我国深圳地区HIV分子流行病学调查及优势毒株感染性克隆的制备

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分类号：：密级ＵＤＣ：编号：学位论文我国深圳地区ＨＩＶ分子流行病学调查及优势毒株感染性克隆的制备ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｎＨＩＶｒｅｖａｌｅｎｔｉｎＳｈｅｎｚｈｅｎａｎｄｐｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＣｌｏｎｅｏｆＤｏｍｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｉｎｉｎＣｈｉｎａ贾涤静指导教师姓名李林副研究员申请学位级别硕士专业名称微生物学提交论文日期２０１７／２／２８论文答辩日期２０１７／５／８学位授予单位和日期安徽医科大学答辩委员会主席何金生评阅人年月 ＡＮＨＵＩＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ颂士学位论文我国深圳地区ＨＩＶ分子流行病学调查及优势毒株感染性克隆的制备ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｎＨＩＶｒｅｖａｌｅｎｔｉｎＳｈｅｎｚｈｅｎａｎｄｐｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＣｌｏｎｅｏｆＤｏｍｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｉｎｉｎＣｈｉｎａ作者姓名：贾涤静指导教师：李林副研究员专业名称：微生物学申请学位：硕士论文工作时间：２０１５年９月至２０１７年２月２０１７年５月 目录缩略词表.......................................................................................................1摘要.............................................................................................................2Abstract.........................................................................................................5前言...............................................................................................................9第一部分深圳地区HIV分子流行病学调查研究.................................131研究背景..............................................................................................132实验材料..............................................................................................132.1研究对象........................................................................................132.2主要试剂........................................................................................142.3主要实验仪器...............................................................................142.4相关软件........................................................................................143实验方法..............................................................................................143.1RNA提取.......................................................................................153.2样本扩增........................................................................................153.3序列整理及亚型分析....................................................................213.4溯源分析........................................................................................213.5耐药分析........................................................................................213.6HCV血清学检测...........................................................................213.72013年、2015年两年深圳样本对比..........................................223.8HES感染人群中MSMs的甄别研究...........................................233.9HIV全长分析................................................................................234实验结果..............................................................................................244.1背景信息整理...............................................................................244.2PCR扩增以及序列拼接................................................................241 4.3亚型分析........................................................................................254.4溯源分析........................................................................................304.5耐药位点分析...............................................................................344.6HCV与HIV共感染......................................................................354.7深圳地区2015年与2013年HIV流行状况比较分析..............354.8HES感染人群中MSMs的甄别研究...........................................404.9URF全长分析................................................................................425讨论......................................................................................................43第二部分我国优势毒株（CRF01_AE）感染性克隆的构建................461研究背景..............................................................................................462实验材料..............................................................................................472.1实验标本........................................................................................472.2主要试剂........................................................................................472.3主要仪器设备及耗材...................................................................472.4细胞及培养基...............................................................................483实验方法..............................................................................................493.1CRF01_AE感染性克隆构建流程................................................493.2DNA的提取...................................................................................503.3半分子扩增...................................................................................513.4测序、拼接及序列分析................................................................553.5全长分子克隆的制备...................................................................553.6质粒转染及活毒参数测定...........................................................604实验结果..............................................................................................644.1半分子PCR结果..........................................................................644.2构建全长克隆...............................................................................644.3质粒转染及p24值的测定...........................................................712 4.4MT2翻毒及p24、TCID50的测定................................................724.5衍生病毒的复制动力学曲线.......................................................734.6衍生病毒的嗜性检测....................................................................745讨论......................................................................................................75参考文献.....................................................................................................78附录...........................................................................................................81致谢...........................................................................................................82综述...........................................................................................................833 缩略词表英文缩写英文全名中文译名AIDSAcquiredImmunodeficiencySyndrome获得性免疫缺陷综合征HIVHumanImmunodeficiencyVirus人类免疫缺陷病毒HCVHepatitisCvirus丙型肝炎病毒CDCCenterforDiseaseControl疾病预防控制中心CRFCirculaterecombinantform流行重组型URFUniquerecombinantform独特重组型MSMMenwhohavesexwithmen男男同性恋HESHeterosexuals异性性传播IDUIntravenousdrugusers静脉吸毒MLMaximum-likelihood最大似然法NJNeighbor-joining临接法ELISAEnzymeLinkedImmuno-sorbedAssay酶联免疫吸附实验FBSFetalBovineSerum胎牛血清PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液TCID5050%tissuecultureinfectivedose半数组织感染量ThejointUnitedNationsProgrammeonUNAIDS联合国艾滋病规划署HIV/AIDS1 摘要第一部分深圳地区HIV分子流行病学调查1992年，深圳发现首例HIV阳性感染者。随后深圳市报告的HIV/AIDS病例数呈现逐年上升趋势，年平均增长率高达24.7%；病例感染途径亦不断发生变化，由早期的IDU传播转变为以性传播为主，HIV感染呈现出从高危人群向普通人群快速扩散的态势。艾滋病的出现以及快速传播成为深圳市重要的公共卫生问题。鉴于深圳市存在大量非户籍人口，人员流动频繁、人口结构复杂，迫切需要对其进行艾滋病分子流行病学调查，以阐明其HIV流行模式。目的：对深圳地区传播的HIV进行分子流行病学调查，了解HIV流行趋势。方法：采用随机数字法挑选深圳地区2015年新确认HIV感染者作为研究对象，收集人口统计学信息；利用核酸提取试剂盒获取样本基因组，采用逆转录/巢式PCR的方法扩增HIVgag、pol基因片段，扩增片段纯化后测序并进行序列拼接；将各片段基因序列提交LosAlamosHIVDatabases，分析亚型并构建系统进化树；扩增、测定URF病毒全长序列并进行重组分析；将深圳序列与全国序列比对后构建系统进化树，进行溯源分析；pol基因序列提交斯坦福大学耐药数据库检测耐药位点；利用HCV酶联免疫试剂盒检测样本中HCV抗体存在情况；将深圳地区2015年HIV流行状况与2013年进行比较，了解深圳HIV的流行变化；采用系统进化的方法对HES感染人群中的MSMs进行甄别研究。结果：随机法获得深圳市2015年新报告HIV感染者250例，其中88.4%为男性感染者；感染者年龄以青壮年为主，其中15~29岁人群高达49.2%；96.8%感染者传播方式为性传播，其中MSM占52%。主要传播亚型为CRF01_AE，CRE07_BC，CRF55_01B，分别占31.96%，37.90%，10.50%；URF比例较高，占7.76%。获得的样本中耐药率为2.8%，HIV与HCV共感染人数仅7人（2.8%）。溯源分析发2 现深圳样本中，CRF01_AE亚型中的HESs与MSMs分别形成单独的流行簇，与全国CRF01_AE的流行簇相重合，而CRF07_BC则无明显流行簇出现。与2013年本室获得的深圳市HIV分子流行病学数据进行比较时发现15~29岁感染者在2015年明显增加，差异性统计学检验显示P＜0.05，具有统计学意义。