唾液皮质醇正常参考值的建立及2型糖尿病和进食火锅对皮质醇水平变化的影响研究

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勺化￥《雖＞硕±学位论文唾液皮质醇正常参考值的建立及２型糖尿病和进食火锅对皮质醇水平变化的影响硏究＊Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｎｏｒｍａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｉｉ＂ｅｒｖａｌｏｆｓａｌｉｖａｒｙｃｏｉｔｉｓｏｌａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｔｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓａｎｄｔｈｅｄｉｅｔｏｆｔｈｅｈｏｔｏｔｏｎｙｐｐｔｈｅｃｈａｎｅｓｏｆｃｏｒｔｉｓｏｌｌｅｖｅｌｓｇ作者；张晓过导师：严宗趣副教授二〇—六年五月 川北医学院硕±研究生学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研。究成果除了文中特别加Ｗ标注引用的内容外，本论文不包含巧何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对木文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中Ｗ明确方式标明，。除与外单位合作项目将予Ｗ明确方式规定外木研究己发表与未发表成果的知识产权均归属川北医学院。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。－作者签名：全抑日期：心八年Ｊ月ｊｏ日川北医学院硕±研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。木人可授权川北医学院可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，（＾采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在Ｗ下相应方框内打＂Ｖ＂）：１．保密□，在＿年解密后适用本授权书。２．不保密口。作者签名：沫裝曰期：如／６年＞月如曰导师签名：、少日期：ｒ月日喜卢 中图分类号R563学校代码10634UDC616密级授予单位川北医学院唾液皮质醇正常参考值的建立及2型糖尿病和进食火锅对皮质醇水平变化的影响研究Theestablishmentofnormalreferenceintervalofsalivarycortisolandtheinfluenceoftype2diabetesandthedietofthehotpotonthechangesofcortisollevels作者张晓红导师严宗逊副教授培养院系临床医学系授位类别学术学位授位级别硕士学科门类医学学科专业内科学内分泌方向研究方向糖尿病及其并发症年级2013级学号201303025二○一六年五月 致谢三年的研究生学习生活转瞬即逝，在这三年时间里，大家给予了我很多帮助，在此向大家表示衷心的感谢。首先我想感谢我的导师严宗逊副教授，感谢您在课题设计、实验开展及论文写作方面给予我的悉心指导、支持和鼓励，您严谨的科研作风、广博而扎实的医学理论知识、丰富的临床经验、高尚的医德及一丝不苟的工作态度是我终生受益。也由衷感谢您对我三年研究生期间生活上的帮助、关心及理解。感谢川北医学院内分泌科全体老师在我临床实习和实验过程中给予我的无私指导及帮助。感谢川北医学院附属医院检验科的全体老师和风湿免疫研究所的全体老师在本课题实验的过程中给予的支持与帮助。感谢师姐章娜、同窗陈曦、以及师妹刘冰莲对我的帮助和支持！感谢所有帮助过我的同学和朋友们！感谢我的家人三年来对我无私的支持、关心和理解，他们是我坚实的后盾。 唾液皮质醇正常参考值的建立及2型糖尿病和进食火锅对皮质醇水平变化的影响研究摘要目的：应用我院实验室现用测定血浆皮质醇的方法，探索唾液皮质醇（Salivarycortisol,SC）与血浆皮质醇（Plasmacortisol,PC）的相关性，并完成我院实验室对唾液皮质醇正常参考区间的初步确定；研究SC及PC在2型糖尿病患者中水平的变化及其影响因素；探讨火锅这种饮食方式对SC、PC的分泌及检测的影响。方法：招募60例我院体检中心体检健康的志愿者作为正常组（NC组），以65例我院内分泌科住院的2型糖尿病患者作为2型糖尿组（T2DM组），并在60例体检健康的志愿者中再招募自愿食用火锅的31人作为火锅组（NC火组），前两组各自收集全天08:00、16:00、00:00的唾液及血液标本，食用火锅组则再收集食用火锅后的00:00的唾液标本、08:00的血液及唾液标本。利用电化学发光法分别检测正常对照组及2型糖尿病患者组、食用火锅组的各个时间点的唾液皮质醇（SC）浓度及血浆皮质醇（PC）浓度。同时检测正常对照组及2型糖尿病组空腹状态下的FBG浓度值、糖化血红蛋白（HbA1C）、总胆固醇TC、甘油三脂TG、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C、同型半胱氨酸（Hcy）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）。分析各组的SC浓度与PC浓度相关性，初步探讨唾液皮质醇（SC）浓度变化的正常值参考区间，分析2型糖尿病患者唾液及血浆皮质醇水平变化及与上述所查各项临床指标之间的相关性，同时分析健康志愿者食用火锅前后的SC及PC波动情况，探讨火锅这种饮食方式是否会对人体皮质醇的分泌及唾液皮质醇检测形 成影响。结果：1.正常组及2型糖尿病组SC、PC在08:00、16:00、00:00的结果分别为，正常组SC：（0.1807±0.07013）ug/dL，（0.0600±0.00475）ug/dL，（0.0310±0.00236）ug/dL，正常组PC：（13.4452±0.45730）ug/dL，（6.2803±0.31455）ug/dL，（2.1273±0.18304）ug/dL；2型糖尿病组SC：（0.4766±0.02286）ug/dL，（0.1551±0.01115）ug/dL，（0.1472±0.01157）ug/dL，2型糖尿病组PC：（16.5577±0.46403）ug/dL，（9.3586±0.50970）ug/dL，（5.1422±0.51391）ug/dL。2.正常组及2型糖尿病组各自组内的3个标本采集时间点的SC与PC均有较好的相关性，且呈显著线性相关，其中NC组的SC（08:00、16:00、00:00）与PC（08:00、16:00、00:00）的相关系数分别为（r=0.554,r=0.481,r=0.671，P<0.01）。T2DM组的SC（08:00、16:00、00:00）与PC（08:00、16:00、00:00）的相关系数分别为（r=0.635,r=0.621,r=0.671，P<0.01）。3.电化学发光法测得的我院健康成年人于每日08:00、16:00、00:00的唾液皮质醇95%参考区间分别为：0.0432-0.3182ug/dL、0.0507-0.0693ug/dL、0.0264-0.0356ug/dL。4.2型糖尿病组SC与PC水平均显著高于正常组。将与皮质醇可能相关的因素和SC及PC水平进行线性回归分析，结果显示糖化血红蛋白（HbA1C）、甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、空腹血糖（FBG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度变化均对皮质醇浓度有显著影响。5.2型糖尿病组部分患者存在皮质醇分泌昼夜节律的紊乱现象。 6.火锅组在食用火锅后SC及PC水平均值高于食用前水平，在第二天清晨08:00测得的PC值与食用前一天08:00时测得的PC值相比有显著提高。另外，食用火锅前后08:00及00:00的SC值差异无统计学意义。结论：1.本实验室利用电化学发光法测得SC与PC水平在08:00、16:00、00:00的时间点均呈显著线性相关关系，也反应出皮质醇分泌的节律变化规律，可初步建立本验室的唾液皮质醇浓度正常值参考区间。每日08:00、16:00、00:00的唾液皮质醇95%正常参考区间分别为：0.0432-0.3182ug/dL、0.0507-0.0693ug/dL、0.0264-0.0356ug/dL。2.2型糖尿病组皮质醇水平高于正常对照组，且部分2型糖尿病患者存在皮质醇分泌昼夜节律的紊乱。推测2型糖尿病的发生可能与高皮质醇水平有关，也有可能是由于2型糖尿病患者的长期高血糖状态损伤了下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的正常功能，而引起皮质醇分泌节律紊乱，皮质醇与糖，脂代谢有一定的相关性。3.食用火锅后次日08:00的唾液及血浆皮质醇水平均值均高于食用火锅前的皮质醇水平，且血浆皮质醇在食用火锅后与食用火锅前比较差异具有统计学意义，推测食用火锅可能会影响次日皮质醇的分泌。建议不要在行皮质醇检测之前食用火锅。