸莱姆病生物媒介调查及病原分型研究.中华流行病学杂志,2007,28(1):70-73.19陈露菲,刘彦成,陈淑红,等.我国新分离森林脑炎病毒E基因特征分析.病毒学报，2008,24(3):202-207.20吕新军,唐青,冯育明,等.新疆南部地区蜱传虫媒病毒分子生物学调查.中华实验和临床病毒学杂志,2005,19(4):325-330.21BouxV,FournierPE,RaoultD.DifferentiationofspottedfevergrouprickettsiaebysequencingandanalysisofrestrictionfragmentlengthpolymorphismofPCR-amplifiedDNAofthegeneencodingtheproteinrOmpA.JClinMicrobiol,1996,34(9):2058-2065.22刘洋,黄学勇,杜燕华,等.河南发热伴血小板减少综合征流行区蜱类分布及媒介携带新布尼亚病毒状况调查.中华预防医学杂志,2012,46(6):500-504.23吕锡宏,刘洪霞,郭晓芹,等.上海市松江区蜱虫种类及分布的调查分析.中华卫生杀虫药械,2015,21(4):378-380.24余向华,张孝和,倪庆翔,等.温州市宿主动物体表寄生蜱初步调查分析.中国媒介生物学及控制杂志,2012,23(6):572-580.25姜晓林,王显军,李建东,等.家养动物体表蜱中发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒分离及鉴定.病毒学报,2012,28(3):253-257.26呼满霞.绥芬河口岸蜱类调查报告.口岸卫生控制,2014,19(2):44-45.27刘孝刚,张世伟,于本良,等.辽宁绒山羊寄生虫流行区系的调查.畜牧与兽医，2011,43(4):80-81.28刘孝刚,于迪,于本良,等.辽宁地区肉牛寄生虫流行区系调查.畜牧与兽37 医,2014,46(2):85-86.29GaoX，NasciR，LiangG.TheneglectedarboviralinfectionsinmainlandChina.PLoSNeglTropDis,2010,4(4):624-632.30YuXJ,LiangMF,ZhangSY,etal.FeverwiththrombocytopeniaassociatedwithanovelbunyavirusinChina.NEnglJMed,2011,364(16):1523-1532.31ZhangL,LiuY,NiD,etal.NosocomialtransmissionofhumangranulocyticanaplasmosisinChina.JAMA,2008,300(19):2263-2270.32吕燕宁,窦相峰,王小梅,等.北京地区动物及蜱中新型布尼亚病毒携带状况的初步调查与分析.国际病毒学杂志,2011,18(2):33-36.33牛庆丽,关贵全,杨吉飞,等.采用PCR方法对我国蜱伯氏疏螺旋体感染的流行病学调查.中国预防兽医学报,2010,32(12):984-987.34唐琨,左双燕,李颖,等.黑龙江省旅游区蜱伯氏疏螺旋体和斑点热群立克次体复合感染的动态调查.中华流行病学杂志,2012,33(5):513-516.35赵俊伟,王环宇,王英,等.中国蜱传病原体分布研究概况.