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《普萘洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其机理研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号腦密级公开＃学号２００２０１３３１６学校代码如肪１弟若辛皆火？聲硕壬学隹冷义普蔡洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其机理研究’刘亦舒指导教师程應教授、主任匯师＼导师组成员唐建兵室敏培养单位广州军匹广州总医院申请学位类别硕去学术学位专业名祿外科学（整形）论文提交日期２０１６年５月论文答辩日期２０１６年５月答辩委员会主席高建华教授评巧人李学拥教授朱晓海副教授—二〇—六年五月—‘本课趣受固家自巧科学基金项目巧１巧２１０５项目巧助。） 第Ｈ军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加ＬＸ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之一处，本人承担切相关责任。、＾主．Ｋ论文作者签名：沛曰期：气第三？军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第王军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第Ｈ军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第Ｓ军医大学。学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可レ乂公布学位论文的全部或部分巧容（保密内容除外），可Ｌ乂采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：寺亦、奸指导教师签名：－玉．７＾日期： 目录缩略语表....................................................................................................................................1英文摘要....................................................................................................................................3中文摘要....................................................................................................................................6论文正文普萘洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其机理研究....................................8第一章前言............................................................................................................8第二章普萘洛尔对C57BL/6J小鼠背部创面愈合的影响.......................................112.1材料与方法.....................................................................................................112.2实验结果.........................................................................................................142.3讨论.........................................................................................................17第三章普萘洛尔对糖尿病小鼠背部创面愈合的影响..............................................193.1材料与方法.....................................................................................................193.2实验结果.........................................................................................................283.3讨论.........................................................................................................38全文结论..........................................................................................................................42参考文献..........................................................................................................................43文献综述β肾上腺素受体阻滞剂对皮肤创面愈合影响的研究进展...............................48参考文献..........................................................................................................................52攻读学位期间发表的论文......................................................................................................56致谢..................................................................................................................................57 第三军医大学硕士学位论文缩略语表英文缩写英文全称中文全称Angangiogenin血管生成素APSammoniumperoxydisulfate过硫酸铵BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白cAMPcyclicadenosinemonophosphate环磷酸腺苷dday天DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸FGFfibroblastgrowthfactor成纤维细胞生长因子ggram克GAPDHglyceraldehydephosphatedehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶hhour小时HEhematoxylinandeosinstain苏木素伊红染色HRPHorseRadishPeroxidase辣根过氧化酶IGFInsulin-likegrowthfactor胰岛素样生长因子IL-1interleukin-1白细胞介素-1kgkilogram千克mgmilligram毫克mlmilliliter毫升mmmillimeter毫米μmmicron微米minminute分钟MIPMacrophageinflammatory巨噬细胞炎性蛋白MCPmonocytechemoattractantprotein单核细胞趋化蛋白6-OHDA6-hydroxydopamine6-羟基多巴胺PVDFPolyvinylideneFluoride聚偏氟乙稀PBSPhosphatebuffersolution磷酸盐缓冲液PCNAproliferatingcellnuclearantigen增殖细胞核抗原1 第三军医大学硕士学位论文PVDFpolyvinylidenedifluoride聚二氟乙烯PKAproteinkinaseA蛋白激酶APDGFplatelet-derivedgrowthfactor血小板衍生生长因子STZstreptozocin链脲菌素SPFSpecifiedPathogenFree无特定病原体ssecond秒SDS-PAGESDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠TBStris-bufferedsaline三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液Tween-20polyethyleneglycolsorbitanmonolaurate聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯TEMEDtetramethylethylenediamine四氨基乙二胺Tristrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷TBSTtris-bufferedsalinewithTween-20吐温-20-三羟甲基氨TGF-βtransforminggrowthfactor转化生长因子TNFtumornecrosisfactor肿瘤坏死因子TietyrosineKinaseReceptor酪氨酸激酶受体Vvolt伏特VEGFvascularendothelialgrowthfactor细胞血管内皮生长因子WBwesternblot蛋白免疫印记杂交2 