关键词：唾液皮质醇；血浆皮质醇；2型糖尿病；HPA轴；火锅 Theestablishmentofnormalreferenceintervalofsalivarycortisolandtheinfluenceoftype2diabetesandthedietofthehotpotonthechangesofcortisollevelsAbstractObjective:Tosetupthereferenceintervalofsalivarycortisolatdifferentcollectingtimeof8:00,16:00,0:00ofnortheastSichuanarea.Studyonthechangeofsalivarycortisol、plasmacortisolinpatientswithtype2diabetesmellitusandfactorsaffectingthecortisol.EvaluatethecorrelationbetweenSCandPCanddiscussSCinsteadofPCtobealineoftheclinicalvalueofscreeningindicators.ToexplorewhetherhotpothadeffectonthesecretionofSCandPC.Methods:60healthyvolunteerswererecruitedasnormalsubjects,65endocrinologypatientswithtype2diabetesmellitus（diagnosisaccordwiththeWHOdiagnosticcriteriain1999）inourhospitalwererecruitedasdiseasecontrolgroup,31peoplewererecruitedvoluntarilyfromnormalsubjectstoeathotpat.Salivaandbloodsampleswerecollectedat08:00,16:00,00:00.Salivarycortisolofeatinghotpotgroupwerecollectedat00:00,08:00andbloodofeatinghotpotgroupwerecollectedat08:00.SalivarycortisolandplasmacortisolweredetectedbyElectrochemiluminescenceimmunoassay.Wemeasuredfastingbloodglucose(FBG),plasmalipid（includingTC,TG,LDL-C,HDL-C）,HbA1C,Hcy,hs-CRPoftype2diabetesandnormalgrouponemptystomach.Toanalyzingthechangeofthecortisollevelsinpatientswithtype2diabetesandthecorrelationbetweentheclinicalindicators.Toexplorethecortisolwhetherthereisachangeaftereatingthehotpat. Results:1.Theresultsofsalivarycortisolinnormalgroupat08:00,16:00,00:00were（0.1807±0.07013）ug/dL，（0.0600±0.00475）ug/dL，（0.0310±0.00236）ug/dL,Theresultsofplasmacortisolinnormalgroupat08:00,16:00,00:00were（13.4452±0.45730）ug/dL（6.2803±0.31455）ug/dL，（2.1273±0.18304）ug/dL;Theresultsofsalivarycortisolintype2diabetesat08:00,16:00,00:00were（0.4766±0.02286）ug/dL，（0.1551±0.01115）ug/dL，（0.1472±0.01157）ug/dL,Theresultsofplasmacortisolintype2diabetesat08:00,16:00,00:00were（16.5577±0.46403）ug/dL，（9.3586±0.50970）ug/dL，（5.1422±0.51391）ug/dL.2.Innormalgroupandtype2diabetesgroup,salivarycortisolandplasmacortisolatthesametimewereatgoodcorrelation,andhassignificantlinearcorrelationwithrvalueswere（r=0.554,r=0.481,r=0.671，P<0.01thenormalgroup）（,r=0.635,r=0.621,r=0.671，P<0.01thetype2diabetesgroup).3.ElectrochemicalimmuneluminescencemethodinnortheastSichuansalivacortisol95%referencerangefornormaladultsat08:00,16:00,00:00were0.0432-0.3182ug/dL、0.0507-0.0693ug/dL、0.0264-0.0356ug/dL。4.Salivarycortisolandplasmacortisoloftype2diabetesgroupwerehigherthanthenormalcontrolgroup.ThehigherplasmacortisolandsalivarycortisolconcentrationswerepositivelyassociatedwithHbA1C、TG、TC、LDL-C、FBG.AndFBGisthestrongestfactorassociatedwithplasmacortisolandsalivarycortisol.5.ThepatientsofT2DMdisplayabnormalcircadianrhythmsofcortisolsecretion.6.ThePCandSClevelsaftereatinghotpotwerehigherthanbefore eatingit.Aftereatinghotpot,thePCvaluesof08:00ontheseconddayweresignificantlyincreasedcomparedwiththePCvaluesof08:00ofthedaybefore.Inaddition,therewasnosignificantdifferenceinSCvaluebetween08:00and00:00beforeandaftereatinghotpot.Conclusions:1.Salivarycortisolandplasmacortisolatthesamecollectingtimewereinsignificantcorrelation.Itcanconsidertosetupourlaboratorysalivacortisolnormalreferencerange.Usingthemethodofdeterminationofsalivarycortisolconcentrationinsteadofplasmacortisolasalineofscreeningrelateddiseasesdiagnosisindex.2.Thecortisollevelintype2diabeticgroupwashigherthanthatinnormalcontrolgroup,andtherewasadisturbanceinthecircadianrhythmofcortisolsecretioninsomepatientswithtype2diabetes.Speculatedthattype2diabetesoccurrencemaybeassociatedwithhighlevelsofcortisol,theremaybeduetotype2diabetespatientswithlong-termhighbloodglucosedamagethehypothalamicpituitaryadrenalaxis(HPA)axisofnormalfunction,causedbycortisolsecretingrhythmdisturbance,cortisolandglucose,lipidmetabolismhavecertaincorrelation.3.Hotpotmayaffectthesecretionofcortisol,suggestingnottoeatitbeforethedeterminationofcortisol.Keywords:Salivarycortisol;plasmacortisol;type2diabetes;hypothalamus-pituitary-adrenalaxis(HPAA);Hotpot 目录前言........................................................1对象与方法..................................................5结果.......................................................10讨论.......................................................19结论.......................................................26附图.......................................................27参考文献...................................................34综述：唾液皮质醇的检测及临床意义...........................38参考文献...................................................46附录.......................................................49个人简历...................................................50原创性声明及版权使用授权说明...............................51 前言皮质醇（cortisol）也可叫做“氢化可的松”，是由肾上腺皮质束状带分泌的对人体糖代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素，即属于糖皮质激素的一种，也是机体一种基本的“应激激素”。