中国媒介生物学及控制杂志,2012,23(5):445-448.36HaoQ,HouX,GengZ,etal.DistributionofBorreliaburgdorferisensulatoinChina.JClinMicrobiol,2011,49(2):647-650.37WangZ,ZhangJ,MaoLL,etal.EpidemiologicalcharacteristicsofseverefeverwiththrombocytopeniasyndromeinLiaoningprovince,2010-2013.ZhonghuaYuFangYiXueZaZhi,2016,50(4):362-363.38GaiZ,LiangM,ZhangY,etal.Person-to-persontransmissionofseverefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirusthroughbloodcontact.ClinInfectDis,2012,54(2):249-252.39LiuY,LiQ,HuW,etal.Person-to-persontransmissionofseverefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus.VectorBorneZoonoticDis,2012,12(2):156-160.40冯立,王卓,杨军,等.黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测.中国人兽共患病学报,2014,30(10):1020-1023.41张芳,刘增加.我国西北部分地区Q热分子流行病学调查.中国病原生物学杂38 42志,2011,6(3):183-185.43叶晓东,郑寿贵,孙毅,等.蜱传斑点热群立克次体研究进展.中国人兽共患病学报,2008,24(4):368-371.39 ·附录·一、文献综述蜱和蜱传病一、蜱虫的基本特征概述蜱，又名蜱虫、壁虱、扁虱、草爬子，是一种体形极小的蛛形纲蜱螨亚纲蜱总科的节肢动物寄生物，仅约火柴棒头大小[1]。蜱虫体成椭圆形,未吸血时腹背扁平,背面隆起,成虫体长2~10mm;饱血后胀大可长达30mm。蜱分颖体和躯体两部分，其形态结构包括假头、假头基、盾板、气门板、须肢、缘垛、腹侧沟等。蜱虫分3科有硬蜱科、软蜱科和纳蜱科，软蜱与硬蜱的主要区别是有无盾板，软蜱无盾板，假头在前面腹面头窝内，从背面不易看到。蜱虫呈变态发育，一生发育过程分为卵、幼虫、若虫和成虫四个阶段，由幼蜱到若蜱和由若蜱到成蜱均需经1~4周蜕皮发育而成[2]。蜱在每个阶段发育成长时都需要吸血，硬蜱多白天吸血，软蜱多夜间吸血，硬蜱一生产卵一次，软蜱吸饱血交配后终生可产卵，雌蜱不吸血不会产卵的[3]。不同蜱种的蜱虫在不同的生长时期和不同的生存环境的寿命是不一样的，饱血后，雄蜱比雌蜱的寿命长；低温潮湿的状态下，硬蜱的存活时间较长。蜱虫寻找宿主主要依靠对动物排除的汗臭和CO2的敏感察觉，当与宿主距离15m之内，一旦感知就可能攀爬到宿主身上。温度、水分、土壤、动植物等都可影响蜱虫的活动及季节消长，一般5-9月份是蜱虫活动的高峰期。（一）蜱虫的鉴定方法和分类1、传统鉴定方法分类应用蜱虫本身的形态学特有的结构鉴定蜱种的特征、气相色谱法区分不同的蜱种和分析表行变异与地理位置的关系、同工酶分析法用于研究蜱虫种内与种间的遗传变异。利用传统鉴定法，Hoogstraal和Aeschlimann经多年的研究提出了传统的蜱类系统进化假说。蜱分为3科（硬蜱科、软蜱科、纳蜱科），7亚科（硬蜱亚科、花蜱亚科、血蜱亚科、璃眼蜱亚科、扇头蜱亚科、钝缘蜱亚科、锐缘蜱亚科），40 16属（硬蜱属、花蜱属、盲花蜱属、血蜱属、璃眼蜱属、斑蜱属、革蜱属、扇革蜱属、异扇蜱属、扇头蜱属、牛蜱属、巨足蜱属、钝缘蜱属、残缘蜱属、锐缘蜱属、纳蜱属）[4,5]。2、现代鉴定方法分类20世纪90年代以后，分子生物学技术在蜱种鉴定、种群水平、种间及种内变异、系统进化研究中的得到应用，研究中主要涉及的分子标记有ITS1和ITS2、COI和COII、线粒体16SrDNA，12SrDNA[6,7]。根据现代鉴定法和传统鉴定法的综合分析，学者Barker和Murrell提出了另一种对蜱类系统进化假说，但在软蜱科划分上由于缺乏足够的分子生物学证据没有得到广泛的认可。