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１．１《ＪＱ分类号：Ｒ５８７学校代码ｌｌｉ：遍２觸－密级：学号？厶而ｇ斜大学ＳＨＡＮＸＩＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文替米沙坦和胰岛索对糖尿病大鼠睾丸内质网应激和沉默倌息调节因子１表达的彩晌ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓａｎｄＳｉｒｔｌｉｎｔｈｅｔｅｓｔｉｓｏｆｔｙｅ１ｐｐｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ研究生：黄艳指导教师：郭志新教授专业名称：内科学研究方向：糖尿病及其慢性并发症学位类型：专业学位所在学院：第二临床医学院中国山西二Ｏ—七年五月十一曰 分类号：R587.1学校代码：10114密级：学号：021420651替米沙坦和胰岛素对糖尿病大鼠睾丸内质网应激和沉默信息调节因子1表达的影响EffectoftelmisartanandinsulinontheexpressionofendoplasmicreticulumstressandSirt1inthetestisoftype1diabeticrats研究生：黄艳指导教师：郭志新教授专业名称：内科学研究方向：糖尿病及其慢性并发症学位类型：专业学位所在学院：第二临床医学院中国山西二O一七年五月十一日 学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师郭志新指导下，本人独立完成的研宄成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或成一果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。：本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果交回学校授予的学位证书；学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；３、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉；４、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。Ｉ论文作者签名：寺３令）日期：＞〇／７年「月日！学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。保密论文在解密后应遵守此规定（）论文作者签名：曰期：＾年ｆ月／７日指导教师签名：日期：７年Ｃ月／日７／（本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用） 目录中文摘要..............................................................................................................................Ⅰ英文摘要..............................................................................................................................Ⅳ前言....................................................................................................................................11材料与方法.....................................................................................................................31.1实验材料.................................................................................................................31.2实验方法.................................................................................................................31.3统计学分析.............................................................................................................82结果..............................................................................................................................93讨论............................................................................................................................124结论............................................................................................................................14参考文献..............................................................................................................................15综述..................................................................................................................................19致谢..................................................................................................................................29个人简历..............................................................................................................................30 山西医科大学（博）硕士学位论文替米沙坦和胰岛素对糖尿病大鼠睾丸内质网应激和沉默信息调节因子1表达的影响摘要目的：观察替米沙坦和胰岛素对1型糖尿病大鼠睾丸组织内质网应激诱导CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、葡萄糖调节蛋白-78（GRP-78）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-12（caspase-12）、沉默信息调节因子1（Sirt1）mRNA表达的影响，探讨替米沙坦和胰岛素对糖尿病大鼠的睾丸保护作用及机制。方法：雄性SD大鼠36只随机分为正常对照组8只（A组）和糖尿病造模组28只。用链脲佐菌素（STZ）诱导T1DM模型，24只成功。造模成功的大鼠被随机分为糖尿病组（B组，n=8)、糖尿病胰岛素治疗组（C组，n=8)和替米沙坦治疗组（D组，n=8）。给C、D组分别予以胰岛素注射及替米沙坦灌胃，C组每日予以精蛋白锌胰岛素注射液3-5U/只皮下注射，血糖控制在约10mmol/l，D组给予替米沙坦10mg/kg/d灌胃。A组和B组等量生理盐水。于实验第8周末留取血标本，然后处死动物，迅速取出双侧睾丸，称重并计算睾丸指数，剪下附睾制备精子悬液，计数精子数量及活动率。睾丸组织迅速投入液氮中，冻透后保存于-70℃冰箱待用。睾酮水平用放射免疫法测定。CHOP、GRP-78、Caspase-12、Sirt1mRNA表达水平用实时荧光定量PCR测定。结果：1、与A组比较，B组糖尿病大鼠血糖[（5.11±0.23）比（27.38±0.82）mmol/l，P<0.05]明显升高，睾酮[血清睾酮（1.60±0.38）比（3.75±1.01）ng/ml，睾丸睾酮（0.45±0.12）比（3.31±0.26）pg/μg蛋白，均P<0.05]、睾丸重量[（1.79±1.10）比I 山西医科大学（博）硕士学位论文（3.23±0.49）g，P<0.05]、精子数量[（38.25±3.06）比（34.38±3.58）x106个/mL，P<0.05]及活动率[83.13±3.68）比（74.38±7.01）%，P<0.05]水平明显降低，睾丸CHOP、GRP-78、Caspase-12mRNA（[1.33±0.04）比（1.00±0.00）、（1.64±0.16）比（1.00±0.00）、（1.55±0.13）比（1.00±0.00），均P<0.05]表达水平明显升高，Sirt1mRNA（[0.52±0.04）比（1.00±0.00），P<0.05]表达水平明显降低。