应激状态下身体需要皮质醇来维持正常的生理活动，如果缺乏皮质醇，机体则无法对刺激做出有效反应，即使面临危险时，也不能启动积极的应激保护反应如：逃跑或搏斗等。另外，皮质醇在维持情绪和健康、免疫反应和炎症、血压和血管间关系，以及维持结缔组织（例如骨骼、肌肉、皮肤）正常功能等方面也具有重要作用。正常情况下，机体有一套完备的皮质醇调节机制，能很好地控制皮质醇的分泌和调控血中皮质醇的浓度。正常的皮质醇代谢有昼夜节律规律，24小时为一个周期，一般在清晨6-8时达峰，在上午8-12时会陡然下降，之后全天维持在一个缓慢的下降趋势中，在凌晨0-2时降至谷底，之后开始由谷底再次回升。但皮质醇分泌并不总是遵从上述规律，当打破规律则会使皮质醇的昼夜节律出现紊乱，在本该下降的时候升高。这时皮质醇昼夜节律紊乱的负面影响开始表现为新陈代谢的异常，诸如：体重上升、血糖升高、食欲增加、过度疲劳感以及性欲减退等。所以皮质醇是人体非常重要的糖皮质激素之一。目前国内评价皮质醇水平主要是通过检测血浆中的总皮质醇浓度。但血浆中只有1%-3%的皮质醇具有生物活性，因为只有未与皮质类固醇结合球蛋白（CBG）或白蛋白结合[1]的皮质醇才起生物作用，所以总皮质醇浓度无法准确代表体内生物活性皮质醇的水平。但是直接测定血清中游离皮质醇的技术并不成熟，其操[2]作复杂、样本耗量大、影响因素多，且误差大。另外，血浆中游离皮质1 醇可通过肾脏从尿液中排出，故测定尿皮质醇浓度即可排除CBG变化的影响，间接反映血浆游离皮质醇的水平，但该方法需要收集24小时尿液，[3][4]只能反映全天平均值，无法测得即时数据。Vining等根据唾液中几种激素在不同的唾液分泌情况下其浓度与血清中该激素浓度的相关性研究结果，提出了激素由血液进入唾液的转运机制，其中以游离形式存在的未结合的皮质醇因具有脂溶性，从而易穿过亲脂细胞膜扩散进入腺泡细胞，随即穿过细胞的另一侧进入唾液。其在血液与唾液之间迅速平衡，且稳定不易受影响因素例如：血清中皮质类固醇结合球蛋白的影响，也[5,6]与性别、年龄、体重指数、吸烟状况及患病时间等无关。因为唾液皮质醇不受血清CBG变化的影响，已有文献报道认为唾液皮质醇能准确反[7,8]应血清中具有生物活性的游离皮质醇水平。因此，近年来国内外许多[1,3]学者已采用唾液作为测定皮质醇浓度的体液标本。利用唾液检测皮质醇浓度不仅比利用血清检测经济耗费少，而且稳定性较高，标本易获取，还可提供血清检测所不易获得的信息。唾液皮质醇检测的主要优点如下：(1)唾液皮质醇不受血清CBG波动的影响，反映的是游离皮质醇水平，且[9,10]其浓度不受唾液流速的影响。(2)标本收集采用无创性操作，无刺激性，[9,11]全天可多次取样，患者易于接受。(3)取样操作简便，无需特殊培训可[9]直接自行采样。(4)检测方法多采用血浆皮质醇方法直接或改良后测定，[10]其中放射免疫法，其准确度和精确度高。总之，使用唾液皮质醇检测来监测肾上腺功能及节律变化相对血清皮质醇更为简便，不仅适用于住[11]院病人，对门诊患者及老年、儿童等同样适用。已经成为库欣病一线筛查指标。目前我院临床实验室只检测血浆皮质醇，本研究是以血浆皮质醇的检测方法来检测血浆及唾液皮质醇的相关性，以确立本实验室唾2 液皮质醇的正常值范围。随着社会的发展，人民生活水平的提高，糖尿病俨然已经成为严重威胁人类健康的世界性卫生难题。仅我国的糖尿病患者数量就已超一亿人。更为严重的是仍有超过半数的糖尿病患者未被明确诊断，且已接受[12]治疗者的血糖控制情况及其并发症的诊治情况也很不理想。为减轻糖尿病给人们带来的身体上的痛苦、生活上的不便以及沉重的经济负担，就要求我们迫切地在影响糖尿病的发生发展因素方面及糖尿病的诊治技术上有进一步的认识和发现。糖皮质激素（主要是皮质醇）的分泌紊乱可导致库欣综合征。库欣综合症也会造成脂代谢、糖代谢的的紊乱而引起肥胖、血糖增高等异常以及其他很多物质代谢异常，导致糖尿病，骨质疏松，高血压等很多疾病。皮质醇在体内作为胰岛素的一种拮抗激素，在糖代谢调节过程中起着与胰岛素相反的作用。其可以促进升高血糖途径，例如：糖皮质激素促进外周组织蛋白质的分解，脂肪的分解，糖异生途径增加等，这些共[13]同作用最终会使血糖升高。另外，皮质醇还可通过抑制降糖途径，如：抑制外周组织对葡萄糖的摄取利用，进一步升高血糖。据国内外最新的文献报道，皮质醇激素还可直接作用于胰岛β细胞，减少胰岛素受体的数目或降低其效能而导致胰岛素抵抗和胰岛素分泌功能下降，这种作用在2型糖尿病中表现得更为突出。因此，糖尿病患者体内长期高皮质醇[14,15]水平可能是造成胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗的又一种原因。糖尿病患者在应激状态下，胰高血糖素、儿茶酚胺、皮质醇分泌异常，在1型糖尿病患者中存在下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的轻度损[13]害。有研究表明损伤海马功能区可以使HPA轴对多种应激激素的敏感3 [16]性升高，导致血皮质醇应激性增高，从而进一步损伤HPA轴。糖尿病患者由于长期的高血糖状态可以造成大血管及全身弥漫性微血管病变，造成海马功能区结构的异常，导致皮质醇分泌增加，进一步加重机体糖、脂代谢异常并增加并发症的患病风险。鉴于皮质醇水平及HPA轴功能的异常对糖尿病的发生、发展，及治疗过程风险有着重要影响，二者可能起相互促进作用。且应用唾液皮质醇代替血浆皮质醇作为评判机体游离皮质醇水平，并以此研究HPA轴功能的报道在国内外均鲜见，因此本研究将正常人群的唾液皮质醇及血浆皮质醇与2型糖尿病人的唾液皮质醇与血浆皮质醇相比较，以了解2型糖尿病患者的皮质醇水平的变化情况及可能的影响因素，以及其与HPA轴功能改变之间的关系。机体皮质醇水平变化受多种因素的影响，唾液皮质醇及血浆皮质醇监测也受多种因素的影响，其中不乏食物的影响。川渝地区的人们喜食辛辣、麻辣食物,火锅是该地区比较具有代表性的一种食物或饮食方式,喜爱之人众多。但由于火锅底料组成成分复杂，其中含有大量的油脂、香辛料（花椒、辣椒、胡椒、大葱、生姜、大蒜、八角、山奈、茴香等），以及其他各种食品调料等。火锅食材也包括有各种复杂的动、植物成分。而且各种食材的处理可能用到一些化学物质等。此种饮食方式常导致食用者食用后出现以消化道黏膜刺激症状为主的各种轻度不适症状如：咽喉疼痛、恶心、呕吐、脐周疼痛、腹泻、里急后重、排便次数增多、肛[17,18]门灼热等。有学者将其称之为“火锅综合症”。火锅除了对食用者消化道造成影响之外，是否会对人体的内分泌系统有一定影响，国内外尚未有此类研究或者报告。本研究以健康体检组中自愿进食火锅的志愿者为4 研究对象，初步探讨进食火锅对人体皮质醇分泌水平的影响以及对唾液皮质醇及血浆皮质醇检测结果的意义。1对象与方法1.1研究对象（1）正常组(NC组)：选取2015年8月-2016年1月期间在川北医学院附属医院体检中心健康体检者60例（男性28例，女性32例），年龄18岁-65岁，平均年龄(49.01±0.36)岁。研究对象均符合以下条件：1）肝、肾功能等生化指标均正常；2）无糖尿病、高血压、冠心病及肾上腺功能异常、垂体功能异常等急、慢性病史；3）受试前两周无明显的应激状况，有规律的作息时间；4）近期没有使用外源性糖皮质激素或者可能影响糖皮质激素合成、分泌及分解的药物；5）既往无高皮质醇分泌史及典型临床表现；6）无口腔疾病，无明确的精神病史或服用安眠药、镇静药史，无酗酒；7）女性有正常的月经周期或已绝经，近期未服用避孕药。（2）2型糖尿病组（T2DM组）：本研究根据1999年WHO关于糖尿病的诊断标准选取2015年8月-2016年1月期间在川北医学院附属医院内分泌科住院的2型糖尿病病人共65例（男性27例，女性38例），平均年龄(50.35±1.28)岁。研究对象需符合正常对照组的3）、4）、5）、6）、7）标准外，还需符合以下排除标准：1）1型糖尿病及糖尿病严重的急慢性并发症（如：糖尿病高渗状态、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病周围神经病变、糖尿病血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等）；2）各种急慢性感染；3）风湿免疫性疾病、各种肿瘤、其他内分泌相关疾病。（3）火锅组（NC火组）：在正常对照组招募自愿食用火锅（本实验5 所采用火锅均为某品牌传统川味红汤火锅）人员共31人，男性13例，女性18例，平均年龄（48.17±2.16）岁。1.2研究方法1.2.1一般资料的采集：通过向实验对象询问病史，收集所有研究对象的基本信息：主要包括姓名、性别、年龄、现病史、既往史（有无糖尿病、高血压、肝炎、结核、疟疾等，有无血脂异常，以及近期使用药物情况）、吸烟史、饮酒史、家族遗传史等一般情况，女性还应当详细询问月经史、生育史及避孕药物服用史等。2测量患者的身高、体重等基本信息，并计算体重指数。（BMI（kg/m）22=体重/身高(kg/m)）。1.2.2生化标本的收集及测定：取符合本试验的住院病人次日清晨空腹肘静脉血（空腹8小时及以上），将部分血离心后取出血清，在我院临床检验中心用生化分析仪检测以下生化指标：空腹血糖（FBG）：葡萄糖氧化酶法。