2013年和2015年流行亚型均为CRF01_AE、CRF07_BC、CRF55_01B，各亚型所占比例无明显变化。耐药率2013年与2015年分别为0.8%和2.8%；与HCV共感染人数分别为23人（9.2%）和7人（2.8%），主要人群均集中在IDU或HES中男性人群。溯源分析中2013年与2015年差别不大，CRF07_BC不聚集成簇，CRF01_AE存在单独的MSMs流行簇和HESs流行簇。利用系统进化树分析甄别了深圳感染CRF01_AE的HES男性感染者中约有11%的人是由于男男同性性行为感染HIV。结论：深圳地区HIV主要在男性性传播人群中扩散，感染者年龄呈现年轻化趋势；HIV感染亚型分布的明显多样，URF比例高，流行状况复杂；因为特殊的社会、文化背景，深圳地区部分MSM人群在现场调查中不愿暴露其男男性行为方式。第二部分深圳地区优势HIV毒株（CRF01_AE）感染性克隆的构建1994年我国发现第一例CRF01_AE毒株后，该毒株快速传播，目前已经成为我国大部分地区的（除了西南地区）主要流行亚型。在一些省份，超过80%的新报告病例为CRF01_AE感染。由于性传播造成的感染不断增加，CRF01_AE亚型在全国HIV感染者中所占比例也不断增加。在深圳地区，CRF01_AE也是主要流行亚型之一，因此对CRF01_AE流行病学和发病机理的研究刻不容缓。感染性克隆不仅是确定特定基因生物学效应的有力工具，更是研究病毒致病基因与人体免疫反应的有效手段。因此构建CRF01_AE病毒的感染性克隆对于深入研究CRF01_AE毒株的致病机制至关重要。目的：构建CRF01_AE毒株的感染性克隆，为深入研究其致病机制奠定基础。3 方法：采用半巢式PCR方法分两段扩增CRF01_AE毒株全长基因组，将扩增产物纯化后分别连接T载体构建半分子克隆；利用AarI和XholI限制性内切酶酶切两个半分子克隆，将两个半分子片段进行连接，构建全长克隆；将获得的全长克隆转染HEK293T细胞，包装CRF01_AE感染性克隆的衍生病毒。将包装的病毒感染MT2细胞，观察细胞病变，测定获得的细胞培养上清的p24和TCID50；以p24的量为纵坐标，时间为横坐标，绘制衍生病毒在MT2上的复制动力学曲线，比较其与野生型病毒的复制能力差异；利用表达不同受体的U87细胞测定衍生病毒的嗜性。结果：经过PCR、酶切、连接、转化成功构建CRF01_AE全长克隆，获得长度13630bp的全长克隆质粒，其中病毒序列长为9702bp，具有15个独立的开放阅读框。将全长克隆质粒转染293T细胞，细胞培养上清的p24为0.375ug/ml；转染获得的衍生病毒再次感染MT2细胞，观察到明显的细胞病变，其培养上清的p24为19.1ug/ml，TCID50为15588；衍生病毒的复制动力学曲线与其野生株病毒没有明显差异，复制能力相近；利用U87测得CRF01_AE感染性克隆的衍生病毒为双嗜性病毒。结论：我们成功构建了一株完全来自野生株病毒并与其有相似复制能力的CRF01_AE感染性克隆，为研究病毒的致病机理以及疫苗研究提供了有力的工具。关键词：人类免疫缺陷病毒（HIV）分子流行病学调查CRF01_AE感染性克隆4 AbstractChapter1MolecularepidemiologicalstudyonHIVprevalentinShenzhencityThefirstHIV-positivepatientinShenzhenwasfoundin1992.Afterthat,thenumberofHIV/AIDScasesreportedinShenzhenhasincreasedyearbyyear,withanaverageannualgrowthrateof24.7%.ThedominanttransmissionroutealsochangedfromIDUintheearlytimetosexualtransmission,whichsuggestingthatHIVhasspreadoutofhigh-riskpopulationsintogeneralpopulation.TheemergenceandrapidspreadofHIVinShenzhenCityhascausedanimportantpublichealthproblem.ConsideringthefrequentflowofpeopleinShenzhen,thecomplicatedcharacteristicsofpopulationstructure,thelargenumberofpopulationnotlivingwithspouse,itisurgenttofulfillepidemiologicalsurveyonHIVprevalentinShenzhencity.OBJECTIVE:TofulfillepidemiologicalsurveyonHIVprevalentinShenzhenarea.METHODS:HIVpositivecasesnewlyreporedin2015wererandomlyselected.Thecorrespondingdemographicinformationwasinvestigatedandperipherialbloodsampleswerecollected.GenomicDNAwasextractedbyusingthenucleicacidextractionkit.HIVgag,polgenefragmentswereamplifiedbyusingnested/reversetranscriptionPCRmethod.Theamplifiedfragmentswerepurifiedandsequenced.AllofthesequencedsegmentswereassembledbyusingContigExpresssoftware.ThegenefragmentsweresubmittedtoLosAlamosHIVDatabasestoanalyzesubtypesandconstructsubtypesofMLtrees.ThefulllengthofURFviruswasamplifiedandsequenced.OursequenceswerealignedwithHIVsequencesfromthewholenationbeforeconstructingthephylogenetictreetoexploretheoriginofShenzhensequences.PolgenesequencesweresubmittedtotheStanfordUniversitydrugresistancedatabasetodetectdrugresistancesites.Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssaywasusedto5 detectHCVantibody.TheepidemicofHIVprevalenceinShenzhenin2015wascomparedwiththatin2013toexplorethetendencyofHIVprevalentinShenzhen.Phylogenetictreebasedanalysiswasusedtodetectpeopleswhowereinfectedbyhomosexualactivitybutreportedthroughheterosexualcontact.RESULT:The250newlyreportedHIV-postiveindividualswereenrolled.Amongthem,88.4%individualsweremale;theHIVpositiveparticipantsweremainlycomposedofyoungandmiddle-agedpeople.Amongthem,individualsof15~29yearsoldcomposedof49.2%oftotalpeople;96.8%individualswereinfectedthroughsexuallycontact,amongofthem,52%individualswereMSMs.ThedominantsubtypeswereCRF01_AE,CRE07_BCandCRF55_01B,accountingfor31.96%,37.90%and10.50%oftotalinfectionsrespectively.TheproportionofURFswas7.76%.Primaryresistancewasdetectedin0.046%individuals.HCVnuclicacidwasdetectedin7individuals(2.8%).Inthephylogentictrees,HIVCRF01_AEstrainsisolatedinHESsandMSMsgroupedintoseparatedclusters,whileCRF07_BCstrainsdistributedequally.Thecomparationofcharacteristicsofthoseparticipantscollectedin2015and2013showedthattheproportionof15to29-years-oldcasesin2015wassignificantlyhigherthanthatin2013(P<0.05).ThedistributionsoftheproportionofHIVsubtypesinthosetwoyeareweresimilar..Theratioesofdrugresistancewere0.9%and2.74%in2013and2015respectively.ThetotalnumbersofHCVco-infectionswere23(9.2%)and7(2.8%),respectively,whichweremainlyfoundinIDUsandHES.Nosignificantdifferencebetween2013and2015wasidentified.Approximately11%maleswhowereinfectedbyCRF01_AEstrainsandreportedtobeinfectedthroughheterosexualcontactwereinferredtobeinfectedthroughhomosexualcontactbyusingphylogenetictreeanalysis.CONCLUSION:HIVprevalentinShenzhenwasmainlyidentifiedinthemaleswhowereinfectedthroghsexuallytransmission.Furthermore,theageofHIVinfected6 peoplehasbecomeyoungerandyounger.DiversedistributionofHIVsubtypeswerefoundinShenzhenCity.HighratioofURFswasfound.HighratioofmenwhoreportedtobeinfectedbyHIVthroughheterosexualcontactwereactuallyinfectedthroughhomosexualcontact.Chapter2ConstructionofInfectiousCloneofDominantHIVstrain(CRF01_AE)inShenzhencitySincethefirstCRF01_AEinfectedcasesidentifiedin1994,CRF01_AEstrainshasspreadquicklyinthecountryandnowbecomeoneofthedominantstraininChina(exceptthesouthwesternregion).Insomeprovinces,morethan80%ofnewHIVinfectionswerecausedbyCRF01_AEstrains.DuetotherapidincreaseofHIVinfectionsthroughsexuallycontact,theproportionofCRF01_AEsubtypeswillalsoincrease.InShenzhen,CRF01_AEisalsooneofthedominantsubtypes.Hence,itisurgenttostudyontheepidemiologyandpathogenesisofCRF01_AE.Thetechnologyofinfectiousclonisnotonlyapowerfultooltodeterminethebiologicaleffectsofvirusgene,butalsoaneffectivemeanstostudythepathogenesisofHIVvirusandthehumanimmuneresponse.Therefore,itissignificanttoconstructiontheCRF01_AEinfectiousclonetostudythepathogenicitymechanismofCRF01_AE.OBJECTIVE:ToconstructiontheinfectiouscloneofCRF01_AEandfurtherstudythepathogenesisofthat.METHODS:Firstconstructionthesemi-molecularclonesusedbysemi-nestedPCRandT-vector.Second,thesemi-molecularcloneswasdigestedwithAarIandXholI,respectively.AndthetwogenefragmentswaslinkedbyT4ligasetocontructionthefull-lengthinfectiousclone.Third,thefull-lengthclonesweretransfectedintoHEK293TcellstoobtainthederivatizedvirusofCRF01_AEinfectiousclones.Then7 thederivedvirusinfectedtheMT2cell,anddeterminedthevalueofp24andTCID50usingtheculturesupernatantofMT2cell.Forth,thereplicationkineticscurveofthederivedvirusonMT2wasplottedonthebasisoftheamountofp24astheordinateandthetimeastheabscissatocomparisonofitsabilitytoreplicatewithwild-typeviruses.ThelastusingU87cellswhichexpressdifferentreceptorstodeterminethetropismofderivedviruses.RESULT:ThefulllengthclonesofCRF01_AEweresuccessfullyconstructedafterPCR,digestion,ligationandtransformation.Thelengthoftheclonewas13630bp.Thesequenceoftheviruswas9702bp,with15independentopenreadingframes.Thefull-lengthcloneplasmidwastransfectedinto293Tcells.Thep24ofcellculturesupernatantwas0.375ug/ml.ThentransfectedviruswasinfectedwithMT2cellsagain.Theobviouscytopathiceffectwasobserved.Thep24was19.1ug/ml,andthevalueofTCID50was15588.Thereplicationkineticcurveofthederivedviruswassimilarwiththatofthewildstrainvirus.Thetropismofthederivatizedvirusisdouble-tropismviruswhichwasdeterminedbyU87cell.CONCLUSION：WehavesuccessfullyconstructedaCRF01_AEinfectiousclonethatwascompletelyderivedfromwild-bornevirusesandhassimilarreplicationcapabilities.Andthecloneprovidapowerfultoolforstudyingthepathogenesisofthevirusandthestudyofthevaccine.Keywords:Molecularepidemiological/HIV/CRF01_AE/Infectiousclones8 前言人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus,HIV），即艾滋病（AIDS，[1]获得性免疫缺陷综合征）病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。