第三军医大学硕士学位论文TheeffectofpropranololonwoundhealingindiabeticmiceAbstractBackgroundandpurposeDiabeticulcerisoneoftheseriouscomplicationsofdiabetes.Diabeticulcerisdifficulttotreat,hasbeenamajorchallengeinclinicalwork,oftenleadtoamputation,evendeath.Thereareproblemssuchastheslowofepitheliumandthedamageofbloodvesselornerveinpatientswithdiabeticulcer.Itisnecessarystudyingonhealingmechanismofdiabeticchroniculcer,findingakeyfactorinpromotingthewoundhealing,seekingaeconomicandeffectivetreatment.Thepreviousresearchofourgroupfoundthatspontaneousdiabeticmiceandwild-typenormalmicehavedifferentskintissuestructure,inspontaneouslydiabeticmiceskinsympatheticnervespecificsymbolexpressionoftyrosinehydroxylasewassignificantlyhigherthanthatofnormalmice,innormalmicetyrosinehydroxylaseexpressionaftertheformationofthewoundfirstincreasedrapidlyandthenbacktonomallever,tyrosinehydroxylaseincreaseddelayinhealingprocessofdiabeticmice.Increasedexpressionoftyrosinehydroxylase,increasedcatecholamines,prolongthetimeofinflammationindiabeticmice,resultinginslowdownthewholeprocessofthewoundhealing.Studieshaveindicatedthattraumaandstressleadtoelevatedlevelsofcatecholamineinbloodandtissues,whilehighlevelsofcatecholamineinhibitwoundhealing.Asanonselectivebetablocker,propranololisfirstfortreatmentofcardiovasculardiseases,withtheroleofantagonisticsympatheticnerveactivityandcatecholamine.Ofpediatricburnpatientsduringhospitalizationbepropranololtreatmentcanreducehypermetabolismandreversalofmuscleproteincatabolism,promotehealingofburnwounds.Thisstudyonthebasisofthepreliminarywork,usingpropranololtreatmentofnormalmiceandthespontaneousdiabeticmice,inhibitsympatheticnerveactivity,makingwoundmodel,micewereobservedforwoundhealing,focusesonthedetectionofspontaneousdiabeticmousepropranololtreatmentafterwoundhealing,comparetheeffectsofbetaadrenergicreceptorblockersonthehealing3 第三军医大学硕士学位论文ofskinwoundsindiabeticmice.Mathods1.20femaleC57BL/6Jmicewererandomlydividedintopropranololgroupandcontrolgroup,10miceeach.Propranololgroupweregiven50mgpropranololdissolvedin100mlofwatertodrink,thecontrolgroupwithnormalwatertodrink.Aftersustaineddrugdeliveryforaweek,afull-thicknessexcisionallesionwereperformedonmiceback.Propranololadministrationcontinueafterthewound..1,3,5,7,10daysafterthewound,picturesweretakingbyadigitalcamera,toobservethewoundhealing,measuringthewoundarea,woundhealingratewascalculated.HEstainingwasusedtoobservethehistologicalchanges,inflammatoryreaction,granulationgrowthandneovascularizationofthewound,andthehistologicalscoreswerecompared.2.18femaleDiabeticmice,wererandomlydividedintopropranololgroupandcontrolgroup,9miceeach.afull-thicknessexcisionallesionwereperformedonthespontaneousdiabeticmiceback.Propranololgroupandthecontrolgroup,thewoundswereexternalsmearpropranololcreamandcreambase(exceptwithoutpropranolol,creambasecomponentsandpropranololcreamingredientsexactly).2,5,7,10,14,17daysaftertheformationofthewound,changeddressingandrandomlyselectedonediabeticmicefortissuecutting,whendressingpropranololgroupandthecontrolgroupreapplycontainingornotcontainingpropranololcreamandphotographed.Measuredthewoundareaandcalculatedthewoundhealingrateand21dayswhentheremaining3diabeticmicewereallkilled.HEstaining,Massonstaining,toluidinebluestainingwereobservedinwoundreepithelialization,collagenfiberandmastcellsituation;proliferatingcellnuclearantigen(PCNA),CD68immunohistochemistrybasedviewcellproliferationandmacrophageinfiltration.DetectionofWesternblotinwoundtissuePCNAandinterleukin-1beta(IL-1β)andangiopoietin2(Ang2)expression,MMP-9.Results1.Aftertheformationofwoundonnormalmice,1d,3d,5d,7dwoundhealingrate,propranololgroupwerehigherthancontrolgroup,comparedwithin3D,5D,p<0.05haveobviousdifference,and1D,7d,p>0.05;10dtwogroupwoundswerecompletelyhealed.Woundwithhematoxylinandeosin(he)stainingvisibleandhistologicalscoreswerefoundinthepropranololgroupearlywoundagainepithelializationandgranulationtissuegrowthwere4 第三军医大学硕士学位论文higherthanthoseinthecontrolgroup,andangiogenesiswithoutsignificantdifference.2.Aftertheformationofthewoundsondiabeticmice,2d,5d,7d,10d,14d,17dwoundhealingrateandpropranololgroupwerehigherthancontrolgroupandP<0.05.The21daysaftertheformationofthewound,propranololgrouphadhealed,notcompletelyhealedincontrolgroup,P>0.05.HEstaining,propranololgroupagainepithelialspeedsignificantlyfasterthanthatofthecontrolgroup,earlystageinflammatoryinfiltrateobviously,weakinthelaterperiod.Massonstainingshowedthattheexpressionofcollagenarrangementofcollagenleveldifferenceisnotobviousintwogroups.Toluidinebluestaining,mastcellsinwoundtissueinthetwogroupswereless.PCNAimmunohistochemistryresultsshowedthatpropranololgroupearlykeratinocyteproliferationwassignificantlyincreased.CD68showedthatpropranololgroupofwoundtissueinearlyinfiltrationofmacrophageexpressionandexpressionoflateisnotobvious;controlgroup,thewoundtissueearlyexpressionofmacrophagesisnotobviousandthelateobviousexpression.WesternblotresultsshowedthattheIL-1,Ang2expressionofpropranololgroupwassignificantlylowerthanthatofcontrolgroup,(P<0.05).2dpropranololgroupPCNAexpressionwashigherthanthatofthecontrolgroup,propranololgroupMMP-9expressionin2d,5d,7d,10dwerehigherthanthoseinthecontrolgroup.Conclusion1.Propranololcanacceleratewoundre-epithelializationandpromotewoundhealinginnormalmice.2.Propranololsignificantlypromotewoundhealinginspontaneouslydiabeticmice,themechanismisstablewhichcanobviouslypromotethereepithelialization,reduceinflammationandneovascularization.3.Topicalpropranololmaybeanewmethodfortreatmentofdiabeticulcers,worthyoffurtherstudy.Keywords:propranolol;woundhealing;diabeticulcers;diabeticmice;topical5 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其机理研究摘要研究背景、目的及意义糖尿病慢性溃疡是糖尿病最严重的并发症之一。