Barker和Murrell将蜱分为3科（硬蜱科、软蜱科、纳蜱科），9亚科21属（凹沟蜱亚科的凹沟蜱属、硬蜱亚科的澳大利亚硬蜱属和其他硬蜱属、花蜱亚科的花蜱属和须角蜱属、血蜱亚科的血蜱属、璃眼蜱亚科的璃眼蜱属、斑蜱属、革蜱属、扇革蜱属、异扇蜱属、诺蜱属和巨足蜱属、扇头蜱亚科的牛蜱属和扇头蜱属、钝缘蜱亚科的钝缘蜱属、残缘蜱属、伪盾蜱属和匙喙蜱属、锐缘蜱亚科的锐缘蜱属、纳蜱亚科的纳蜱属）[8]。（二）蜱虫的危害蜱虫的危害分为直接危害和间接危害：直接危害是蜱虫寄生在动物体表时直接叮咬分泌毒素，大量的吸食血液，可引起动物营养和发育不良、代谢障碍、行走不便，甚至发生急性蜱瘫痪死亡等[9]。间接危害就是蜱虫作为病原体携带者或传播媒介传播疾病，简称蜱传疾病。其中主要是给人类带来各种不适和传播疾病。其携带的病原体包括如新型布尼亚病毒、森林脑炎、出血热等126种病毒、野兔热、布氏杆菌、鼠疫等14种细菌、贝氏柯克斯体、斑点热立克次体、劳氏立克次体等20种立克次体、伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体等18种螺旋体、巴贝斯虫、孢子虫、泰勒虫等32种原虫、1种衣原体、1种支原体、1种巴尔通氏体和2种线虫[10]。蜱媒传染病在国内外共发现18种，即颚木斯克出血热、苏格兰脑炎、凯萨努森林病、波瓦桑脑炎、落基山斑点热、钮扣热、昆士兰蜱传斑疹伤寒、阵发性立克次体病、人巴贝虫病、蜱41 传脑炎、北亚蜱媒斑点热、克里米亚-刚果出血热、Q热、莱姆病、土拉弗氏菌病、蜱传回归热、人埃立克体病和蜱瘫，其中后10种疾病在我国也有分布[11]。在国内外蜱传病都有引起过疫情爆发，如澳大利亚有暴发过Q热疫情、美国暴发过莱姆病疫情、河南爆发过新布尼亚疫情等，因此蜱传病的危害已不容忽视[12]。二、几种重要的蜱传染病（一）森林脑炎森林脑炎俗称蜱媒脑炎，是森林地区特有的一种经蜱传播由森林脑炎病毒(Tickborneencephalitisvirus，TBEV)引起的中枢神经系统急性自然疫源性传染病。该病毒是长约11kb的黄病毒属的球形单正链RNA病毒，根据E蛋白206位三种不同亚型的氨基酸，分西欧亚型、远东亚型和西伯利亚亚型3类。我国该病毒的主要传播媒介蜱为包括硬蜱属的全沟硬蜱和卵形硬蜱、血蜱属的嗜群血蜱和日本血蜱、革蜱属的森林革蜱和边缘革蜱[13]。该病毒通过卵巢传递感染各个阶段的蜱虫。1936年Tkachev氏首次用小白鼠从患者分离得到病毒，我国于1943年发现此病，1952年从患者及蜱中分离到森林脑炎病毒[14]。蜱传脑炎病原体具有严格的地域性、季节性、职业性，主要分布于欧洲、亚洲俄罗斯、日本及我国的东北和西北森林地区，且自1990年记录以来发现该病毒的流行趋势在逐渐的增强，已蔓延到以前没有出现过的地方。该病毒通过蜱虫叮咬传播给人，患者多数是隐性感染，不易察觉，有临床症状的则表现严重，可治愈伴有后遗症，病死率高。森林脑炎是唯一可通过疫苗接种得到预防的蜱传染病。本病受气候条件、地域分布因素等影响,森林脑炎旧疫源地的爆发以及新疫源地的产生,都给人类带来严重的威胁。（二）新疆出血热新疆出血热的病原体是克里米亚一刚果出血热RNA病毒(CrimeanCongohemorrhagicfeverviruses，CCHFV)。该病最早于1944年发现于俄国的克果米亚，1965年我国于新疆南部首次诊断出该病，故称新疆出血热(XHF)。它是一种流行于中国新疆南北部、四川、云南、青海、俄国北部、中东、南部欧洲大陆及非洲撒哈拉地区的自然疫源性急性传染病，其平均病死率在10％～50％之间[15]。42 本病潜伏时间短，发病急，临床症状表现为畏寒、高热、全身痛、身体部分地方出现出血点或血斑块，严重者有出血现象或休克，预后差[16]。该病的重要传播媒介是亚洲璃眼蜱，传染源是主要是疫源地放牧羊，也可以是疫源地的的野生动物，如塔里木兔及各种野鼠、刺猬、狐狸等以及在疫源地放牧的羊、牛、骆驼、马等家畜都能感染出血热病毒[17]。