HIV病毒在分类上属于逆转录病毒科、慢病毒属、灵长类慢病毒群，前病毒长约9.8k。基因组两端各含有一个结构相似的长末端重复序列（LTR），属于非编码区，是调节基因表达的重要调控序列，并且病毒需要借助LTR区整合进宿主基因组；病毒基因组的编码区至少含有9个基因，其中gag，pol，env为逆转录病毒所共有，分别编码病毒的核心蛋白、多聚蛋白以及包膜蛋白，是病毒进入宿主细胞并进行逆转录与整合必不可少的结构蛋白；其余基因编码6个附属蛋白，在HIV-1的生命周[2]期中同样具有不可或缺的重要作用。[3]1981年美国疾病预防控制中心报道了全球首例AIDS患者。艾滋病的发现使全世界感到震惊，很多科学家致力于寻找艾滋病的病原体。1983年艾滋病病毒被首次发现并成功分离。在随后的30多年的时间内，艾滋病在世界各地广泛传播，疫情在全球范围内全面爆发，造成了十分严重的危害。虽然这30多年来生物技术和抗HIV药物的研发与应用取得了长足进步，人们对HIV的了解也逐渐深入，艾滋病逐渐从致死性疾病变为可以有效控制的慢性传染病，但HIV在全球范围内的[4]蔓延并未受到有效的遏制，每年仍会有数以万计的感染者。根据2015年9月联合国艾滋病规划署（theUnitedNationsJointProgrammeonHIV/AIDS，UNAIDS）的最新报告，截至2014年底，全球HIV感染人数已达3690万（3430万-4140万），并且这个数字还在持续增加，2014年共有200万（190万-220万）新报告病例者，[5]120万AIDS相关死亡病例。我国于1985年发现首例AIDS传入病例，30多年来艾滋病在我国的流行经历了传入期、播散期和快速增长期三个阶段，全国31个[6]省、市、自治区均有病例报告。截至2014年年底，我国共报告HIV感染者50.19 万人，其中艾滋病病毒感染者29.6万人，艾滋病病人20.5万人，报告死亡人数15.9[7]万人。由于HIV病毒分子在复制过程中逆转录酶的忠实性较差，缺乏3’端到5’端外切核酸酶的校正功能，使RNA逆转录为DNA时时常出现错误，从而导致HIV具[8]有高度变异性。就基因型而言，HIV分为两型，即HIV-1、HIV-2。HIV-1和HIV-2之间的核苷酸序列同源性只有55%~60%。HIV-1致病性更强，易传播，是全球HIV[9]感染的主要流行型；而HIV-2相对传播少，主要出现在西非。目前全球广泛流行的HIV-1可分为M群、N群、O群和P群，其中M群又可分为9个亚型、88个流行重组型（CRF）以及许多独特重组型（URF），在全球范围内广泛蔓延；而N群流行于非洲喀麦隆，感染人数较少；O群主要流行于非洲中西部，大约感染数万人；P群则是最新新鉴定得到的，仅在喀麦隆两位感染者体内发现。根据我国第三次HIV分子流行病学调查显示，我国HIV-1流行的主要亚型中CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC和ThaiB亚型分别占全国总体亚型分布的[10]35.5%、27.6%、20.1%、9.6%，占HIV感染者总数的92.8%。其中CRF07_BC和CRF08_BC是由于90年代初自印度传入我国云南的C亚型毒株和几乎同时自泰[11-14]国传入云南的B（ThaiB）亚型在云南IDU人群流行过程中发生重组产生的。[13,14]CRF08_BC毒株从云南流出传入东南沿海地区，之后向北方传播，而CRF07_BC则通过毒品走私通道从云南进入四川、甘肃、宁夏、新疆，之后传入[12,14-17]东部地区然后进入MSM人群，并以此途径快速传向全国多个地区，并且这[15]两个中国重组毒株已传播到其他亚洲国家和欧美国家。1994年，在泰国遣返回中国云南的暗娼（FSW）中首次发现了CRF01_AE亚型。随后1996年到1997年之间，CRF01_AE在中国南方部分城市的吸毒人群和异性性传播人群中传播，并[18,19][20]且很快通过性传播途径进入南方大部分沿海城市。而ThaiB亚型则由于河[12,21,22][23]南省在1992至1995年期间大范围违规有偿献血早成大范围播散。近年来，CRF01_AE和ThaiB亚型形成的CRF55_01B、ThaiB和C重组的CRF57_BC10 以及CRF07_BC和CRF08_BC重组的CRF61_BC等二代重组型也在我国部分地区[4]开始流行，并且各地频繁发现独特重组型，我国的HIV流行情况十分复杂。深圳在1988年开始进行艾滋病监测工作，1992年首次发现HIV感染者，自此深圳市HIV的感染人数呈逐年上升趋势，年均上升24.7%，并且深圳也是国内[24]发现HIV-1亚型最多的城市之一。1992年至1996年之间深圳每年报告HIV最[25]新病例不足10例，2000年以后深圳每年最新报告病例达20例以上，而在2016年1-10月，深圳市共进行艾滋病病毒抗体筛查142万人次，新增艾滋病病毒（HIV）感染者及病人高达1900例。深圳市地理位置特殊，是中国最早的经济开发特区。改革开放后，深圳经济迅猛发展，大量内陆务工人员前往深圳谋生，深圳市成为[26]全国流动人口最多的城市之一。由于深圳市非户籍人口和流动人口所占比例很大，因此深圳市艾滋病疫情分布特征与我国其它地区的疫情特征有着很大的不同。在2000年以前，深圳市HIV-1的流行以CRF01_AE（52.7%）和ThaiB亚型（30.9%）[27]为主；2001-2004年在深圳市共发现B，ThaiB，C3种亚型和CRF01_AE，CRF07_BC，CRF08_BC3种重组亚型，其中CRF01_AE，CRF08_BC和ThaiB亚型为主要流行毒株，分别占45.1%、31.1%和14.8%，而CRF07_BC，B和C亚型[28]在人群中流行较少，分别仅占6.6%、1.6%和0.8%。2005年深圳市主要流行毒[29]株演变为CRF01_AE（占45.1%）、CRF08_BC(占31.1%)和B亚型（占14.8%）。2010年分析深圳市HIV-1的流行情况，发现深圳地区以CRF01_AE，ThaiB亚型CRF07_BC和CRF08_BC为主要流行亚型，分别占63.3%14.1%13.3%和7.0%，其中CRF01_AE所占的比例比国内其他地区高，并且深圳市发现的感染者和病人也大约占全部感染者的6-7成左右，还有部分“隐蔽”的感染者。就传播方式而言，深圳地区的传播方式也在不断发生变化，从早期以静脉吸毒为主转变成以性传播途径为主，到2010年，深圳地区HIV的主要传播方式则以性传播为主，静脉吸毒次之，并且MSM人群所占比例逐年增加。各类监测资料也表明：艾滋病正由吸毒、卖淫、嫖娼等高危人群向一般人群扩散。11 RNA病毒感染性克隆技术也称拯救病毒，是利用病毒感染性cDNA克隆研究RNA病毒结构和功能的一项技术，该技术实现了对RNA病毒在分子水平上的操作，为RNA病毒基因组结构和功能研究提供了有效方法。而感染性克隆则是指在细菌质粒中含有病毒全基因组的cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。1986年Adachi首次获得HIV的嵌合性感染性克隆[30]pNL4-3。随后，各亚型的感染性克隆诸如A，C，D/C，AG，AE，O相继构建[31-35]出来。此后，感染性克隆技术被广泛运用于病毒致病分子机制和机体免疫保[36]护机理的研究，以及减毒疫苗的开发。该项技术的广泛应用极大地推动了分子病毒学的发展。目前，国外构建HIV各种亚型的感染性克隆技术已经相当成熟，并广泛应用于HIV的各项研究。目前我国HIV-1流行的主要亚型有CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC和ThaiB，其中B亚型、CRF07_BC、CRF08_BC均成功[37-39]构建出感染性克隆，还缺乏有效的CRF01_AE的感染性克隆。为了解深圳复杂的HIV-1流行状况，我们首先对2015年深圳HIV进行了流行病学调查，进行亚型、耐药、溯源分析等，其次将获得的分子流行病调查数据与2013年数据相比较，研究深圳HIV流行变化情况，并首次在国内判断HES男性感染人群是否存在MSM感染者以及所占比例。同时根据深圳亚型分布状况以及我国目前感染性克隆构建现状，成功构建出CRF01_AE亚型的感染性克隆，并测定相应的生物学参数，为病毒致病机理和疫苗研究提供有力工具。12 第一部分深圳地区HIV分子流行病学调查研究1研究背景自1992年深圳市发现第一例HIV阳性感染者以来，在随后的20多年来HIV病毒在深圳迅速播散开来。从最初的每年少于10例新报告感染者，到每年超20例的新报告病例，再到2016年新报告HIV感染者及病人达1900例，HIV感染者年均增长高达24.7%，深圳市HIV疫情不断加重。而深圳地处东南沿海，独特的地理位置使深圳经济迅猛发展，大量务工人员及外来人口不断涌入深圳，流动人口居多的城市模式也使深圳HIV流行趋势不同于全国整体的流行趋势。深圳市危急的HIV传播情况以及特殊的人口分布使得对深圳市HIV进行分子流行病学研究刻不容缓。目前国内还缺乏对深圳市近几年的HIV流行状况的调查，因此本部分重点对深圳地区2015年HIV-1的基本流行现状进行了分析研究，并且综合对比2013年与2015年深圳地区HIV流行状况，探究2013年到2015年期间深圳地区HIV变化情况，同时尝试利用系统进化的方法判断HIV男性异性性传播感染者中是否存在谎报高危行为的MSM感染者。2实验材料2.1研究对象深圳市疾病预防控制中心对深圳市2015年新报告HIV感染者采用简单随机抽样的方法随机挑选获得250份样本，同时采集感染者的人口统计学信息。13 2.2主要试剂1）RNA提取试剂盒：QIAampViralRNAminiKit，QIAgen2）一步法逆转录扩增试剂盒：TaKaRaOneStepRNAPCRKit，TaKaRa3）扩增试剂盒：TaKaRaExTaq，TaKaRa4）半分子扩增试剂盒：PlatinumTaqDNAPolymerase,HighFidelity，Invitrogen5）HCV检测：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒，丽珠公司2.3主要实验仪器台式离心机，Sigma公司基因扩增仪，Biometra公司凝胶成像仪，Thermo公司DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂酶标仪，Anthos公司AW1洗板机，Anthos公司-80℃超低温保存箱，Thermo或SANYO公司2.4相关软件序列拼接：ContigExpress序列比对和校对：Muscle、BioEditHIV-1分型：REGA（http://bioafrica.net/rega-genotype/html/subtypinghiv.html），jpHMM（http://jphmm.gobics.de/submission_hiv），RIP（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/RIP/RIP.html），NCBIHIVSubtypingtoolhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）等在线分型工[40]具构建系统进化树：MEGA6.0，ATGCPhyML（http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/）等建树软件14 3实验方法3.1RNA提取将冻存于-80℃冰箱的血浆样本置于室温融化，待融化后进行基因组的提取。1)取融化后样本500μl于1.5ml离心管中，4℃24000×g离心1h，弃去300μl上清；2)配液：将Poly(A)carrierRNA溶于ElutionBuffer中，并按比例与BindingBuffer混合；无水乙醇配置InhibitorRemovalbuffer和WashBuffer；3)步骤1）完成后向含有沉淀的1.5ml离心管中加入400μl的BindingBuffer，混匀，静置10min；4)再向1.5ml离心管中加入560μl无水乙醇，斡旋15s后瞬时离心；5)将混合液转移至带有HighPureFilterCube的收集管中，8000×g离心15s；6)换新的收集管，加入500μlInhibitorRemovalbuffer，8000×g离心1min；7)换新的收集管，向离心柱中加入450μl洗液，8000×g离心1min；8)重复步骤7）；9)换新的收集管，20000×g空甩1min；10)用1.5ml离心管更换收集管，向离心柱中加50μl洗脱液，以8000×g离心1min，并将离心后液体分装并置于-80℃保存备用。3.2样本扩增以血浆样本中提取的RNA为模板，以表1.1所示的引物，用逆转录/巢式PCR的方法分别扩增HIV病毒基因组的gag，pol两个片段的基因序列；以引物pol-1.3（表1.1）扩增pol基因全长片段扩增阴性样本，基因序列为pol区短片段；以3＇half引物（表1.1）扩增gag、pol全长均为阳性样本的3’端半分子，获得全长序列。并对扩增序列进行电泳鉴定。随后扩增阳性样本纯化后送公司测序，用表1.2中所示引物进行测序，获得gag，pol以及pol短片段序列；用表1.3中所示引物测序，获得3’half端半分子序列，并与相对应的gag，pol获得序列拼接得到全长。（1）扩增及测序引物：15 表1.1HIV-1扩增引物Tab1．1AmplificationofprimersofHIV-1表1.2HIV-1gag、pol全长片段测序引物Tab1.2Sequencingprimersofgag、polgeneinHIV-116 表1.3HIV-1全长分子测序引物Tab1.3SequencingprimersofthewholesequenceofHIV-1（2）反应体系：gag、pol两个基因组片段扩增的反应体系基本相同，引物不同。gag、pol基因片段逆转录/巢式PCR第一轮扩增反应体系：试剂体积（μl）10×OneStepRNAPCRBuffer2MgCl2（25mM）4dNTPMixture（10Mmeach）2RNaseInhibitor（40U/ul）0.4AMVRTaseXL（5U/ul）0.4AMV-OptimizedTaq（5U/ul）0.4PrimerForward（20uM）0.4PrimerReverse（20uM）0.4RNAtemplate4RNaseFreedH2O6Total2017 gag、pol基因片段逆转录/巢式PCR第二轮扩增反应体系：试剂体积（μl）10×ExTaqBuffer5dNTPMixture（10Mmeach）2TaKaRaExTaq（5U/ul）0.5PrimerForward（20uM）1PrimerReverse（20uM）1Template2RNaseFreedH2O39.8Total50pol-1.3逆转录/巢式PCR第一轮反应体系：试剂体积（μl）10×OneStepRNAPCRBuffer2MgCl2（25mM）4dNTPMixture（10Mmeach）2RNaseInhibitor（40U/ul）0.4AMVRTaseXL（5U/ul）0.4AMV-OptimizedTaq（5U/ul）0.4PrimerForward（20uM）0.4PrimerReverse（20uM）0.4RNAtemplate5RNaseFreedH2O5Total20pol-1.3逆转录/巢式PCR第二轮反应体系：试剂体积（μl）10×ExTaqBuffer5dNTPMixture（10Mmeach）1TaKaRaExTaq（5U/ul）0.5PrimerForward（20uM）1PrimerReverse（20uM）1Template2RNaseFreedH2O39.5Total5018 3’half半分子逆转录/巢式PCR第一轮反应体系：试剂体积（μl）2×ReactionMix12.5TemplateRNA5PrimerForward（10uM）0.5PrimerReverse（10uM）0.5TaqMix1ddWater5.5Total253’half半分子逆转录/巢式PCR第二轮反应体系：试剂体积（μl）10×HighFidelityPCRBuffer52.5uMdNTPMix450uMMgSO42PrimerForward（10uM）1PrimerReverse（10uM）1ddWater34.8TemplateRNA2TaqHighFidelity0.2Total50（3）扩增条件：gag区基因一步法逆转录/巢式PCR扩增条件：gag第一轮gag第二轮50℃30min94℃2min94℃2min94℃30s94℃30s50℃1min3cycles55℃1min3cycles72℃2min20s72℃2min94℃20s94℃20s50℃30s32cycles55℃30s32cycles72℃2min72℃1min40s72℃10min72℃10min4℃∞4℃∞19 pol区基因一步法逆转录/巢式PCR扩增条件：pol第一轮pol第二轮50℃30min94℃2min94℃2min94℃30s94℃30s50℃1min3cycles55℃1min3cycles72℃3min30s72℃3min20s94℃20s94℃20s50℃30s32cycles55℃30s32cycles72℃3min20s72℃3min72℃10min72℃10min4℃∞4℃∞pol-1.3基因一步法逆转录/巢式PCR扩增条件：pol短片段第一轮pol短片段第二轮50℃30min94℃2min94℃2min94℃30s94℃30s55℃30s30cycles63℃30s35cycles72℃2min30s72℃2min30s72℃10min72℃10min4℃∞4℃∞3’half半分子一步法逆转录/巢式PCR扩增条件3’half第一轮3’half第二轮50℃30min94℃2min94℃2min94℃15s94℃30s55℃30s40cycles55℃30s30cycles68℃5min68℃5min68℃10min68℃10min4℃∞4℃∞20 3.3序列整理及亚型分析PCR扩增产物纯化后送北京六合华大和博迈德公司测序，测序结果利用Contig软件进行序列拼接，获得的基因序列提交HIVDatabase中的GeneCutter（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html）进行校正，校正后的序列再次提交HIVDatabase中的QualityControl（https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QC/index.html）进行序列的质量控制。