糖尿病慢性溃疡治疗困难，一直是临床工作的一大挑战，易并发感染，感染严重的会导致截肢甚至死亡。糖尿病溃疡普遍存在着上皮化缓慢、血管神经受损等问题。因此，研究糖尿病皮肤慢性溃疡难愈的机制，发现促进愈合的关键因素，寻求经济有效的治疗手段非常必要。课题组前期研究发现，自发性糖尿病小鼠和野生型正常小鼠皮肤组织结构有较大差异，自发性糖尿病小鼠皮肤中交感神经特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达显著高于正常小鼠，在创面形成后正常小鼠酪氨酸羟化酶的表达迅速增高而后回落至正常水平，而糖尿病小鼠愈合过程中酪氨酸羟化酶升高延迟。酪氨酸羟化酶蛋白水平表达增高时，儿茶酚胺类物质增加，糖尿病小鼠炎症期时间延长，从而导致创面愈合整个过程的减慢。有研究表明，创伤和应激导致血液及组织中儿茶酚胺升高，而高水平的儿茶酚胺抑制创面的愈合。普萘洛尔作为一种非选择性的β受体阻滞剂，它最早用于心血管疾病治疗，具有拮抗交感神经兴奋和儿茶酚胺的作用。对小儿烧伤患者住院期间予以普萘洛尔治疗能减轻代谢亢进并逆转肌肉蛋白质的分解代谢，促进烧伤创面愈合。本研究在前期工作基础上，使用非选择性β受体阻滞剂普萘洛尔对正常小鼠及自发性糖尿病小鼠进行处理，抑制交感神经活动，制作创面模型，观察小鼠创面愈合情况，重点检测自发性糖尿病小鼠β受体阻滞剂普萘洛尔处理后创面愈合情况，探讨β肾上腺素受体阻滞剂对糖尿病小鼠皮肤创面愈合的作用。研究方法1.普萘洛尔对正常小鼠创面愈合的影响：雌性C57BL/6J小鼠20只，分为两组，每组10只。普萘洛尔组予50mg普萘洛尔溶于100ml饮水中，对照组正常饮水，持续给药1周后在小鼠背部制作全层皮肤缺损创面。创面制作后普萘洛尔组继续给药直至安乐死。创面形成后1d、3d、5d、7d、10d数码相机拍照，观察创面愈合情况，测量创面的面积并计算创面愈合率；HE染色观察创面组织再上皮化、炎症反应、肉芽生长及新生血管等情况，组织学评分进行比较。2.普萘洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响：雌性糖尿病小鼠18只，分为两组，每6 第三军医大学硕士学位论文组9只。在糖尿病小鼠背部制作全层皮肤缺损创面。普萘洛尔组及对照组创面分别外用涂抹普萘洛尔乳膏及乳膏基质（除了不含普萘洛尔，乳膏基质成分与普萘洛尔组乳膏成分完全一致）。创面形成后2d、5d、7d、10d、14d、17d换药，换药时普萘洛尔组及对照组创面再次分别涂抹普萘洛尔乳膏及乳膏基质，数码相机拍照，并随机抽取一只小鼠取材。测量创面的面积并计算创面愈合率，21d剩余3只糖尿病小鼠全部处死取材。HE染色、Masson染色、甲苯胺蓝染色分别观察创面的再上皮化、胶原纤维及肥大细胞情况；PCNA、CD68免疫组化查看细胞增殖及巨噬细胞浸润情况。Westernblot检测创面组织中PCNA、白细胞介素-1β（IL-1β）、血管生成素2(Ang2)、MMP-9的表达。研究结果1.正常小鼠创面形成后1d、3d、5d、7d创面愈合率比较，普萘洛尔组均高于对照组，在3d、5d比较,p<0.05有明显差异，而1d、7d比较，p>0.05；10d两组创面均完全愈合。创面HE染色可见，组织学评分发现普萘洛尔组早期创面再上皮化及肉芽组织生长均高于对照组，而新生血管无明显差异。2.糖尿病小鼠创面形成后2d、5d、7d、10d、14d、17d创面愈合率比较，普萘洛尔组均高于对照组，且p<0.05；创面形成后第21d，普萘洛尔组已经愈合，对照组未完全愈合，p>0.05。HE染色，普萘洛尔组的再上皮化速度明显快于对照组，早期阶段炎症浸润较明显，后期较弱。Masson染色提示普萘洛尔组与对照组胶原表达量及胶原排列情况差异不明显。甲苯胺蓝染色，两组创面组织内肥大细胞均分布较少。PCNA免疫组化结果显示普萘洛尔组早期角质形成细胞增殖明显增加。CD68结果显示，普萘洛尔组创面组织早期有巨噬细胞浸润表达而后期表达不明显；对照组创面组织早期巨噬细胞表达不明显而后期明显表达。Westernblot结果显示普萘洛尔组IL-1β、Ang2表达均低于对照组，P<0.05；2d普萘洛尔组PCNA表达高于对照组；普萘洛尔组MMP-9表达在2d、5d、7d、10d均较对照组高。研究结论1.普萘洛尔加速创面的再上皮化促进了正常小鼠的创面愈合；2.普萘洛尔明显促进自发性糖尿病小鼠的创面愈合，机制是其能明显促进再上皮化，减轻炎症反应，及新生血管的稳定；3.外用普萘洛尔可能成为治疗糖尿病溃疡的一种新的手段，值得深入研究。关键词：普萘洛尔；创面愈合；糖尿病溃疡；糖尿病小鼠；外用7 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响及其机理研究第一章前言创伤或疾病造成皮肤软组织解剖结构完整性被破坏而形成创面，严重的创面会导致残疾甚至死亡。导致人体皮肤软组织缺损的原因有很多，包括烧创伤、医源性损伤、放射性溃疡、糖尿病溃疡及压疮等。机体在损伤发生后即开始了愈合过程，按照愈合时间的长短，有急性创面和慢性创面之分。慢性创面的治疗一直都是一个挑战。临床上把治[1]疗时间超过1个月仍难以自行愈合的创面，称为慢性难愈创面。各种慢性难愈溃疡的创面修复一直是整形外科临床治疗工作的难点，其中以糖尿病皮肤慢性溃疡尤为多见。糖尿病是一种以多饮、多尿为主要临床表现的慢性代谢性疾病，与人们的饮食、运动等生活方式有着密切的联系。近年来因为生活方式产生的巨大变化，显著增加了糖尿[2]病在我国的患病率，中国罹患糖尿病的患者数量可能已经是全球最多。糖尿病溃疡是长期罹患糖尿病的患者严重并发症之一，治疗不易，一直是临床工作的一大挑战，容易[3]并发感染，严重的感染会导致截肢甚至死亡，给患者及其家庭带来巨大的压力。《中国2型糖尿病防治指南（2013年版）》2010年调查发现因糖尿病足而截肢的患者占所[2]有39家医院的1684例截肢患者的28.2%。而据统计糖尿病足患者占已诊断糖尿病患[4,5]者的15%。因此，研究糖尿病皮肤慢性溃疡难愈的分子机制，发现促进慢性溃疡愈合的关键因素，寻求安全有效经济的治疗手段是广大医学科研工作者一直追求的目标。皮肤及皮下组织中分布着丰富的交感神经纤维。交感神经通过调节毛细血管的舒[6]张、立毛肌的运动以及汗液的分泌维持皮肤代谢及皮肤微环境的稳态。交感神经受到刺激兴奋，释放儿茶酚胺作用于靶器官细胞膜上肾上腺素能受体产生一系列的生物学效[7]应。肾上腺素能受体分为（α受体、β受体）两大类，又有（α1、α2、α3、β1、β2、β3）[7][7]几种亚型。β2肾上腺素受体亚型是表达于人类免疫细胞上的最主要的肾上腺素受体。[8]而在皮肤组织中，β肾上腺素能受体存在于角质形成细胞、成纤维细胞和黑素细胞，[9]并且可能在一些皮肤病的病理生理中起作用，包括特应性湿疹，银屑病，和白癜风。角质形成细胞，成纤维细胞，肥大细胞，巨噬细胞和血管内皮细胞的细胞膜上均有β肾[10,11]上腺素受体表达，受交感神经调控都参与了创面愈合。创面修复包括了炎症反应、组织增生和组织重塑三个过程，它们在时间上有所重叠[12]但又各有特点。创伤早期，组织损伤后导致出血及血浆外渗，血小板局部聚集形成血8 第三军医大学硕士学位论文[13]栓，同时血小板分泌血小板衍生生长因子，吸引和激活巨噬细胞及成纤维细胞。在趋化因子作用下中性粒细胞和巨噬细胞被集中到创面，中性粒细胞吞噬清除细菌，巨噬细胞吞噬坏死组织或细胞碎片，同时巨噬细胞还能分泌生长因子，刺激血管增生启动创面修复。增生期炎症反应逐渐减弱，在生长因子的调控下血管内皮细胞和周细胞共同参与[14,15]形成血管。成纤维细胞和毛细血管构成了肉芽组织，肉芽组织不断生长，创面被逐渐填充，表皮细胞增殖迁移，最终覆盖创面达到愈合。有研究发现创面愈合过程中交感[16]神经有着重要作用。6-OHDA化学性切除交感神经处理的大鼠创面收缩加速、肌成纤[17]维细胞密度增加，但是再上皮化延迟。接着有研究发现，6-OHDA化学性切除交感神[18]经处理的小鼠创面中性粒细胞及巨噬细胞浸润减低而血管生成增加。而Romana-Souza在2009年研究认为这些效应是由β肾上腺素受体被阻断导致的，而与α[19]肾上腺素受体关系不大。糖尿病创面难愈的机理仍不十分清楚。传统理论上，缺血、神经病变及感染被认为[20]是糖尿病创面难愈的三大因素。中性粒细胞及巨噬细胞在创面愈合过程中有着重要作用，不仅能清除创面附着的细菌，还能分泌多种生长因子参与创面愈合，有研究发现糖[21]尿病患者的中性粒细胞及巨噬细胞功能受损。在糖尿病人群中，神经相关的微血管也受到损害，而且有越来越多的人认为，血管舒缩障碍和神经失能是糖尿病患者皮肤受损[22]的主要原因之一。Romana-Souza的研究显示，STZ诱导产生糖尿病大鼠，饮水中加入普萘洛尔，对照组正常饮水，结果普萘洛尔处理糖尿病大鼠创面区域的细胞增殖、肥大细胞数量、胶原沉积量、血管密度、一氧化氮水平均较高，口服普萘洛尔，可以促进[23]血糖偏高的糖尿病大鼠的皮肤创面愈合速度。普萘洛尔是一种β受体阻滞剂，具有拮[24]抗交感神经兴奋和儿茶酚胺的作用。研究表明，创伤和应激导致血液及组织中儿茶酚[25]胺升高，而高水平的儿茶酚胺抑制创面的愈合。近年来普萘洛尔被发现可以用于治疗[24,26]小儿烧伤、慢性创面及婴幼儿血管瘤溃疡等创面的治疗，相关机制尚不清楚。临床上与普萘洛尔类似但作用效果更强的β受体阻滞剂噻吗洛尔，用于治疗放射性溃疡、静[8,27]脉性溃疡等慢性创面已见有病例报道，具体机制仍不十分清楚。课题组前期研究发现，自发性糖尿病小鼠和野生型正常小鼠皮肤组织结构有较大差异，自发性糖尿病小鼠皮肤中交感神经特异性标志物酪氨酸羟化酶表达显著高于正常小鼠，在创面形成后正常小鼠酪氨酸羟化酶表达先迅速增高而后回落，而糖尿病小鼠创面愈合过程中酪氨酸羟化酶升高延迟。酪氨酸羟化酶蛋白水平表达增高时，儿茶酚胺类物质增加，促进炎症浸润，糖尿病小鼠炎症期时间延长，炎症浸润之后的每个时期都较野[28]生型正常小鼠延迟，从而导致创面愈合整个过程的减慢。本研究在前期课题组工作基9 第三军医大学硕士学位论文础的上，使用非选择性β受体阻滞剂普萘洛尔对正常小鼠及自发性糖尿病小鼠进行处理，抑制交感神经活动，制作创面模型，观察小鼠创面愈合情况，重点检测自发性糖尿病小鼠β受体阻滞剂普萘洛尔处理后创面愈合情况，探讨β肾上腺素受体阻滞剂对糖尿病小鼠皮肤创面愈合的作用。10 第三军医大学硕士学位论文第二章普萘洛尔对C57BL/6J小鼠背部创面愈合的影响2.1材料与方法2.1.1主要材料设备及试剂2.1.1.1仪器设备自动脱水机武汉俊杰电子有限公司包埋机武汉俊杰电子有限公司切片机上海徕卡仪器有限公司冷冻台武汉俊杰电子有限公司摊片机浙江金华科迪仪器设备有限公司烤箱上海慧泰仪器制造有限公司载玻片及盖玻片江苏世泰实验器材有限公司BX-51正置光学显微镜奥林巴斯显微镜成像系统奥林巴斯数码相机佳能IXUS155电动理发器6mm皮肤打孔器眼科剪直尺相机三脚架电子称1ml注射器2.1.1.2材料试剂脱毛膏薇婷10%水合氯醛广州军区广州总医院药剂科样本固定液（10%中性缓沖福尔马林）广州维格斯生物生物科技二甲苯广州化学试剂厂100%酒精广州化学试剂厂盐酸广州化学试剂厂氨水广州化学试剂厂11 第三军医大学硕士学位论文中性树胶广州化学试剂厂苏木素-伊红染液武汉谷歌生物普萘洛尔美国Sigma公司2.1.2实验动物8周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠20只，体重20-22g，购于广东省实验动物中心。