（三）发热伴血小板减少综合征发热伴血小板减少综合征（Severefeverwiththrombocytopeniasyndrome，SFTS）俗称蜱咬病，病原体是布尼亚病毒科白蛉病毒属RNA病毒，RNA外有包膜，耐热不耐酸，抵抗力弱常用的物理化学消毒法就可以迅速杀死病毒。该病于2006年出现，直到2010年，通过对河南、辽宁、湖北、山东、江苏、安徽6个省该病的流行病学研究，将其命名为发热伴血小板减少综合征[18,19]，简称新布尼亚病。该病的临床表现为发热、头痛、恶心、腹泻等，起病急无明显症状，实验室以血小板减少为主要特征[20]，感染高峰期在5-7月份。经流行病学与病原学研究，发现该病的发生与蜱虫的活动区域有，确认蜱虫、蚊子等是该病的主要传播媒介，但其宿主的范围尚不明确，其致病机制也不清楚，还需进一步研究证实。（四）斑点热斑点热(spottedfever)的病原体是斑点热立克次体群（spottedfevergrouprickettsiae，SFGR)。该病是自然疫源性疾病，具有季节性，发病主要月份是4-9月。小型哺乳动物是斑点热立克次体的主要宿主，草原革蜱是主要的传播蜱种，其他的森林革蜱、中华革蜱等也可传播该病。该病潜伏期是4-6天，临床症状表现为出现皮疹，持续发热，局部淋巴结肿大等，症状不典型，易引起误诊漏诊[21]。斑点热在国外曾引起过暴发流行病发生，且经证实我国也已有13个省是其自然疫源地[22]，因此我们不容忽视该病，应不断加强对蜱虫的消除及对该病的病原学、流行病学和临床诊断的研究。（五）Q热Q热是由贝氏立克次体引起的一种自然疫源性疾病,该病原体呈球形，无荚膜、无鞭毛，含有质粒的专性细胞内寄生物，对理化因素抵抗力强,-56℃能活数年,加43 热60～70℃需30～60min才能灭活。该病的病原体可通过空气胶体可经呼吸道、消化道、损伤的皮肤、黏膜或通过蜱的叮咬传播给人或家畜，潜伏期一般为2-4周[23]。临床表现以血培养阴性、超声心内膜炎的慢性Q热为主，无典型症状，误诊漏诊容易导致致命性心律失常，对人类健康造成极大危害。该病的明确诊断以实验室检测为主要依据，应用的实验室诊断方法主要包括:血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)、分子生物学检测聚合酶链反应技术、免疫组织化学检测以及分离培养。（六）莱姆病莱姆病（Lymedisease,LB)是经蜱虫叮咬将革兰氏阴性的伯氏疏螺旋体感染给人和动物的一种自然疫源性疾病[24]。临床症状以慢性游走性红斑和典型皮疹为主，严重者出现神经系统及心脏异常、关节炎。1975年由美国的Steere博士首先确定肩板硬蜱是该病的媒介。1985年我国首次发现莱姆病是在黑龙江海林县。1992年，该病列为世界卫生组织的重点研究对象[25]。该病的主要传播媒介是全沟硬蜱（中国）、篦子硬蜱和全沟硬蜱（亚洲和欧洲）、肩突硬蜱和太平洋硬蜱（美国），一些野生脊椎动物如鼠、鹿、犬、兔等是其主要宿主，宿主感染该病的概率随蜱虫叮咬时间的增长而升高[26]。目前，已知该病已经分布五大洲的30多个国家，尤其是美国，该病有“第二艾滋病”之称。（七）巴贝斯虫病巴贝斯虫病的病原体是巴贝斯寄生虫，巴贝斯虫隶属于顶复口、梨形虫纲、梨形虫目、巴贝斯科属，传播媒介是蜱虫。1888年在罗马尼亚首次被报道，1897年由于美国的“德克萨斯热”事件后，美国的Smith和Kilbour第一次被明确指出是蜱传红细胞内寄生虫病[27]。巴贝斯虫经蜱虫吸血传播给宿主，以无性生殖方式在哺乳动物的红细胞内生存，导致宿主出现高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿等临床症状[28]。巴贝斯虫病的发生与蜱虫的生活史、气候相关，多暴发于秋季，冬季基本不发病[29]。随着人越来越多的饲养宠物猫狗，有关人畜感染巴贝斯虫病的报道也越来越多，应加强对该病的认识及深入的研究。