校正及质控后的序列进行亚型分析，将序列提交HIVDatabase中的REGA分析亚型，不能用REGA确定其亚型的序列分别提交jPHMM、RIP、NCBISubtyping确定其亚型或重组型；随后不同的基因片段序列分别与中国流行亚型的标准参考序列进行比对，构建亚型的系统进化树，并与在线亚型分析软件得到的结果相互印证，最终获得样本的确定亚型，判断出深圳地区主要的流行亚型。3.4溯源分析在HIVDatabase中下载中国所有的gag、pol基因的全部序列，与深圳获得序列进行Muscle比对，然后利用Mega构建bootstrap值为500的NJ树，从树中挑选出与深圳序列相近的全国其他序列，挑选出的序列再利用Mega做bootstrap值为1000的NJ树，判断深圳地区HIV在全国的的流行分布状况。3.5耐药分析将扩增测序获得的所有pol基因序列拼接校对后提交美国斯坦福大学的网络HIV耐药数据库（http://hivdb.stanford.edu/hiv/），利用数据库提供的在线分析软件进行耐药突变位点的筛选以及对各种抗病毒药物的耐受程度。3.6HCV血清学检测利用酶联免疫法检测深圳HIV感染者待测样本血浆中HCV感染状况，判断是否存在HIV与HCV的合并感染。1）加样：将所需要数量的板条固定于支架，每次实验设空白孔1个，阳性对照2个、阴性对照3个并分别加入阳性、阴性对照各100ul，其余孔加入100ul样品稀释液，再加入10μl待测样品，震荡混匀；21 2）温育：随后将待测样品置于37℃±1℃温育60min；3）洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗涤液注满各孔，静置30~60s，弃去孔内洗液。重复洗6次后拍干；4）加酶：空白对照孔不加酶标记物，其余孔加入100μl酶标记物；5）温育：将孔板置于37℃±1℃温育30min；6）洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗涤液注满各孔，静置30~60s，弃去孔内洗液。重复洗6次后拍干；7）显色：每孔加入底物缓冲液50ul，再加入底物液50μl，震荡混匀，置于37℃±1℃温育30min；8）终止：每孔加入终止液50μl，轻拍混匀；9）读值：用酶标仪读值，在单波长450nm（须以空白对照孔较零）或双波长450nm/620nm~700nm下读取各孔A值；参考值：1）空白孔A值应＜0.08（空白较零前）2）阴性对照A值应≤0.123）阳性对照A值应≥0.54）临界值（C.O.）=阴性对照平均A值+0.12（备注：阴性对照平均A值若小于0.05则按0.05计算，若大于0.05按实际值计算）样品A值≥临界值（C.O.）为HCV抗体阳性样品A值＜临界值（C.O.）为HCV抗体阴性3.72013年、2015年两年深圳样本对比2013年与2015年深圳市均对该年新报告感染者进行了随机抽样获得250份样本，本文就这两年样本的人口统计学信息、亚型分布、溯源分析、耐药位点以及HCV共感染进行了比较分析，以判断HIV在这三年中深圳HIV流行感染的变化情况。22 3.8HES感染人群中MSMs的甄别研究利用系统进化的方法分析深圳地区HES人群中男性是否隐藏有MSM感染者[41]的情况，具体实验方法如下：1）为获得充足的实验样本，将2013年和2015年深圳样本合并使用，挑选出亚型数量较多的pol基因片段；2）将序列比对并手工校对；3）校对好的序列进行序列见两两基因距离的检测，并且两两之间基因距离必须大于95.5%，删除不符合要求的序列；4）利用最大似然法构建系统进化树，采用模型为GTR+CAT（GeneralTimeReversiblemodelofnucleotidesubstitutionsandvaryingsubstitutionratesacrosssites）；5）确定成簇情况，成簇条件：a每一簇至少有两条序列，b最大基因距离4.5%以内，c支的可信值95%以上，d每一簇时间跨度少于5年，e每一簇只有一个异性性传播；6）首先分别统计异性性传播人群中男女人数（a和b），其次统计成簇样本中男女人数（c和d），然后比较a/c和b/d，（a/c-b/d）为HESs中MSM所占比例。3.9HIV全长分析深圳地区2015年250份样本中获得的全长序列进行亚型分析，不能确定其正确亚型的将其全长提交HIVDatabases的jPHMM进行断点分析；根据断点将全长序列分割为不同长度的目的片段，随后对不同目的片段分别进行BLAST；同时寻找在相同断点位置与目的片段亚型相同的CRF亚型，与BLAST结果和目的片段一起构建bootstrap值为1000的NJ树，判断目的片段亚型，从而确定该条序列的重组亚型。23 4实验结果4.1背景信息整理随机挑选获得2015年深圳新报告HIV感染250份样本，整理相应的人口统计学信息，将获得信息分性别，年龄和传播方式进行整理并汇总，结果见表1.4。表1.4深圳2015年样本背景信息Tab1.4BackgroundInformationofShenzhensamplein2015人数/个所占百分比/%性别男22188.4%女2911.6%年龄2~1400%15~2912349.2%30~448534.0%45~593112.4%≥60114.4%传播方式异性11244.8%同性13052.0%IDU41.6%血液10.4%unknown31.2%深圳2015年随机选取的250份样本中，男性人数居多，占总人数的88.4%；年龄构成上，主要感染人群集中在15~44岁，占总人数的83.2%，其中49.2%的新报告感染者为15~29岁的青少年；从传播方式上看，性传播是深圳地区艾滋病蔓延的主要方式，性传播人群占总人群的96.8%，52%的为MSM人群，44.8%的为HES人群，MSM人群数量多于HES人群。4.2PCR扩增以及序列拼接对250份样本进行基因组提取、PCR扩增以及测序，拼接获得gag区序列153条，pol区序列73条，pol短片段序列144条，全长序列10条。并将获得的序列24 提交HIVDatabases的GeneCuttrer和QulityControl对序列进行校对和质控。对序列进行整理共有219人获得序列，其它样本可能由于样本运输或储存不当，并未获得序列。4.3亚型分析我们将获得的基因序列提交HIVDatabase中REGA进行分型，同时使用其它在线软件确认REGA分型结果，随后采用最大似然法构建系统进化树。具体亚型分布详情见表1.5。从表1.5中我们可以看出深圳地区主要流行亚型是CRF01_AE、CRF07_BC和CRF55_01B，分别占核酸阳性样本数的31.96%、37.90%、10.50%；三种亚型占总流行亚型80.36%；7.76%的亚型为URF，深圳地区URF发现比例较高；并且深圳地区亚型分布状况复杂，流行重组型种类较多。随后将获得的亚型分布情况与相应的人口统计学信息综合分析（表1.6）发现HIV感染者主要集中在性传播人群中，HES人群与MSM人群之间的亚型分布状况相差不大，主要是CRF01_AE、CRF07_BC和CRF55_01B；极少量IDU人群中只有CRF07_BC亚型；并且URF只在性传播人群中发现。25 表1.52015深圳获得序列亚型分布Tab1.5ThesubtypeofShenzhensampleCRF01_AEBCCRF07_BCCRF08_BCCRF55_01BCRF59_01BCRF68_01BURFTOTAL数量70151836233117219百分比31.96%6.85%0.46%37.90%2.74%10.50%1.37%0.46%7.76%100.00%表1.62015深圳地区不同传播方式的亚型分布Tab1.6SubtypedistributionindifferentpropagationmodeofShenzhensampleCRF01_AEBCCRF07_BCCRF08_BCCRF55_01BCRF59_01BCRF68_01BURFTOTALHES387355936103MSM31844114111110IDU33NO111326 图1.1、图1.2、图1.3中的图A分别是2015年深圳样本中获得的gag、pol、pol短片段基因与中国主要流行亚型的标准参考序列的对应片段比对后构建的ML亚型树。从树中也可以发现深圳地区的主要流行亚型是CRF01_AE、CRF07_BC和CRF55_01B，并且URF也多出现于这几簇中。图1.1gag区序列与标准参考序列构建的亚型树Fig1.1Thesubtypeofgaggene图A是2015年样本gag区序列构建的ML树，图B是2013年样本gag区序列构建的ML树，均以O亚型为outgroup，碱基替换模型是GTR。图中不同颜色代表不同亚型，其中红色代表CRF07_BC，黄色代表CRF08_BC，天蓝色代表B亚型，蓝色代表CRF01_AE，绿色代表CRF55_01B，紫色代表CRF59_01B，深绿色代表CRF68_01B，深紫色代表CRF67_01B灰色代表C亚型，红棕色则为URF，黑色代表参考序列。27 图1.2pol区序列与标准参考序列构建的亚型树Fig1.2Thesubtypeofpolgene图A是2015年样本pol区序列构建的ML树，图B是2013年样本pol区序列构建的ML树，均以O亚型为outgroup，碱基替换模型是GTR。图中不同颜色代表不同亚型，其中红色代表CRF07_BC，黄色代表CRF08_BC，天蓝色代表B亚型，蓝色代表CRF01_AE，绿色代表CRF55_01B，紫色代表CRF59_01B，深绿色代表CRF68_01B，深紫色代表CRF67_01B灰色代表C亚型，红棕色则为URF，黑色代表参考序列。28 图1.3pol短片段基因与标准参考序列构建的亚型树Fig1.3Thesubtypeofpol-shortgene图A是2015年样本pol区短片段构建的ML树，图B是2013年样本pol区短片段构建的ML树，均以O亚型为outgroup，碱基替换模型是GTR。图中不同颜色代表不同亚型，其中红色代表CRF07_BC，黄色代表CRF08_BC，天蓝色代表B亚型，蓝色代表CRF01_AE，绿色代表CRF55_01B，紫色代表CRF59_01B，深绿色代表CRF68_01B，深紫色代表CRF67_01B灰色代表C亚型，红棕色则为URF，黑色代表参考序列。29 4.4溯源分析我们分别选取了CRF01_AE和CRF07_BC的gag，pol基因片段分别与相应的全国序列构建NJ树，利用bootstrap值（500）确定进化树拓扑结构稳定性；随后挑选出深圳序列进化关系相近的参考序列重新构建系统进化树，使用bootstrap值为1000验证进化树拓扑结构稳定性。我们发现深圳地区CRF01_AE在全国序列构建的系统进化树（图1.5B）中深圳地区序列没有单独成簇，与全国相应高危人群聚集成簇，gag区序列可分为三簇，cluster1以HES人群为主，cluster2中HES和MSM均有出现，cluster3以MSM人群为主。在pol区序列中（图1.6B），相对应的具有以HES人群为主的cluster1，具有HES与MSM的cluster2和以MSM人群为主的cluster3；并且在图1.6B中还存在另一个以HES人群为主的cluster4。在CRF07_BC亚型中gag和pol区序列构建的NJ树中（图1.7B和图1.8B）并没有单独成簇情况，均匀的散布在全国CRF07_BC性传播人群中。30 图1.4CRF01_AEgag区溯源图Fig1.4TraceabilityofCRF01_AEgaggene图A为2013年获得的深圳地区CRF01_AEgag区溯源图，图中蓝色圆形图标代表深圳序列；图B是2015年获得的深圳地区序列CRF01_AEgag区溯源图，图中红色圆形图标代表深圳序列；图C则为2013年、2015年两年序列合并后CRF01_AEgag区溯源图，图中蓝色圆形图标为2013年序列，红色圆形图标为2015年序列。图A、B、C三个树均为bootstrap值为1000的NJ树。31 图1.5CRF01_AEpol区基因片段溯源图Fig1.5TraceabilityofCRF01_AEpolgene图A为2013年获得的深圳地区CRF01_AEpol区溯源图，图中蓝色圆形图标代表深圳序列；图B是2015年获得的深圳地区序列CRF01_AEpol区溯源图，图中红色圆形图标代表深圳序列；图C则为2013年、2015年两年序列合并后CRF01_AEpol区溯源图，图中蓝色圆形图标为2013年序列，红色圆形图标为2015年序列。图A、B、C三个树均为bootstrap值为1000的NJ树。32 图1.6CRF07_BCgag区短片段溯源图Fig1.6TraceabilityofCRF07_BCgaggene图A为2013年获得的深圳地区CRF07_BCgag区溯源图，图中蓝色圆形图标代表深圳序列；图B是2015年获得的深圳地区序列CRF07_BCgag区溯源图，图中红色圆形图标代表深圳序列；图C则为2013年、2015年两年序列合并后CRF07_BCgag区溯源图，图中蓝色圆形图标为2013年序列，红色圆形图标为2015年序列。图A、B、C三个树均为bootstrap值为1000的NJ树。33 图1.7CRF07_BCpol区短片段溯源图Fig1.7TraceabilityofCRF07_BCpolgene图A为2013年获得的深圳地区CRF07_BCpol区溯源图，图中蓝色圆形图标代表深圳序列；图B是2015年获得的深圳地区序列CRF07_BCpol区溯源图，图中红色圆形图标代表深圳序列；图C则为2013年、2015年两年序列合并后CRF07_BCpol区溯源图，图中蓝色圆形图标为2013年序列，红色圆形图标为2015年序列。图A、B、C三个树均为bootstrap值为1000的NJ树。4.5耐药位点分析我们将得到的所有pol区基因序列提交斯坦福大学耐药数据库，获得提交序列的耐药位点（表1.7）。其中核苷类逆转录酶抑制剂耐药位点有L74I和V75M，非核苷类逆转录酶抑制剂耐药位点有K101E和L100I，蛋白酶抑制剂耐药位点有F53L、N83D和V82ILV，并且均为单一耐药位点，其中V82ILV为主要蛋白酶抑34 制剂耐药位点，对蛋白酶抑制剂低度耐药。2015年深圳HIV新报告病例中耐药率仅有2.8%。表1.72015深圳耐药位点汇总Tab1.7ResistantsitesinShenzhensequencesNRTINNRTIPISequenceIDSDRMsSDRMsSDRMs14003K101E14037V82ILV14084F53L14139L100I14146N83D14173L74I14179V75M4.6HCV与HIV共感染利用酶联免疫的方法检测获得的250份样本中HCV感染情况。我们发现250份样本中HCV抗体阳性样本为7例，说明这些个体体内HCV病毒依然处于复制状态。这7例阳性患者中有6人为男性，平均年龄为33岁，主要传播方式为IDU（5例）和HES（2例），其中获得HIV亚型的有5例，四例均为CRF07_BC。表1.8HCV阳性人群信息Tab1.8ThebackgroungofHCVpositivesample标号性别年龄传播方式亚型14033男37IDUCRF07_BC14038男37HESCRF07_BC14132女29HESCRF01_AE14159男27IDUCRF07_BC14210男46IDU14214男27HES14233男29IDUCRF07_BC4.7深圳地区2015年与2013年HIV流行状况比较分析深圳地区在2013年与2015年均随机挑选该年新报告感染者各250份样本，分别获取相应的人口统计学信息并汇总整理。为了分析深圳地区HIV流行状况的变化，我们将获得的2015年数据与2013年数据进行比较分析。35 1）人口统计学差异比较比较2015年和2013年深圳地区HIV感染者在性别、年龄和传播方式上的差异（见表1.8）。结果显示，2015年深圳地区的HIV感染者在性别分布上与2013年并无明显差异，均以男性感染者为主（88.4%vs88.4%）。在年龄组成上，2015年与2013年的感染人群均以15~44岁的青壮年为主（分别占到了83.2%vs86.0%），但两年中感染者15~44岁间分布存在一定的差异。2013年，HIV感染者中30~44年龄段人数明显高于15~29的年龄段人数，而在2015年，15~30的年龄段感染人数明显高于30~44年龄段感染人数；统计学分析显示，两年中HIV感染者在15~292岁的感染人数分布存在明显差异（X检验，P＜0.05）。