广州军区广州总医院动物实验中心屏障系统内饲养并开展实验。2.1.3实验方法及内容2.1.3.1C57BL/6J小鼠给药实验组予50mg普萘洛尔溶于100ml饮水中，对照组正常饮水，每笼饲养5只小鼠，每天定期检查饮水情况，及时更换饮水。持续给药1周后开始背部全层皮肤缺损创面模型制作。2.1.3.2C57BL/6J背部创面模型制作(1)术前备皮：创面制作前一天用电动理发器剪去下背部毛发，并用薇婷脱毛膏脱毛，脱毛效果满意后无菌纱布沾少量灭菌用水擦拭干净脱毛膏。(2)小鼠称重，按3ml/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉满意后，75%酒精背部消毒，在背部中线两侧(间距1cm以上)用6mm皮肤打孔器各压下一圆形切迹，无菌眼科剪沿切迹剪下全层皮肤，深达深筋膜。无菌纱布稍压迫止血。(3)创面制作完成后单笼饲养，实验组继续予200mg普萘洛尔溶于400ml饮水后每笼均匀分配，对照组正常饮水。每天定期检查饮水情况，及时更换饮水。2.1.3.3创面取材及愈合率的观察每组小鼠抽取5只固定用于创面愈合情况的观察。剩余5只小鼠用于取材。（1）创面取材：创面形成后第1、3、5、7、10d随机抽取1只小鼠取材。腹腔注射过量10%水合氯醛麻醉处死，无菌眼科剪迅速切取创缘外0.2cm内的全层皮肤及创面组织。将皮肤创面标本展平在滤纸上，放入10%中性缓沖福尔马林样本固定液中固定。（2）创面拍照方法：三脚架固定相机并开机，设置为拍照模式为微距模式，架设好拍照平台，白纸为背景，相机镜头平行于平台，镜头下固定画一方框，镜头对准方框，相机一侧边缘与平台垂直距离为15cm，抓持小鼠使小鼠位于镜头下方框之中，且创面平行于镜头，直尺放置在创面附近作为标记，拍照、分组标记并存储。创面制作当天，数码相机拍照。创面形成后1、3、5、7、10d查看创面愈合情况，并用数码相机拍照。[29]（3）图像录入电脑，Image-ProPlusv6.0分析图像，计算创面愈合率创面愈合率=[1－（n天创面面积／初始创面面积）]×100%12 第三军医大学硕士学位论文2.1.3.4组织包埋切片（1）取材：标本固定24h以上。在通风橱内将皮肤及创面组织标本取出，用刀片稍修剪，将修好的组织放入标记好的包埋胶盒内，包埋胶盒PBS浸泡防止干燥。（2）脱水：将胶盒置于组织脱水机固定液缸里，打开电源，按设定好的程序开始脱水。1×PBS2h，70%乙醇1h，80%乙醇50min，95%乙醇45min，95%乙醇40min，无水乙醇Ⅰ30min，无水乙醇Ⅱ40min，TO生物透明剂30min，TO生物透明剂30min，石蜡1h，石蜡40min，石蜡2h。（3）包埋：脱水后第二天，打开包埋机预热至设定温度，蜡缸放入足量的石蜡融化，将包埋胶盒放入包埋机蜡缸内融化后取出，打开包埋胶盒取出皮肤组织放入包埋框，调整皮肤方向及切面，待蜡稍固定住皮肤组织后，将胶盒贴覆放置在组织上方，适当注入蜡油后放冻台冷却，蜡凝固完好后向下拍打，将蜡块拍出。（4）切片：石蜡切片机切片，片厚4-6μm，切片在40℃温水上展平后用载玻片与液面成45度角将切片捞起，切片位置以载玻片中央为宜。随后将切片放进65℃烤箱内1h。2.1.3.5HE染色（1）切片固定组在塑料染色架上，标签面朝上，在通风橱内操作染色；（2）脱蜡：将染色架放入二甲苯中，5min后捞出，再次放入二甲苯中5min；（3）水化：按次序将染色架放入到无水乙醇5min×2次，90%酒精2min×1次，80%酒精2min×1次，70%酒精2min×1次，最后放入装满自来水的染色缸中，染色缸放在自来水龙头下，小流量滴速冲洗1min；（4）苏木素染液过滤后倒入另外的染色缸中，放入染色架5min，再放入装满自来水的染色缸内，放在龙头下小流量滴速冲洗1min；（5）染色架放入0.5%的盐酸酒精中并迅速拿出，反复快速操作5次，自来水洗1min；（6）染色架放入0.6%氨水返蓝30s，自来水洗1min。（7）伊红倒入染色缸，放入染色架染色3min；（8）按以下次序依次将染色架放入脱水透明70%酒精脱水20s，80%酒精30s，95%酒精1min×2次、无水乙醇1min×2次，二甲苯5min×2次；（9）晾干后中性树胶封片；（10）显微镜下观察。2.1.4统计学方法使用SPSS21.0软件进行统计，两组间比较采用独立样本T检验和重复测量的方差13 第三军医大学硕士学位论文分析，数据使用均数±标准差表示，p<0.05有统计学意义。2.2实验结果2.2.1创面制作及愈合情况大体观察C57BL/6J小鼠背部两侧成功制作圆形全层皮肤缺损创面，创面制作后小鼠均存活直至安乐死。与对照组相比，普萘洛尔组小鼠在3d、5d创面愈合较快，在第10天两组创面均愈合（图2.1）。图2.1C57小鼠各时间点创面Figure2.1ThewoundsofC57miceateachtimepoint2.2.2创面愈合率比较普萘洛尔组与对照组1d创面愈合率比较，普萘洛尔组愈合率较高，但无显著差异，p>0.05：普萘洛尔组（35.04±17.10）%，对照组（26.96±13.98）%，p=0.263。3d、5d普萘洛尔组与对照组创面愈合率有显著差异，p<0.05且普萘洛尔组愈合较快：3d普萘洛尔组（70.75±9.07）%，对照组（57.77±7.61）%，p=0.003；5d普萘洛尔组（82.89±6.37）%，对照组（76.84±6.36）%，p=0.048。7d普萘洛尔组愈合率较高，但无显著差异，p>0.05：普萘洛尔组（90.54±4.87）%，对照组（87.92±6.09）%，p=0.302；10d两组创面愈合率均为100%（图2.2）。14 第三军医大学硕士学位论文图2.2两组小鼠创面愈合率Figure2.2woundhealingratebetweenpropranololgroupandcontrolgroup2.2.3创面组织形态学观察3d创面组织切片HE染色（图2.3A）：黄色三角标识创缘，黑色箭头标识为上皮舍，两标识点之间直线距离，普萘洛尔组404μm，对照组324μm，且表皮细胞层数明显较对照组多，说明普萘洛尔组再上皮化明显增强；普萘洛尔组胶原纤维排列较对照组整齐；炎症细胞浸润较对照组少。7d创面可见普萘洛尔组已完成再上皮化，有皮肤附属器生成；对照组血管较多。图2.3A普萘洛尔组与对照组小鼠3d创面HE染色，黑色箭头指向为上皮舌，黄色三角标识为创缘100×15 第三军医大学硕士学位论文图2.3B普萘洛尔组与对照组小鼠7d创面HE染色200×Figure2.3HEstainingin2groupsat3,7d:A3d100×,B7d200×2.2.4创面组织学评价[30]按表1进行创面组织学评分，发现3d普萘洛尔组创面的再上皮化情况、肉芽组织生长情况、血管情况均较对照组好；7d普萘洛尔组再上皮化情况更好，但血管生成情况较对照组差；10d两组均完成再上皮化。表1创面组织学评分分数表皮和真皮再生肉芽组织血管新生1±少量表皮和真皮组织薄的颗粒层1-2个微血管生成，特点是血管周围高度水肿，有出血和血栓2±中等量表皮真皮组织中等的颗粒层3-6个微血管生成，中度水肿，无血栓3±表皮和真皮完全覆盖厚的颗粒层7-10个新生微血管，周围轻度水肿4±非常厚的颗粒层大于10个微血管，血管结构完整16 第三军医大学硕士学位论文图2.4创面组织学评分Figure2.4Histologicalscoresofwounds2.3讨论上皮化是创面成功愈合的一个重要标志性过程，没有再上皮化的创面不能被认为愈合，所有慢性创面的上皮化进程都受到抑制。在生理状态下，基底层的角质形成细胞处于不断增殖的状态，角质形成细胞向外层分化迁移，通过颗粒层，最后形成角质层。创[31]伤后的再上皮化过程也是由角质形成细胞来完成。因此，角质形成细胞在创面愈合过程中非常重要。普萘洛尔又名心得安，临床常用于治疗心率失常等心血管疾病，属于非选择性β肾上腺素受体阻滞剂。银屑病样皮肤改变是普萘洛尔及其他β受体阻滞剂药物的不常见的[32]副作用。有研究发现外用普萘洛尔于豚鼠耳背皮肤可诱发制作银屑病动物模型，原因是通过阻滞β肾上腺素能受体，导致细胞内cAMP浓度的降低，使得角质形成细胞加速[33]增殖。β肾上腺素受体在多种组织中广泛表达，是调节心脏、肺、血管、神经内分泌的关键因子。近年来，β肾上腺素受体在皮肤软组织中的功能已被大家认识。β2肾上腺[34]素受体是表达在皮肤主要细胞细胞膜上的唯一亚型，成纤维细胞、黑素细胞及角质形[35]成细胞均有表达。这说明β2肾上腺素受体对维持皮肤组织正常生理功能有重要作用，17 第三军医大学硕士学位论文但其在创面愈合方面是否起作用尚不确定。本实验研究发现，与对照组相比口服普萘洛尔组小鼠创面愈合明显较快，3d、5d创面愈合率有显著差异。组织学观察发现，3d普萘洛尔组小鼠创缘表皮厚度较对照组厚、迁移距离均较对照组远。组织学评分，普萘洛尔组再上皮化较对照组增强，与Pullar报[10]道的β受体阻滞剂可促进角质形成细胞增殖迁移相一致。有研究发现，肾上腺素通过[36]与β2受体结合抑制角质形成细胞迁移从而延迟再上皮化。因此，促进角质形成细胞增殖及创面再上皮化可能是普萘洛尔促进创面愈合的机制之一。本研究还发现，3d普萘洛尔组创面炎症细胞浸润较对照组少，普萘洛尔可能对创面早期炎症反应有抑制作用，但需要进一步的研究。本研究发现普萘洛尔组创面血管生成在创面愈合后期较对照组稍弱，但差异不明显。有研究发现，普萘洛尔能通过提高糖尿病大鼠创面区域一氧化氮的[23][18]浓度而增加创面血管密度，促进糖尿病大鼠创面的愈合。在2012年TangJ报道了一例外用0.5%噻吗洛尔成功治疗一名43岁女性慢性难愈创面的病例。噻吗洛尔又名噻吗心安，与普萘洛尔一样同为β肾上腺素受体阻滞剂，但作用较强。普萘洛尔能否也外用于治疗慢性创面尚不清楚，有待进一步的研究。为此，设计了下面的实验，即直接外用普萘洛尔于糖尿病小鼠创面，观察外用普萘洛尔能否促进糖尿病小鼠创面的愈合，并初步研究其作用的机制。18 第三军医大学硕士学位论文第三章普萘洛尔对糖尿病小鼠背部创面愈合的影响一直以来创面修复都是一个挑战性的问题，特别是糖尿病溃疡、压疮及下肢静脉性溃疡等慢性难愈创面不仅给患者带来巨大经济负担，心理问题也不容小视。研究发现交[16]感神经在创面愈合中起着重要作用。普萘洛尔是一种β肾上腺素受体阻滞剂，最早是[24]用于心血管疾病的治疗，具有拮抗交感神经兴奋和儿茶酚胺的作用。近年来普萘洛尔[26]被发现可以用于治疗小儿烧伤、慢性创面及婴幼儿血管瘤溃疡等创面的治疗。课题组前期研究亦表明口服普萘洛尔对婴幼儿严重血管瘤具有良好疗效，但导致心率减慢等副作用。为减少口服用药带来的副作用，研发制作了局部外用的盐酸普萘洛尔乳膏（专利[37]号：CN201310003911.5）。目前，有关外用普萘洛尔能否促进糖尿病创面愈合罕见报道。为此，本次研究观察了外用普萘洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响，分析其可能的机制。