2、经胰岛素治疗后，C组大鼠血糖[（9.71±0.23）比（27.38±0.82）mmol/l，P<0.05]较B组明显降低，睾酮[血清睾酮（2.48±0.57）比（1.60±0.38）ng/ml，睾丸睾酮（3.11±0.63）比（0.45±0.12）pg/μg蛋白，均P<0.05]、睾丸重量[（3.05±0.36）比（1.79±1.10）g，P<0.05]、精子数量[（34.38±3.58）比（7.75±1.67）x106个/mL，P<0.05]及活动率[（74.38±7.01）比（19.25±2.38）%，P<0.05]较B组明显升高，睾丸CHOP、GRP-78、Caspase-12mRNA表达水平较B组明显降低[（0.98±0.06）比（1.33±0.04）、（1.21±0.08）比（1.64±0.16）、（1.24±0.10）比（1.55±0.13），均P<0.05]，Sirt1mRNA表达水平较B组明显升高（[0.83±0.09）比（0.52±0.04），P<0.05]。3、替米沙坦治疗后，D组大鼠血糖[（21.28±0.54）比（27.38±0.82）mmol/l，P<0.05]较B组明显降低，精子数量（[11.1±2.03）比（7.75±1.67）x106个/mL，P<0.05]、精子活动率[（30.13±3.83）比（19.25±2.38）%，P<0.05]明显升高，睾酮[血清睾酮（1.71±0.32）比（1.60±0.38）ng/ml，睾丸睾酮（0.58±0.10）比（0.45±0.12）pg/μg蛋白，P>0.05]、睾丸重量[（2.16±0.99）比（1.79±1.10）g，P>0.05]无明显变化，睾丸CHOP、GRP-78、Caspase-12mRNA表达水平均较B组明显降低[（1.29±0.04）比（1.33±0.04）、（1.36±0.12）比（1.64±0.16）、（1.33±0.09）比（1.55±0.13），均P<0.05]，Sirt1mRNA表达水平较B组明显升高[（0.69±0.07）比（0.52±0.04），均P<0.05]。4、四组大鼠睾丸指数比较差异均无统计学意义[(0.94±0.20)比(1.07±0.52)、(0.73±0.08)比(0.94±0.201)、(0.73±0.08)比(1.07±0.52)、(1.03±0.39)比(0.94±0.201)、(1.03±0.39)比(1.07±0.52)（P均>0.05）]。结论：1、糖尿病大鼠睾丸CHOP、GRP-78和Caspase-12表达水平升高，Sirt1表达水平降低，导致睾丸内质网应激水平升高，沉默信息调节因子1保护作用减低，最终II 山西医科大学（博）硕士学位论文可致糖尿病大鼠睾丸病变的发生。2、替米沙坦和胰岛素通过下调内质网应激水平、上调Sirt1表达，减轻了内质网应激对糖尿病大鼠睾丸组织的损伤，提高了Sirt1对糖尿病大鼠睾丸组织的保护，从而对糖尿病大鼠睾丸组织产生保护作用。关键词：糖尿病；睾丸；内质网应激；沉默信息调节因子1；替米沙坦III 山西医科大学（博）硕士学位论文EffectoftelmisartanandinsulinontheexpressionofendoplasmicreticulumstressandSirt1inthetestisoftype1diabeticratsAbstractObjective:Toobservetheregulationeffectofinsulinortelmisartanontheexpressionofchop,GRP-78,caspase-12andSirt1inthetestesoftype1diabeticrats.Toexploretheprotectiveeffectandmechanismofinsulinortelmisartanonthetesticulartissueofdiabeticrats.Methods:Thirty-sixmaleSprague-Dawley(SD)ratsweredividedintonormalcontrolgroup(groupA,n=8)anddiabeticmodelgroup(n=28)randomly,whichwereinducedbyasingleintraperitonealinjectionofstreptozotocin(STZ).Thereweretwenty-fourratsinducedsuccessfully.Alltheseweredividedintodiabeticgroup(groupB,n=8),diabetictreatedwithinsulingroup(groupC,n=8)anddiabetictreatedwithtelmisartangroup(groupD,n=8).RatsingroupCweregivenprotamine-zincinsulinbysubcutaneousinjectiononcedailytocontrolbloodglucoseatabout10mmol/l.TheratsingroupDweregiventelmisartanonceadaybygavage.TheratsingroupAandgroupBweregivenequalvolumeofnormalsalinebygavage.Onlyattheendoftheeighthweek,canspecimensbetaken.Atthesametime，sometaskshadtobedone,andthenthebilateraltestesweretookoutandtheepididymiswascuttopreparedspermsuspension.Thetresticulartissueswereimmediatelythrownintotheliquidnitrogenandthenstoredinthe﹣70C°refrigeratoruntilanalyseswerecarriedout.Thelevelsoftestosteroneweredetectedbyradioimmunoassay,andcalculattheweightandindexoftesticle,accounttheIV 山西医科大学（博）硕士学位论文quantityandactivityrateofsperm.ThemRNAexpressionlevelsofchop,GRP-78,caspase-12andSirt1wereassessedbyreal-timefluorescentquantitativePCR.Results:1.Thelevelsofbloodglucose[（5.11±0.23）vs（27.38±0.82）mmol/l，P<0.05]wereremarkablyincreasedingroupBthanthoseingroupA,testosterone[serumtestosterone（1.60±0.38）vs（3.75±1.01）ng/ml，testiculartestosterone（0.45±0.12）vs（3.31±0.26）pg/μgprotein，allP<0.05],testesweight[（1.79±1.10）vs（3.23±0.49）g，P<0.05],spermcounts（[38.25±3.06）vs（34.38±3.58）x106个/mL，P<0.05]andmotility[83.13±3.68）vs（74.38±7.01）%，P<0.05]weresignificantlydecreasedingroupBthanthoseingroupA.ThemRNAexpressionlevelsexpressionoftesticularchop,GRP-78,caspase-12[（1.33±0.04）vs（1.00±0.00）、（1.64±0.16）vs（1.00±0.00）、（1.55±0.13）vs（1.00±0.00），均P<0.05]wereremarkablyincreasedingroupBthanthoseingroupA.However,thelevelofthemRNAexpressionoftesticularSirt1[（0.52±0.04）vs（1.00±0.00），P<0.05]wassignificantlydecreased.2.Afterinsulintherapy,thelevelsofbloodglucose[（9.71±0.23）vs（27.38±0.82）mmol/l，P<0.05]weresignificantlydecreasedingroupCthanthoseingroupB,testosterone