糖化血红蛋白（HbA1c%）：色谱法。血脂：总胆固醇（TC）：胆固醇氧化酶法；甘油三酯（TG）：磷酸甘油氧化酶法。同型半胱氨酸（Hcy）:循环酶法。超敏C反应蛋白（hs-CRP）：免疫增强比浊法。1.2.3唾液及血浆皮质醇的收集健康志愿者采集标本前一晚22:00后禁食禁水，于第二天08:00、16:00、00:00留取唾液标本并同步采集静脉血；2型糖尿病患者在入院后当日晚上22:00后禁食禁水，于次日的08:00、16:00、00:00分别采取静脉血测定皮质醇浓度并同步留取患者唾液标本。食用火锅组收集食用火6 锅后午夜00:00的唾液标本，清晨08:00的血液及唾液标本。留取唾液的受检者在每次唾液标本收集前禁食禁水15-20分钟，用清水漱口，然后静息，吐去第一口唾液，将唾液收集管中的药签置于口腔中咀嚼或直接置于舌下，静待唾液自然流入，避免混入水、血或痰等杂质。1.2.4唾液皮质醇的收集及保存①从唾液采集管中取出药签②将药签置于受试者口腔中，咀嚼45-60s刺激唾液的分泌或直接置于舌下，静待唾液自然流入，随即取出附着有唾液的药签放到唾液采集管中。③塞紧管塞，4000r/min离心5分钟，直至管中产生透明的唾液。④唾液中颗粒及黏液成分沉淀于唾液采集管特殊设计的尾梢中，内置的药签随即进行卫生处理，取得的清亮唾液标本则用于实验分析。唾液标本于2-8℃下保存，有效期可维持4天；-20℃到-80℃下保存，有效期维持3月，但为了避免标本浓度降低或冻融次数过多对实验精度的影响，本研究在取得标本后立即置于2-8℃冰箱保存，当天或次日检测。1.2.5血浆及唾液皮质醇的实验测定：电化学发光免疫分析（ECLIA）法1.3检测所需的主要试剂、仪器及试剂测定1.3.1主要实验试剂及仪器飞鸽TDL-5A台式水平离心机上海安亭公司台式低温高速离心机HealForce，Neofuge15R普通冰箱青岛海尔股份有限公司7 DXC800全自动生化分析仪贝克曼库尔特（美国）公司BKECMANLH750血细胞分析仪贝克曼库尔特（美国）公司Sarstedt唾液采集管德国莎斯特公司Cobase602罗氏诊断产品（上海）有限公司皮质醇检测试剂盒（电化学发光法）RocheDiagnosticsGmbH1.3.2耗材准备：①Cobase602分析仪②系统缓冲液（ProCellM），2×2L③测量池清洗液（CleanCellM）,2×2L④PC/CC-Cups12杯,用于在检测前预热ProcellM及CleancellM⑤ProbeWashM清洗液⑥吸头/反应杯CombimagazineM,48暗盒×84反应管或移液管吸头，废物包⑦Wasteliner,废物袋⑧系统清洁适配器M1.3.3试剂准备：将冷藏的足量皮质醇检测试剂盒预温到20℃，后置于Cobase602分析仪试剂舱内的试剂盘上，整个过程避免产生泡沫。1.3.4样本准备：①Sarstedt唾液采集管收集好的唾液以4000r/min离心5分钟，后用移液枪吸取适量唾液于罗氏仪器专用样本管中待测；②真空采血管收集好的血液以4000r/min离心5分钟，弃去沉淀后待测。8 由于皮质醇的含量存在昼夜周期变化，故每个标本均需注明采样时间。1.3.5上机测试将样本管放入Cobase602分析仪进行检测（考虑到可能存在蒸发效应，故上机的标本、定标液、质控品均应在2小时内测定），整个检测过程需18分钟，具体测试步骤如下：①第一步：40ul样本液分别加入生物素化的羊抗皮质醇抗体和钌（Ru）标记的皮质醇衍生物溶液中。生物素化的羊抗皮质醇抗体一部分与钌标记的皮质醇衍生物混合，另一部分则与待测样本混合。②第二步：加入链霉亲合素包被的微粒体。③第三步：利用移液枪将反应混合液移至测量池中，结合有钌的微粒被磁铁吸附于电极板上，未结合的微粒体则被清洗液包裹清除出去。检测结果由仪器自动根据标准曲线生成，并自动计算出每份标本的皮质醇含量，其单位是nmol/L,ug/dl,或ug/L。转换因子nmol/L×0.03625=ug/dl，nmol/L×0.3625=ug/L，ug/dL×27.586=nmol/L,ug/L×2.7586=nmol/L。在本研究中，采用我院临床实验室统一报告单位：ug/dL。1.4统计学分析采用SPSS18.0统计软件对资料进行统计学分析，计量资料经检验符合正态分布，数据采用（x—±s）表示，两两比较采用t检验，唾液皮质醇参考区间以（x—±1.96s）（95%数据分布范围）建立；双变量间的相关性分析采用Pearson相关分析，多因素间的相关性分析采用线性逐步回归分析，以P<0.05为有统计学意义。9 2结果2.1唾液皮质醇每日08:00、16:00、00:00的95%参考区间分别为：0.0432-0.3182ug/dL、0.0507-0.0693ug/dL、0.0264-0.0356ug/dL。(见表1)表1唾液皮质醇每日08:00、16:00、00:00时间点95%参考区间时间点参考区间（ug/dL）08:000.0432-0.318216:000.0507-0.069324:000.0264-0.03562.2比较T2DM组与NC组两组间临床指标结果显示：(1)T2DM组与NC组相比，其BMI、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、Hcy、hs-CRP、PC08:00、PC16:00、PC00:00、SC08:00、SC16:00、SC00:00水平较NC组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；HDL-C水平则低于NC组，差异有统计学意义（P＜0.05）。(见表2)2.32型糖尿病组全天各时间点PC、SC与临床指标的相关分析结果显示：PC(08：00、16:00、00:00)及SC(08：00、16:00、00:00)水平分别与FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、hs-CRP、Hcy呈正相关，与HDL-C呈负相关（P＜0.05）。(见表3、表4、表5)10 —表2各组人群一般资料及血生化、PC、SC指标比较（x±s）与t检验结果项目组别N均值标准差tdfp年龄T2DM6550.353810.328101.00574.0110.318NC6049.01672.78915BMIT2DM6523.43951.545407.652**1230.000NC6021.33001.53408pc8时T2DM6516.55773.741154.767**1230.000NC6013.44523.74115pc16时T2DM659.35864.109345.139**105.4420.000NC606.28032.43653pc0时T2DM655.14224.143255.526**79.8740.000NC602.12731.41784sc8时T2DM650.47660.1842912.037**83.4280.000NC600.18070.07013sc16时T2DM650.15510.089937.841**86.2720.000NC600.06000.03682sc0时T2DM650.14720.093309.841**69.3100.000NC600.03100.01829HbA1c%T2DM658.10431.1540318.141**85.3640.000NC605.29120.46202TGT2DM652.70852.030425.490**68.5560.000NC601.30130.36857TCT2DM654.90091.323142.503*97.0450.014NC604.43530.67771LDLT2DM653.65080.904133.764**118.1420.000NC603.11530.67771HDLT2DM651.11000.34735-4.631**94.9040.00011 —表2各组人群一般资料及血生化、PC、SC指标比较（x±s）与t检验结果（续）项目组别N均值标准差tdfpNC601.33420.17094HcyT2DM658.50463.828063.643**1230.000NC606.23753.04868CRPT2DM653.59463.140643.267**94.1810.002NC602.16881.52434FBGT2DM6510.47223.8953411.591**71.1910.000NC604.71570.88968注：“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。表3T2DM组8:00PC、SC与临床指标的相关性PCSC变量rprpBMI0.824**0.0000.563**0.000HbA1c%0.595**0.0000.639**0.000TG0.265*0.0330.1880.134TC0.0700.5820.2010.108LDL0.482**0.0000.307*0.013HDL-0.246*0.048-0.1880.135Hcy0.260*0.0360.1040.410CRP0.0770.5420.2010.108FBG0.684**0.0000.301*0.015注：“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。12 表4T2DM组16:00PC、SC与临床指标的相关性PCSC变量rprpBMI0.619**0.0000.516**0.000HbA1c%0.460**0.0000.271*0.029TG0.1950.1190.251*0.044TC0.0430.7360.1390.270LDL0.2430.0510.376**0.002HDL-0.0660.6030.0520.682Hcy0.1430.2560.371**0.002CRP0.0270.8340.0300.810FBG0.714**0.0000.552**0.000注：“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。