3.1材料与方法3.1.1主要材料设备及试剂3.1.1.1仪器设备脱水机武汉俊杰电子有限公司包埋机武汉俊杰电子有限公司病理切片机上海徕卡仪器有限公司摊片机浙江省金华市科迪仪器设备有限公司冻台武汉俊杰电子有限公司烤箱上海慧泰仪器制造有限公司载玻片及盖玻片江苏世泰实验器材有限公司微波炉美的微波电器制造有限公司脱色摇床北京市六一仪器厂涡旋混合器天悦电子移液枪上海大龙仪器免疫组化笔基因科技（上海）有限公司BX-51正置光学显微镜奥林巴斯成像系统奥林巴斯19 第三军医大学硕士学位论文数码相机佳能IXUS155超低温冰箱日本三洋公司全波长酶标仪美国Thermo公司垂直电泳槽美国Bio-Rad公司转移电泳槽美国Bio-Rad公司电泳仪美国Bio-Rad公司摇床金坛市富华仪器有限公司高速离心机珠江黑马凝胶成像系统美国Bio-Rad公司电动理发器上海奔腾电工有限公司6mm皮肤打孔器眼科剪20cm直尺相机三脚固定架电子称1ml注射器3.1.1.2材料试剂脱毛膏薇婷0.6%戊巴比妥广州军区广州总医院药剂科1%盐酸普萘洛尔乳膏广州军区广州总医院药剂科不含普萘洛尔的乳膏广州军区广州总医院药剂科样本固定液（10%中性缓沖福尔马林）广州维格斯生物生物科技公司二甲苯广州化学试剂厂100%酒精广州化学试剂厂盐酸广州化学试剂厂氨水广州化学试剂厂中性树胶广州化学试剂厂苏木素-伊红染液武汉谷歌生物Masson染色试剂盒武汉谷歌生物甲苯胺蓝染色试剂武汉谷歌生物蛋白酶抑制剂Cocktail美国Sigma公司20 第三军医大学硕士学位论文磷酸酶抑制剂上海碧云天生物技术有限公司蛋白含量检测试剂盒上海碧云天生物技术有限公司预染蛋白美国Thermo公司蛋白预染Marker美国Thermo公司一抗稀释液上海碧云天生物技术有限公司RIPA裂解液上海碧云天生物技术有限公司Gelbuffer上海碧云天生物技术有限公司TrisBase威佳科技有限公司甘氨酸威佳科技有限公司脱脂奶粉威佳科技有限公司SDS北京鼎国生物技术公司甘油北京鼎国生物技术公司β-巯基乙醇北京鼎国生物技术公司过硫酸铵（APS）北京鼎国生物技术公司溴酚蓝北京博大泰克生物技术公司30%丙烯酰胺上海碧云天生物技术有限公司乙醇广州牌化学试剂甲醇广州牌化学试剂无水亚硫酸钠广州牌化学试剂硫代硫酸钠广州牌化学试剂冰醋酸广州牌化学试剂Tween-20生工生物工程（上海）有限公司0.4μmPVDF膜德国默克公司ECL发光液德国默克公司GAPDH内参上海康成生物山羊抗兔IgG(H+L)美国Southernbiotech公司兔抗鼠IgG(H+L)-HRP美国Southernbiotech公司Ang2抗体（ab155106）美国abcam公司MMP-9抗体（ab38898）美国abcam公司IL1β抗体（ab9722）美国abcam公司PCNA抗体（ab29）美国abcam公司21 第三军医大学硕士学位论文CD68抗体（ab31630）美国abcam公司3.1.1.3相关溶液配置方法1×磷酸盐缓冲液（PBS）NaCL9g，Na2HPO4-7H2O0.795g，KCL0.2g，KH2PO40.144g，H2O1000ml5×电泳缓冲液Glycine94g，Tirs-Hcl15.1g，SDS5g，H2O1000ml。10×转膜缓冲液Glycine96.48g，Tris-Hcl30.2g，H2O900mL，甲醇100ml。6×上样缓冲液Tris-HCL(PH6.8)1.8g，H2O5ml，SDS0.46g，溴酚蓝0.03g，甘油3ml。1×TBS缓冲液Tris-base2.42g，NaCl8g，H2O1000ml，pH7.4。1×TBST缓冲液TBS1000ml，TritonX-1002.5ml。Tris-EDTATris-base1.21g,EDTA0.37g,H2O1000ml加Tween-200.5ml,pH9.0。1%BSATBST10ml,BSA0.1g。分离胶Gelbuffer3.5ml，30%丙烯酰胺2.7ml，H2O1.8ml,10%APS0.04ml，TEMED4μl。浓缩胶Gelbuffer0.62ml，30%丙烯酰胺0.3ml，H2O1.68ml,10%APS0.05ml，TEMED5μl。3.1.2实验动物SPF级18只8周龄雌性BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju自发性糖尿病小鼠，35-40g，购于南京大学-南京生物医药研究院。经空运至广州，在广州军区广州总医院动物实验中心屏障系统内喂养并进行实验，实验在适应性喂养1周后开始。3.1.3实验方法及内容3.1.3.1糖尿病小鼠背部创面制作(4)术前备皮：创面制作前一天用电动理发器剪去下背部毛发，并用薇婷脱毛膏脱毛，脱毛效果满意后无菌纱布沾少量灭菌用水擦拭干净脱毛膏。(5)糖尿病小鼠称重，40mg/kg计算麻醉药0.6%戊巴比妥的剂量，腹腔注射麻醉。22 第三军医大学硕士学位论文麻醉满意后，75%酒精背部消毒，在背部中线两侧(间距1cm以上)用6mm皮肤打孔器各压下一圆形切迹，无菌眼科剪沿切迹剪下全层皮肤，深达深筋膜。无菌纱布稍压迫止血。图3.1糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型Figure3.1fullthicknessskindefectmodelofdiabeticmice3.1.3.2实验分组及处理(1)糖尿病小鼠随机分为对照组及普萘洛尔组，每组9只。实验组采用1%盐酸普萘洛尔乳膏（1000g乳膏含10g盐酸普萘洛尔），该乳膏为广州军区广州总医院专利试剂[37]（专利号：CN201310003911.5）。对照组采用不含普萘洛尔的基质乳膏，除了不含盐酸普萘洛尔，对照组乳膏成分与盐酸普萘洛尔乳膏成分完全一致，均由广州军区广州总医院药剂科制备提供。(2)普萘洛尔组创面直接涂抹适量盐酸普萘洛尔乳膏，要完全覆盖创面。对照组创面涂抹不含盐酸普萘洛尔的基质乳膏，完全覆盖创面。外层使用无菌纱布覆盖，适度胶布缠绕包扎固定，使小鼠能正常活动，单笼饲养，分组编号。23 第三军医大学硕士学位论文图3.2涂药及包扎过程Figure3.2coatinganddressingprocess3.1.3.3创面愈合率的观察及组织取材创面拍照方法：三脚架固定相机并开机，设置为拍照模式为微距模式，架设好玻璃面板拍照平台，相机镜头平行于平台，镜头下固定画一直径约为4cm圆圈，镜头对准圆圈，相机一侧边缘与平台垂直距离为15cm，抓持小鼠使创面位于镜头下玻璃面板下且位于圆圈之中，直尺固定位置放置并标记，拍照、标记并存储。创面制作当天，数码相机拍照。创面形成后2、5、7、10、14、17d打开纱布，擦掉旧的乳膏，查看创面愈合情况，数码相机拍照，之后再次按分组涂抹含或不含盐酸普萘洛尔的乳膏，最后无菌纱布包扎固定。[29]创面图像录入电脑，Image-ProPlusv6.0分析图像，计算创面愈合率创面愈合率=[1－（创面面积／初始创面面积）]×100%创面组织取材：创面形成后第2、5、7、10、14、17日随机抽取1只糖尿病小鼠取材，第21天剩余3只小鼠全部取材。腹腔注射过量0.6%戊巴比妥麻醉，无菌眼科剪迅速切取创缘外0.2cm内的全层皮肤及创面组织。将创面标本切成两半，一半10%中性缓沖福尔马林固定液，用来行HE、Masson和甲苯胺南染色染色，另一半冻存于-80℃超低温冰箱，用来行westernblot检测。24 第三军医大学硕士学位论文图3.3糖尿病小鼠创面拍照过程Figure3.3photoprocessofdiabeticmicewound3.1.3.4组织染色（1）组织切片：方法同2.1.3.4步骤，片厚4-6μm。（2）HE染色：方法同2.1.3.5步骤，显微镜下观察。（3）Masson染色：a、切片脱蜡水化；b、苏木素染10min，自来水洗，0.5%的盐酸酒精分化3s，自来水洗5min，0.6%氨水返蓝30s，自来水洗1min；c、丽春红酸性品红液染10min，纯水清洗1min；d、磷钼酸水溶液5min；e、苯胺蓝液复染5min；f、1%冰醋酸1min；g、酒精逐级脱水，二甲苯透明；h、中性树胶封片；i、显微镜下观察。（4）甲苯胺蓝染色：a、切片脱蜡水化；b、甲苯胺蓝染液染色10min；c、95%酒精分化脱色；d、电吹风吹干，二甲苯透明，中性树胶封片；e、显微镜下观察。（5）免疫组化染色：a、石蜡切片脱蜡水化。b、阻断内源性过氧化物酶：3%H2O2甲醇溶液10min，TBS洗3次，每次5min；25 第三军医大学硕士学位论文c、抗原修复：切片浸泡在EDTA溶液中，高压锅煮沸加热15min。自然冷却，TBS洗3次，每次5min；d、BSA封闭：免疫组化笔画一合适大小圆圈，圈内滴加适量1%BSA，湿盒内室温封闭1h；e、加一抗：甩掉封闭液，稍晾干，勿洗，切片上滴加适量配好的一抗（PCNA1：10000稀释，CD681：100稀释，PBS为对照），切片平放于湿盒内4°C冰箱过夜；一抗稀释用1%BSA+TBST；f、加二抗：TBS洗涤4次，每次5min。滴加与一抗相应种属的二抗，湿盒内室温孵育1h。g、DAB显色：TBS洗涤3次，每次5min，稍晾干。滴加DAB显色液，通过显微镜观察来控制时间，自来水终止显色。h、染核：苏木素染10min，用前过滤，自来水洗，0.5%的盐酸酒精分色3s，自来水洗5min，氨水返蓝，自来水洗5min。i、酒精逐级脱水，中性树胶封片；j、显微镜下观察。3.1.3.5Western-blot方法检测组织中PCNA、ang2、IL1β、MMP-9表达3.1.3.5.1组织中总蛋白的提取1、超低温冰箱内取出创面组织标本，分析天平称取100mg，剩余继续冻存。组织放入匀浆器，加入1ml裂解液后在冰上研磨。研磨充分后吸出研磨液至离心管内，4ºC静置30min，中间不断震荡。3、低温离心机离心，4℃，13000转，离心15min。4、吸取上清液即总蛋白，超低温冰箱保存。3.1.3.5.2蛋白样品初步定量按照BCA检测试剂盒说明书（上海碧云天生物技术有限公司）操作1、按说明配制25mg/ml蛋白标准液；2、PBS稀释蛋白标准液至0.5mg/ml；3、50比1的体积比配制适量BCA工作液；4、将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板样品孔，不足的用样品稀释液补足到20ul，做好标记比对；5、各孔加入200μLBCA工作液，37℃30分钟；6、酶标仪波长设置为560nm，记录下吸光值。根据所测样品的吸光值，查标准曲26 第三军医大学硕士学位论文线上得到相应蛋白含量，计算出样品的浓度。3.1.3.5.3凝胶电泳（SDS-PAGE）（1）洗板提前1天清洗干净制胶板，晾干：洗洁精反复清洗制胶玻璃板和制孔梳，自来水冲洗，再用纯水冲洗，75％酒精溶液擦净后晾干，将制胶玻璃板安装在配胶架上，注意与架子紧密贴合，涂凡士林防渗漏；（2）按配方配制分离胶，用移液枪将配置好的分离胶液体沿玻璃杯的边缘注入到两块制胶玻璃板中间的空隙中，避免产生气泡，留出与制胶板顶部大约1.5cm的距离，用超纯水覆盖，水平放置，37℃恒温箱内凝胶约40分钟；（3）待分离胶聚合完成后，倒掉顶部超纯水，冲洗数次，用滤纸吸干；（4）按配方配制浓缩胶，将浓缩胶缓缓加入到聚合好的分离胶上，平玻璃板上缘，迅速插入制孔梳，室温放置约30分钟；（5）浓缩胶聚合后，装入电泳仪，加入电泳缓冲液，拔去制孔梳，清理上样孔，排除气泡；（6）加蛋白Marker及样品，45mA恒流电泳；（7）根据蛋白Marker确定电泳时间；（8）电泳结束后依照蛋白Marker的条带剪下所需胶条；3.1.3.5.4蛋白质转移(1)依照胶的大小剪下1张PVDF膜和6张滤纸，PVDF膜甲醇活化2min，将6张滤纸、2张海绵垫、1张PVDF膜在转膜缓冲液中浸泡30min；(2)按照海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵的顺序，先放上海绵垫1张、滤纸3张，先排空气泡；再放上凝胶、PVDF膜，再排空气泡；最后放上滤纸3张和海绵垫1张，再排空气泡；(3)电泳槽置于冰上，100V恒压2h。