44 三、蜱传染病的国内外研究现状随着全球的气候变暖，生态环境的改变，贸易和旅游的发展及人员的流动，为蜱类的生长和蜱传染的传播提供了适宜的条件,蜱传病的传染在逐年的增加。2000-2006年欧洲新发现了7种蜱传染病[30]。2006年美国的普杜大学对宠物犬携带蜱及蜱传病进行了动态监测[31]。2009年西德结合该地区的地理生态条件对蓖子硬蜱的种群密度进行了监控[32]。2010年，中国根据临床病例表现在河南、山东等地方发现了新布尼亚病毒[33]。2013年长白山地区应用血清学调查到含有斑点热立克次体、莱姆病、贝氏柯克斯体、蜱传脑炎、查菲埃立克体5种病原体[34]。2015年刘相叶等发现山东地区长角血蜱携带吞噬细胞无形体的概率比2009年增长了1.7倍[35]。由于蜱及蜱传病严重危害着人畜的健康和安全，人们利用传统技术和现代技术的结合，对其展开了更深一步的研究。目前，传统技术形态学分类和生物学特征为蜱种的鉴定提供了基础的参考，现代技术如应用基因的测序、蛋白质电泳、聚合酶链反应（PCR）、RFLP限制性酶切技术、随机扩增多态性DNA技术（RAPD-PCR）等分子技术，使人们对蜱种及蜱传病的检测鉴定水平有了很大的提高。传统的技术只适于小范围的调查。2005年以来，人们将以Solexa技术和SOLiD技术为标志的高通量测序技术应用到了蜱虫携带微生物多样性的研究中[36]，该技术有利于蜱种明确的鉴定及蜱传病的病原体更多的发现。四、问题与展望目前，我国对蜱种的分类鉴定和蜱传病研究处在一个上升阶段，但与国外还是存在一定的差距，仍需研究更多亟待解决的问题。1、我国地域辽阔，蜱种分布广泛，目前对蜱虫的种类和分布没有完整的数据统计，且蜱种类的鉴定研究还未完全与蜱的分子生物研究方向完全结合，不能更好的对蜱虫的流行病学、免疫蛋白学、基因学等展开研究。因此，应不断地创新研究技术，加强对蜱种的鉴定的完善[37]；且更深入的研究蜱虫的发育学和潜在应用价值基因功能，以便有效的防治蜱虫和提高我国对蜱虫研究的整体水平。2、蜱携带的病原体的多样性和不确定性，搞清楚不同蜱虫对单一病原体或混合病原体的相互关系和蜱传病的致病机制，对蜱及蜱传病的防治有着极为重要的45 影响。3、开发高效稳定的植物或生物杀虫剂使用灭蜱，避免蜱虫产生抗药性问题，降低了化学药物残留对人和动物的危害同时也保护了环境。4、疫苗在人和动物疾病的防治中起着至关重要的作用，然而，目前对蜱和蜱传病的疫苗分别仅存在抗微小牛蜱疫苗和森林脑炎疫苗，相关部门和研究人员要运用现代生物技术尽快的寻找出蜱和蜱传病病原体的保护性抗原[38]，对其进行分析，研制出高效的疫苗，可相对有效的提前防治蜱传病和阻止疫情的爆发。5、对于虫媒控制缺乏完整的标准和技术法规，这也影响着蜱传病的防治。6、加强安全管理和防护，全面体现“预防为主、防重于治”的原则[39]。加大对蜱和蜱传病的预防控制相关知识的宣传[40]，使人们对此有更多的了解，做好个人防护。五、研究目的和意义蜱种的多样性和蜱传病的流行涉及到病原体、宿主、媒介和易感人群等多个环节，所以自然界存在大量的患病动物,同时更加威胁者人类，因此我们必须重新认识并重视蜱和蜱传病。本试验通过对辽西地区蜱及蜱传人畜共患病病原体的调查研究，确定了该地区的蜱种类及存在的蜱传病原体，为有关部门及时有效的完善蜱种分类及蜱传人畜共患病的检测，有效的控制蜱及蜱传疾病在人畜之间的传播，从而制定疫病综合防治措施，减少蜱传染病给辽西地区居民的公共安全、养殖业、畜牧业等带来的威胁。46 参考文献1康发亮.蜱分类的方法及我国蜱分类的研究进展.安徽农业科学,2011,39(33):20495-20497.2王金会,黄新海,黄芳.对家畜蜱虫的认知与防治.山东畜牧兽医,2015,36(7):25-27.3汪才侠,胡方成,雷呈祥,等.蜱虫和蜱传疾病的预防.