[serumtestosterone（2.48±0.57）v（s1.60±0.38）ng/ml，testiculartestosterone（3.11±0.63）vs（0.45±0.12）pg/μgprotein，allP<0.05],testesweight[（3.05±0.36）vs（1.79±1.10）g，P<0.05],spermcounts[（34.38±3.58）vs（7.75±1.67）x106个/mL，P<0.05]andmotility[（74.38±7.01）vs（19.25±2.38）%，P<0.05]weresignificantlyincreasedingroupCthanthoseingroupB.ThelevelsofthemRNAexpressionoftesticularchop,GRP-78,caspase-12weresignificantlydecreasedthanthoseingroupB[（0.98±0.06）vs（1.33±0.04）、（1.21±0.08）vs（1.64±0.16）、（1.24±0.10）vs（1.55±0.13），allP<0.05].ThelevelofthemRNAexpressionoftesticularSirt1wassignificantlyincreasedthanthoseingroupB[（0.83±0.09）vs（0.52±0.04），P<0.05].3.Aftertelmisartantherapy,thelevelsofbloodglucose[（21.28±0.54）vs（27.38±0.82）mmol/l，P<0.05]weresignificantlydecreasedingroupDthanthoseingroupB,spermcounts[（11.1±2.03）vs（7.75±1.67）x106个/mL，P<0.05]andV 山西医科大学（博）硕士学位论文motility[（30.13±3.83）vs（19.25±2.38）%，P<0.05]weresignificantlyincreasedingroupDthanthoseingroupB,butthelevelsoftestosterone[serumtestosterone（1.71±0.32）vs（1.60±0.38）ng/ml，testiculartestosterone（0.58±0.10）vs（0.45±0.12）pg/μgprotein，allP>0.05]andtestesweight[（2.16±0.99）vs（1.79±1.10）g，P>0.05]hadnosignificantchanges.ThelevelsofthemRNAexpressionoftesticularchop,GRP-78,caspase-12weresignificantlydecreasedingroupDthanthoseingroupB[（1.29±0.04）vs（1.33±0.04）、（1.36±0.12）vs（1.64±0.16）、（1.33±0.09）vs（1.55±0.13），allP<0.05].ThelevelofthemRNAexpressionoftesticularSirt1wassignificantlyincreased[（0.69±0.07）vs（0.52±0.04），P<0.05].4.Theindexoftesteshadnostatisticalsignificancedifferenceamongfourgroups[(0.94±0.20)vs(1.07±0.52)、(0.73±0.08)vs(0.94±0.201)、(0.73±0.08)vs(1.07±0.52)、(1.03±0.39)vs(0.94±0.201)、(1.03±0.39)vs(1.07±0.52)（P>0.05）].Conclusion：1.Thelevelsoftheexpressionoftesticularchop,GRP-78,caspase-12wereincreasedandtheleveloftheexpressionoftesticularSirt1wasdecreasedindiabeticgroup,whichplaysanimportantintheoccurrenceoftesticularpathologicalchanges.2.Insulinortelmisartanmayplayaprotectiveroleontesticulartissuesbydown-regulatingtheexpressionofendoplasmicreticulumstressandup-regulatingtheexpressionofSirt1.Keywords:diabetes;testis;endoplasmicreticulumstress;Sirt1;telmisartanVI 山西医科大学（博）硕士学位论文前言糖尿病是一种由多种因素（如遗传、免疫功能紊乱、肥胖等）导致的慢性代谢性疾病，现已造成潜在的世界性健康危机，所致严重危害在于该病的急、慢性并发症。生殖系统功能障碍是糖尿病常见的慢性并发症之一，其发病率是非糖病患者的5~10倍。生殖系统功能障碍如逆行性射精、勃起功能障碍、精子产生异常、精液质量下降等生殖相关问题均与体内高糖状态有关[1-2]。随着糖尿病发病率升高及发病年龄年轻化，糖尿病生殖系统损伤造成的生育问题备受关注，成为当前研究的热点[3]。临床试验及动物研究显示，氧化应激在糖尿病并发症的发生发展中起了重要作用，以往认为氧化应激被认为是造成糖尿病患者睾丸功能障碍的主要因素，目前新型研究提出内质网参与多种凋亡通路的传导，内质网持续应激状态可导致细胞凋亡。据现研究现状分析，细胞凋亡机制主要有三种[4]，典型细胞内凋亡途径有死亡受体活化(外源性途径)和线粒体损伤途径(内源性途径)，而内质网应激凋亡途径是近几年的最新发现[5]。内质网(endoplasmicreticulum,ER)是细胞质中蛋白质合成加工以及Ca2+储存的重要场所，本身具有强大的内稳态体系，但也易受多重因素的影响，如营养负荷过重，能量需求增加、毒素等[6-7]，都会打破内稳态，导致Ca2+平衡破坏、异常蛋白质蓄积，形成内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)[8]，细胞启动自身保护机制，引起未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponseUPR）。ESR是内质网在应对应激状态时的一种适应性保护机制，主要方式有抑制空间结构异常的蛋白翻译；同时激活分子伴侣，重新折叠、转运蛋白质分子；加速异常蛋白降解即内质网相关蛋白质降解(ER-associatedpro-teindegradation,ERAD)。UPR主要是通过跨膜蛋白介导ESR的信号传导，启动保护系统，目前已知的跨膜信号分子有双链RNA依赖蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、肌醇依赖酶1(IRE1)、活化转录因子(ATF6)[9]。适度的应激，激活其上游信号蛋白——GRP-78，对抗ROS引起的细胞损伤，起到自身保护作用[10]。但持续或过强的应激会引起细胞启动相关凋亡途径[11]。细胞凋亡是生物体内细胞主动死亡的一种具有自我保护性质的生理过程。ESR相关的细胞凋亡途径包括CHOP/GADD153表达；JNK的激活；caspase-12蛋白水1 山西医科大学（博）硕士学位论文解酶的活化[12]，其中CHOP是主要途径，caspase-12通路仅在ESR时被激活[13]，未在其他凋亡途径中发现。沉默信息调节因子2(silentinformationregulator2，Sirt2)首先是在酵母菌研究中发现的，后逐步探索出7个同源基因即SIRT1-7，统称为Sirtuins家族。SIRTl具有NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶活性。研究表明，SIRT1协调体内氧化物代谢的平衡。高糖刺激SIRTl／NADPH氧化酶／ROS信号途径激活，使ROS产生增多，引起体内氧化应激损伤。血糖升高状态下，肾素—血管紧张素—醛固酮系统呈激活状态，血管紧张素II是RAS系统的主要影响因素，替米沙坦作为血管紧张素II的受体拮抗剂，可以部分激动PPAR-γ[14]，一方面拮抗RAS的激活，另一方面通过PPAR-γ受体发挥降血糖作用，糖尿病治疗药物中，罗格列酮亦是通过激动PPAR-γ受体发挥减轻胰岛素抵抗，改善血糖的功能。此外，有研究显示，替米沙坦还可以通过降低内质网应激水平从而发挥改善细胞凋亡的作用[15-16]，从而起到相应靶器官保护作用。