3.1.3.5.5孵育抗体(1)TBS漂洗PVDF膜5分钟，5%脱脂奶粉封闭1小时。(2)TBST洗PVDF膜5min，3次。(3)4℃孵育一抗，轻轻震荡过夜。(4)TBST漂膜5min，3次。(5)37℃孵育二抗1h。(6)TBS漂洗5min，3次。27 第三军医大学硕士学位论文(7)曝光、显影。表2抗体稀释浓度各抗体稀释浓度抗体名称稀释比例（抗体：封闭液）MMP-9一抗1：1000Ang2一抗1：3000IL-1β一抗1：1000PCNA一抗1：1000HRP标记的GAPDH内参1：10000GoatAnti-RabbitIgG(H+L)1：20000RabbitAnti-MouseIgG(H+L)-HRP1：100003.1.3.5.6保存好图像，ImageProPlusv6.0软件分析条带灰度值。目标蛋白的条带灰度值比上对应的内参蛋白条带的灰度值所得的灰度值比即可表示蛋白表达量。3.1.4统计学方法采用SPSS21.0软件进行统计，组间比较使用T检验、单变量方差分析，数据用均数±标准差表示，p<0.05统计有意义。3.2实验结果3.3.1两组小鼠创面制作及愈合情况的观察3.3.1.1大体观察糖尿病小鼠明显较为肥胖，动作反应迟缓，有明显的多饮多食多尿表现。糖尿病小鼠背部两侧成功制作圆形全层皮肤缺损创面，创面制作后小鼠均存活直至处死取材。与对照组相比，普萘洛尔组糖尿病小鼠创面愈合明显较快，较早完成再上皮化。（图3.4）图3.4糖尿病小鼠各时间点创面Fig3.4Woundsindiabeticmiceateachtimepoint28 第三军医大学硕士学位论文3.3.1.2创面愈合率%比较在2、5、7、10、14、17d两组创面愈合率比较，普萘洛尔组均高于对照组，且P<0.05，说明普萘洛尔组创面愈合明显快于对照组（表3、图3.5）。表3糖尿病小鼠创面愈合率2d5d7d10d14d17d21d普萘洛尔组15.05±8.9021.72±15.4539.06±22.0360.37±15.6184.10±14.2995.18±6.20100±0对照组3.92±11.325.85±18.6213.79±21.6641.77±15.6561.98±16.6362.34±26.4772.57±32.40p值0.0050.0210.0100.0160.0250.0490.131图3.5普萘洛尔组与对照组创面愈合率Fig3.5Woundhealingrateoftwogroups3.3.2两组小鼠创面组织学观察3.3.2.1HE染色镜下可见，创面形成后2d普萘洛尔组即开始出现表皮增厚，而对照组未见明显表皮增厚现象（图3.6A）；5d，对照组开始出现表皮增厚现象，普萘洛尔组创缘表皮增厚较为明显且较多炎症细胞浸润（图3.6B）；10d，普萘洛尔组可见表皮细胞向创面中心爬行，且基底较多毛细血管（图3.6C）；14d，普萘洛尔组创面较多肉芽组织生长，而炎症浸润较对照组轻（图3.6D）；29 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔组对照组图3.6A创面形成后2d创缘，普萘洛尔组表皮开始增厚200×普萘洛尔组对照组图3.6B创面形成后5d创缘，普萘洛尔组及对照组表皮均有增厚，普萘洛尔组增厚较为明显200×普萘洛尔组对照组图3.6C创面形成后10d，普萘洛尔组可见表皮细胞向创面中心爬行，且基底可见较多微血管200×30 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔组对照组图3.6D创面形成后14d，普萘洛尔组创面炎症细胞浸润较对照组弱200×Fig.3.6HEstainingofwoundin2groupsat2,5,10,14d200×3.3.2.2PCNA免疫组化染色创面PCNA免疫组化染色，观察创面细胞增殖情况，PCNA阳性表达于细胞核，棕黄色为阳性表达。5d，普萘洛尔组PCNA阳性表达于表皮基底层细胞，基底软组织少量表达（图3.7A）；对照组少量表达在表皮基底层细胞，基底软组织未见明显表达。10d，普萘洛尔组PCNA主要阳性表达于新生表皮下方的基底软组织；对照组仍主要表达于表皮基底层细胞，基底软组织少量阳性细胞表达（图3.7B）。14d，基底软组织中普萘洛尔组PCNA阳性细胞数明显多于对照组（图3.7C）。普萘洛尔组对照组图3.7A创面形成后5d，普萘洛尔组PCNA阳性大量表达于表皮基底层细胞及下方软组织；对照组少量阳性表达于表皮基底层细胞，基底软组织未见明显表达200×31 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔组对照组图3.7B创面形成后10d，普萘洛尔组PCNA主要阳性表达于基底肉芽组织；对照组仍主要表达于表皮细胞，基底肉芽组织少量阳性细胞表达200×普萘洛尔组对照组图3.7C创面形成后14d，基底软组织中普萘洛尔组PCNA阳性细胞数明显多于对照组200×Fig3.7PCNAimmunohistochemicalstainingin2groupsat5,10,14d200×3.3.2.3Masson染色胶原纤维被染成蓝色。创面形成后5d、10d、14d每个时间点两组创面镜下各随机取5个视野，IPP6.0软件计算胶原纤维染色总面积，SPSS21.0软件进行T检验统计分析。创面形成后第5天创面胶原纤维表达面积无明显差异P>0.05；创面形成后10d创面胶原纤维表达面积无明显差异P>0.05；创面形成后第14天创面胶原纤维表达面积无明显差32 第三军医大学硕士学位论文异P>0.05。创面形成后5、10、14d两组胶原纤维表达面积逐渐升高，普萘洛尔组均高于对照组。胶原排列上看两组创面胶原排列均较紊乱，粗细不均。普萘洛尔组对照组图3.8A创面形成后5d创缘均见胶原纤维表达，创面胶原纤维表达面积无明显差异，P>0.05。200×普萘洛尔组对照组图3.8B创面形成后10d创面基底均见胶原纤维表达，创面胶原纤维表达面积无明显差异，P>0.05。200×33 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔组对照组图3.8C创面形成后14d创面基底均见胶原纤维表达，创面胶原纤维表达面积无明显差异，P>0.05。200×图3.8D创面形成后5、10、14d两组胶原纤维表达面积逐渐升高，普萘洛尔组均高于对照组。Fig.3.8Massonstainingin2groupsat5,10,14d200×3.3.2.4甲苯胺蓝染色甲苯胺蓝染色后肥大细胞颗粒呈紫红色。创面形成后5、10、14d均在创缘有少量表达，两组差异不明显。34 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔组对照组图3.9A创面形成后5d，普萘洛尔组及对照组创面边缘皮肤均有较少量肥大细胞颗粒表达（红色箭头所示）200×普萘洛尔组对照组图3.9B创面形成后10d，普萘洛尔组创缘未见明显表达，对照组创面边缘有较少量肥大细胞颗粒表达（红色箭头所示）200×35 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔组对照组图3.9B创面形成后14d，普萘洛尔组及对照组创面未见明显肥大细胞颗粒（红色箭头所示）200×Fig3.9Toluidinebluestainingin2groupsat5,10,14d200×3.3.2.5CD68免疫组化结果CD68免疫组化标记巨噬细胞，胞膜及胞浆均表达。创面形成后5d，两组CD68阳性表达均较少，普萘洛尔组与对照组表达无明显差异。创面形成后14d，普萘洛尔组表达较少，对照组表达较多。普萘洛尔组对照组图3.10A创面形成后5d，两组CD68阳性表达均较少，普萘洛尔组与对照组表达无明显差异200×36 第三军医大学硕士学位论文普萘洛尔组对照组图3.10B创面形成后14d，普萘洛尔组CD68表达阳性较少，对照组CD68表达阳性较多200×Fig3.10CD68immunohistochemicalstainingin2groupsat5,14d200×3.3.3Western-blot方法检测组织中PCNA、Ang2、IL1β、MMP-9的表达计算条带灰度值比值，比值越大蛋白含量越高。两组间比较采用单变量方差分析，普萘洛尔组PCNA表达与对照组比较无明显差异，p>0.05，但在2d、17d、21d表达高于对照组；Ang2表达，普萘洛尔组明显低于对照，p<0.05；IL-1β表达，普萘洛尔组明显低于对照，p<0.05；普萘洛尔组MMP-9表达与对照比较，p>0.05，2、5、7、10d表达高于对照组（图3.11）。37 第三军医大学硕士学位论文图3.11Westernblot观察创面形成后2、5、7、10、14、17、21d的PCNA、Ang2、IL1β、MMP-9蛋白表达Fig3.11WesternblotresultsofPCNA,Ang2,IL1β,MMP-9at2,5,7,10,14,17,21din2groups3.3讨论利用动物模型对疾病进行研究是科研工作的常用手段。目前常见的糖尿病小鼠模型主要有三种：药物诱导糖尿病小鼠模型、自发性糖尿病小鼠模型和基因工程糖尿病小鼠[38]模型。其中以链脲佐菌素诱导的糖尿病动物模型多见，有报道链脲佐菌素诱导的糖尿[39]病动物模型需要制定严格的血糖标准，否则模型不稳定。本实验用到的BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju糖尿病小鼠属自发性糖尿病小鼠模型。于1966年在C57BLKS/J(BKS)近交系中被发现，自发突变的纯合小鼠在三到四周龄时产生可以辨认[40]的肥胖表型，四至八周龄时血糖开始升高，并表现出多饮多食多尿的典型糖尿病表现。有研究发现与链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型相比，自发性糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面模型在创面愈合方面延迟更加明显，更适合作为模型进行糖尿病慢性创面的研究[41]。本研究使用的是自发性糖尿病模型，模型较为稳定，在实验开始前能明显观察到其多饮多食多尿的表现。38 第三军医大学硕士学位论文本研究发现创面形成后2、5、7、10、14、17d，普萘洛尔组糖尿病小鼠创面愈合速度始终快于对照组，且差异明显，这表明普萘洛尔有助于糖尿病小鼠创面愈合。Romana-Souza曾经报道口服普萘洛尔有助于链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠创面愈合，本实验研究使用的实验动物是自发性糖尿病小鼠，模型更为稳定，且采用了外用局部给药的方法，相比系统给药而言更为安全。创面愈合是一个多细胞参与的动态过程，包括炎症反应期、组织增殖期和组织重塑期三个时期。适时且适度的炎症反应有利于创面的愈合过程。在创伤发生后，炎症细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）迁移到创面区域，吞噬清除创面坏死组织及细菌，随后分[42]泌多种细胞因子和生长因子（如IL-1β、TGF-β）促进肉芽组织生长。糖尿病创面愈合延迟的原因尚不完全清楚。研究发现，糖尿病创面在创面愈合过程中不管是早期还是晚期均存在炎症因子的过度表达（如MIP-2、MCP-1、TNF-α和IL-1β），刺激中性粒[43,44]细胞及巨噬细胞在创面过度停留，最终导致组织修复缓慢而创面延迟愈合。另外一方面，减弱一些抗炎症因子（如IL-10）和生长因子（如VEGF、TGF-β及IGF-1）的表[45]达，抑制中性粒细胞及巨噬细胞功能也是导致慢性创面延迟愈合的原因。