上海畜牧兽医通讯,2013,21(5):50-51.4HoogsraalH,AeschlimannA.Tick-hostspecificity.BulletinDeLaSocieteEntomologiquedeSuisse,1983,55:5-32.5HoogstraalH.Argasidandnutallielidticksasparasitesandvectors.AdvParasitol,1985,24:135-238.6陈泽.蜱类系统学研究进展.昆虫学报,2007(9):109-112.7MurrellA,CampbellNJ,etal.Recurrentgainsandlossesoflarge(84-109bp)repeatsintheRdnainternaltranscribedspacer2(ITS2)ofrhipicephalineticks.InsectMol.Biol,2001,10(6):587-596.8MurellA,BarkerSC.SynonymyofboophilusCwithrhipicephalus.Syst.Parasitol.2003,56(3):169-172.9DiazJamesH.Acomparativemeta-analysisoftickparalysisintheUnitedStatesandAustralia.ClinToxicol(Phila),2015,53(9):874-883.10代旭磊,宝福凯,柳爱华,等.新发蜱媒传染病的国内外研究概况.寄生虫与医学昆虫学报,2013,20(3):202-209.11李一凡,王卷乐,高孟绪,等.自然疫源性疾病地理环境因子探测及风险预测研究综述.地理科学进展,2015,34(7):926-935.12石宏武.蜱与森林脑炎研究进展.安徽农学通报,2014,20(13):138-140.13SlavikI.Studiesontick-borneencephalitisvirus.Partialpurificationofvirusfromratbrainsuspensions.ActaVirol,1968,12(6):535-545.14李婷,韩淑祯,张晓光,等.森林脑炎诊治的研究进展.中国伤残医学,2014,22(8):300-301.15相大鹏,师永霞,李小波.新疆出血热的研究进展.中国医药生物技术,2009,4(1):37-39.16TangQ,GaoD,ZhaoX,etal..Studyonthemolecularbiologyofhemorrhagicfever47 virusinXinjiang.ZhonghuaLiuXingBingXueZaZhi,2002,23(6):449-452.17A.J.Shepherd,R.Swanepoel,S.P.Shepherd,etal.ViraemictransmissionofCrimean-Congohaemorrhagicfevervirustoticks.EpidemiologyandInfection,1991,106(2):373-382.18吕沐天,孙颖,刘沛,等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展.微生物学杂志,2013,32(2):86-88.19YuXJ,LiangMF,ZhangSY,etal.FeverwiththrombocytopeniaassociatedwithanovelbunyavirusinChina.NewEnglandJournalofMedicine,2011,364(16):1523-1532.20BarbieriAmaliaRM,FilhoJonasM,Nieri-BastosFernandaA,etal.Epidemiologyofrickettsiasp.strainAtlanticrainforestinaspottedfever-endemicareaofsouthernBrazil.Ticksandtick-bornediseases,2014,5(6):848-853.21梁姝怡,周明浩.