在传播方式的构成上，2013年和2015年深圳地区主要传播方式均为性传播（93.6%vs96.8%），但2015年MSM人群较2013年有很所增加。表1.92013年、2015年深圳样本背景信息比较Tab1.9Comparethebackgroundbetween2013and20152013深圳2015深圳（人数/百分比）（人数/百分比）性别男222/88.8%221/88.4%女27/10.8%29/11.6%unknown1/0.4%0/0年龄2~140015~2978/31.2%123/49.2%30~44137/54.8%85/34%45~5926/10.4%31/12.4%≥608/3.2%11/4.4%unknown1/0.4%0传播方式异性133/53.2%112/44.8%同性101/40.4%130/52%IDU12/4.8%4/1.6%血液1/0.4%1/0.4%unknown3/1.2%3/1.2%2）亚型分布比较36 2013年和2015年获得的样本的亚型整理汇总，对同种亚型在不同年份所占比例进行比较，详情见表1.9。同时分别构建不同年份序列的亚型树，进行比较分析，见图1.1、1.2、1.3。表1.102013年、2015年深圳地区亚型分布比较Tab1.10Comparethesubtypebetween2013and201501_AEA1BC07_BC08_BC55_01B59_01B67_01BCRF68_01BDURFTOTAL2013年样本78213277922111152212015年样本70151836233117219结合图和表我们发现2013年和2015年深圳地区亚型分布没有太大差异，CRF01_AE、CRF07_BC和CRF55_01B为主要流行亚型；同样深圳地区在这两年都存在较高比例的URF，亚型分布状况复杂。3）溯源分析我们分别对2013年和2015年CRF01_AE以及CRF07_BC亚型进行了溯源分析。在以gag构建的系统进化树中（图1.5和图1.7），2013年和2015年CRF01_AE构建的进化树（图1.5）均可以看到明显的流行簇，cluster1为HES人群为主，cluster2是HES和MSM相互混杂，cluster3以MSM人群为主；2013年和2015年CRF07_BC构建的进化树（图1.7）中没有明显的流行簇的形成，可能是由于进化时间较短或者传播人群为散发传播，不能形成流行簇。在以pol构建的系统进化树中（图1.6和图1.8），2013年和2015年CRF01_AE构建的系统进化树（图1.6）可以分为4簇，cluster1-cluster3分别对应相应gag区基因片段构建的系统进化树中的分簇情况，而cluster4簇则是以HES人群为主的流行簇；在gag区基因片段构建的树中没有出现cluster4可能是由于gag区基因样本量较少的缘故。同样，CRF07_BCpol区基因片段构建的系统进化树（图1.8）没有流行簇的形成。我们以样本量较多的CRF01_AEpol区基因片段构建的系统进化树为例，分别统计了各簇中样本数量以及所占比例（表1.10）。37 表1.11CRF01_AEpol基因系统进化树各簇比例Tab1.11ComparetheproportionindifferentclusterCluster1（n/%）Cluster2（n/%）Cluster3（n/%）Cluster4（n/%）TOTAL（n/%）20134/6.15%16/24.62%30/46.15%6/9.23%65/100%20155/7.94%9/14.29%36/57.14%9/14.29%63/100%从表中发现，cluster4中在2015年比例有所增加，与2015年MSM人群增加趋势相符。而总HES人群（cluster1和cluster4）2015年较2013年也有所增加，但HES与MSM的混合簇人群有所下降。4）耐药位点比较将2013年和2015年pol区序列提交斯坦福大学耐药数据库进行耐药位点检测，详情见表1.11。从表中可以得出，2013年和2015年未用药人群均存在较少的耐药位点（0.4%vs2.8%），并且均为单一耐药位点，只在2015年的深圳序列中出现一例蛋白酶抑制剂主要耐药位点，所以深圳地区原发耐药率低。表1.12深圳两批耐药位点比较Tab1.12ComparetheResistantsitesbetween2013and2015NNRTISequenceIDNRTISDRMsPISDRMsSDRMs7137L76V2013年样本7142L41I14003K101E14037V82ILV14084F53L2015年样本14139L100I14146N83D14173L74I14179V75M38 表1.12是深圳序列中出现耐药位点人群的人口统计学信息，从表中可以看出耐药位点主要出现在异性性传播中的男性人群中，出现耐药位点的序列系统进化树中也没有单独成簇的现象出现。表1.13产生耐药突变的人群信息Tab1.13BackgroundofResistantsitessample编号性别年龄传播方式亚型7137男HESCRF01_AE7142男HESCRF01_AE14003女HESB14037男MSMCRF01_AE14084男HESCRF59_01B14139女HESCRF01_AE14146男HESCRF07_BC14173男MSMCRF01_AE14179男HESCRF01_AE5）HIV与HCV共感染比较对2013年和2015年共500份样本进行HCVELASA检测，检出2013年HCV阳性患者23人（表1.12），2015年HCV阳性患者7人（表1.8）。对比表1.8和表1.12，我们发现HCV阳性患者绝大部分为为男性（85.7%vs73.9%），其中2015年HCV阳性患者中IDU人群占主要（5/7），2013年则是IDU（8/23）和HES（12/23）为主，并且两年HCV感染者的平均年龄并无太大变化，2013年为34.8岁，2015年为33.1岁，但2015年HCV阳性率（2.8%）远远低于2013年HCV阳性率（9.2%）。39 表1.142013深圳HCV抗体阳性人群信息Tab1.14BackgroundofHCVpositivesample标号性别年龄传播方式亚型7025男32IDUCRF07_BC7037女29HESCRF01_AE7047女39HESCRF08_BC7050男44HESD7062男33BloodB7067男49HESB7072男34HESCRF07_BC7076男24HESCRF07_BC7081男31HESCRF07_BC7090男35IDUCRF08_BC7091女43HESCRF07_BC7104男25MSMCRF55_01B7116男45IDUCRF55_01B7123男31IDUCRF01_AE7128男40IDUCRF08_BC7154男48HESB7158男28HES7206女29HESCRF08_BC7222女25HESCRF01_AE7225男44IDU7236男33IDU7243男25MSMCRF01_AE7248男36IDU4.8HES感染人群中MSMs的甄别研究由于中国文化和社会因素的影响，中国的MSMs在进行现场调查中往往不愿暴露其同性性取向，而导致调查信息出现偏差。研究显示，很多MSMs在现场调查中往往将其性行为信息提供为异性性行为，从而造成异性性行为传播HIV的比例增加。有效甄别异性性传播人群中经同性性行为感染HIV的人数比例，对于评估深圳地区MSMs中HIV的流行率，制定有效的干预措施至关重要。在本部分研究中，我们利用系统进化方法对其进行推断。深圳地区两年序列中CRF01_AE和CRF07_BC数量较多，挑选这两种亚型进行异性性传播中男性人群传播方式的误40 判研究。但由于CRF07_BC中获得的女性样本极少，难以进行统计，结果并不准确，所以只选取了CRF01_AE的结果。深圳2013年和2015年所有样本中pol短片段共有409条，其中CRF01_AE有131条，这131人中有78人（男47人，女24人）是异性性传播；符合成簇条件的有8簇21人，这21人包括男7人，女1人，详情见表1.13。表1.15异性应传播人群与成簇异性性传播人群Tab1.15HESsandHESsinthecluster男女TOTALAllheterosexuals472471Linkedheterosexuals718成簇异性性传播男性占全部异性性传播男性的比例为15%（7/47），成簇异性性传播女性占全部异性性传播女性的比例为4%（1/24），中间相差11%。异性性传播是指男女之间有危险性行为，所以成簇异性性传播中男/女占全部异性性传播男/女比例应相近。但深圳地区CRF01_AE亚型男女比例之间相差11%，所以深圳地区CRF01_AE亚型异性性传播的男性人群中有大约11%的人不是异性性传播（见图1.9）。15%4%11%图1.8误判比例柱状图Fig1.8Histogram41 横坐标代表性别，纵坐标代表人数（个），灰色代表成簇人数所占比例。4.9URF全长分析我们共获得的10条全长序列，经过亚型分析其中包括三条CRF01_AE，三条CRF07_BC，一条B亚型，三条URF。选取其中两条URF进行jPHMM断点分析（图1.10），每个UFR全长均可以切割为5个目的片段，然后分片段构建NJ树（图1.11），判断不同片段来源。最终判定两条URF分别是CRF55_01B与C亚型、CRF07_BC与CRF01_AE的二代重组，发表SCI论文一篇。图1.9URF全长断点图Fig1.9BreakpointinURFwholesequences42 图1.10目的片段溯源分析Fig1.0Traceabilityofdifferentfragment根据断点，每个全长分成了5个片段，Ⅰ为URF-1的5个片段构建NJ树，Ⅱ为URF-2的5个片段构建的NJ树；树中黑色圆形图标为目的片段5讨论改革开放后，深圳经济快速发展，大量务工人员涌入深圳，使深圳成为我国人口最多的城市之一。由于人口激增，出现各种社会问题，深圳HIV感染人数则逐年增加。通过调查发现2013-2015年深圳地区HIV新报告感染者以男性为主，传播途径主要是性传播，MSM人群不断增加；主要流行亚型为CRF01_AE，CRF07_BC和CRF55_01B，其中CRF01_AE和CRF07_BC在这两年中所占比例有轻微浮动，但仍是深圳地区新报告感染者中的最主要感染亚型，而在深圳本地形成的CRF55_01B重组株已成为深圳另一主要传播亚型，新报告感染者中所占比例超过10%，并且这三种亚型主要在深圳性传播人群中播散。同样性传播人群中的CRF01_AE，CRF07_BC和CRF55_01B也成为URF重组产生主要“来源”。经溯源分析发现深圳HES人群和MSM人群中CRF01_AE可单独成簇，在我国CRF01_AE43 分簇中找到；深圳CRF07_BC则散布在全国性传播CRF07_BC中，可能由于进化时间较短，没有明显的流行簇产生。值得注意的是深圳新报告感染者年龄在逐渐年轻化，从表1.8中2015年感染人群的年龄比例较2013年也有很大的改变，15~29岁之间的感染者人数在2015年急剧增加，已将近采样人群的一半，HIV-1已经开始学生群体之间播散，这提示我们需要对青少年加大宣传和教育。深圳地区HIV流行早期主要感染人群主要IDU人群，到2010年，深圳地区HIV的主要传播方式变为性传播为主，IDU次之的传播模式。HIV进入性传播人群后，开始从高危人群向一般人群蔓延。在我们调查的2015年新报告感染者中，IDU人群比例仅占1.6%，而性传播人群比例不断增加，从2013年93.6%的增长为2015年96.8%，并且深圳地区流行的亚型基本上均可以在性传播人群中找到，而且URF只在性传播人群中发现。性传播人群不仅成为各种人群相互“联系”的纽带，也成为各种病毒相互“交流”的桥梁。各种亚型的病毒在性传播人群中不断重组进化，有不断经性传播人群播散开来。在溯源分析中，我们发现CRF07_BC亚型在两年中均未发现成簇情况，而CRF01_AE亚型则形成明显的流行簇。2015年样本CRF01_AE溯源分析中，CRF01_AE可以分为4簇，分别是HES人群为主、MSM人群为主以及HES人群和MSM人群共同组成的cluster1、cluster2、cluster3，分别是全国分簇的cluster1、cluster5和cluster4a，而只在pol区基因片段中出现的以HES人群为主的cluster4在全国CRF01_AE分簇中属于cluster2。同样的在2013年形成了3个流行簇，但是MSM人群在2013年并未单独成簇，可能是由于CRF01_AE进入MSM人群时间较短或样本量不足造成的。根据溯源分析的结果我们可以推断出CRF01_AE有性传播进入深圳后，首先在异性性传播人群中播散，由于部分双性恋的存在，毒株借此进入同性恋人群，进一步扩散开来。并且近年来，深圳地区MSM人群不断增长，也促使了深圳地区HIV疫情的加重。其次，深圳地区CRF01_AE亚型形成的4个流行簇与我国CRF01_AE的分簇可一一对应，说明深圳地区感染CRF01_AE44 亚型的人群与全国人群之间存在“交流”，推断出深圳地区新报告感染者中流动人口占据一部分比例，符合深圳地区流动人口居多的人口现状。在我国历年报告病例中经男性同性和异性性传播的构成比均呈逐年上升趋势。每年新报告病例中，经性传播所占比例从2006年的33.1%上升到2014年的92.2%，其中男性同性性传播比例从2006年的2.5%上升到2014年的25.8%。而由于文化和社会因素，HIV感染者中部分MSM感染者会隐瞒自身感染方式，这就造成了我们在进行分子流行病学调查时人口统计学信息整理上的偏差，真实的MSM人群比例要远高于调查获得的比例。在本文研究中，我们首次在国内尝试利用系统进化的方法来对异性性传播男性人群中是否存在隐藏的同性传播人群进行甄别。我们发现在深圳经异性性传播的CRF01_AE男性感染者中，有11%的人是MSM感染，而我们得到的11%的数据只是居于2013年和2015年新报告感染随机挑选获得的样本。并且我国CRF01_AE主要传播人群为性传播人群，在其它地区这种MSM感染者谎报感染方式的比例可能会更高。45 第二部分我国优势毒株（CRF01_AE）感染性克隆的构建1研究背景在2014年，我国HIV新报告感染者约有91.5%是由于性传播造成的，毫无疑问，我国目前正面临着由于性传播造成的的HIV快速传播。而在中国，性传播主要的传播亚型为CRF01_AE。1994年我国发现了第一例CRF01_AE病例后，CRF01_AE在中国南方部分城市的吸毒人群和异性性传播人群中快速传播，并通过性传播途径进入南方大部分沿海城市，CRF01_AE成为中国大部分地区（除了西南地区）主要流行亚型，在一些省份，超过80%的新报告感染是CRF01_AE亚型。性传播造成的新报告感染不断增加，CRF01_AE亚型在整个国家HIV感染者中所占比例也在不断增加。并且我国流行的CRF01_AE比其它地区流行的CRF01_AE毒力更强，因此对我国流行CRF01_AE进行流行病学和发病机理的研究刻不容缓。感染性克隆不仅仅是确定基因的特定生物学效应的有力工具，更是研究病毒致病基因与人体免疫反应的有效手段。因此亟待成功构建出来自我国本地流行的CRF01_AE感染性克隆。在第一部分我们对深圳地区2015年进行了HIV-1分子流行病学调查，CRF01_AE是深圳地区主要流行亚型。我们实验室成功研究了ThaiB亚型毒株的感染性克隆，有良好的实验基础。并且针对CRF01_AE亚型的感染性克隆至今未见报道。在本研究中，我们成功构建了一株CRF01_AE病毒的感染性克隆，并分析了其相应的生物学特征，为CRF01_AE毒株的流行、病原学及疫苗研究奠定了基础。46 2实验材料2.1实验标本临床分离株GX002感染的MT2细胞2.2主要试剂1）DNA提取试剂盒：QIAampDNAMiniKit，QIAgen2）半分子扩增试剂：PrimeSTARHSDNAPolymerase，TaKaRaPlatinumTaqDNAPolymerase,HighFidelity，Invitrogen3）质粒构建：pEASY-T1CloningKit，全式金4）转化：Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell，全式金TransSTBl3ChemicallyCompetentCell，全式金5）连接：pEASY-T1CloningKit，全式金T4DNA连接酶，NewEnglandBiolabs6）质粒提取：WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystems，PromegaPureYield?PlasmidMiniprepSystem，Promega7）酶切：AarI，ThermoFisherScientificXhoI，Takara8）转染：Lipofectamine®2000，invitrogen9）荧光检测：Bright-GloTMLuciferaseAssaySystem，Promega2.3主要仪器设备及耗材1）基因扩增仪，Biometra公司2）电泳仪，北京市六一仪器厂3）凝胶成像仪，Thermo公司4）离心机，Sigma公司47 5）不同量程的微量移液器，Eppendorf公司6）紫外分光光度计，Eppendorf公司7）全温震荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司8）电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司9）水浴锅，北京方通达科技有限公司10）生物安全柜，NUAIRE公司11）CO2恒温培养箱，SANYO公司12）显微镜，Olympus公司13）10ml刻度移液管，GreinerBio-One公司14）15ml和50ml离心管，GreinerBio-One公司15）25cm2和75cm2细胞培养瓶，GreinerBio-One公司16）6孔、96孔细胞培养板，GreinerBio-One公司17）96孔化合物稀释板，GreinerBio-One公司2.4细胞及培养基㈠细胞1）人胚肾传代细胞系（HEK293T细胞系），实验室自存2）MT2细胞，实验室自存3）TZM-b1，实验室自存4）U87细胞，实验室自存㈡培养基1）不含抗生素的LB液体培养基：10g的Typtone，5g的YEASTEXTRACT和10g的NaCl加入一定体积的去离子水，再用5MNaOH将pH值调至7.0，加水定容至1L。