方勇等比较糖尿病小鼠与正常小鼠全层皮肤缺损模型的创面愈合情况发现，糖尿病小鼠在创面愈合早期局部的中性粒细胞和巨噬细胞数量明显较低，但在创面愈合的后期，中性粒细胞和[46]巨噬细胞数量较正常小鼠升高。刘宸等研究发现，糖尿病大鼠创面早期巨噬细胞较少，[47]而晚期巨噬细胞持续停留在创面。因此炎症细胞早期反应不足而后期过度停留可能是导致糖尿病慢性创面难愈的机制之一，改善这样的变化可能促进糖尿病创面愈合。在本研究中，组织学观察发现普萘洛尔组糖尿病小鼠早期创面炎症细胞浸润较对照组多，而后期炎症细胞浸润较对照组少。CD68是巨噬细胞特异性标志物，CD68免疫组化染色发现，普萘洛尔组及对照组阳性表达均较少，早期普萘洛尔组与对照组表达相比无明显差异，晚期则是对照组表达多于普萘洛尔组。肥大细胞颗粒表达均较少，无明显[48]差异。巨噬细胞膜表面存在高密度的β肾上腺素受体，巨噬细胞体外培养实验发现，[49]普萘洛尔降低巨噬细胞吞噬能力。也有研究发现在普通大鼠创面模型中口服普萘洛尔[50]阻断β肾上腺素能受体，导致cAMP水平降低，而白细胞聚集增加。因此普萘洛尔促进糖尿病小鼠创面愈合的原因可能是其在早期增加了中性粒细胞的浸润，后期抑制巨噬细胞在创面过度停留，与肥大细胞无明显关系。IL-1β是一种炎症细胞因子，参与调节许多局部和全身的炎症反应，抑制成纤维细[51]胞的胶原合成。研究发现糖尿病足难治溃疡组IL-1β的表达显著增高，抑制了成纤维[52]细胞的增殖。本研究结果发现普萘洛尔组明显促进糖尿病小鼠创面愈合，组织胶原较39 第三军医大学硕士学位论文对照组多，普萘洛尔组的IL-1β表达比对照组低。胶原组织主要由成纤维细胞分泌产生，对创面愈合起到重要作用，普萘洛尔能抑制IL-1β的表达，可减少IL-1β对成纤维细胞的抑制，从而导致胶原的产生增多，促进创面愈合，这可能是盐酸普萘洛尔外用促进创[53]面愈合的原因之一。Deten等报道在心肌梗塞的大鼠，普萘洛尔可以减少IL-1β的表[23]达。Romana-Souza也提出口服普萘洛尔可减少糖尿病大鼠创面炎症从而促进愈合。在糖尿病的创面中，血管内皮细胞增殖活跃，但是由于缺乏功能性的毛细血管所以[54]并不能提供血供。这一机制可能与持续不正常的Angs的表达和VEGF下调有关。[55]Ang1、Ang2及其受体Tie2是调控血管新生的信号通路。Ang1与血管内皮细胞膜上[55,56]的Tie2受体特异性结合，促进血管稳定和成熟。Ang2由血管内皮细胞合成，竞争[56]性抑制Ang1与Tie2受体特异性结合，形成不稳定的血管。李小强等报道创面负压治[57]疗可通过增强Ang-1的表达，降低Ang-2的表达，促进糖尿病大鼠伤口的血管发生。KämpferH报道糖尿病小鼠创面Ang-2的过度表达可降低VEGF的含量，不利于血管的[58]形成。本研究表明普萘洛尔乳膏组Ang2的表达减少，有利于稳定的血管生成。也有[59]学者研究表明普萘洛尔并不抑制视网膜病理性新血管形成，且不改变Ang2的表达。因此普萘洛尔与Ang2的关系还需要进一步深入研究。再上皮化是创面愈合的一个重要环节和标志，主要由角质形成细胞增殖迁移来完成。增殖细胞核抗原（PCNA）是反应细胞增殖状态的主要指标，在增殖的细胞胞核中表达。基质金属蛋白酶-9在创面修复过程中主要参与创面修复的早期阶段，能促进角质[60]形成细胞从基底膜脱离并向创面中心迁移。本研究发现，外用普萘洛尔组2d的PCNA表达高于对照组，且表皮明显增厚；10d普萘洛尔组PCNA主要在基底层表达，而对照仍在表皮大量表达，所以在蛋白表达量上无明显差异；14d普萘洛尔组表达低于对照组可能是因为已经进入重塑期，细胞增殖相对减弱，而对照仍有组织细胞增殖；17、21d主要以再上皮化为主，所以普萘洛尔组PCNA表达高于对照组，说明普萘洛尔明显促进创面角质形成细胞的增殖。普萘洛尔组MMP-9在前期表达明显高于对照组，说明普萘洛尔也明显促进了角质形成细胞的迁移。因此普萘洛尔加速了糖尿病小鼠再上皮化的进程而促进了创面的愈合。Pullar也报道了β2受体阻滞剂可促进角质形成细胞增殖迁移，[61]显著加速再上皮化。VEGF是促进血管生成的重要细胞因子，角质形成细胞是其来源[62]之一。银屑病以角质形成细胞增殖过度、局部血管新生及真皮炎症细胞浸润为主要表[63]现，有研究发现银屑病皮损处VEGF表达明显增高。外用普萘洛尔于豚鼠耳背皮肤可[33]诱发制作银屑病动物模型。普萘洛尔对角质形成细胞增殖的促进作用，可能导致VEGF表达增高而促进血管生成。这可能是普萘洛尔促进创面愈合的机制之一。40 第三军医大学硕士学位论文总之，普萘洛尔可促进自发性糖尿病小鼠背部全层皮肤缺损创面的愈合，其机制涉及多个方面，主要包括促进再上皮化、减轻炎症反应、稳定血管等各个方面。普萘洛尔有可能成为治疗糖尿病溃疡的一种新方法，值得深入研究。41 第三军医大学硕士学位论文全文结论1.普萘洛尔促进正常C57小鼠背部全层皮肤缺损创面愈合，尤其对再上皮化的作用是其可能的机制；2.普萘洛尔明显促进自发性糖尿病小鼠背部全层皮肤缺损创面愈合，机制可能涉及促进再上皮化，减轻炎症反应，及新生血管的稳定等生物学过程；3.外用普萘洛尔可能成为治疗糖尿病溃疡的一种新的手段，值得深入研究。42 第三军医大学硕士学位论文参考文献1.杨宗城.中华烧伤医学[M].北京:人民卫生出版社,2008:256.2.中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中国糖尿病杂志,2015,88(3):26-89.3.ArgianaV,EleftheriadouI,TentolourisN.Screeningforthehigh-riskfootofulceration:testsofsomaticandautonomicnervefunction[J].CurrDiabRep,2011,11(4):294-301.4.ApelqvistJ.Diagnosticsandtreatmentofthediabeticfoot[J].Endocrine,2012,41(3):384-397.5.RafehiH,El-OstaA,KaragiannisTC.Epigeneticmechanismsinthepathogenesisofdiabeticfootulcers[J].JDiabetesComplications,2012,26(6):554-561.6.SingerAJ,ClarkRA.MechanismsofDisease:cutaneouswoundhealing[J].NEnglJMed,1999,341(10):738-746.7.KinNW,SandersVM.IttakesnervetotellTandBcellswhattodo[J].JLeukocBiol,2006,79(6):1093-1104.8.TangJC,DosalJ,KirsnerRS.Topicaltimololforarefractorywound[J].DermatolSurg,2012,38(1):135-138.9.GrandoSA,PittelkowMR,SchallreuterKU.Adrenergicandcholinergiccontrolinthebiologyofepidermis:physiologicalandclinicalsignificance[J].JInvestDermatol,2006,126(9):1948-1965.10.PullarCE,AmilcarR,RRivkahI.beta-Adrenergicreceptorantagonistsaccelerateskinwoundhealing:evidenceforacatecholaminesynthesisnetworkintheepidermis[J].JBiolChem,2006,281(30):21225-21235.11.DuellEA.Identificationofabeta2-adrenergicreceptorinmammalianepidermis[J].BiochemPharmacol,1980,29(1):97-101.12.RiveraAE,SpencerJM.Clinicalaspectsoffull-thicknesswoundhealing[J].ClinDermatol,2007,25(1):39-48.13.PierceGF,MustoeTA,AltrockBW,etal.Roleofplatelet-derivedgrowthfactorinwoundhealing[J].JCellBiochem,2010,45(4):319-326.14.SengerDR,DavisGE.Angiogenesis[J].ColdSpringHarbPerspectBiol,2011,3(8):521-525.43 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第三军医大学硕士学位论文文献综述β肾上腺素受体阻滞剂对皮肤创面愈合影响的研究进展交感神经纤维在皮肤组织中广泛分布，皮肤中毛细血管平滑肌、立毛肌及汗腺周围均有交感神经分布，它们受到交感神经支配具有调节毛细血管舒张、立毛肌运动以及汗[1]液分泌等功能，在维持皮肤代谢自稳态方面具有重要作用。交感神经释放儿茶酚胺去甲肾上腺素作用于靶器官肾上腺素能受体产生生物学效应。肾上腺素能受体分为（α受体、β受体）两大类，又有（α1、α2、α3、β1、β2、β3）几种亚型。近年来交感神经在皮肤创面愈合中的作用受到大家关注。创面愈合是一个高度协调的动态过程，复杂而有序，包括炎症反应、组织增殖和组织重塑三个阶段，这三个阶段相互重叠但又各有特点，需要角质形成细胞、炎症细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞及周细胞等多种细胞共同参[1]与。研究表明，交感神经化学切除促进大鼠创面收缩、血管生成和增加创面组织肌成[2,3]纤维细胞的密度，但抑制了炎症反应。最近的研究结果显示，这些作用是通过阻滞β[4]肾上腺素受体作用而产生的。[5]β2肾上腺素受体亚型是表达于人类免疫细胞上的最主要的肾上腺素受体。角质形成细胞，成纤维细胞，肥大细胞，多形核白细胞和血管内皮细胞等细胞均存在β肾上腺[6,7]素受体表达且都参与了创面愈合。本文就β肾上腺素受体阻滞剂对创面愈合中炎症反应、血管生成及再上皮化过程的影响进行综述。1β肾上腺素受体作用机制β肾上腺素受体是一种G蛋白偶联的细胞膜表面受体，交感神经分泌产生儿茶酚胺等肾上腺素受体激动剂，与细胞膜表面β肾上腺素受体结合，活化腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP浓度增高，cAMP活化蛋白激酶A，蛋白激酶A激活启动级联反应，产生[8]一系列生物学效应。β肾上腺素受体阻滞剂则拮抗这一过程，降低细胞内cAMP的浓[9]度。2β肾上腺素受体阻滞剂与创面愈合[10]研究表明，创伤和应激导致血液及组织中儿茶酚胺升高，而高水平的儿茶酚胺抑[11]制创面的愈合。应激导致严重烧伤患者的血浆儿茶酚胺水平显著升高，不利于患者的[12,13]恢复及烧伤创面的愈合。普萘洛尔是一种常用的非选择性β受体阻滞剂，多用于心48 第三军医大学硕士学位论文血管疾病的治疗，具有拮抗交感神经兴奋和儿茶酚胺的作用。对小儿烧伤患者，普萘洛尔通过拮抗交感神经兴奋和儿茶酚胺的作用减轻代谢亢进并逆转肌肉蛋白质的分解代[14][15]谢，促进烧伤创面愈合。Mohammadi也报道了一项住院烧伤患者临床及盲随机对照实验，结果表明相比于安慰剂组，口服普萘洛尔组表面创面愈合更快、接受植皮效果更好、住院时间更短。