2 山西医科大学（博）硕士学位论文1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验试剂链脲佐菌素（STZ）美国sigma公司精蛋白锌胰岛素江苏万邦生化医药股份有限公司替米沙坦海南selection药业有限公司葡萄糖测定试剂盒上海荣盛生物药业有限公司睾酮放射免疫试剂盒北京北方生物技术研究所Trizol试剂上海生工生物科技有限公司RT-PCR试剂盒大连TaKaRa公司PCR内参引物北京SBS基因技术有限公司BCA蛋白质定量试剂盒武汉BOSTER生物工程有限公司1.1.2实验仪器设备双目显微镜JapanOlympusCompany全自动生化分析仪JapanOlympusCompany实时荧光定量PCR仪型号SLAN-96，上海宏石医疗科技有限公司高速低温离心机GermanyHeraeusCompany1.2实验方法1.2.1建立模型，实验分组清洁级6周龄雄性SD大鼠36只(由山西医科大学动物实验中心提供)，体重200±20g，性功能正常（与发情雌鼠交配证明），适应性喂养（自然24小时照明屏蔽环境，通风好，湿度40-70%、温度20℃-25℃，可自由进水和进食，更换敷料1-2次/日，）1周后随机分为正常对照组（A组，n=8)和糖尿病组（n=28)。糖尿病造模组禁食12小时后，按体质量给予链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司溶解于3 山西医科大学（博）硕士学位论文4℃,PH=4.0,0.1mmol/l无菌柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲液配制而成的10mg./ml的浓度）65mg/kg腹腔注射，对照组给予等量生理盐水腹腔注射，72h后尾静脉采血测血糖≥16.7mmol/L为造模成功。将造模成功的24只大鼠随机分为糖尿病对照组（B组，n=8)和糖尿病胰岛素治疗组（C组，n=8)及替米沙坦治疗组（D组，n=8)。C组给予精蛋白锌胰岛素（江苏万邦生化医药股份有限公司）3~5U/d皮下注射，使血糖控制于10mmol/L左右，D组给予替米沙坦10mg/(kg.d)（海南赛力克药业有限公司）灌胃。A组及B组给予等量生理盐水皮下注射，共干预治疗8周。1.2.2标本收集药物干预治疗8周后，于实验结束前1d禁食10~12h后称重，用10%水合氯醛（3ml/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉采血留取血标本，用于血糖和睾酮水平检测。采血后立即处死动物，迅速取出双侧睾丸，剪下附睾制备精子悬液，用于计数精子数量及活动率。睾丸去白膜，用冰生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后称重，计算睾丸指数（睾丸重量/体重）。睾丸组织迅速投入液氮中，冻透后储藏于－70℃冰箱，用于睾丸组织CHOP、GRP-78、caspase-12、Sirt1、睾酮的检测。1.2.3观察指标及方法1.2.3.1血糖、血清和睾丸组织睾酮的测定1.2.3.1.1血糖采用葡萄糖氧化酶法测定（试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。1.2.3.1.2血清睾酮采用放射免疫法测定（试剂盒购自北京北方生物技术研究所）。125I睾酮-放射免疫试剂。1.2.3.1.3睾丸组织中睾酮的测定首先提取睾丸组织总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，其次睾丸组织睾酮含量采用放射免疫法测定。1.2.3.1.3.1睾丸组织总蛋白提取1)用已消毒的小剪刀，剪出0.1g组织，放入EP管。2)每个试管加1ml裂解液。4 山西医科大学（博）硕士学位论文3)小剪刀于裂解液中充分剪碎组织，4℃冰箱中孵育3h。4)以14000g离心4min。上清液为组织蛋白提取物。提取后分装于EP管中，-70℃冰箱保存。1.2.3.1.3.2微孔板法BCA蛋白定量1)配制BCA工作液：BCA试剂A、B按50:1体积充分混匀而成。根据本实验标准品和样品数量，以及每个标本做复孔的要求，计算孔数=(标准品个数+样本个数)x2=(9+32)x2=82孔，每孔加入工作液200ul，则需要BCA工作液16400ul，结合实际加样以及操作过程中误差，本试验配制BCA工作液18600ul(A试剂18000ul，B试剂360ul混合)。2)稀释标准品：向标准冻干品加1ml生理盐水，制成10mg/ml稀释液，依次稀释。管号稀释液(ul)标准品(ul)终浓度(ug/ml)A240602000B3090(从A管取)混匀1500C6060(从A管取)混匀1000D6060(从B管取)混匀750E6060(从C管取)混匀500F6060(从E管取)混匀250G6060(从F管取)混匀125H10025(从G管取)混匀25I60003)标准品和待测品各25ul均加入微孔，每个标本上下做复孔，以提高试验准确性。4)各孔加200ulBCA工作液，混匀。5)盖上96孔板盖，37℃孵育30min。6)酶标仪测A562处吸光值。据标准曲线得样本蛋白浓度。1.2.3.1.3.3睾丸组织睾酮放射免疫法5 山西医科大学（博）硕士学位论文同血清睾酮检测法。组织T浓度(pg/ug)=测定T浓度(ng/ml)x1000/组织蛋白浓度(ug/ml)。1.2.3.2精子计数及活动率测定处死大鼠，取下一侧睾丸，清除干净周围组织，置入备好的37℃的2ml生理盐水EP中，剪碎睾丸，取上层精子悬液0.02ml至试管中，然后加入0.38ml精子固定液(碳酸氢钠5.0g，甲醛1.0ml，加蒸馏水至100ml）混匀，用血细胞计数器进行计数。将计数板置于37℃预温好的显微镜载物台上，加入精子混悬液，于10倍镜下观察精子形态，40倍镜下计数精子数量、活动率。1.2.3.3睾丸组织CHOP、GRP-78、Caspase-12、Sirt1mRNA表达的测定采用实时荧光定量PCR法测定。1.2.3.3.1Triol试剂提取睾丸总RNA1)取约0.1g睾丸组织，置于1.5ml无酶EP管,向其加入1mlTrizol试剂,在冰块上用小剪刀将组织剪碎。2)组织液静置5min。3)离心机12000g4℃离心5min。4)上述得到的上清液移到空的无酶EP管中。5)然后向其中加入200ul氯仿，盖上EP管盖。使用振荡机使其乳化，静置5min。6)12000g，4℃离心15min。液体分3层。7)取上清液转入空的无酶EP管，然后取1ml的异丙醇滴入上清液。混匀后静置15min。8)12000g，4℃离心10min，试管底部出现RNA沉淀。9)弃去上清，1ml75%乙醇洗涤EP管壁。7500g4℃离心5min，弃去上清液。10)RNAisoPlus溶解干燥的沉淀，即得RNA。1.2.3.3.2RNA反转录制备cDNA下述步骤在冰浴下进行1)将上述步骤所得到的RNA取0.001ml放入0.5ml试管中，向其中加入249ulTEBuffer稀释RNA,混匀，测定RNA的浓度。6 山西医科大学（博）硕士学位论文2)计算每个样本的加样量。3)标记无酶EP管，各管中加入2ul5XPrimeScriptRTMasterMix、对应样本RNA体积以及RNaseFreeedH2O，震荡5s，离心15s。4)BIO-RADDNAEngine仪器设定反转录条件：37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃孵育1h，反应终止后即成功得到cDNA，在-20℃条件下保存。1.2.3.3.3PCR扩增1.2.3.3.3.1PCR反应体系表1特异性DNA体外引物定向酶促扩增成分加量(ul)SYBRPreminExTaqII(2X)10.0PCRForwardPrime(10uM)0.8PCRReversePrime(10uM)0.8RTreactionsolution(cDNAsolution)2.0dH2O(steriledistilledwater)6.0Dyell(50X)0.41.2.3.3.3.2PCR扩增条件PCR反应体系充分混合均匀后放入RT-PCR扩增仪器中，设置条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共循环32次；72℃再延伸7min。1.2.3.3.3.3结果分析采用实时荧光定量PCR电脑系统读取△Ct值，△Ct=待测组目的基因Ct值－待测组内参基因Ct值，△△Ct=△Ct一(对照组目的基因平均Ct值－对照组内参基因平均Ct值)。以2-△△Ct表示样品中目的基因mRNA相对于对照组的表达量。7 山西医科大学（博）硕士学位论文1.2.3.3.3.4引物信息见表2表2引物信息表引物名称引物序列引物长度(bp)GRP-78上游引物：5’-CCTGTYGCTGGACTCTGTGA-3’204下游引物：5’-GAATACACCGACGCAGGAAT-3’caspase-12上游引物：5’-GCTGCCAAGAGAACACATGA-3’169下游引物：5’-GGTTCTCAGCTTTGCTCAGG-3’CHOP上游引物：5’-CCTCGCTCTCCAGATTCCA-3'147下游引物：5’-CTCATTCTCCTGCTCCTTCTCC-3’Sirt1上游引物：5’-CAGGTACAGGAATTGCTCCACCA-3’85下游引物：5’-CTGATCTCCTTGTTCAAGTTCACA-3’β-actin上游引物：5’-ATGGTGAAGGTCGGTGTG-3’161下游引物：5’-AACTTGCCGTGGGTAGAG-3’1.3统计学处理采用SPSS18.0软件进行统计分析，所有数据均以xs表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。