表5T2DM组00:00PC、SC与临床指标的相关性PCSC变量rprpBMI0.426**0.0000.419**0.001HbA1c%0.513**0.0000.450**0.000TG0.320**0.0090.374**0.002TC0.1870.1350.1780.155LDL0.543**0.0000.479**0.000HDL-0.1600.203-0.1230.331Hcy0.525**0.0000.602**0.000CRP0.0330.7920.0620.622FBG0.367**0.0030.486**0.000注：“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。13 2.4两组各时间点PC与SC相关分析结果显示：PC(08：00、16:00、00:00)及SC(08：00、16:00、00:00)水平分别在对应时间点呈正相关（P＜0.01）。(见表6)表6T2DM组与NC组各时间点PC与SC的相关性T2DMNC项目rprp8:000.635**0.0000.529**0.00016:000.621**0.0000.481**0.00000:000.671**0.0000.671**0.000注：“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。2.5T2DM组各时间点PC值与相关影响因素的回归分析PC值在08:00与相关因素回归分析结果显示，BMI、HbA1c%、FBG对其影响显著（PBMI=0.000,PHbA1c%=0.035，PFBG=0.000,见表7）。PC值在16:00与相关因素回归分析结果反应，BMI、HbA1c%、TC、Hcy、FBG对其影响显著（PBMI=0.000,PHbA1c%=0.042，PTC=0.003，PHCY=0.036，PFBG=0.000，见表8）。PC值在00:00与相关因素回归分析结果表明，LDL、Hcy对其影响显著（PLDL=0.044,PHCY=0.009，见表9）。14 表7T2DM组8:00PC与相关影响因素的回归分析偏回归系数B标准回归系数Betap(常量)-22.7800.000BMI1.4230.5880.000HbA1c%0.4710.1450.035TG-0.123-0.0670.360TC-0.167-0.0590.318LDL0.2110.0510.415HDL-0.745-0.0690.250Hcy-0.086-0.0880.162CRP-0.077-0.0640.327FBG0.4190.4360.000a因变量:PC（ug/dL)表8T2DM组16:00PC与相关影响因素的回归分析偏回归系数B标准回归系数Betap(常量)-20.8110.000BMI1.0290.3870.000HbA1c%0.6690.1880.042TG0.0890.0440.652TC-0.774-0.2490.003LDL-0.570-0.1250.139HDL1.1060.0930.248Hcy-0.193-0.1800.036CRP-0.160-0.1220.167FBG0.6920.6560.000a因变量:PC（ug/dL)15 表9T2DM组00:00PC与相关影响因素的回归分析偏回归系数B标准回归系数Betap(常量)-14.3980.049BMI0.3140.1170.324HbA1c%0.8540.2380.066TG0.2250.1100.421TC-0.116-0.0370.739LDL1.1060.2410.044HDL-0.507-0.0430.706Hcy0.3410.3150.009CRP-0.279-0.2110.090FBG-0.015-0.0140.905a因变量:PC（ug/dL)2.6T2DM组各时间点SC与相关影响因素的回归分析SC值在08:00与相关因素回归分析结果显示，BMI、HbA1c%、TC对其影响显著（PBMI=0.003,PHbA1c%=0.000，PTC=0.003，见表10）。SC值在16:00与相关因素回归分析结果反应，BMI、FBG对其影响显著（PBMI=0.006，PFBG=0.004，见表11）。SC值在00:00与相关因素回归分析结果表明，各因素对其影响都没有达到显著水平(见表12)。16 表10T2DM组8:00SC与相关影响因素的回归分析偏回归系数B标准回归系数Betap(常量)-1.0570.000BMI0.0380.3200.003HbA1c%0.0980.6140.000TG0.000-0.0050.967TC-0.044-0.3180.002LDL-0.007-0.0330.749HDL0.0830.1560.125Hcy-0.004-0.0910.384CRP0.0030.0450.680FBG0.0020.0440.677a因变量:SC（ug/dL)表11T2DM组16:00SC与相关影响因素的回归分析偏回归系数B标准回归系数Betap(常量)-0.4450.008BMI0.0200.3520.006HbA1c%-0.009-0.1190.373TG0.0020.0340.813TC-0.002-0.0370.752LDL0.0140.1420.253HDL0.0380.1450.223Hcy0.0020.1050.394CRP0.000-0.0090.942FBG0.0090.3720.004a因变量:SC（ug/dL)17 表12T2DM组00:00SC与相关影响因素的回归分析偏回归系数B标准回归系数Betap(常量)-0.2280.161BMI0.0060.1050.374HbA1c%0.0090.1090.391TG0.0040.0920.499TC-0.005-0.0690.533LDL0.0160.1570.184HDL-0.006-0.0230.838Hcy0.0100.4010.001CRP-0.003-0.0910.458FBG0.0040.1680.157a因变量:SC（ug/dL)2.7NC(火)在食用火锅前后PC、SC的比较表13NC组自愿参与食用火锅后检验PC、SC值t检验项目组别N均值标准差tdfpPC08:00NC3113.52943.79679-2.197*600.032NC（火）3115.65063.80577SC08:00NC310.34900.14131-1.807600.076NC（火）310.43840.23631SC00:00NC310.03260.01999-1.284600.204NC（火）310.03900.01955比较两组临床指标结果后得出：(1)NC组自愿参与食用火锅后检验被试NC（火）其PC及SC水平均值高于食用前水平，在第二天上午08:00时的PC值与食用前一天08：00时的PC值有显著差异，考察的00:00及08:00两个时间点SC值差异无统计学意义。18 3讨论3.1唾液皮质醇参考区间的建立唾液皮质醇（salivarycortisol,SC）是血液中具有生物活性的游离皮质醇经过唾液腺泡细胞扩散进入唾液形成的。由于游离皮质醇呈脂溶性，易通过富于脂质的细胞膜，故SC几乎不受唾液流速等唾液自身因素的影响，浓度变化及节律基本与血液中游离态皮质醇保持一致，同样也遵循昼夜节律变化规律[19]。国内外多项研究显示SC检测较传统PC检查在评价肾上腺皮质功能方面更为简便可行，尤其是午夜SC浓度的检测对于筛查及诊断库欣综合征（Cushing’ssyndrome）是一个简便、敏感的临床指标[20-23]。事实上，许多学者已将SC浓度的检测在皮质类固醇相关疾病中的作用提高到了一个新的高度。目前，市面上所用的测定PC的检测方法可直接或经过改良后用于SC的检测。本研究采用电化学发光法检测所有研究对象的唾液及血浆皮质醇浓度，相较其他皮质醇浓度检测方法，电化学发光法有以下几点优势：①标记物的可循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定；②敏感度高，可达pmol或pg/ml级别；③线性范围宽，可达到>10的四次方；④反应时间短，20min以内可完成测定；⑤试剂稳定性好，2～5℃可保存一年以上。有效地克服了传统ELISA法测定皮质醇浓度重复性不好；受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性；干扰因素过多等缺点。在测定程序上更加简便经济，也使结果更加准确。我院临床实验室目前只开展了利用电化学发光法测定PC的浓度，只建立了PC的正常参考值区间，而暂时没有开展利用电化学发光法19 测定SC的浓度，也没有相应的SC正常值参考区间。本研究的目的之一就是利用我院临床实验室测定血浆皮质醇浓度的电化学发光法来测定SC的浓度，探讨SC与PC的相关性，并通过获得60例健康体检志愿者的SC水平数据，采用（x—±1.96s）（95%数据分布范围）建立我院临床实验室的正常健康成人SC正常值参考区间。本研究将60例NC组的SC（08:00、16:00、00:00）与PC（08:00、16:00、00:00）在对应时间点做person相关分析显示该组SC与PC在08:00、16:00、00:00分别呈显著直线相关关系（r=0.554,r=0.481,r=0.671，P<0.01）；同样将65例T2DM组的SC（08:00、16:00、00:00）与PC（08:00、16:00、00:00）在对应时间点做person相关分析显示该组SC与PC在08:00、16:00、00:00分别呈显著直线相关关系（r=0.635,r=0.621,r=0.671，P<0.01）。