高温高压灭菌，并于4℃保存备用。48 2）含抗生素的LB液体培养基：10g的Typtone，5g的YEASTEXTRACT和10g的NaCl加入一定的去离子水，用5MNaOH将pH值调至7.0，加水定容至1L。高温高压灭菌，温冷却至50℃~60℃时加入1ml的Ampicillin（100mg/ml），然后4℃保存。3）含抗生素的LB固体培养基（1L配制体系）：10g的Typtone，5g的YEASTEXTRACT，10g的NaCl和15g琼脂糖加入一定量去离子水，用5MNaOH将pH值调至7.0，加水定容至1L，高温高压灭菌，室温冷却至50℃~60℃时，加入1mlAmpicillin（100mg/ml）后混合均匀，倒入培养皿中铺制平板，密封后于4℃保存。4）DMEM（Gibco,CatNo:C11995500BT）：加入10%胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。5）无酚红DMEM（Gibco,21063-029）：加入10%FBS，不加抗生素，转染以及测定TZM-b1细胞化学发光值（relativeluminescenceunits，RLU）6）RPMI1640培养基（Gibco,11875-093）：加入10%FBS、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素7）U87细胞系培养基：DMEM（Gibco,CatNo:C11995500BT）中加入10%FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、300ug/mlG418以及1μlg/ml嘌呤霉素。3实验方法3.1CRF01_AE感染性克隆构建流程如图2.1所示，以PCR产物为模板，首先构建半分子克隆质粒，在经过酶切连接，得到CRF01_AE全长分子克隆质粒。49 图2.1CRF01_AE感染性克隆制备流程图Fig2.1ProcessofconstructCRF01_AEinfectiousclone3.2DNA的提取以临床分离株GX002感染MT2细胞的细胞混悬液为样本，提取病毒DNA。1）配液：取95%的酒精配制AW1和AW2；2）取20ul配置好的蛋白酶K置于离心管，随后加入200μl培养的细胞混悬液，然后加入200ulBufferAL，斡旋15s；3）将完成步骤2的离心管56℃水浴10min，然后瞬时离心；50 4）向离心管中加入200μl无水酒精，斡旋15s，然后离心5）将离心管中液体转移至离心柱，静置1min，然后6000×g离心1min6）更换收集管，向离心柱中加入500ulAW1，6000×g离心1min7）更换收集管，向离心柱中加入500ulAW2，最大转速离心3min8）更换收集管，空甩，最大转速离心1min9）向离心柱中加入100μlBufferAE，6000×g离心1min，然后提取的DNA分装并冻存。3.3半分子扩增从细胞培养液中获得的DNA为模板，以表2.1中所示的引物为PCR引物，用半巢式PCR的方法分别扩增毒株基因组5’半分子和3’半分子。第一轮5’半分子使用U-LTR5-AE(+)和07Rev8；3’半分子使用07For7和D-MluI-AE+BC；第二轮5’半分子使用U-LTR5-AE(+)和Rev11；3’半分子使用Vif1和D-MluI-AE+BC。为保证获得序列的正确性，我们所用的DNA聚合酶为高保真酶，分别是PlatinumTaqDNAPolymerase和PrimeSTARHSDNAPolymerase，并且通过调整第一轮DNA模板的量，最终以最低模板浓度、最大保真性获得PCR产物。PCR产物纯化后送交公司测序，以表1.3中所示的引物分别对此两个片段的序列进行测序，获得具有确定碱基的样本序列。（一）扩增及测序引物扩增引物见表2.1，测序引物见表1.351 表2.1半分子扩增引物Tab2.1AmplificationofprimersPositioninGenesPrimersPrimersequence(5'-3')DirectionHXB25'halfU-LTR5-AE1→245'-GCGCCGAATTCTGGATGGGCTAATTTACTCCA(A/G)GA-3'Forward(Outer&Inner)Rev115066→50415'-ATCATCACCTGCCATCTGTTTTCCAT-3'Reverse(Inner)07Rev85219→51935'-CCTARTGGGATGTGTACTTCTGAACTT-3'Reverse(Outer)3'half07For74875→49125'-CAAATTAYAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3'Forward(Outer)VIF14900→49235'-GGGTTTATTACAGGGACAGCAGAG-3'Forward(Inner)D-MluI-AE+BC9656←96915'-GTCCACGCGTGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG-3'Reverse(Outer&Inner)（二）反应体系及反应条件PCR反应所用的高保真DNA聚合酶分别用PlatinumTaqDNAPolymerase和PrimeSTARHSDNAPolymerase，相同的DNA聚合酶的两轮PCR反应的反应条件相同，并且PrimeSTARHSDNAPolymerase保真性高于PlatinumTaqDNAPolymerase。所以分别试验以下几种情况：第一轮第二轮1PlatinumTaqDNAPolymerasePlatinumTaqDNAPolymerase2PlatinumTaqDNAPolymerasePrimeSTARHSDNAPolymerase3PrimeSTARHSDNAPolymerasePrimeSTARHSDNAPolymerase通过不断改变第一轮DNA模板浓度，来获得保真性最高的半分子PCR产物。（1）PlatinumTaqDNAPolymerase反应条件及体系PlatinumTaqDNAPolymerase第一轮反应体系：52 N5（μl）N3（μl）PlatinumTaqDNAPolymerase0.20.210*Buffer55dNTP-10uM44MgSO4-50uM22引物1-20uM0.50.5引物2-20uM0.50.5模板DNADNA水补至50μl补至50μlPlatinumTaqDNAPolymerase第二轮反应体系：N5（μl）N3（μl）PlatinumTaqDNAPolymerase0.20.210*Buffer55dNTP-10uM44MgSO4-50uM22引物1-20uM0.50.5引物2-20uM0.50.5模板3ul3ul水补至50μl补至50μlPlatinumTaqDNAPolymerase反应条件：温度时间循环数94℃2min94℃30s58℃40s3cycles68℃6min94℃30s60℃30s27cycles68℃5min66℃10min4℃∞53 （2）PrimeSTARHSDNAPolymerase反应条件及体系PrimeSTARHSDNAPolymerase第一轮反应体系：N5（μl）N3（μl）PrimeSTARHSDNAPolymerase0.50.55*Buffer（MgSO4plus）1010dNTP-10uM44引物1-20uM0.50.5引物2-20uM0.50.5模板DNADNA水补至50μl补至50μlPrimeSTARHSDNAPolymerase第二轮反应体系：N5（μl）N3（μl）PrimeSTARHSDNAPolymerase0.50.55*Buffer（MgSO4plus）1010dNTP-10uM44引物1-20uM0.50.5引物2-20uM0.50.5模板33水补至50μl补至50μlPrimeSTARHSDNAPolymerase反应条件：温度时间循环数94℃3min98℃10s58℃15s3cycles72℃6min98℃10s60℃15s27cycles72℃5min72℃10min4℃∞54 3.4测序、拼接及序列分析将GX002样本5h和3h基因扩增产物纯化后送交北京六合华大公司测序，测序基因片段使用Contig软件进行拼接，获得GX002毒株5’半分子和3’半分子标准序列（包括LTR区），将两个半分子拼接，获得GX002毒株全长基因标准序列。利用NEB在线软件（http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）分析GX002毒株全长基因酶切位点，获得单一酶切位点分布状况，分别在两个半分子重叠区域查找单一酶切位点，用于后续酶切、连接。3.5全长分子克隆的制备（一）PCR产物切胶纯化为提高PCR纯化后产物浓度，每个半分子片段分别做6~8个二轮产物，然后切胶纯化。50μlPCR产物加入10μl6×loadingbuffer混匀后，15000的DNAMarker，120V电泳40~60min。5’半分子和3’半分子序列长度约为5K，所以在Marker5000的位置切胶纯化。1）将5’半分子和3’半分子在5K大小左右的胶切下来，每2~3个PCR产物的胶块置于一个离心管；2）向离心管中加入与胶块重量相同体积的溶胶液，置于60℃水浴锅水浴，直至胶体全部融化；3）瞬时离心后将融化的溶液转移至离心柱，静置1~2min后，最大转速离心1min；4）弃去收集管内液体，加入750μl洗液，最大转速离心1min；5）弃去收集管内液体，加入500μl洗液，最大转速离心1min；6）弃去收集管内液体，空甩，最大转速离心5min；7）向离心柱内加入适量洗脱液，静置1~2min，最大转速离心1min；8）去2μl洗脱产物电泳鉴定，观察是否将目的片段纯化出来。（二）PCR产物加A纯化55 1）向之前获得的5’半分子和3’半分子PCR纯化产物中加入等量的ExTaqMix，72℃反应10min，在半分子片段尾端加A，以便连入载体；2）加A产物过膜纯化，向加A反应后的体系加入等量的溶胶液，混匀后转移至离心柱，纯化PCR加A产物（三）半分子克隆制备1）连接：按照pEASY-T1CloningKit试剂盒说明书，向半分子N5、N3加A纯化产物中加入T1反应体系，25℃反应30min（使用体系为4μlT1+1μl纯化产物）2）转化：将连接产物于50μlTrans-T1感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴20~30min；然后42℃水浴热激30s，再立即置于冰上2min；随后向感受态细胞中加250μl平衡值室温的无氨苄的LB培养基，190rpm、37℃摇菌1h；然后再将全部菌液均匀的涂在固体LB培养平板上，37℃培养过夜。3）挑克隆：培养过夜后，在平板上挑取白色单克隆于1ml有氨苄的LB液体培养基中并标记，190rpm、37℃培养6~8h后吸取200μl浑浊菌液送公司测序，并根据测序结果找到与标准序列一致的半分子克隆质粒的菌液。4）提质粒：提前一天取50μl含有N5、N3半分子克隆质粒的菌液于5ml有氨苄的LB液体培养基中，190rpm、37℃培养过夜；①收菌：将5ml菌液从玻璃试管转移入15ml规格离心管中，6000×g离心1min，弃去上清，并将离心管倒置于吸水纸上，将残留上清尽量倒干净；②重悬：向步骤①完成后的15ml规格离心管中加入250μlCellResuspensionSolution，轻柔吹打至完全混匀，并将菌体的重悬液转移心新的1.5ml的离心管，并做好标记；③裂解：向1.5ml离心管中加入250μlCellLysisSolution，轻柔的上下颠倒离心管4~6次以方便均匀（不要涡旋），然后倒置静置5min；56 ④向步骤③完成后的离心管中加入10μlAlkalineProteaseSolution，轻柔上下颠倒离心管4~6次方便以混合均匀；随后倒置离心管室温下静止反应5分钟至液体清亮；⑤中和：向步骤④完成后的离心管中加入350μlNeutralizationSolution，轻柔上下颠倒离心管4~6次以方便均匀；随后立即最大转速室温离心10min⑥将离心柱置于收集管上，将离心后得到的上清液移入离心柱内，室温静置1min后，最大转速离心1min；⑦弃去上清液，向离心柱中加入750μlColumnWashSolution，最大转速离心1min；⑧弃去上清液，再次向离心柱加入250μlColumnWashSolution，最大转速离心2min；⑨随后最大转速空甩1min；⑩洗脱：将离心柱移至新的1.5ml离心管上并做好标记，向其中加入50μlNuclease-FreeWater，室温孵育1min后，最大转速离心1min；将离心后的滤液从1.5ml离心管吸出再次加入到SpinColumn，重复洗脱以提高洗脱浓度；⑨洗脱下来质粒电泳鉴定，大小约为5k。（四）全长克隆质粒构建利用NEB在线软件我们发现了AarI酶和Xhol1酶均为单一酶切位点，AarI酶的酶切位点位于N5、N3两个半分子重叠区域，Xhol1酶的酶切位点位于克隆载体上。因两个酶酶切时间以及反应体系不同，因此两个酶分两次单酶切反应进行。1）AarI酶切：按照说明书酶的最适用量以及半分子产物浓度，配制50μl酶切体系，37℃酶切18h左右AarI酶切体系如下：57 体积AarI5.5μl10×buffer5.5μloliga1μl质粒7μl无核酸水31μlTotal50μl2）第一次酶切纯化18h后，向50μl酶切体系中加入10μl6×loadingbuffer，混匀后电泳，120V电泳40~60min，并切胶纯化，45μl洗脱液洗脱。纯化后取纯化产物2μl电泳鉴定，观察是否将酶切后的序列片段纯化出来。2）Xhol1酶切：按照说明书酶的最适用量配制50μl酶切体系，37℃酶切16h左右Xhol1酶切体系如下：体积Xhol15μl10×buffer5μl纯化产物40μlTotal50μl4）第二次酶切纯化16h后，向50μl酶切体系加入10μl6×loadingbuffer混匀电泳，120V电泳40~60min，并切胶纯化；N5半分子出现两条5K左右的片段，取较大的一条，N3半分子只能看到一条10K左右的片段。纯化时30μl洗脱，并取2μl第二次酶切纯化后产物电泳鉴定。5）连接：根据N5、N3片段长度以及纯化产物浓度，并结合T4连接酶的说明书，分别以以下4个体系连接，连接条件为16℃连接24h。连接体系：58 序号N5N3T4连接酶T4BufferTotal17.2μl0.8μl1.2μl1.2μl10.4μl27μl1μl1.2μl1.2μl10.4μl36.5μl1.5μl1.2μl1.2μl10.4μl42.5μl6.5μl1.2μl1.2μl10.4μl6）连接产物转化24h后，分别将4个连接体系的样本加入50μlstbl3感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），并做好标记，轻弹混匀，冰浴20~30min；然后42℃水浴热激45s，再立即置于冰上2min；随后向感受态细胞中加250μl平衡值室温的无氨苄的LB培养基，190rpm、37℃摇菌1h；然后再将将全部菌液均匀的涂在固体LB培养平板上，37℃培养过夜。7）挑克隆：培养过夜后，在平板上挑取白色单克隆于1ml有氨苄的LB液体培养基中并标记，190rpm、37℃培养6~8h后吸取200μl浑浊菌液送公司测序，并根据测序结果找到与标准序列一致的全长克隆质粒。8）提质粒：取50μl与标准全长序列完全一致的全长克隆质粒的菌液于5ml有氨苄的LB液体培养基中，190rpm、37℃培养过夜，其中2ml菌液用于冻存，3ml菌液无内毒素提质粒。无内毒素提取的质粒可以直接用于细胞实验。①取700μl菌液加入300μl甘油，混匀后冻存于-40℃冰箱，每个克隆质粒冻存3支，做好标记；②收菌：将剩余3ml菌液从玻璃试管中转移入15ml规格的离心管，6000×g离心1分钟，弃上清，并将离心管倒置于吸水纸上，将残留上清尽量吸尽；③重悬：向步骤①完成后的15ml规格离心管中加入600μl无核酸水，吹打至菌体完全混匀，并将重悬液移入新的1.5ml离心管；59 ④裂解：向1.5ml离心管中加入100μl裂解液（裂解液为蓝色），轻柔上下颠倒4~6次，浑浊蓝色液体变澄清⑤中和：向步骤④完成后的离心管中加入350μl中和液（4℃保存，黄色），液体出现黄色沉淀，一直上下颠倒混匀，直至蓝色完全消失；随后将离心管放入离心机，室温最大转速离心3min；⑥将离心后得到的上清转移至离心柱，静置1min后，最大转速离心30s；⑦弃去收集管内液体，向离心柱加入200μl的去内毒素洗液，最大转速30s；⑧收集管内液体不丢掉，向离心柱内加入400ulCWB，最大转速1min；⑨洗脱：将离心柱转移至新的1.5ml离心管，向其中加入50μlNuclease-FreeWater，室温孵育1min后，最大转速离心1min；将离心后的洗脱液从1.5ml离心管吸出再次加入到SpinColumn，重复洗脱，增加质粒浓度取无内毒素提取的质粒电泳鉴定。