在整形外科，普萘洛尔主要用于婴幼儿血管瘤的治疗，Kunzi-Rapp[16]等研究表明普萘洛尔可促进血管瘤表面的溃疡愈合。近几年，已见有病例报道在临床上应用与普萘洛尔类似但作用效果更强的β肾上腺素受体阻滞剂噻吗洛尔治疗放射性溃疡、静脉性溃疡等慢性难愈创面，均取得良好治疗效果，促进慢性创面愈合效果明显[17-19]。2.1肾上腺素受体阻滞剂与创面炎症反应炎症反应是创面愈合的初始阶段，适度的炎症反应有利于创面的愈合。在急性创伤发生后，炎症细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）迁移到创面区域，吞噬清除创面坏死组[20]织及细菌，随后分泌多种细胞因子和生长因子（如IL-1β、TGF-β）促进肉芽组织生长。但是持续、过度的炎症反应不利于创面的愈合，过度表达的中性粒细胞释放损害组织的[21]蛋白酶，降低胶原沉积，引起组织进行性损害导致创面加深。研究发现，糖尿病创面不管是早期还是晚期均存在炎症因子的过度表达（如MIP-2、MCP-1、TNF-α和IL-1β），[22,刺激中性粒细胞及巨噬细胞在创面过度停留，最终导致组织修复缓慢而创面延迟愈合23]。另外一方面，减弱一些抗炎症因子（如IL-10）和生长因子（如VEGF、TGF-β及[24]IGF-1）的表达，抑制中性粒细胞及巨噬细胞功能也是导致慢性创面延迟愈合的原因。[25]巨噬细胞膜表面存在高密度的β肾上腺素受体，巨噬细胞体外培养实验发现，普萘洛[26]尔呈剂量依赖性地降低巨噬细胞吞噬能力。也有研究发现在普通大鼠创面模型中口服[27]普萘洛尔阻断β肾上腺素能受体，导致cAMP水平降低，而白细胞聚集增加。[28]Romana-Souza也提出口服普萘洛尔可减少糖尿病大鼠创面炎症从而促进愈合。且局[29]部外用普萘洛尔促进足底较深慢性溃疡已见有病例报道。因此，肾上腺素受体阻滞剂能通过减轻慢性难愈创面的炎症反应而促进创面的愈合，这可能是临床上应用普萘洛尔促进慢性创面愈合的原因之一。2.2肾上腺素受体阻滞剂与创面血管生成增殖期的特征是肉芽组织的生长，其中新生毛细血管的生成尤为重要，新生血管伸入创面以代偿肉芽组织代谢需要，为肉芽组织运输氧和营养物质，同时运输炎症细胞清[30]除创面产生的代谢产物。毛细血管生成的时间、多寡和质量会直接影响到创面愈合的[31]结局。血管生成是由血管内皮细胞和周细胞共同完成的，包括末端微血管舒张、血管49 第三军医大学硕士学位论文基底膜降解、血管内皮细胞出芽、细胞外基质的降解、血管内皮细胞迁移增殖、血管内皮细胞围成管样结构、周细胞分化迁移到内皮细胞周围并包裹内皮细胞形成新生的血管[32]一系列环节。β肾上腺素受体阻滞剂对创面血管生成的影响尚不清楚。之前有报道称[33]β受体阻滞剂的应用可能导致皮肤血流量减少增加糖尿病患者的风险。也有研究认为[27]普萘洛尔抑制了正常大鼠创面的血管生成。但是对糖尿病大鼠应用普萘洛尔发现，创面形成后第14天创面组织血管密度较对照组增加，其机制可能与普萘洛尔刺激一氧化[28]氮的合成有关。在整形外科，普萘洛尔对于血管瘤的治疗取得了良好的效，其作用的机制尚不明确。有大量对血管瘤的研究表明普萘洛尔通过下调VEGF的表达、加速微血[34]管内皮的凋亡来抑制血管的生成。但Pullar研究发现，β2肾上腺素受体阻滞剂能增加[35]小鼠创面血管生成，其可能的机制是因为β2肾上腺素受体阻滞剂能增加角质形成细[36]胞的增殖，而角质形成细胞是VEGF的重要来源。在慢性复杂创面，β2肾上腺素受[37]体阻滞剂还能促进创面细胞分泌其他促进血管生成的细胞因子，如FGF或PDGF。2.3肾上腺素受体阻滞剂与创面再上皮化上皮化是创面成功愈合的一个重要标志性过程，没有再上皮化的创面不能被认为愈[38]合，所有慢性创面的上皮化进程都受到抑制。表皮作为皮肤最外层的屏障由多层角质形成细胞组成。生理状态下，基底层的角质形成细胞处于不断增殖的状态，角质形成细[38]胞向外层分化迁移，通过颗粒层，最后形成角质层。创伤后的再上皮化过程也是由角[38]质形成细胞来完成。β2肾上腺素受体是表达在皮肤主要细胞的细胞膜上的唯一亚型，[39]在角质形成细胞、成纤维细胞及黑素细胞上均有表达。并且β2肾上腺素受体可能在[40]皮肤病的病理生理中起作用，包括特应性湿疹，银屑病和白癜风。皮肤银屑病样改变[41]是普萘洛尔及其他β受体阻滞剂不常见的药物副作用。外用普萘洛尔于豚鼠耳背皮肤[42]可使角质形成细胞增殖加速而诱发制作银屑病动物模型。Pullar也报道了β受体阻滞[7]剂可促进角质形成细胞增殖迁移，显著加速再上皮化。因此，促进角质细胞增殖，加速创面再上皮化可能是β受体阻滞剂促进创面愈合的重要因素。3β肾上腺素受体阻滞剂对慢性创面的治疗作用临床上β肾上腺素受体阻滞剂外用促进慢性创面愈合的病例已见有报道。2012年[18]TangJ报道了一例外用0.5%噻吗洛尔成功治疗一名43岁女性慢性难愈创面的病例，2该女性患者因多次开胸手术留置导管导致左中背部一个长达15个月，面积26cm、深3.5cm的创面，经过创面每日外用0.5%噻吗洛尔后，8周后创面完全愈合。2013年Liza[19]R报道了5例慢性难愈创面（3例下肢静脉性溃疡、1例压疮、1例创伤性溃疡）的治50 第三军医大学硕士学位论文[17]疗，外用0.5%噻吗洛尔4-8周，3例完全愈合，2例创面明显缩小。2014年KouroshB报道了一例头部放射性溃疡，外用0.5%噻吗洛尔治疗，4个月后完全愈合。2016年Vestita[29]M报道了一例外用1%盐酸普萘洛尔乳膏治疗足底部慢性溃疡的病例，持续治疗4周后创面完全愈合。从以上几例成功病例来看，外用β肾上腺素受体治疗慢性复杂难愈创面安全有效，是临床上治疗慢性创面的一个新的手段。4小结β肾上腺素受体在创面愈合过程中有重要作用，对炎症细胞浸润、血管新生、角质细胞增殖及再上皮化均有调控作用。特别是β受体阻滞剂对角质形成细胞增殖有着明显的促进作用。其次β受体阻滞剂对炎症反应的调控作用，也是促进各类慢性创面愈合的重要因素。多年来β肾上腺素受体阻滞剂在临床用于治疗心血管疾病，安全性已得到检验，虽然其促进创面愈合的具体机制尚不十分清楚，但目前临床上已有外用β受体阻滞剂成功治疗慢性难愈创面的病例报道，为临床上治疗慢性难愈创面提供了新的思路和手段。51 第三军医大学硕士学位论文参考文献1.SingerAJ,ClarkRA.MechanismsofDisease:cutaneouswoundhealing[J].NEnglJMed,2004,341(2):403-407.2.SouzacBR,CardosocJF,AmadeuTP,etal.Sympatheticdenervationaccelerateswoundcontractionbutdelaysreepithelializationinrats[J].WoundRepairRegen,2005,13(5):498-505.3.AnkushG,JonesSB,RaviS,etal.Norepinephrinemodulatestheinflammatoryandproliferativephasesofwoundhealing[J].JTrauma,2006,60(4):736-744.4.Romana-SouzaB,SantoscJS,Monte-Alto-CostaA.β-1andβ-2,butnotα-1andα-2,adrenoceptorblockadedelaysratcutaneouswoundhealing[J].WoundRepairRegen,2009,17(2):230-239.5.KinNW,SandersVM.IttakesnervetotellTandBcellswhattodo[J].JLeukocBiol,2006,79(6):1093-1104.6.DuellEA.Identificationofabeta2-adrenergicreceptorinmammalianepidermis[J].BiochemPharmacol,1980,29(1):97-101.7.PullarCE,RizzoA,IsseroffRR.beta-Adrenergicreceptorantagonistsaccelerateskinwoundhealing:evidenceforacatecholaminesynthesisnetworkintheepidermis[J].JBiolChem,2006,281(30):21225-21235.8.KolinskiM,PlazinskaA,JozwiakK.Recentprogressinunderstandingofstructure,ligandinteractionsandthemechanismofactivationoftheβ2-adrenergicreceptor[J].CurrMedChem,2012,volume19(8):1155-1163.9.赵赵赵，周明学，翟翟婷，王宁，底婷婷，李萍不同基质配方的.普萘洛尔外涂对豚鼠耳背部皮肤的影响[J].世世中世医结合杂志,2014(7):703-705,731.10.NankovaBB,SabbanEL.Multiplesignallingpathwaysexistinthestress-triggeredregulationofgeneexpressionforcatecholaminebiosyntheticenzymesandseveralneuropeptidesintheratadrenalmedulla[J].ActaPhysiolScand,1999,167(1):1-9.11.Romana-SouzaB,OtrantoM,VieiraAM,etal.Rotationalstress-inducedincreaseinepinephrinelevelsdelayscutaneouswoundhealinginmice[J].BrainBehavImmun,2010,24(3):427-437.12.ZhangXJ,MengC,ChinkesDL,etal.Acutepropranololinfusionstimulatesprotein52 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第三军医大学硕士学位论文致谢三年时间过得很快，一转眼我的研究生生活即将结束。三年时间收获很大，不仅在学业上使我进步，在生活上也让我更加成熟。在这里我要由衷感谢三年来给我许多帮助和指导的老师们、同学朋友们和亲人们！首先要感谢我的导师程飚教授，是您接受了我成为您的一名研究生，给了我学习和生活上更大的空间。您在手术台上那巧妙地皮瓣设计、精准细致的手术操作和认真负责的态度让我认识到成为一名合格的整形医生应该具备的基本条件；您对学术研究的热忱和丰富博学理论知识让我认识到成为一名学者所要具备的知识储备。您临床和科研上的指导将让我终身受益，生活上的启迪也将让我以后的道路走得更加顺利!其次还有感谢临床工作中对我严格要求的带教老师唐建兵副主任医师及广州总医院整形外科其他老师们对我临床工作的支持和帮助！感谢你们让我更加好的掌握了许多临床专业知识！还要感谢在论文研究工作中医学实验科及动物实验中心的老师们对我的指导和帮助！感谢师姐宣敏博士、崔晓博士、孔亚男博士、李刘博士、卓志媛硕士，感谢师兄郑志张博士、黄翀博士、邹吉平硕士、万雨硕士及同学潘良利、钱胜林还有师弟师妹们给我提供的帮助！特别要感谢我的家人对我的支持和关心，希望你们健康快乐！最后感谢专家们在百忙之中对我论文的评审！论文有许多不足，周请您们提出宝贵的意见和建议！谢谢！57