8 山西医科大学（博）硕士学位论文2结果2.1整体观察随着饲养时间的延长，B组大鼠可见毛色无光泽，容易激怒，有明显的“三多一少”症候群。而胰岛素、替米沙坦治疗组大鼠上述症状减轻，且体重明显增加。2.2各组大鼠体重、睾丸重、睾丸指数以及精子数量、活动率的比较与A组比较，B组糖尿病大鼠体重、睾丸重量、精子数量及活动率明显降低(P<0.05)。经胰岛素治疗后，C组大鼠体重、睾丸重量、精子数量及活动率较B组明显升高(P<0.05)，替米沙坦治疗8周后，D组大鼠精子数量、精子活动率明显升高（P<0.05），大鼠体重、睾丸重量无明显变化（P>0.05），四组大鼠睾丸指数比较差异均无统计学意义(P>0.05）。具体见表3。表3各组大鼠睾丸重量、睾丸指数、精子数、精子活动率的比较（xs,n=8)组别睾丸重量（g)睾丸指数精子数量（x106个/mL）精子活动率（%）A组3.23±0.490.94±0.2038.25±3.0683.13±3.68B组1.79±1.10(1)1.07±0.527.75±1.67(1)19.25±2.38(1)C组3.05±0.36(2)0.73±0.0834.38±3.58(2)74.38±7.01(2)D组2.16±0.99(1)1.03±0.3911.1±2.03(2)30.13±3.83(2)注：（1）与A组比较P<0.05；(2)与B组比较P<0.052.3各组大鼠血糖、血清及睾丸组织睾酮比较与A组比较，B组糖尿病大鼠空腹血糖明显升高（P<0.05)，血清和睾丸组织睾酮降低（P<0.05）。胰岛素治疗后，C组大鼠空腹血糖低于B组（P<0.05)，血清和睾丸组织睾酮明显高于B组（P<0.05)，替米沙坦治疗8周后，D组大鼠血糖明显降低（P<0.05），血清及睾丸组织睾酮无明显变化（P>0.05）。具体见表4。9 山西医科大学（博）硕士学位论文表4大鼠血糖、血清和睾丸睾各组酮的比较（n=8,xs)组别空腹血糖(mmol/L)血清睾酮（ng/ml)睾丸睾酮（pg/μg蛋白）A组5.11±0.233.75±1.013.31±0.26B组27.38±0.82(1)1.60±0.38(1)0.45±0.12(1)C组9.71±0.23(1)(2)2.48±0.57(1)(2)3.11±0.63(2)D组21.28±0.54(1)(2)1.71±0.32(1)0.58±0.10(1)注：（1）与A组比较P<0.05；(2)与B组比较P<0.052.4各组大鼠睾丸CHOP、GRP-78、Caspase-12、Sirt1mRNA表达的比较与A组比较，B组糖尿病大鼠睾丸CHOP、GRP-78、Caspase-12mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，Sirt1mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。经胰岛素和替米沙坦治疗后，C组、D组大鼠睾丸CHOP、GRP-78、Caspase-12mRNA表达水平均较B组明显降低(P<0.05)，Sirt1mRNA表达水平较B组明显升高（(P<0.05)见表5（如图1）。表5各组大鼠睾丸CHOP、GRP-78、Caspase-12、Sirt1mRNA表达的比较（xs,n=8)组别CHOPGRP-78Caspase-12Sirt1A组1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00B组1.33±0.04(1)1.64±0.16(1)1.55±0.13(1)0.52±0.04(1)C组0.98±0.06(2)1.21±0.08(2)1.24±0.10(2)0.83±0.09(2)D组1.29±0.04(2)1.36±0.12(2)1.33±0.09(2)0.69±0.07(2)注：CHOP：CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白；GRP-78:葡萄糖调节蛋白-78；Caspase-12:半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-12；Sirt1:沉默信息调节因子1。(1)与A组比较P<0.01；(2)与B组比较P<0.05。10 山西医科大学（博）硕士学位论文注：内质网应激相关指标mRNA测定循环曲线注：沉默信息因子1mRNA测定循环曲线图111 山西医科大学（博）硕士学位论文3讨论内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)是指细胞受到各种因素刺激时，内质网内错误折叠与未折叠蛋白质过度堆积超出了内质网处理能力，导致内质网功能障碍的一种状态[17]。当机体出现内质网应激时，内质网会启动未折叠蛋白反应(UPＲ)以保护细胞免受应激损伤。UPR通路主要涉及3种跨膜应激感受蛋白：双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、肌醇需要酶1(IRE-1)和转录激活因子6(ATF6)[18-20]。生理状态下，应激感受蛋白与ERS分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)结合处于无活性状态。当ＥＲＳ发生时，应激感受蛋白与GRP78分离活化，促进下游内质网相关凋亡基因C/EBP同源蛋白(CHOP)和半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)的表达，从而引起细胞凋亡[21-22]。糖尿病持续高血糖、氧化应激、过多钙离子释放和蛋白超负荷损伤了内质网平衡，导致内质网应激增加。严重内质网应激最终通过激活凋亡通路引起糖尿病睾丸细胞凋亡增加，导致睾丸功能紊乱[23-24]。研究发现，1型糖尿病小鼠睾丸GPR78、CHOP和Caspase12表达增加[25]，2型糖尿病大鼠睾丸CHOP、PERK表达增加[26]，从而导致糖尿病睾丸功能减退。本实验研究结果显示，STZ诱导的1型糖尿病大鼠睾丸GRP-78、CHOP和Caspase-12表达水平明显升高，提示高糖使内质网应激水平增加，从而激活下游凋亡信号通路，导致凋亡增加，促进了糖尿病睾丸病变的发生和发展。研究发现，血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂对糖尿病和非糖尿病大鼠睾丸具有保护作用[26-28]。缬沙坦降低2型糖尿病大鼠睾丸内质网应激指标CHOP和PERK的表达，对糖尿病大鼠睾丸产生保护作用[26]。本实验研究结果显示，替米沙坦和胰岛素明显降低糖尿病大鼠睾丸GRP-78、CHOP和Caspase-12表达水平，提示替米沙坦和胰岛素通过降低睾丸内质网应激水平、减少下游凋亡信号通路相关因子的表达，减少凋亡，对糖尿病大鼠睾丸产生保护作用。哺乳动物沉默信息调节因子1(Sirt1)是一种尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的蛋白去乙酰化酶，具有调节糖代谢、细胞生存、线粒体呼吸、精子发生等作用[29]。研究发现，Sirt1基因敲除小鼠出现生精障碍和精子功能异常[29]。Sirt1通过调节下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴对雄性小鼠生育功能产生调控作用。Sirt1基因敲除小鼠HPG轴内分泌信号减弱，睾丸间质细胞和支持细胞成熟障碍，睾酮生成减少，12 山西医科大学（博）硕士学位论文精子发生受损[30]。研究发现，糖尿病小鼠睾丸Sirt1表达降低，凋亡增加[31]。本实验研究结果显示，STZ诱导的1型糖尿病大鼠睾丸Sirt1表达明显降低，替米沙坦和胰岛素能明显升高糖尿病大鼠睾丸Sirt1表达，提示替米沙坦和胰岛素通过调节Sirt1表达对糖尿病大鼠睾丸产生保护作用。研究发现，AMPK对Sirt1表达具有调节作用[32]。我们前期研究结果显示，糖尿病大鼠睾丸AMPK表达降低，替米沙坦和胰岛素能明显升高糖尿病大鼠睾丸AMPK表达，提示替米沙坦和胰岛素可能通过升高AMPK促进Sirt1的表达[33-34]。总之，本实验研究结果显示，1型糖尿病大鼠睾丸组织GRP-78、CHOP和Caspase-12表达增高，Sirt1水平降低。替米沙坦和胰岛素能明显逆转糖尿病大鼠上述各项指标的变化，对糖尿病大鼠睾丸产生保护作用。13 山西医科大学（博）硕士学位论文4结论1、糖尿病大鼠空腹血糖升高，大鼠体重、睾丸重、睾丸指数、精子数量、精子活动率、血清及睾丸组织睾酮明显降低，内质网应激水平升高，Sirt1表达水平降低，导致睾丸组织的损伤。2、胰岛素治疗后空腹血糖下降，大鼠体重、睾丸重、睾丸指数、精子数量、精子活动率、血清及睾丸组织睾酮水平明显升高，内质网应激水平降低，Sirt1表达水平升高，睾丸组织的损伤减轻。3、替米沙坦治疗后空腹血糖下降，精子数量、活动率显著增加，大鼠体重、睾丸重、睾丸指数、血清及睾丸组织睾酮水平未见明显变化，内质网应激水平降低，Sirt1表达水平升高，睾丸组织的损伤减轻。