9）构建系统进化树获得的克隆序列与其野生株病毒血浆中获得的序列一同构建亚型的系统进化树，以O亚型为outgroup，中国流行的各亚型的参考序列，构建ML树，碱基替换模型为GTR。同时将全长克隆序列与从病人体内获得的全场序列进行比较，观察两者之间的差异如何。3.6质粒转染及活毒参数测定（一）质粒转染及p24测定（1）转染用紫外分光光度计测之前无内毒素提取质粒的浓度，计算2.5μg质粒所需液体的量，并以pNL4-3质粒为阳性对照，转染HEK293T细胞。转染的前24h，用无抗生素的DMEM处理HEK293T，并细胞计数。然后计算出350万细胞所用量，并将细胞浓度调至40万/ml。取细胞培养板6孔板，每孔加入80万细胞（40万/ml，2ml），铺4个孔。24h后转染。60 转染所用溶液的体系如下：质粒用量lipo用量opti-DMEM用量克隆质粒1X10μl(190-X)μl克隆质粒2Y10μl(190-Y)μlpNL4-32.5ul10μl187.5μl细胞对照010μl190μl取5个干净的离心管，分别标记克隆质粒1、克隆质粒2、pNL4-3、cell以及lipo。向lipo的离心管中加入40μl的lipo以及360μl的opti-DMEM，轻柔吹吸混匀，静置5~10min。随后向分别标有克隆质粒1、克隆质粒2、pNL4-3中加入相应的质粒并用opti-DMEM定容至100ul，标有cell的离心管中直接加入100μl的opti-DMEM。lipo与opti-DMEM混合溶液静置好后分别取100μl加入克隆质粒1、克隆质粒2、pNL4-3、cell的离心管中，轻柔混匀，室温静置10~15min。然后将相对应的混合液加入细胞培养板中，轻轻滴入。6h后，每孔加入3mlDMEM（有无抗生素均可）细胞培养液，并将细胞培养板转移至p3实验室。48h后将细胞培养上清转移至15ml离心管，250×g离心5min，然后将离心后的上清分装于离心管，每支500μl，做好标记冻存于-80℃冰箱。与此同时各取出120ul培养上清用于p24的测定。（2）p24测定P24测定方法如下：1）配液：将50ml浓缩洗涤液（20倍）用蒸馏水稀释至1000ml；2）定量稀释阳性对照，以倍比稀释倍数为横坐标，阳性对照稀释后p24的量为纵坐标绘制标准曲线，并且每板设置3个阴性对照，1个空白对照3）首先在每个反应孔中加入25μl裂解液；4）然后将100μl待测样品或对照品加入到有裂解液的反应孔中，震荡30~60s，37℃孵育1h；5）弃去反应孔内液体，洗板5次，拍干后每孔加入酶结合物125μl（空白孔不加），置37℃孵育1h；61 6）弃去反应孔内液体，洗板5次，拍干后每孔加入底物（底物液：显色液=1:1混合）125μl，置37℃孵育30min；7）加入终止液50ul/孔；8）用酶标仪读数，波长450nm；根据标准曲线计算待测样品的p24值。（二）MT2细胞翻毒及p24与TCID50的测定1）处理MT2细胞，将细胞分别加入3个细胞培养瓶中，每瓶细胞浓度30万/ml、2ml，随后每瓶细胞分别加入克隆质粒1、克隆质粒2、pNL4-3转染HEK293T获得的培养上清1ml，24h后补液至10ml；随后每天观察细胞状态直至细胞瓶内90%左右细胞团出现病变后收取细胞培养上清，分装冻存于-80℃冰箱。452）收取的MT2细胞培养上清分别做10~10倍稀释后测定其p24。3）TCID50的测定①分别取克隆质粒1、克隆质粒2、pNL4-3冻存的MT2细胞上的培养上清进行稀释，先将培养上清进行10倍稀释，再做3倍的倍比稀释，稀释7个梯度，并且每支毒做4个复孔；稀释上样表：90μlDMEM+10μl毒-克隆质粒190μlDMEM+10μl毒-克隆质粒290μlDMEM+10μl毒-NL4-360μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM+30μl上一孔溶液60μlDMEM60μlDMEM60μlDMEM②准备TZM-b1，用无酚红的DMEM处理细胞，将细胞浓度调整为11万/ml，然后将细胞混悬液加到96孔细胞培养板上，每孔90μl；62 ③在②的基础上每孔加入10μl做过稀释的毒，最后一行加入10μl培养基然后将细胞培养板放入CO2培养箱，37℃培养48h；④48h后，向96孔板的每孔中加入30μl裂解液和发光液的混合溶液，避光放置10min，然后测定TZM-b1细胞化学发光值（relativeluminescenceunits，RLU），计算每支毒的TCID50值。以阴性对照孔的平均相对化学发光值（relativeluminescenceunits，RLU）的标准差为阈值；实验孔RLU高于阈值判定为阳性孔（+），实验孔RLU低于阈值则判定为阴性孔（-）。依据公式（1）和（2）计算TCID50，其中b为第一个稀释度。（三）测定衍生病毒的复制动力学曲线用6孔细胞培养板做临床分离株GX002与获得的毒力较高的一支01_AE感染性克隆衍生病毒的生长曲线，并设置细胞对照，每孔加入等量的p24的毒。1）分别计算临床分离株GX002和质粒克隆5ngp24所需毒的体积；2）处理MT2，准备3小瓶细胞，每瓶210万细胞，培养液的体积与毒的体积相加为6ml，所以细胞终浓度60万/ml，每瓶3.5ml，随后细胞培养瓶放入p3的细胞培养箱中直立培养6h；3）6小时后，分别将细胞混悬液吸取至50ml离心管，200×g离心5min；4）到掉上清，加入10mlPBS，轻柔吹吸混匀，200×g离心5min；5）重复步骤4）；6）倒掉上清，每个离心管加入35ml1640，轻柔吹吸混匀，分装在3个6孔板中，每孔5ml；7）0天取样，每个6孔板每孔吸出250μl于离心管中，200×g离心5min；，将上清分装于8连管中，每孔115μl；63 8）随后第2天、第4天、第6天、第8天分别取样；9）根据不同天的取样分别做不同浓度的稀释，然后测定5次取样的p24值；10）根据取样天数以及计算得到的p24值绘制复制动力学曲线。（四）测定01_AE感染性克隆的嗜性利用实验的方法测定CRF01_AE感染性克隆衍生病毒的嗜性。以NL4-3为CXCR4嗜性的阳性对照，HIV-Bal为CCR5嗜性的阳性对照，用分别表达不同受体的的U87细胞系培养上清p24确定衍生病毒嗜性。1）分别计算等p24量的NL4-3、Bal以及01_AE感染性克隆的体积；2）处理U87-CCR5和U87-CXCR4细胞，细胞计数，并将细胞浓度调整为细胞浓度为10万/ml；3）96孔细胞培养板分别加入细胞混悬液和相应的毒的体积，并用培养基补足至4250μl，终每孔的细胞量为10/孔；4）48h、72h、120h分别取样测定p24的值，确定01_AE感染性克隆的嗜性4实验结果4.1半分子PCR以MT2细胞培养上清提取的DNA为模板，采用半巢式PCR扩增的方法，通过不断减少模板用量，保证扩增出单一明亮条带。最终第一轮用HighFidelity，第二轮用PrimeSTAR，DNA量为3μl，扩增的到N5、N3半分子PCR产物，并测序；测序结果连接得到01_AE感染性克隆的标准序列。提交HIVDatabases中的QualityControl和NCBIBLAST进行质控和BLAST，确定获得的标准序列为CRF01_AE全长，序列全长为9702bp，具有15个独立的开放阅读框。4.2构建全长克隆（一）半分子PCR64 采用获得克隆质粒标准序列的扩增条件，每个半分子PCR扩增4管，然后PCR产物产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化。图2.2就是PCR结果的电泳胶图，左边是N5片段，右边是N3片段，15000的DNAMaeker，半分子片段在5K左右，可以确定扩增片段成功进行下一步实验。图2.2两个半分子PCR电泳图Fig2.2Electrophoresischartoftwohalfmolecule获得的PCR产物切胶纯化，纯化产物利用ExTaq在片段3’端加A，加A后在过膜纯化。图2.3则是加A过膜纯化后得到的纯化产物电泳胶图。N5、N3分别都有明亮单一的条带，并且大小均在5K左右，所以半分子PCR产物加A纯化成功，可以开始构建半分子克隆。图2.3PCR产物加A纯化后电泳图Fig2.3ElectrophoresischartofPCR65 （二）构建半分子克隆采用pEASY-T1CloningKit将N5、N3片段分别与T载体连接，连接产物转化T1感受态后涂平板，平板培养过夜后挑克隆，然后摇菌，菌液测序同时冻存菌液，获得的序列与标准序列比对，并提取构建成功的半分子克隆质粒，N5、N3半分子克隆分别获得两个克隆质粒，提取的质粒电泳鉴定大小。图2.4则是从菌液中得到了N5、N3半分子克隆电泳胶图。图2.4半分子克隆质粒电泳图Fig2.4Electrophoresischartoftwohalfmoleculeclone（三）构建全长分子克隆（1）选取获得的两个半分子克隆中的其中一个，取冻存菌液分别摇菌6只，以增大后续酶切产物的浓度。然后按照设计好的AarI酶切体系进行酶切，18h后将酶切产物电泳然后切胶纯化。图2.5为两个半分子克隆AarI酶切产物电泳图。66 图2.5AarI酶切产物电泳图Fig2.5ElectrophoresischartafterAarI从图2.5中可以看到所有的半分子质粒全部切开，T载体的长度约为4K，HIV序列的半分子长度约为5K，片段长度10K左右。电泳后每个半分子片段要进行切胶纯化，为增大纯化后片段浓度，每三个质粒片段共同纯化。图2.6是AarI酶切产物切胶纯化后电泳图，从图中可以看到纯化后片段没有丢失，并且长度大约在10K，片段单一并且明亮。图2.6AarI酶切产物纯化后电泳图Fig2.6Electrophoresischartafterpurification67 （2）利用第一次AarI酶产物进行第二次酶切，按照设计好的酶切体系进行Xhol1酶切。16h酶切结束后电泳，电泳胶图见图2.7。从图中我们可以看到N5的半分子克隆片段被切成两个长度相差不大的片段，一个在5K左右，一个在5K以下，根据酶切位点所在位置判断，较大的片段为我们所需要的目的片段；N3的半分子克隆片段则被切成两个相差极大的片段，一个将近10k，一个仅为几十bp的长度，胶图上并不能看到两个片段。因为N5、N3两个半分子克隆片段浓度相近，我们可以从胶图上看到N5的半分子克隆片段已经酶切完全，不存在10k左右的片段，因此我们也断定N3的半分子克隆片段也酶切完全，然后进行酶切纯化。图2.7Xhol1酶切产物电泳图Fig2.7ElectrophoresischartafterXholIN5、N3的所有酶切产物各纯化到一支离心管中，纯化产物电泳鉴定。从图2.8为纯化后电泳胶图，从图中可以看出N5、N3半分子克隆片段均酶切纯化成功，胶图中可以看到单一明亮的条带，并且N5在5K左右，N3在10K左右，大小符合预估的片段大小，可以继续进行连接。68 图2.8Xhol1酶切产物纯化后电泳图Fig2.8Electrophoresischartafterpurification（3）按照预先设计好的方案进行连接，连接产物转化、挑克隆、摇菌、测序、拼接比对、无内毒素提质粒，获得两个全长克隆，分别标号为2-1和2-2。然后提取的质粒电泳鉴定。克隆质粒全长14K左右，但因质粒环化成环所以在胶图上片段在10K左右。图2.9CRF01_AE全长克隆质粒电泳图Fig2.9ElectrophoresischartofCRF01_AEclone69 （4）成功获得全长克隆后，将全长克隆序列野生毒株血浆样本RNA获得的序列构建系统进化树（图2.10）。从树上我们可以清晰地看到全长克隆质粒与野生株均属于CRF_01AE，并且这两者之间单独成簇，置信值为100。图2.10系统进化树Fig2.10Phylogenetictree全长克隆序列与分离株序列构建的ML树，其中红色野生毒株血浆样本中获得的序列，蓝色代表构建的感染性克隆70 在全长克隆与病人体内获得的序列相比的过程中，我们发现两者之间存在较大的差异。从病人体内获得的活毒在经历传代培养并分离的过程中，病毒发生了改变。两者之间的变化见表2.2。并且在env（C2V3）区与嗜性相关的位置发生了4个有意突变。表2.2全长克隆序列与野生病毒序列之间的区别Tal2.2ThedifferentbetweenthecloneandRNA碱基突变氨基酸突变无义突变gag19118pol27819env554015vif1082vpr642tat211rev440vpu752nef14113Total14492524.3质粒转染及p24值的测定以pNL4-3为阳性对照，利用lipo2000质粒2-1和质粒2-2转染HEK293T细胞。转染后48h取培养上清原液测p24。测得的p24的OD值见表2.3。阳性对照OD值为4.462，并且细胞对照OD值为0.15，低于阳性临界值，所以转染操作成功；同时克隆质粒p24OD值分别为3.68和4.458，说明全长克隆质粒成功转染出活毒，CRF01_AE的感染性克隆构建成功。但因为OD值的取值大于检测上线，不能计算出具体p24的量，还需要对培养上清进一步稀释。表2.3转染上清p24的OD值Tal2.3TransfectionofsupernatantODvalue质粒名称1-22-2pNL4-3细胞对照OD值3.684.4584.4620.1571 4.4MT2翻毒及p24、TCID50的测定为提高单位体积中CRF01_AE感染性克隆衍生病毒的数量，将获得的转染上清感染MT2细胞，体外培养，仍然以NL4-3为阳性对照。当看到细胞培养瓶中90%的细胞团出现病变后，收取上清，测定p24和TCID50。图2.11细胞病变图Fig2.11Celldiseasemap感染MT2细胞后，经过培养，从镜下可以看到明显的细胞病变（图2.11）。随后分别对HEK293T细胞转染上清以及MT2细胞培养上清利用酶联免疫试剂盒测得p24值，同时利用荧光检测获得TCID50（见表2.3，表2.4）。从p24的值上可以看出，经过MT2的翻毒，感染性克隆载体衍生病毒的p24从0.375μg/ml增长为19.31μg/ml，毒力明显提高，所以在测定TCID50时选取了经过MT2翻毒的感染性克隆载体衍生病毒。测得的TCID50值如表2.4，其中CRF01_AE感染性克隆的衍生病毒的TCID50为15588，与PBMC培养的野生株TCID50值相同。72 表2.4p24值Tal2.4p24value293T转染上清MT2翻毒上清质粒名称pNL4-31-22-2pNL4-31-22-2A值0.4240.8991.0310.9460.4860.891646864稀释倍数1×101×101×101×101×101×10计算值16.2991071437.50446443.397321439.602678619.066964337.147321644864pg/ml16.3×1037.5×1043.4×1039.6×1019.1×1037.1×103ug/ml16.30.3750.4343.96×1019.10.371表2.5TCID50Tal2.5TCID50编号GX002-PBMCGX002-MT2NL4-3-MT201_AE(1-2)-MT201_AE(2-2)-MT2TCID5015588394881000155889000注：GX002-PBMC是指PBMC细胞培养获得临床分离株GX002；GX002-MT2是指MT2细胞培养获得临床分离株GX002；NL4-3-MT2是指MT2细胞翻毒获得的pNL4-3感克隆衍生病毒；01_AE(1-2)-MT2是指质粒1-2转染后在MT2细胞上翻毒获得的感染性克隆载体衍生病毒；01_AE(2-2)-MT2质粒2-2转染后在MT2细胞上翻毒获得的感染性克隆载体衍生病毒4.5衍生病毒的复制动力学曲线使用等量p24的野生型分离株GX002与感染性克隆载体衍生病毒01_AE感染MT2细胞，分别在感染后0天、2天、4天、6天以及8天取培养上清，测定P24量。以不同时间点取得的p24量为纵坐标，取样天数为横坐标，绘制生长曲线（图2.12）。结果显示，在MT2细胞中，衍生病毒和野生型病毒均能够正常复制，感染性克隆转染得到的衍生病毒与野生株病毒均在第六天p24值达到顶峰，但野生株病毒的p24值大于衍生病毒，野生株复制能力强于衍生病毒。73 图2.12复制动力学曲线Fig2.12Copythedynamicscurve4.6衍生病毒的嗜性检测以NL4-3为CXCR4嗜性阳性对照，HIV-Bal为CCR5嗜性阳性对照，使用等P24抗原量的病毒分别表达CCR5和CXCR4辅助受体的U87细胞，测定感染后48h、72h、120h三个时间点培养上清的p24值，判断构建的01_AE感染性克隆的嗜性。结果显示获得的衍生病毒为双嗜性病毒。各时间点测定的p24量见表2.5。CCR5嗜性的阳性对照为HIV-Bal，实验过程中我们发现Bal质粒的衍生病毒的毒力极弱，所以在表达不同受体的U87细胞上只有微弱区别，但HIV-Bal为CCR5嗜性的病毒；NL4-3在表达CCR5受体的细胞上p24值逐渐下降，而在表达CXCR4受体的细胞上p24值则在不断升高，说明NL4-3为CXCR4嗜性的毒。我们构建的CRF01_AE感染性克隆的衍生病毒其p24值在U87两种表达不同受体的细胞上均有极高的p24值，所以我们判定CRF01_AE感染性克隆的衍生病毒为双嗜性病毒。