可见无论是正常对照组还是2型糖尿病组，其SC与PC均呈显著的线性相关关系。且除8例2型糖尿病患者昼夜节律紊乱外，其余57例2型糖尿病组患者与正常对照组的SC及PC均存在正常昼夜节律，且SC与PC的昼夜节律变化规律一致。这些与既往的国内外研究结果基本一致，提示唾液皮质醇浓度与血浆皮质醇浓度都可以反应机体皮质醇的水平及节律的变化情况。故本研究利用电化学发光法建立我院临床实验室的SC正常值参考区间是可行的。本研究通过严格对受试人群进行筛选，剔除年龄低于18岁及大于65岁的人群，获得60例健康体检志愿者的SC水平数据，采用（x—±1.96s）确立的08:00、16:00、24:00的95%正常值参考区间分别为：0.0432-0.3182ug/dL、0.0507-0.0693ug/dL、0.0264-0.0356ug/dL。志愿者均经过体检健康，且在志愿者的选择上充分考虑到了年龄因素的影响。各志愿者在受试前均被充分告知并签署知情同意书。标本采集及20 其他操作标准均按照CLSIC28-A3指南进行，数据的处理均严格按照统[24]计学标准进行。所以，本实验得出的SC参考区间具有较高可信度。本[25]实验结果与前期国内文献报道中采用ECLIA法测得的结果相近，其中存在的小差异不排除检测技术引起的系统误差，样本量较小，或地域、饮食习惯等差异而造成的影响。3.22型糖尿病患者的皮质醇水平变化本研究中65例2型糖尿病患者SC及PC在（08:00、16:00、00:00）均值明显高于60例健康正常组SC及PC在（08:00、16:00、00:00）的均值，两组数据具有显著性差异（P<0.01）。本研究结果表明大部分2型糖尿病患者血皮质醇的生理波动节律仍然存在。主要表现为以血浆皮质醇水平分泌增多，尤以早晨08:00血浆皮质醇分泌增多。引起此现象的原因及机制目前尚不明确，需要进一步探索研究。血浆皮质醇的过量分泌可直接或间接抵抗胰岛素的作用，进一步加重2型糖尿病的高血糖和胰岛素抵抗作用。2型糖尿病患者的皮质醇升高是否与某些生化指标存在相关性，本研究将T2DM组的PC、SC、BMI、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、Hcy、hs-CRP与NC组上述生化指标进行比较，发现T2DM组PC、SC、BMI、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、Hcy、hs-CRP均高于NC组，HDL-C均低于NC组，差异具有统计学意义。并将T2DM组的3组时间点的PC、SC与BMI、FBG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C做Person直线相关性分析得到：T2DM组清晨08:00PC与BMI、FBG、HbA1c呈正相关（r=0.824,r=0.684,r=0.595,P<0.01）,下午16:00PC与BMI、FBG、HbA1c呈正相关（r=0.619，r=0.714，r=0.460，P<0.01），午夜00:00PC与BMI、FBG、HbA1c呈正相关（r=0.426，r=0.317，r=0.513，P<0.01）；21 清晨08:00SC与BMI、FBG、HbA1c呈正相关（r=0.563,r=0.301,r=0.639,P<0.01），下午16:00SC与BMI、FBG、HbA1c呈正相关（r=0.516,r=0.552,r=0.271,P<0.01），午夜00:00SC与BMI、FBG、HbA1c呈正相关（r=0.419,r=0.486,r=0.450,P<0.01）。可见T2DM组皮质醇浓度与BMI、[26]FBG和HbA1c之间存在显著线性相关关系。RoyM等在1型糖尿病患者中做了CRH兴奋试验的研究，结果发现糖尿病患者中普遍合并存在慢性肾上腺皮质分泌功能增高。这种在1型糖尿病病人中的皮质醇分泌增高，可以推测糖代谢紊乱可能引起皮质醇水平的升高。糖皮质激素是胰岛素的拮抗激素之一，能够通过多种途径升高血糖：首先，能够直接抑制胰岛分泌胰岛素的作用，并且也能使血液循环中的胰高血糖素水平增[14]高，故糖尿病患者血液中的皮质醇水平升高可使得血糖更难控制；其次，糖皮质激素可使蛋白质和脂肪分解代谢加速，产生大量的氨基酸及游离脂肪酸，为糖异生途径提供了更多原料，进一步加重了血糖的升高[27]。研究证实人或动物在生理需要量基础上长期给予过量皮质醇激素将[28]导致胰岛分泌功能的下降。糖尿病患者的长期高皮质醇状态可直接作用于胰岛β细胞，从而引起胰岛β细胞功能的异常。除此之外皮质醇还[29]有促进酮体生成的作用，将会加重酮症酸中毒的风险。可见糖尿病高皮质醇不仅可以引起血糖失控，而且还会加速酮症酸中毒的发生，从而危及患者生命。研究发现T2DM患者清晨8时的血皮质醇浓度明显增高，[30]这一点与空腹血糖浓度有很高的相关性。Zoe等对300例T2DM患者及200例正常对照组研究证实，T2DM患者清晨8时血皮质醇浓度明显增高，且增高的皮质醇浓度与增高的空腹血糖明显相关。可见皮质醇在2型糖尿病糖代谢异常中起着一定的作用。22 脂代谢紊乱将会导致或加重糖代谢紊乱，而糖代谢紊乱又会反过来破坏脂代谢平衡轴，二者互为因果，相互促进。McGarry教授更是大胆提出脂代谢紊乱是2型糖尿病糖代谢异常的根源所在，脂代谢异常是糖尿病及其并发症的上游病理生理改变。甚至将2型糖尿病称作“糖脂病”（DiabetesMellipitus）,从而将人们对脂代谢在糖尿病中的作用提高到了[31]一个新的高度。流行病学研究一致认为外源性或内源性的糖皮质醇激[7,32]素增加可致脂代谢异常。皮质醇在脂类代谢中的作用机制目前尚未完全阐明，目前认为糖皮质激素调节人类大约10%的基因表达，在人体外[33]已被证实可通过多种机制调节脂代谢。糖皮质激素参与脂代谢的调节，可能由以下几方面引起：①糖皮质激素作用于肝脏脂肪酸的代谢过程；②糖皮质激素具有分解脂肪的作用；③11β羟类固醇脱氢酶1型（11-βHSD-1）具有类脂化合物代谢作用。④腺苷酸活化蛋白肌酶（AMPK）调节许多糖皮质激素诱发新陈代谢的改变。其中11-βHSD-1是糖皮质激素代谢酶，在体内可将无生物活性的可的松还原为有生物活性的氢化可的松。11-βHSD-1主要存在于肝脏，有研究报道肥胖及代谢[34]综合征患者的脂肪细胞内皮质醇水平显著升高。本研究中T2DM组的皮质醇值与正常健康组比较显著升高，且皮质醇与脂代谢紊乱存在相关性。本研究结果与既往研究结果基本相符。进一步分析结果提示本研究T2DM组清晨08:00PC与TG、LDL呈正相关（r=0.265，r=0.482，P<0.05），与HDL-C呈负相关（r=-0.246，P<0.05）。但与TC呈正相关（r=0.070，P>0.05），无统计学意义；午夜00:00PC与TG、LDL呈正相关（r=0.320，r=0.543，P<0.01），但与HDL-C呈负相关（r=-1.60，P>0.05），与TC呈正相关（r=0.187，P>0.05），后两组均无统计学意义；下午16:00PC与23 TC、TG、LDL-C呈正相关，与HDL-C呈负相关，但均为P>0.05，无统计学意义。一些研究发现降脂治疗对于2型糖尿病患者而言，可大幅降[35]低心血管原因所导致的病残率和病死率。目前许多糖尿病患者在接受降糖治疗的同时，也在接受降脂治疗。他汀类的降脂药物在糖尿病的治疗中应用广泛，本研究选择病人时并未考虑到部分糖尿病患者可能已使用降脂药物。而且本研究样本量较少等因素导致研究结果存在一些差异。另外，本研究发现在2型糖尿病组中存在着皮质醇昼夜节律变化的紊乱，65例2型糖尿病患者中，有8例出现00:00皮质醇水平下降未达到清晨水平的50%,有8例出现00:00皮质醇水平高于16:00皮质醇水平，提示在2型糖尿病中存在着肾上腺皮质分泌机能紊乱现象，同时也可能存在着下丘脑-垂体-肾上腺轴昼夜分泌节律的紊乱。糖尿病患者存在的胰岛素、胰高血糖素、皮质醇等的分泌异常。这些异常分泌可能造成下丘[13]脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）不同程度的损伤。HPA轴在内分泌反馈调节系统中居于中心位置。海马功能区为HPA轴负反馈调节在高位中枢[36]的控制中心，以皮质醇激素作为负反馈调节中的信号分子。人为地刺激海马功能区可抑制应激诱发的皮质醇分泌。糖尿病患者长期的高血糖状态可能会对海马功能区造成不可逆转的损伤，从而失去海马对皮质醇[37]水平的正常调节功能。而血皮质醇浓度的升高又进一步加重了糖代谢紊乱，居高不下的血糖继续作为一种慢性刺激因素进行性破坏海马功能区，周而复始，使得糖尿病的控制越来越不理想。3.3进食火锅对皮质醇分泌及检测的影响本研究将31例健康志愿者食用火锅前后的PC及SC进行观察，结果发现食用火锅后的PC及SC均值较食用前均有升高，以次日08:00PC24 升高最为显著（P<0.05，具有统计学意义）。00:00及08:00SC有升高（P>0.05）无统计学意义。故推测，火锅这种饮食方式可能会影响皮质醇的分泌，及影响检查的结果。其原因我们推测可能是由于火锅，烫，味道麻辣，油腻。各种动物植物食材多样，及多种调料混杂。有研究报道食用者可引起消化系统产生刺激，导致咽喉疼痛、恶心、呕吐、脐周[17,18]疼痛、腹泻、里急后重、排便次数增多、肛门灼热等。这些刺激均可导致身体应激反应，导致皮质激素分泌增加。但是，参加本研究的31位志愿者均没有出现上述刺激症状。其原因我们分析认为可能是刺激症状较轻，机体内分泌系统做出了反应而机体没有感觉到。另外，超过平时摄入量的大量油腻食物的摄入，引起血糖、血脂及其他代谢因素的变化，使皮质醇分泌增加。志愿者食用火锅后血糖及血脂是否产生较大波动，多长时间能够恢复正常水平，是否与皮质醇分泌变化有关，本研究没有测定，这些问题有待进一步深入探讨。