14 山西医科大学（博）硕士学位论文参考文献[1]ForouzanElyasi,ZahraKashi,BentolhodaTasfieh,AdeleBahar,MohammadKhademloo.Sexualdysfunctioninmenwithtype2diabetes[J].PostgradMedJ,2012,88(1037):152-159.[2]EricaL.Schoeller,SamanthaSchon,KelleH.Moley.Theeffectsoftype1diabetesonthehypothalamic,pituitaryandtestesaxis[J].CellTissueRes,2012,349(3):839-847.[3]施颖芸,孙宜.糖尿病对生殖系统的影响[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2014,33(2):144-148.[4]BarateiroA,VazAR,SilvaSL,ETAL,ERStress.MitochondrialDysfunctionandCalpainJNKActivationareInvolvedinOligodendrocytePrecursorCellDeathbyUnconjugatedBilirubin[J].NeuromolecularMed,2012.14(4):285-302.[5]PoonehMokarram,MohammedAlbokashy,MaryamZarghooni,MohammadAminMoosavi,ZahraSepehri,QiMinChen,AndrzejHudecki,AliyehSargazi,JavadAlizadeh,AdelRezaeiMoghadam,MohammadHashemi,HesamMovassagh,ThomasKlonisch,AliAkbarOwji,MarekJŁos,andSaeidGhavami.Autophagypromotesnecrosisinapoptosis-deficientcellsinresponsetoERstress[J].CellDeathDiffer,2008,15(2):422-425.[6]KatherineBowers,DeirdreKTobias,EdwinaYeung,FrankBHu,CuilinZhang.Aprospectivestudyofdietarypatterns,meatintakeandtheriskofgestationaldiabetesmellitus[J].Diabetologia,2006,49(11):2604-2613.[7]YingHao,WangDefen.Theimpactofdietaryfactontheincidenceofgestationaldiabetesmellitus[J].ChineseJournalofObstetricsandGynecology,2006,41(9):729-731.[8]SungHoonBack,RandalJ,Kaufman.Endoplasmicreticulumstressmediatedapoptosisinpancreaticbetarcells[J].Apoptosis,2002,7(4):335-345.[9]SongYF,HogstrandC,WeiCC,WuK,PanYX,LuoZ.Theunfoldedproteinresponse:fromstresspathwaytohomeostaticregulation[J].Science,2011,334(6059):1081-1086.[10]HammadiM,OulidiA,GackièreF,KatsogiannouM,SlomiannyC,RoudbarakiM,DewaillyE,DelcourtP,LepageG,LotteauS,DucreuxS,PrevarskayaN,VanCoppenolleF.ModulationofERstressandapoptosisbyendoplasmreticulumcalciumleakviatransloconduringunfolded15 山西医科大学（博）硕士学位论文proteinresponse:involvementofGRP78[J].FASEBJ,2013,9(7):217-220.[11]MontaneJ,CadavezL,NovialsA.Novials.Stressandtheinflammatoryprocess:amajorcauseofpancreaticcelldeathintype2diabetes[J].DiabetesMetabSyndrObes,2014,7(8)25-34.[12]LaiE,TeodoroT,VolchukA.Endoplasmicreticulumstress:signalingtheunfoldedproteinresponse[J].Physiology(Bethesda),2007,22(8):193-201.[13]BoyceM,YuanJ.Cellularresponsetoendoplasmicreticulumstress:amatteroflifeordeath[J].CellDeathDiffer,2006,13(3):363-373.[14]KintscherU,UngerT.Vascuarprotectionindiabetes:apharmacologicalviewofangiotensinⅡtypelreceptorblockers[J].ActaDiabetol,2005,42(11):26-32.[15]唐家荣,晏小妮,周昌清,尼黎,侯静杰,王道文.替米沙坦对腹主动脉缩窄大鼠内质网应激相关的心肌细胞凋亡的影响[J].中华心血管病杂志，2008，36(3):838-842.[16]陈玉凤,张会娟,沈育芬,刘威,贺洁,李凤丽.替米沙坦对糖尿病大鼠肾脏组织中内质网应激介导相关细胞凋亡的保护作用[J].中华内分泌代谢杂志,2011,10(27):849-852.[17]PulinilkunnilT,KienesbergerPC,NagendranJ,WallerTJ,YoungME,KershawEE,KorbuttG,HaemmerleG,ZechnerR,DyckJR..Myocardialadiposetriglyceridelipaseoverexpressionprotectsdiabeticmicefromthedevelopmentoflipotoxiccardiomyopathy[J]．Diabetes,2013,62:(9)1464-1477．[18]CoxDJ,StrudwickN,AliAA,PatonAW,PatonJC,SchröderM.Measuringsignalingbytheunfoldedproteinresponse[J].MethodsEnzymol,2011,491(2):261-292.[19]OkadaT,YoshidaH,AkazawaR,NegishiM,MoriK.Distinctrolesofactivating(ATF6)anddouble-strandedRNA-activatedproteinkinase-likeendoplasmicreticulumkinase(PERK)intranscriptionduringthemammalianunfoldedproteinresponse[J].BiochemJ,2002,366(2):585-594.[20]RichardsonCE,KinkelS,KimDH.PhysiologicalIRE-1-XBP-1andPEK-1signalinginCaenorhabditiseleganslarvaldevelopmentandimmunity[J].PLoSGenet,2011,7(11):e1002391.[21]徐春艳,赵林双.血管紧张素Ⅱ1型受体与内质网应激在糖尿病肾病中的研究进展[J].中国糖尿病杂志,2014,8(9):759-761.[22]邵德翠,薛红,陆利民.内质网应激在糖尿病致肾脏损害中的作用及机制[J].生理科学进16 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山西医科大学（博）硕士学位论文AMPK/SIRT1[J].Nature,2010,464(7293):1313-1319.[33]王蕾,郭志新,吴杰萍,闫旭红,景晓瑞,刘佳.替米沙坦对1型糖尿病大鼠睾丸脂联素及其受体表达的影响[J].中华医学杂志,2015,22(13):1773-1778.[34]闫旭红,郭志新,吴杰萍,王蕾,景晓瑞,刘佳.胰岛素对糖尿病大鼠睾丸脂联素及其受体表达的影响[J].中华糖尿病杂志,2015,7(8):507-512.18 山西医科大学（博）硕士学位论文综述内质网应激和沉默信息调节因子1与糖尿病生殖系统研究进展糖尿病是胰岛素缺乏或胰岛素抵抗引起的血糖控制不佳，血糖水平的变化可以引起多系统损害，临床常见的有糖尿病微血管、大血管疾病以及糖尿病周围神经病变，此外还有研究表明糖尿病患者出现精子及睾丸功能缺陷的比率增加[1]。