蜱媒传染病研究进展.中华卫生杀虫药械,2014,20(1):77-81.22郭雨微,孟庆峰,王伟利,等.蜱传立克次体病检测方法研究进展.中国农学通报,2012,28(26):36-39.23SprongH,Tijsse-KlasenE,LangelaarM,etal.PrevalenceofCoxiellaburnetiiinticksafteralargeoutbreakofQfever.ZoonosesPublicHealth,2012,59(1):69-75.24ScottJD.Borreliaburgdorferi.JMedEntomol,2012,49(2):237.25ZhangLJ,LiuY,NiDX,etal.NosocomialtransmissionofhumangranulocyticanaplasmosisinChina.JAMA,2008,300(19):2263-2270.26MichaelCook.Lymeborreliosis:areviewofdataontransmissiontimeaftertickattachment.InternationalJournalofGeneralMedicine,2015,8:1-8.27于志军,刘敬泽.蜱传疾病及其媒介蜱类研究进展.应用昆虫报,2015,52(5):1072-1081.28SevincF,SevincM,EkiciOD,etal.Babesiaovisinfections:detailedclinicalandlaboratoryobservationsinthepre-andpost-treatmentperiodsof97fieldcases.VetParasitol,2013,191(1):35-43.29尚泽松,王雪莹,张才,等.犬巴贝斯虫病的诊治病例.中国兽医杂志,2012,48(9):60-61.30VorouRM,PapavassilioVG,TsiodrasS.Emergingzoonosesandvecter-borneinfectionsaffectinghunmaninEurope.EpidemiolInfect,2007,135(8):1231-1247.48 31GlickmanLT,MooreGE,GlickmanNW,etal.PurdueUniversity-BanfieldNationalCompanionAnimalSurveillanceProgranforemergingandzoonosesdiseases.VectorBorneZoonoticDis,2006,6(1):14-23.32SchwarzA,MaierWA,KistemannT,etal.AnalysisofthedistributionofthetickIxodesricricinusL.(Acari:Ixodide)inanaturereserveofwesternGermanyusingGeographicInformationSystems.IntJHygEnvironHealth,2009,212,(1):87-96.33YuXJ,LiangMF,ZhangSY,etal.FeverwiththrombocytopeniaassociatedwithanovelbunyavirsinChina.NEnglJMed,2011,364(16):1523-1532.34秦哲,冯立,秦德柱,等.长白山地区几种蜱媒传染病的血清学调查研究.中国预防医学杂志,2013,14(12):886-888.35刘相叶,武志强,刘转转,等.山东沂源硬蜱携带无形体的调查及进化分析.动物医学进展,2015,36(12):103-107.36庄璐.蜱携带病原体多样性及长角血蜱实验传播SFTSV的研究:[博士学位论文].北京:中国人民解放军军事医学科学院,2014.37孟阳养,李朝品,梁国光.