此外，测得00:00的唾液皮质醇，08:00的唾液皮质醇较进食火锅前升高，但无统计学差异。可能与本研究的观察样本量少有关，还需加大样本量及观察参数确定。本研究的局限性在于：（1）本实验各组的样本量较小，下一步将扩大样本量对该结果进行验证。（2）本研究在收集标本时一直未收集到库欣氏综合征的病人标本，以后收集到此类病人的标本后将进一步分析探讨SC与PC的关系及SC作为该疾病一线诊断指标的价值。（3）本课题仅仅对PC及SC在2型糖尿病患者中的表达水平及节律进行了测定并进行对照研究，需进一步研究其在2型糖尿病中的作用机制。以及SC对糖尿病患者中库欣综合症的筛查价值。25 4结论4.1本实验室利用电化学发光法测得SC与PC水平在08:00、16:00、00:00的时间点均呈显著线性相关关系，也反应出皮质醇分泌的节律变化规律，可初步建立本验室的唾液皮质醇浓度正常值参考区间。每日08:00、16:00、00:00的唾液皮质醇95%正常参考区间分别为：0.0432-0.3182ug/dL、0.0507-0.0693ug/dL、0.0264-0.0356ug/dL。4.22型糖尿病组皮质醇水平高于正常对照组，且部分2型糖尿病患者存在皮质醇分泌昼夜节律的紊乱。推测2型糖尿病的发生可能与高皮质醇水平有关，也有可能是由于2型糖尿病患者的长期高血糖状态损伤了下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的正常功能，而引起皮质醇分泌节律紊乱，皮质醇与糖，脂代谢有一定的相关性。4.3食用火锅后次日08：:00的唾液及血浆皮质醇水平均值均高于食用火锅前的皮质醇水平，且血浆皮质醇在食用火锅后与食用火锅前比较差异具有统计学意义，推测食用火锅可能会影响次日皮质醇的分泌。建议不要在行皮质醇检测之前食用火锅。26 附图NC组PC8:00（ug/dl）NC组SC8:00(ug/dl)NC组PC16:00（ug/dl）NC组SC16:00(ug/dl)27 NC组PC00:00（ug/dl）NC组SC00:00(ug/dl)T2DM组PC8:00（ug/dl）T2DM组SC8:00(ug/dl)T2DM组PC16:00（ug/dl）T2DM组SC16:00(ug/dl)28 T2DM组PC00:00（ug/dl）T2DM组SC00:00(ug/dl)T2DM组PC8:00（ug/dl）T2DM组HbA1c%T2DM组PC16:00（ug/dl）T2DM组HbA1c%29 T2DM组PC00:00（ug/dl）T2DM组HbA1c%T2DM组SC8:00（ug/dl）T2DM组HbA1c%30 T2DM组SC16:00（ug/dl）T2DM组HbA1c%T2DM组SC00:00（ug/dl）T2DM组HbA1c%T2DM组PC8:00（ug/dl）T2DM组FBG(mmol/l)31 T2DM组PC16:00（ug/dl）T2DM组FBG(mmol/l)T2DM组PC00:00（ug/dl）T2DM组FBG(mmol/l)32 T2DM组SC8:00（ug/dl）T2DM组FBG(mmol/l)T2DM组SC16:00（ug/dl）T2DM组FBG(mmol/l)T2DM组SC00:00（ug/dl）T2DM组FBG(mmol/l)33 参考文献[1]TunnS,MollmannH,BarthJ,etal.Simultaneousmeasurementofcortisolinserumandsalivaafterdifferentformsofcortisoladministration[J].ClinChem,1992,38(8):1491-1494.[2]LentjesEG,RomijnF,MaassenRJ,etal.Freecortisolinserumassayedbytemperature-controlledultrafiltrationbeforefluorescencepolarizationimmunoassay[J].ClinChem,1993,39(12):2518-2521.[3]BonninR,VillabonaC,RiveraA,etal.IssalivarycortisolabetterindexthanfreecortisolinserumorurinefordiagnosisofCushingsyndrome?[J].ClinChem,1993,39(6):1353-1354.[4]ViningRF,McGinleyRA,SymonsRG.Hormonesinsaliva:modeofentryandconsequentimplicationsforclinicalinterpretation[J].ClinChem,1983,29(10):1752-1756.[5]HansenAM,GardeAH,ChristensenJM,etal.EvaluationofaradioimmunoassayandestablishmentofareferenceintervalforsalivarycortisolinhealthysubjectsinDenmark[J].ScandJClinLabInvest,2003,63(4):303-310.[6]RaffH,HomarPJ,BurnsEA.Comparisonoftwomethodsformeasuringsalivarycortisol[J].ClinChem,2002,48(1):207-208.[7]ArnaldiG,AngeliA,AtkinsonAB,etal.DiagnosisandcomplicationsofCushing'ssyndrome:aconsensusstatement[J].JClinEndocrinolMetab,2003,88(12):5593-5602.[8]CastroM,EliasPC,MartinelliCJ,etal.Salivarycortisolasatoolforphysiologicalstudiesanddiagnosticstrategies[J].BrazJMedBiolRes,2000,33(10):1171-1175.[9]HofmanLF.Humansalivaasadiagnosticspecimen[J].JNutr,2001,131(5):1621S-1625S.[10]PapanicolaouDA,MullenN,KyrouI,etal.Nighttimesalivarycortisol:ausefultestforthediagnosisofCushing'ssyndrome[J].JClinEndocrinolMetab,2002,87(10):34 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[1,2]质醇已被定性为筛查库欣综合征的高特异性及敏感性指标。因此，本文对唾液皮质醇的当前的研究进行综述。1SC的生理特性皮质醇（cortisol）也可叫做“氢化可的松”，是由肾上腺皮质束状带分泌的对人体糖代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素，即属于糖皮质激素的一种，也是机体一种基本的“应激激素”。皮质醇是通过肾上腺皮质线粒体中的11β-羟化酶由11-脱氧皮质醇生成，也可通过11-β-羟类固醇脱氢酶（11-β-hydroxysteroiddehydrogena-se）的作用变成皮质素。正常情况下，机体有一套完备的皮质醇调节机制，能很好地控制皮质醇的分泌和调控血中皮质醇的浓度。正常的皮质醇代谢有昼夜节律规律，24小时为一个周期，一般在清晨6-8时达峰，在上午8-12时会陡然下降，之后全天维持在一个缓慢的下降趋势中，在凌晨0-2时降至谷底，之后开始由谷底再次回升。但皮质醇并不总是遵从上述规律，当打破规律则会使皮质醇的昼夜节律出现紊乱，甚至出现浓度的变化，在本该下降的时候升高。这时皮质醇昼夜节律紊乱的负面影响开始表现为新陈代谢的异常，诸如：体重上升、血糖升高、食欲增加、过度疲劳感以及性欲减退等。外周血中大约有70%的皮质醇与肝脏合成的皮质类固醇结合球蛋白（CBG）结合，其结合特点呈现为高亲和力低容量性。25%与血清白蛋白结合，其结合特点呈现为低亲和力高容量性。仅3-5%以游离形式存在[3]且具有生物活性。Vining等根据唾液中几种激素在不同的唾液分泌情况下其浓度与血清中该激素浓度的相关性研究结果，提出了激素由血液进入唾液的转运机制，其中以游离形式存在的未结合的皮质醇因具有脂溶性，从而易穿过亲脂细胞膜扩散进入腺泡细胞，随即穿过细胞的另一侧39 进入唾液。其在血液与唾液中迅速平衡，不受血清中皮质类固醇结合球蛋白浓度变化及唾液流速等因素的影响，也与性别、年龄、体重指数、[4,5]吸烟与否及患病时间等无关。因为SC不受血清CBG变化的影响，所[1,6]以一般认为SC能反应血清中具有生物活性的游离皮质醇水平。鉴于此，目前国内外许多学者已采用唾液作为类固醇尤其是皮质醇测定的体[7,8]液标本。2唾液皮质醇的影响因素唾液皮质醇的分泌受多种因素影响，因为其反应人体游离皮质醇水平，与血皮质醇有较强相关性，故唾液皮质醇主要受HPA轴的调节。正常情况下肾上腺只在收到脑垂体和下丘脑分泌信号时才会分泌皮质醇激素。而当人体在面临巨大精神刺激及压力的情况下，肾上腺则会持续分泌皮质醇激素。研究发现长期压力状态下导致的持续皮质醇分泌会给肾上腺带来不利影响，从而又会反过来影响肾上腺分泌皮质醇激素的能力，形成恶性循环。肾上腺受损后导致肾上腺分泌功能的下降，在临床上一般会被诊断为阿狄森氏病的免疫系统疾病。某些时候，部分患者会因为恶性肿瘤而选择切除肾上腺。但这一类手术导致的终生服用人工合成糖皮质激素也会增加肾上腺皮质功能不全的发生风险。此外，唾液的异常分泌也是造成唾液皮质醇分泌异常的原因之一。