糖尿病目前受到人类的广泛关注，而其所致的各种并发症亦是众多学者研究的重点，现今糖尿病生殖系统功能受损也成为研究热点。目前研究发现的细胞凋亡机制主要有三种[2]，典型细胞内凋亡途径有死亡受体活化(外源性途径)和线粒体损伤途径(内源性途径)，而内质网应激凋亡途径是近几年的最新发现[3]。内质网应激是内质网应对应激状态时的一种适应性保护机制，通过不同的激活途径对靶器官起到保护作用。而沉默信息调节因子1具有NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶活性。SIRT1可以协调体内氧化物代谢的平衡。本文重点讨论体内这些保护性因子对糖尿病并发症尤其是生殖系统病变的发生所起到的积极作用，并深入探讨其发生机制，为指导临床研究提供理论基础。1.糖尿病生殖系统损伤概述1.1糖尿病睾丸功能病变。随着经济的发展、生活水平的提高，糖尿病患病率逐年上升，且呈年轻化趋势，糖尿病生殖系统功能障碍累及男性患者可导致性欲减退、勃起功能障碍、射精障碍、生育力下降或不育等症状[4]，亦可致精液质量下降。以往研究表明,糖尿病机体生精能力减弱,性功能与生殖能力发生障碍，睾丸间质细胞产生睾酮的能力及支持细胞睾丸分泌雄激素受体结合蛋白的能力均下降[5]。有研究发现，糖尿病影响了精子的发生，这主要包括生精细胞增殖减缓或障碍，生精细胞数量减少，小管内生精细胞脱落，生精上皮变薄及上皮周期改变，最终造成DM男性患者精子浓度及精子总数的下降[6]。亦有糖尿病雄性大鼠实验发现，光镜下可见曲细精管发生萎缩变形，管壁上生精细胞数量减少，管腔内无成熟精子，曲细精管上的生精细胞部分或全部脱落于基膜，而其余各级生精细胞及精子消失[7]。1.2糖尿病生殖系统损伤发生机制。19 山西医科大学（博）硕士学位论文1.21下丘脑—腺垂体—睾丸轴病变机制。人体中睾酮95%来自睾丸间质细胞的合成和分泌，糖尿病会影响睾丸间质细胞的功能，主要是通过损伤下丘脑—腺垂体—睾丸轴对睾丸的间质细胞合成及分泌来发挥作用[8]，从而影响了精液的质量，导致精子数量的减少、精子活动率降低，此外长期高血糖状态还可以使睾丸间质细胞膜上黄体生成素受体(LHR)数量减少，促卵泡激素(FSH)水平下降[9]。经过实验研究证实，内源性睾酮能直接或间接促进生精细胞的发育，抑制其凋亡；LH、FSH也可起到相应的保护作用[10-11]。1.2.2糖尿病氧化应激损伤机制。人体内存在三种ROS重要的酶类清除剂，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，在体内对睾丸生精功能起着重要的保护作用。在雄性生殖系统中，氧化和抗氧化保持平衡状态，精子细胞对外界环境中氧化应激水平反应灵敏[12]。当葡萄糖过度氧化时，产生的ROS增多，但酶类清除剂有限，将破坏体内平衡状态[13]，导致生殖系统损伤，精液质量下降。1.2.3糖尿病睾丸病变与炎症因子。有报道显示，糖尿病患者免疫细胞所分泌得炎性细胞，包括白细胞介素（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）等[14]，可通过一系列反应激活细胞内信号转到途径，导致细胞凋亡增加[15]。1.2.4生精细胞异常凋亡。糖尿病生殖系统功能障碍的发生与多种因素有关，一方面体内胰岛素水平的变化会影响细胞应激水平，及其本身的作用，均可对生殖细胞代谢及功能产生影响，另一方面，糖尿病患者内分泌代谢紊乱，下丘脑-垂体-内分泌轴系会发生相应的变化，以在一定水平维持内环境的稳态，此外还有氧化应激水平的变化对机体产生的影响，亦可波及生殖系统[16]，精液质量作为生殖系统功能状态的测定指标，有研究显示糖尿病患者精液质量下降[17]，更进一步的研究发现，JUK和Bax作为睾丸生精细胞凋亡的标志蛋白，在糖尿病大鼠中出现显著升高[18]，在一系列国内外研究中我们可以发现，体内高血糖状态所导致的生殖系统功能的变化，直接反应在精液质量的下降，而实质上反应出生精细胞的减少。2.内质网应激与2型糖尿病2.1内质网应激启动20 山西医科大学（博）硕士学位论文内质网是人体一种重要细胞器，分为粗面内质网和滑面内质网，正常生理情况下，代谢处于平衡状态，细胞可维持稳态，但细胞受到内外环境的刺激时，内环境稳态可被打破，激活内质网应激水平，从而引发内质网应激（ESR）。内质网应激作为机体的一种保护性机制，可通过适度的反应维持机体的稳态。在适度的刺激作用下，内质网通过启动未折叠蛋白反应来对抗外来因素的干扰，即可诱导启动生存信号途径；若受到过度的刺激时，机体将启动细胞凋亡途径，清除体内受损的细胞，即可诱导启动凋亡信号途径，两种途径相互配合、协调发挥保护作用，从而维持内环境的稳态。2.1.1内质网介导的生存信号途径内质网生存信号主要通过PERK／PEK、ATF6和IRE-1三条途径调节。正常状态下，三种跨膜蛋白分子与分子伴侣GRP-78结合，GRP-78是内质网应激关键分子，当应激发生时，GRP-78与跨膜蛋白分子结合减少，从而使后续应激途径被激活，启动未折叠蛋白反应。2.1.1.1PERK-elF2a介导的生存信号途径PERK是一种丝／苏蛋白激酶，在内质网膜中属于I型跨膜蛋白，通过在应激状态时激活方式为自身二聚化和磷酸化，作为真核生物蛋白翻译的起始因子elF2a，此时其51位丝氨酸将被磷酸化，磷酸化状态下会干扰核糖体的聚合反应、蛋白质的聚合反应，解除了应激时，新合成蛋白对内质网的需求，减缓内质网的压力，对维持内环境稳态起到积极的保护作用[19]。有研究显示，当敲除PERK基因时，elF2a磷酸化水平明显降低[20]。2.1.1.2IRE-1介导的生存信号途径IRE-1也是属于I型跨膜蛋白，是一种具有在丝／苏氨酸蛋白激酶位点核酸内切酶活性的蛋白。应激发生时，IRE-1与GRP-78解聚后，自身可以发生寡聚化和磷酸化，成为有活性的内切酶[21]，激活后的IRE-1选择性的剪切XBP-1(X—boxbindingprotein1)的前体mRNA，经过切除修饰后，即可产生有活性的XBP-1蛋白，从而发挥其对GRP-78等的转录激活作用[22]，亦可诱导转录网相关降解途径基因[23]，在经过这一系列转录激活后，增强了内质网的蛋白折叠能力以及错误蛋白的降解能力。2.1.1.3ATF6介导的生存信号途径21 山西医科大学（博）硕士学位论文ATF6属于内质网膜II型跨膜蛋白，应激时，其以囊泡形式可以从内质网细胞膜转入高尔基体，会被高尔基体中SP1和SP2蛋白酶水解激活[24]，进而进一步激活分子伴侣的转录，导致一系列内质网应激反应。2.1.2内质网介导细胞凋亡途径ESR时，在持续或过强的刺激状态下，细胞自我修复能力有限，导致过多的激活不能通过未折叠蛋白反应来维持内稳态，故三条生存信号途径将会进一步激活，致使下游的凋亡信号分子转录表达，这些途径主要有CHOP/GADD153表达；JNK的激活；caspase-12蛋白水解酶的活化[25]，可以达到清除体内受损细胞的作用。其中CHOP是主要途径，caspase-12通路仅在ESR时被激活[26]，未在其他凋亡途径中发现。2.1.2.1CHOP/GADD153介导的细胞凋亡途径CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingproteinhomologousproteinCHOP)属于转录因子，广泛存在与哺乳动物体内，参与多种生命活动，ESR时细胞程序性死亡即为其中之一。CHOP广泛表达与其介导途径多样有关，UPR的三种跨膜蛋白都参与其转录[27]，以PERK介导的表达最为重要。未触及异常信号时，存在于胞浆中，仅有少量存在，当其发现异常信号后，大量表达并从胞质中转移到胞核上[28]，激活其上游凋亡相关蛋白，包括GADD-34，DR-5，Ero-1α(ER应激氧化酶1)，这些蛋白启动不同凋亡途径[29]。GADD34通过eIF2α去磷酸化，使Bip的生成增多，可形成抗凋亡体系，GRP-78、Caspase-7、Caspase-12形成复合物，阻止Caspase-12脱落，抑制其激活，对细胞起到保护作用，这些因子间相互协调，维持内环境稳定。而Ero-1α引起细胞凋亡主要是把内质网的钙转移到线粒体，二者相互配合来发挥作用。Dr-5属于细胞表面的死亡受体，可以激活下游caspase级联反应。Chop通过抑制Bcl-2的表达，导致细胞内谷胱甘肽的过度消耗，以至于影响体内正常的氧化还有反应，最终引起细胞凋亡的发生[30]。2.1.2.2Caspase-12介导的细胞凋亡途径Caspase-12是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease,caspase)中一员，特异性存在于内质网外膜上。在生理状态下，以前体形式存在，并无活性，但在内质网稳态破坏后，就会被激活，启动其保护性的机制，导致细胞死亡。这个大致过程主要为在出现ESR时，一方面可能由于Ca2+平22 山西医科大学（博）硕士学位论文衡被打破，激活的钙蛋白激酶可以直接剪切并激活Caspase-12，另一方面，Caspase-7从胞质转移至内质网表面剪切Caspase-12前体，Caspase-12活化后，可激活下游的Caspase-9，活化的Caspase-9在继续激活下游的Caspase-3，从而促进凋亡的发生[31-32]。