蜱螨与人类疾病·合肥:中国科学技术人学出版社.1995.38ChapmanAS,BakkenJS,FolkSM,etal.Diagnosisandmanagementoftickbornerickettsialdiseases:RockyMountainspottedfever,ehrlichioses,andanaplasmosis-UnitedStates.M,MWRRecommRep,2006,55(4):1-27.39张丽娟,付秀萍,范明远.我国立克次体研究与立克次体病的流行现状.热带病与寄生虫学,2005,3(1):37-42.40ParolaP,PaddockCD,RaoultD.Tick-bornerickettdiosesaroundtheworldemergingdiseaseschallengingoldconcepts.ClinMicrobiolRev,2005,18(4):719-756.49 二、在学期间科研成绩1、在学期间发表论文一篇，王振,刘孝刚,罗义,李冰,于迪,徐鹏,周子涛,于金玲.辽西地区蜱斑点热立克次体的携带情况[J].畜牧与兽医,2015年第47卷第4期143-144.2、辽西地区蜱斑点热立克次体的携带情况论文获中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第13次学术研讨会优秀论文3等奖。50 三、致谢在论文完成的过程中，除了我自己一年多来的潜心学习和研究之外，也凝聚了很多人的心血。在这里，我要对帮助我完成论文的所有人表示感谢。首先，感谢我敬爱的导师于金玲教授。从本科毕业设计开始变师从于于金玲教授，老师给我最大的印象是朴实无华、平易近人、治学严谨、诲人不倦的高尚师德。在三年的研究生生涯中，很幸运又得到老师的抬爱，师恩如母，永刻于心。难忘老师美丽的心灵和身影，难忘老师给予国家重点课题研究的机会，难忘老师坚强的性格与不屈的意志。做为我的导师，感谢您对我科研学习上的严厉与教诲；做为我的长辈，感谢您给予我母亲般的关怀；做为我的朋友，感谢您对我知心好友般的促膝而谈以及耐心地倾听我的心声。此刻，似乎无法用言语来形容我的感激之情，惟愿师生情谊一生延续。其次，要感谢的是刘孝刚教授和李冰教授，两位老师在我的实验期间，给予我的帮助和指导。不仅使我树立了远大的学习目标，掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多为人处事的道理。我的毕业论文从选题到完成，每一步都是在刘老师的悉心指导下完成的，倾注了老师大量的心血，同时，李冰老师在实验技术方面有丰富的实践经验，对分子生物学检查、细菌病毒检测等技术的实验工作给予了我很多的悉心指导和监督，使我能够将理论中的结果与实际相结合。另外，他对待问题的严谨作风也给我留下了深刻的印象。在此向两位教授表示诚挚的感谢和由衷的敬意。再次，感谢实验室的所有教师和研究人员，感谢你们无私的对我工作的支持与帮助和生活上的热心照顾，让我在一个欢乐和谐的环境中学习成长。感谢我的家人和朋友。感谢你们一直以来给与我的关心、支持与理解。今后我会加倍努力，不辜负你们对我的期望。最后，衷心地感谢本次答辩的各位专家评委对我的指导！51 四、个人简介姓名：王振性别：女出生年月：1989年5月民族：汉族学习经历：2005.9-2009.7河北省三河市第一中学，高中2009.9-2013.7辽宁医学院医疗学院动物医学专业，本科2013.9-2016.7锦州医科大学微生物学专业，硕士52 厚德修身精术；齐世塞；漁＂．霞．－－－？？．—＊ｊ．？！？ＳＥＳＫ－ｉ，ｊ＇．＾＾ｙ＂＇■＊．．？ｒ．．ｒ，＇＇＇－。－＇如…？子ｊ＜占苗早、＇＿．．早每护．＿＊—、￣一．．一？■？＇、＼、？■Ｊ？＾－、，？：‘—？■？二一皆气．．？．与己：；■－；苗比■Ｂｒ－—＾二＂－ｉ．Ｔ？－－＇＇■？Ｓ：－：．＇产宝＇－度拭：■－．：：了山话享—■．■■ＩＩ＂，——ｔＬ．ｔ＇－．，１：？？？？＇．