3唾液皮质醇与血浆皮质醇、24小时尿游离皮质醇的相关性血液中的游离皮质醇经自由扩散进入唾液后能在血液及唾液中迅速达到平衡，故二者的浓度具有明显相关性，几乎所有内源性皮质醇均在肝脏细胞内代谢后转变生成无活性的水溶性钠盐，并以尿液的形式排出体外。因此24小时尿游离皮质醇浓度与血浆皮质醇浓度也存在良好的相40 关性。国外的研究证实，唾液皮质醇与血浆皮质醇，还有24小时尿游离[9,10]皮质醇之间均有较强相关性。[10]Putignano等研究分析了33例假库欣综合征、41例库欣综合征、27例健康志愿者和199例单纯性肥胖后得出结论：唾液皮质醇与08:00、00:00的血清皮质醇均呈正相关（r=0.67，P<0.0001）；尿游离皮质醇与库欣综合征患者的血皮质醇在08:00、00:00存在相关性（分别为r=0.51,P<0.001和r=0.43，P<0.005），尿游离皮质醇与唾液皮质醇在08:00、00:00也存在相关性（分别为r=0.55，P<0.0005和r=0.79，P<0.0001）。[9]YanevaM等用放射免疫测定法检测了63例库欣综合征患者，其中包括37例库欣病，54例单纯性肥胖患者，17例肾上腺皮脂腺瘤和9例异位ACTH综合征的00:00唾液皮质醇含量及24小时尿游离皮质醇浓度，证明了库欣综合征患者同一天内的00:00唾液皮质醇和24hUFC高度相关[11]（r=0.90,P<0.0001）。Meulenberg等将口服避孕药物的妇女和有正常月经周期的妇女的PC与SC浓度进行比较，虽然SC仅是PC的50%，但是两组的SC与PC均呈现高度相关性，其中口服避孕药妇女组的SC与PC相关系数为r=0.92，有正常月经周期妇女组的SC与PC相关系数为[8]r=0.81.Bonnin等早期研究也得到血清总皮质醇与尿皮质醇，SC与尿皮质醇之间存在显著相关性（r=0.64，P<0.001）。4SC的昼夜节律性据SC由PC扩散入唾液而形成，猜测SC如PC一样存在生理性的昼夜节律变化。事实上国内外多个研究证实，SC存在正常的生理节律，[12]且与PC的节律一致。Silver等对13例正常人进行研究，测得健康人群早晨09:00和晚上22:00-23:30的SC值，结果显示均存在正常的生理41 [13]节律变化，其中晚上22:00-23:30SC／09:00SC为5-55%。陆永仁等研究报告指出，SC一般在早晨08:00浓度最高，偶尔也在清晨04:00最高；在午夜00:00水平最低，与早晨08:00相比下降约88.7%，而血浆总皮质醇下降约77.3%。这样的结果某种程度上也说明SC比血浆总皮质醇更能反应肾上腺皮质分泌的昼夜变化。5唾液皮质醇的测定5.1唾液皮质醇的收集与处理留取唾液的受检者在标本收集前禁食禁水15-20分钟，用清水漱口，然后静息，吐去第一口唾液，将唾液收集管中的药签置于口腔中咀嚼或直接置于舌下45-60s刺激唾液分泌，静待唾液自然流入，避免混入水、血或痰等杂质。取出附着唾液的药签放到唾液采集管中，塞上管塞。该唾液标本在不影响其检测浓度的情况下5℃可储存3个月，-20℃--80℃下可储存1年，室温下可储存7天。室温下储存1个月，其检测浓度降低9.2%（95%可信区间3.8%-14.3%），冻融次数在4次以内对浓度检测没有[14]影响。唾液标本无需特殊处理，将唾液采集管按3000r/min离心10min，其中黏蛋白等杂质即吸附于脱脂棉上，离心管中产生的透明液体即待测标本，取3ml用于测定唾液皮质醇浓度。5.2唾液皮质醇的检测方法目前用于皮质醇检测的方法特异性较高，经改良后均能适用于唾液[15]皮质醇的测定。如酶联免疫测定法、放射免疫测定法（RIA）、电化学[13]发光法、荧光光度法等，但现阶段实际应用于临床的方法多为放射免疫法和电化学发光免疫法，其中最常用的是放射免疫法，一般都是以血清皮质醇RIA试剂盒经改变孵育时间或温度、抗体和示踪剂浓度、样品42 [15,16]体积等，使灵敏度处于最佳状态，再用于快速测定唾液皮质醇的浓度。现在放射免疫技术已经相当成熟，多家公司已经出品商用放射免疫试剂盒，但其测定结果均受诸多客观因素的影响如时间、PH值、温度、离子强度等以及试剂本身变异如免疫活性、特异性、浓度和比放射性等[4,5,14,17,18]。电化学发光法根据抗原抗体特异性结合的原理，顺磁固相载体和样本（抗原）与荧光标记的抗体（FLA）以最适合的方式结合在一起，注入过氧化氢和氢氧化钠溶液后，氧化反应使第一步中的磁性纳米颗粒上升到高能激发态，而还原反应又将其从激发态恢复到基态，在这个过程中多余的能量以光子的形式释放出来，用光电倍增管接受释放的光子，然后转化成样本中所要检测的皮质醇的含量。该法集高灵敏度的化学发光分析和高特异性的抗原抗体免疫法优点于一身，具有特异性高、敏感[5,19]性高、分离简便、快速、无毒、安全稳定、高度自动化的优点。5.3唾液皮质醇检测的优点唾液用于检测及诊断不仅比血清检测及诊断便宜，而且稳定性较高，还能提供血清检测中不易得到的信息。总结唾液皮质醇检测主要存在优点如下：（1）唾液皮质醇不受血清CBG波动的影响，反映的是游离皮质[20,21]醇水平，且其浓度不受唾液流速的影响。(2)标本收集采用无创性操[19]作，无刺激性，全天可多次取样，患者易于接受。（3）取样操作简便，[20]无需特殊培训可直接自行采样。（4）检测方法采用血浆皮质醇相同的[21]检测方法，常用的如电化学发光法、放射免疫法，其准确度和精确度高。总之，使用唾液皮质醇检测来监测肾上腺功能及节律变化相对血清皮质醇更为简便，不仅适用于住院病人，对门诊患者及老年、儿童等同样适[22]用。43 6唾液皮质醇在诊断库欣综合征的应用价值6.1单独应用唾液皮质醇库欣综合征发病原因众多，但无论哪种原因引起的库欣综合征其唾[9]液皮质醇的高峰及低谷值均是明显升高的，且昼夜节律消失，表现为午夜唾液皮质醇浓度升高，目前国内外多项研究选择00:00唾液皮质醇浓度[2]作为筛查库欣综合征的指标。GafniRI等用放射免疫测定法测定29名健康儿童，24名单纯肥胖患儿，和14名库欣综合征患儿的00:00唾液皮质醇水平获得结果，90%的健康儿童00:00唾液皮质醇含量低于检测限值，库欣综合征患儿的午夜唾液皮质醇均能检出，而且以7.5nmol/L作为午夜[23]唾液皮质醇的临界值，可检测出13个患儿，其灵敏度达93%。TrilckM用放射免疫法检测了150例库欣综合征（其中包含120例成人患者和30例儿童患者）、100例健康志愿者（其中包含45名成人和55名儿童）、31例单纯性肥胖儿童的每日5个时间点的唾液皮质醇后得出结论：以22:00唾液皮质醇筛查库欣综合征有较好的灵敏度和特异性。正常人群00:00唾液皮质醇水平多低于3.0-4.0nmol/L,高于此水平需[24]要进一步做生化检查排除库欣综合征可能。肥胖是一个非特异性体征，大多数肥胖患者都与库欣综合征无关，但需要与库欣综合征相鉴别，00:00[9,10]唾液皮质醇检测能很好地区别单纯性肥胖与库欣综合征。6.2唾液皮质醇与地塞米松抑制试验合用小剂量地塞米松抑制试验出现假阳性极有可能是抽血引起的应激反应。促肾上腺皮质激素分泌无法被lmg地塞米松抑制与00:00皮质醇浓度不降低可能是库欣综合征的两个独立的病生特点。那么，检测00:00唾液皮质醇浓度后立即口服lmg地塞米松后再测定次晨08:00唾液皮质44 醇浓度将增大敏感性和特异性。Castro等验证了此法的科学性，证实了其在鉴别库欣综合征与正常人群时的敏感性和特异性均达到100%，在鉴别库欣综合征与假阳性库欣综合征时的敏感性为l00％，特异性也达到了93%。因此，推荐在检测00:00唾液皮质醇后立即口服lmg地塞米松，并于次日清晨再次检测地塞米松浓度，这将有助于检测敏感性及特异性的提高。7小结国内外研究表明SC与PC存在显著的相关性，且存在昼夜的节律变化。检测唾液皮质醇是一种简便易行，成本-效益比较高的筛查技术手段，既适用于住院患者，也适用于门诊患者，尤其为儿童、老年患者提供了方便。特别适合作为了解肾上腺皮质功能和库欣综合征的一线筛查指标。45 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附录中英文单词缩写T2DMType2Diabeticmellitus2型糖尿病WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织ECLIAElectrochemiluminescenceimmunoassay电化学发光免疫分析法BMIbodymassindex体重指数FBGfastingbloodglucose空腹血糖HbA1cGlycatedhemoglobin糖化血红蛋白TCtotalcholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯HDL-Chigh-densitylipoproteincholesterol高密度脂蛋白胆固醇LDL-Clow-densitylipoproteincholesterol低密度脂蛋白胆固醇hs-CRPhigh-sensitivityC-reactiveprotein超敏C反应蛋白hcyHomocysteine同型半胱氨酸PCPlasmacortisol血浆皮质醇SCSalivarycortisol唾液皮质醇HPAhypothalamus-pituitary-adrenalaxis下丘脑-垂体-肾上腺轴CBGCorticosteroidbindingglobulin皮质类固醇结合球蛋白CSCushing’ssyndrome库欣综合征49 个人简历姓名：张晓红性别：女民族：汉出生年月：1985-11-07籍贯：四川省华蓥市教育及工作经历:2005.09-2010.07川北医学院临床医学学士2010.07-2013.05重庆市急救中心工作2013.09-2016.06川北医学院内科学（内分泌方向）硕士50