2.2内质网应激与糖尿病随着新型细胞凋亡途径的发现，越来越多研究证实内质网应激与众多疾病的发生发展密切相关，糖尿病作为现代人类关注的热点问题，更是需要开辟新的治疗理论支持，以进一步指导临床治疗。有研究显示，I型糖尿病患者中检测发现ORPl50自身抗体显著增高，这种抗内质网分子伴侣的存在提示内质网应激状态与体内高血糖状态密切相关[33]。2.3内质网应激与糖尿病生殖系统功能改变糖尿病患者体内存在多种应激因素，诸如糖脂代谢紊乱、氧化应激、肾素—血管紧张素系统激活等，这些因素均可能诱发机体内质网应激的发生，内质网应激状态下，会促进糖尿病急慢性并发症的发生发展[34-36]，糖尿病生殖系统功能障碍即为其中之一。高血糖状态作为机体的一个刺激因素，可以出发内质网未折叠蛋白反应，严重时会启动内质网相关细胞凋亡途径，致使细胞降解。UPR相关分子伴侣葡萄糖调节蛋白（GRP-78）以及凋亡途径中相关因子CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingproteinhomologousproteinCHOP)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease,caspase-12)在内质网应激发生发展过程中会出现相应的变化。有研究表明，糖尿病大鼠组织中chop、grp-78、caspase-12表达增加[37]，表明糖尿病大鼠内质网应激水平增加。而其对睾丸组织的影响还需要进一步证实。但是已有研究证实糖尿病大鼠生殖系统的病变，即雄性SD大鼠生精能力下降，精子数量、精子活力均明显降低，并研究证实生精细胞凋亡的现象存在[38]。本实验旨在证实大鼠睾丸组织所发生病变是否通过激活内质网相关途径发生，这将是糖尿病大鼠生殖系统并发症的一个新的研究方向。在治疗方面，糖尿病患者控制血糖水平对于减少并发症的发生至关重要，控制血糖水平对于减轻体内应激状态，维持内环境稳定至关重要，从而可以减少体内氧化应激水平、减少内质网应激水平。目前对内质网应激在糖尿病发展中的认识逐渐23 山西医科大学（博）硕士学位论文深入，故关于糖尿病治疗将可能提出一个新的方向，即如何通过减轻内质网应激水平来发挥对糖尿病患者并发症的防治，这亦将成为糖尿病治疗药物研制的一个新靶点。3．沉默信息调节因子1与糖尿病沉默信息调节因子2(silentinformationregulator2，Sirt2)首先是在酵母菌研究中发现的，后逐步探索出7个同源基因即SIRT1-7，统称为Sirtuins家族。SIRTl具有NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶活性。研究表明，SIRT1可以水解多种因子的乙酰基，从而参与调控多条代谢通路，血糖水平的调控亦是其作用之一[39]。SIRT1作为一种机体保护性因子，在适度的应激状态下，可以保护机体免受损伤，但是其调控阈值及其作用机制尚有待进一步研究，而其与血糖水平变化情况相关性是本实验研究的重点。24 山西医科大学（博）硕士学位论文参考文献[1]SliwowskaJH,FerganiC,GawalekM,SkowronskaB,FichnaP,LehmanMN.Insulin:itsroleinthecentralcontrolofreproduction[J].PhysiolBehav,2014,133(7):197-206.[2]BarateiroA,VazAR,SilvaSL,FernandesA,BritesD.ERStress,MitochondrialDysfunctionandCalpainJNKActivationareInvolvedinOligodendrocytePrecursorCellDeathbyUnconjugatedBilirubin[J].NeuromolecularMed,2012.14(6):285-302.[3]UllmanE,FanY,StawowczykM,ChenHM,YueZ,ZongWX.Autophagypromotesnecrosisinapoptosis-deficientcellsinresponsetoERstress[J].CellDeathDiffer2008,15(2):422-425.[4]SextonWJ,JarowJP.Effectofdiabetesmellitusuponmalereproductivefunction[J].Urology，1997,49(4):508-513.[5]王忠山,赵慧,邹东辉,许宗革,辛暨丽.短期糖尿病雄鼠睾丸自由基和抗氧化水平的研究[J].中国男科学杂志,2003,17(2):79-81.[6]丁涛,李俊明,胡毅娜.糖尿病对精子形态和精液质量的影响及相关机制研究[J].江西医药2016,51(6)：520-523.[7]陈锡文,吴晓烨,方周溪.实验性2型糖尿病大鼠睾丸Leydig细胞形态和睾酮合成功能的改变[J].温州医学院学报,2008,38(4):317-320.[8]SudhaS,ValliG,JuliePM,ArunakaranJ,GovindarajuluP,BalasubramanianK.Influenceofstreptozotocininduceddiabetesandinsulintreatmentonthepituitary-testic-ularaxisduringsexualmaturationinrats[J].ExpClinEndo-crinolDiabetes,2000,108(1):14-20.[9]BallesterJ,MunozMC,DominguezJ,RigauT,GuinovartJJ,Rodríguez-GilJE.Insulin-dependentdiabetesaffectstesticularfunctionbyFSH-andLH-linkedmechanisms[J].Andrology,2004,25(5):706-719.[10]赵红光,龚守良.糖尿病雄性生殖损伤及其发生机制[J]。中华男科学杂志,2004,10(10):767-770.[11]赵茜,张如意,余建强.胰岛素治疗对糖尿病大鼠睾丸功能障碍[J].江苏医药,2010,36(21):2540-2542.[12]吴青,冯云,朱晓斌.糖尿病对精液质量的影响及其机制[J].中国优生与遗传杂志,2009,17(12)：1-3.25 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山西医科大学（博）硕士学位论文致谢时光飞逝，三年染指一挥间已匆匆流逝，马上要经历蜕变的我，对三年的人生洗礼之旅充满感激。当然，首先要感谢我的导师郭志新教授给了我继续深造的机会，从成为恩师弟子的第一天起，恩师的职业姿态冲击我崇尚自由的内心，在潜移默化中改变着我的行为、认知，在恩师的耐心教导下，逐步养成了严谨认真的工作态度，在具备这些基本素质的基础上，恩师丰厚的知识储备令我钦佩，崇拜之余默默汲取精华，三年之间，所知所学都与恩师的悉心教导密切相关，在此特别谢谢我的导师。此外，在内分泌科学习的半年时间里，感受到浓浓的学习氛围，收获颇丰，感谢李主任及内分泌科全体老师在工作和教学中的辛苦付出，感谢师姐吴杰萍、闫旭红、王蕾、景晓瑞、刘佳，同门袁瑞霞在实验过程中给予我的帮助和支持，谢谢大家！29 山西医科大学（博）硕士学位论文个人简历一、基本情况黄艳，女，1989年生，汉族，山西省汾阳人。专业：内科学学，主要研究方向：糖尿病及其慢性并发症。二、学习工作经历2009年9月-2014年7月，山西医科大学，第二临床医学院，临床医学专业，学士。2014年9月-2017年7月，山西医科大学，第二临床医学院，内科学专业，硕士。三、研究成果（一）科研项目项目名称(编号:2013011047-1)：山西省自然科学基金资助项目，项目来源：山西省留学回国人员科技活动择优资助项目（2012年度）,2012年到2016年,研究经费（5万），已结题，主持（参与）：郭志新，吴杰萍，王蕾，闫旭红，刘佳，景晓瑞，黄艳。（二）发表文章1、第一作者文章[1]黄艳，郭志新，李艳娇，李兴.甲状旁腺功能亢进症高钙危象心源性死亡1例[J].山西医科大学学报,2016,2，47(2):192-193.(省级)。[2]黄艳，郭志新，闫旭红，王蕾，景晓锐，刘佳.替米沙坦和胰岛素对糖尿病大鼠睾丸内质网应激和沉默信息调节因子1表达的影响[J].解放军医学杂志，2016,10,10（41）：803-807.（国家级，核心期刊）。30 山西医科大学（博）硕士学位论文2、其他作者文章[1]袁瑞霞，郭志新，景晓瑞，刘佳，黄艳.艾塞那肽对高糖培养心肌细胞的保护作用及机制[J].中华糖尿病杂志,2016,10，9(10):623-628.(中华)。（三）获得奖励[1]黄艳，荣获山西医科大学学业奖学金,学业奖学金,二等奖,山西医科大学第二临床医学院授予,于2015.6获得。[2]黄艳，荣获山西医科大学学业奖学金,学业奖学金,二等奖,山西医科大学第二临床医学院授予,于2016.6获得。[3]黄艳，荣获山西医科大学学业奖学金,学业奖学金,三等奖,山西医科大学第二临床医学院授予,于2017.6获得。31