74 表2.6检测嗜性p24的OD值Tal2.6Tropismdetectionp24OD值病毒细胞48h72h120hU87-CCR52.7171.7050.704NL4-3U87-CXCR43.9213.9244.456U87-CCR50.3360.2480.076HIV-BalU87-CXCR40.2390.1910.066U87-CCR50.6782.4954.07201_AEU87-CXCR43.3404.4613.589U87-CCR50.0890.0960.041BlankU87-CXCR40.0560.0940.0235讨论近年来，越来越多的研究显示，不同亚型的病毒具有不同的复制能力和表型，必须针对不同的亚型病毒分别研究。CRF01_AE是世界上第一个被鉴定出来的流行重组型，也是目前全球流行规模最大的重组型毒株之一，目前CRF01_AE也是我国的主要流行亚型之一。在本研究中，我们成功构建了一株完全来自中国野生毒株的CRF01_AE的感染性克隆，并其衍生病毒的p24值可达到19.1ug/ml，TCID50可达到15588/ml；利用表达不同受体的U87细胞系检测衍生病毒的嗜性为双嗜性病毒，同时复制动力学曲线显示感染性克隆的衍生病毒具有与其野生株病毒相媲美的复制能力。成功构建CRF01_AE感染性克隆对于进一步开展CRF01_AE的流75 行规律，鉴定影响其病毒表型的相关因素及研发针对我国主要流行毒株的HIV疫苗具有重要意义。HIV为正链RNA病毒，属于逆转录病毒，获得HIV全长基因组一是通过mRNA逆转录产生cDNA，二是的利用整合进宿主基因组的前病毒DNA。但是通过逆转录的方法只能获得病毒的近似全长，并不能获得病毒的LTR区，所以我们构建的CRF01_AE感染性克隆是以前病毒DNA为模板。为获得高拷贝数的DNA，野生株病毒经过MT2细胞的培养富集。在我们的研究中，提高模板浓度的同时，利用保真性高的酶进行PCR，减少扩增过程中突变的引入，保证基因序列的真实性。采用这种方法本文构建CRF01_AE的感染性克隆完全来自其野生毒株，并不存在重组、缺失以及人工改造的痕迹，其衍生病毒与野生株病毒保持了高度一致性，可以在体外模拟野生毒株的自然生长状态，为研究我国流行的CRF01_AE亚型提供了基础。感染性克隆构建成功后，我们对克隆序列与其亲本病毒序列进行了比较，基因相似达到了98.4%，构建的系统进化树中（图2.10）两条序列位于一簇且置信值为100。我们确定该感染性克隆确实可以代表其原代分离株，作为我们研究CRF01_AE亚型致病机理的有力工具。在感染性克隆与原代分离毒株进行序列对比的过程中，我们发现感染性克隆产生的衍生病毒在核酸序列上发生了144位突变，氨基酸序列上具有92位突变，联系两者的复制动力学曲线的区别，这92位有意突变造成的位点上的改变可能致使衍生病毒的复制能力低于其野生株病毒。而在嗜性研究中，血浆样本中获得的野生株病毒利用HIVDatabases中的Geno2Pheno和WebPSSM预测其嗜性为CXCR4，而感染性克隆衍生病毒利用软件预测其嗜性为双嗜性病毒，并且利用实验验证了预测结果。野生株病毒与衍生病毒之间的92个有意突变中，其中4个来自于嗜性相关的envV3区。这为我们后续以CRF01_AE感染性克隆质粒作为工具质粒利用进一步筛选突变位点中影响病毒复制能力以及嗜性提供了方向。76 近日，中国科学家以甲型流感病毒为模型，应用基因技术人工控制病毒的复制，从而将活体病毒直接转化为疫苗，还可以作为治疗性药物。活病毒疫苗，是指在核酸序列中引入终止密码子，使病毒丧失自身的复制能力，但保留病毒的完整结构和完全感染性；保留了感染性的病毒进入生物体后，可以激活生物体细胞的全部免疫反应，但由于终止密码子的存在，病毒无法进行蛋白质翻译，因而失去复制能力。这种新型疫苗一方面可以最大限度地诱导免疫反应，另一方面却没有病毒复制的后顾之忧。而我们构建成功的CRF01_AE感染性克隆本身已经完美的保留了野生株病毒的结构、感染力以及复制能力，借助活毒疫苗的思想，可以以的感染性克隆为基础，尝试构建HIVCRF01_AE的活毒疫苗，为HIV对预防与治疗提供新的思路。77 参考文献[1]GALLORC,MONTAGNIERL.ThediscoveryofHIVasthecauseofAIDS[J].TheNewEnglandjournalofmedicine,2003,349(24):2283-5.[2]李敬云.艾滋病检测方法与应用［Z］.北京:军事医学科学出版社[3]Kaposi'ssarcomaandPneumocystispneumoniaamonghomosexualmen--NewYorkCityandCalifornia[J].MMWRMorbidityandmortalityweeklyreport,1981,30(25):305-8.[4]韩婧婉.我国HIV-1流行毒株的分离鉴定及Rev蛋白第101位提前终止的生物效应研究[D];中国人民解放军军事医学科学院,2016.[5]UNAIDS.FACTSHEET2015.2015,http://www.unaids.org/en/resources/campaigns/HowAIDSchangedeverything/factsheet[6]王铮.HIV-1ThaiB亚型感染性克隆的构建及其在中和抗体检测和疫苗研究中的初步应用[D].中国人民解放军军事医学科学院,2008[7]UNAIDS.2015ChinaAIDSResponseProgressReport.2015,http://aidsdatahub.org/sites/defaμlt/files/publication/China_narrative_report_2015.pdf[8]PERELSONAS,NEUMANNAU,MARKOWITZM,etal.HIV-1dynamicsinvivo:virionclearancerate,infectedcelllife-span,andviralgenerationtime[J].Science(NewYork,NY),1996,271(5255):1582-6.[9]丁龙飞,何涌泉,陈健,张晓燕.HIV-1的隐身术:变异与进化[J].生命科学,2016,(03):367-376.[10]GroupforHIVMolecμlarEpidemiologicSurvey.ProjectsummaryfornationalHIVmolecμlarepidemiologyanddatabaseestablishment［Z］.2004.（inChinese）“全国艾滋病毒分子流行病学调查及数据库的建立”项目组.“全国艾滋病毒分子流行病学调查及数据库的建立”项目总结［Z］.2004[11]SUL,GRAFM,ZHANGY,etal.Characterizationofavirtuallyfμll-lengthhumanimmunodeficiencyvirustype1genomeofaprevalentintersubtype(C/B')recombinantstraininChina[J].Journalofvirology,2000,74(23):11367-76.[12]QING,SHAOY,LIUG.[SubtypeandsequenceanalysisoftheC2-V3regionofgp120genesamongHIV-1strainsinSichuanprovince][J].Zhonghualiuxingbingxuezazhi=Zhonghualiuxingbingxuezazhi,1998,19(1):39-42.[13]PIYASIRISILPS,MCCUTCHANFE,CARRJK,etal.Arecentoutbreakofhumanimmunodeficiencyvirustype1infectioninsouthernChinawasinitiatedbytwohighlyhomogeneous,geographicallyseparatedstrains,circμlatingrecombinantformAEandanovelBCrecombinant[J].Journalofvirology,2000,74(23):11286-95.78 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附录个人简历：姓名：贾涤静性别：女籍贯：河北石家庄民族：汉出生年月：1992年7月政治面貌：团员专业：微生物学导师：李林主要学习经历：2007.9-2010.6河北石家庄市第十七中学2010.9-2014.6华北理工大学生命与科学学院生物技术专业2014.9-至今安徽医科大学与军事医学科学院联合培养微生物专业获得奖励：2014-2016分获校二等、三等、一等奖学金2016年获国家奖学金科研论文成果：2016年以第一作者发表SCI论文一篇NearFμll-LengthGenomicSequencesofTwoNovelHIV-1RecombinantFormsidentifiedinShenzhen,China.AIDSResearchandHumanRrtroviruses,PMID:27460636,DOI:10.1089/AID.2016.0162（IF=2.325）81 致谢岁月如梭，转眼间三年的研究生生活求学生活即将结束，回忆往昔，仿佛昨日还是刚刚开始的日子。毕业将至，我衷心的向所有指导、帮助过我的老师同学以及一直陪伴我的家人和朋友送上我最真挚的感谢。饮其流时思其园，成吾学时念吾师。首先我要感谢我的指导老师李林副研究员。衷心的感谢他谆谆教诲，让我在三年的求学期间成长良多。从课题的选择、实施直到论文成稿，遇到各种困难挫折，李林老师始终给予我耐心的指导和帮助。求学三年，不仅从李林老师身上学到各种实验方法与技术，他严谨的科研态度、务实的工作作风、高效的工作效率，不断影响激励着我。感谢李敬云老师、鲍作义老师、刘思扬老师、庄道民老师、李韩平老师、刘永健老师以及王晓琳老师对我的帮助和指导。感谢李敬云老师，她严密的思维逻辑深深的影响着我；感谢鲍作义老师在HIV检测上对我的帮助；感谢刘思扬老师与庄道民老师在细胞和活毒实验上对的的指导和帮助；感谢李韩平老师和刘永健老师在分子实验上对我的支持与帮助；感谢王晓林老师在事务性工作上的帮助。感谢韩婧婉博士、常帅博士、李天一博士在实验上和生活上对我的指导与帮助，实验上她们对我的指导与建议使我避免了很多可能出现的困难，生活上她们的陪伴与关心在我的学习生涯留下了浓墨重彩的一笔。感谢贾磊博士在重组分析上对我的帮助和困难时不断地鼓励。感谢桂滔硕士在进化分析上对我的指导，让我在未知的领域得以探索。感谢张敏师妹与裴志超师妹对我的鼓励与支持。感谢孙长荣、董如华、任永珍、吴晓明在实验过程中提供的支持与帮助。再次感谢实验室的各位老师与同学。最后我要特别感谢我的父母与亲人。感谢你们对我的支持与理解，在我困难时对我的鼓励，在我任性时对我的包容，感谢您们一直的关爱，谢谢你们。再一次，向一直以来不断支持和帮助我的人表达我最诚挚的谢意！82 综述HIV的进化与逃逸1981年6月，美国疾病预防控制中心（CDC）在发病率和死亡率周报（MMWR）中报道了26例男性同性恋患卡波肉瘤的报道，这被认定为艾滋病的首次发现。在1982年9月24日的报告中，美国CDC正式提出了获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS）的概念。1984年,法国巴斯德研究所的LucMontagnier和美国国立卫生研究院（NationalInstituteof[1]Health,NIH）的RobertGallo分别发现并分离出艾滋病致病病毒HIV。在随后的30多年的时间内，艾滋病在世界各地广泛传播，疫情在全球范围内全面爆发，造成了十分严重的危害。至今为止，它已造成了全球7500万人感染，超过2500[2]万人死亡，当前尚未有治愈的方法和有效的疫苗。1HIV的进化HIV是迄今为止发现的人类遗传变异最大的病原体。HIV的一个显著特点是高度变异性，这是HIV在强大的免疫和药物选择压力下赖以生存的基础，也是病毒难以清除的主要原因和疫苗研制的主要障碍。HIV遗传多样性及快速进化模式的生物学基础是：首先是HIV逆转录酶的忠实性较差，即缺乏3’-5’的校正功能，这导致HIV在复制过程中极易产生基因突变，每一个HIV基因组的逆转录都会有1~10个错误产生，可能包括碱基的插入、缺失或者替换。而RNA聚合[3]酶转录为DNA时能进一步加剧基因变异。其次是HIV具有较小的基因组和极89高的复制速率，每天会产生10~10个病毒颗粒释放到细胞外体液中，同时也有大约相同量的病毒被清除。第三是HIV存在着广泛的病毒基因的重组现象，大约10%的HIV分离株是重组嵌合体。最后，宿主的免疫压力以及抗HIV药物的筛选也加快了HIV的变异进化速率。同一个感染者体内HIV病毒序列的差异性能达到10%，感染6年后HIV病毒序列的累积差异能达到一株季节性流感病毒[4]一年内全球的变异程度。83 HIV的这种快速复制速率加上高突变率是HIV从原发感染时的状态进化为一群遗传差异很大的病毒，每一个成员都保存了生存所必须的基因，但这并不妨碍复制在基因位点上的细小差异，结果就导致了高度分化的病毒群体。就基因型而言，HIV分为两型，即HIV-1、HIV-2。HIV-1和HIV-2之间的核苷酸序列同源性只有55%~60%。HIV-1致病性更强，易传播，是全球HIV感染的主要流行型；而HIV-2相对传播少，主要出现在西非。而HIV-1可分为M群、N群、O群和P群。HIV-1的M群病毒在全球广泛流行，而O群主要流行于非洲中西部，大约感染数万人；N群流行于非洲喀麦隆，感染人数较少；P群则是最新新鉴定[5-9]得到的，仅在喀麦隆两位感染者体内发现。而HIV-1的M群又可细分为9个亚型、88个流行重组性以及更多的独特重组型。2HIV的逃逸广泛的基因变异、快速的增殖、频繁的重组使HIV成为自然界进化最快的［10］微生物之一。而这种变异在很大程度上是自然选择而不是遗传漂变的结果。［11］中和抗体、多糖屏蔽、Th细胞及CTL均可产生宿主免疫-选择压力。所以，HIV能成功地固定突变，尤其是Eev基因的突变，逃避机体免疫反应。2.1病毒逃逸HIV-1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）临床资料显示,HIV感染长[12]期不发病／病程进展缓慢的患者(LTNP／SP)，Nef基因发生了突变或者缺失。Nef基因表达的蛋白是病毒的负性调节因子，可以通过调节宿主细胞膜表面的受体，结合多种重要的信号转导分子等多种途径逃避免疫监视。AIDS的主要临床表+现是CD4T细胞的持续下降。CD蛋白属于Ig超家族，具有吸附和信号转导的作用，是HIV的主要受体。研究表明，Nef可以引起细胞表面CD4的下调，观察发现Nef[13]的表达细胞有更多包含CD4的网格蛋白内陷小窝(CCPs)形成，提示Nef引起的CIM下调可能通过内体溶酶体途径。CD4的下调可以减少HIV分子与受体的结合从而逃脱免疫监视。CTL识别感染细胞需要Ⅰ类MHC分子呈递感染细胞的病毒肽，而Nef蛋白的存在可以降低Ⅰ类MHC分子的表达。Nef存在时，MHC分子的合成没有改变，但是Ⅰ类MHC分子通过内体迅速的从细胞表面移向胞内，聚积于高尔基体反面的网络结构(trans-Golsinetwork，TGN)，进入网格蛋白小泡而被降解。从而使HIV病毒逃脱CTL的识别。同时Nef还可以是Ⅱ类MHC分子下调。Ⅱ类MHC蛋84 +白表达在所有的APCs上，提成抗原给CD4T细胞。HIV-1的Nef蛋白影响Ⅱ类MHC分子细胞表面的定位，减少外源性抗原肽的提呈。使HIV逃脱CTL的识别。2.2包膜复合物上抗体表位的变化虽然抗体可以有效的抑制很多的病毒，但是HIV病毒即使有抗体的抑制也会不断地复制。体内抗HIV抗体直接抗HIV分子env蛋白产生的抗体，还包括广泛糖基化的CD4结合亚基(gp120)与跨膜相关蛋白(gp41)组成的异二聚体。位于病毒分子表面的env蛋白可以看做钉状物并与gp120-gp41组成三聚体复合物，即使这些位点暴露在病毒表面，这些三聚体复合物仍然可以抵抗抗体的中合作用。他们利用低聚物封闭抗原表位，并且广泛的糖基化作用会延长复合物表面的封闭环，这样空间上封闭抗体结合位点以逃脱抗体的中合作用。一些抗体可以连接gp120蛋白单体或gp41蛋白单体，但是这些抗[14]体并不具有中和作用。这是因为它们识别的抗原表位在三聚体复合物的内部。[15]糖基化作用可以保护蛋白质的核心序列，可以减弱抗原引起的免疫反应。排[16]除抗原的糖基化作用后HIV-1分子会变得非常敏感。蛋白的糖基化位点可能会因为病毒基因突变发生改变从而封闭或改变抗原表位从而逃脱中和抗体的中[17]合作用。同时，蛋白gp120与gp41结合，会导致gp120糖蛋白构象的改变，使结合共受体的保守结合位点暴露，继而gp120结构变形，触发内部的gp41发生构象变化，导致病毒膜融合和病毒进入细胞。抗原决定族多隐藏于寡聚的包膜[18]钉状物。保守的抗原决定族的暴露可能是短暂的。这种不利的gp120构象变化，阻止抗体识别受体结合位点,逃脱免疫压力的选择。2.3HIV蓄积库的存在HIV患者即使通过高活性抗逆转录病毒（HAART）的治疗，可检出的病毒量会减少，但HIV病毒却不会被根除，这其中一部分原因＋就是因为HIV蓄积库的存在。记忆CD4T细胞就是HIV蓄积库之一。这种潜在＋的病毒蓄积库可以通过感染具有活性的CD4T细胞并将病毒的DNA整合到宿主基因组中。部分记忆T细胞能蓄积完整的前病毒，这些病毒可以在细胞活化后，诱导制造出具有感染力的病毒。尽管不断丢失部分潜伏感染的细胞，但由于大量的记忆T细胞生命周期的任何阶段都存在低水平的病毒复制，所以这个前[18]＋病毒蓄积库很可能扩增，或至少维持。如果记忆CD4T细胞可以长时间存活并回到静止期，整合病毒基因组就会存在整个细胞的生命周期内，在这段时间内，85 病毒只能表达有限次。这样潜在感染的病毒就可以逃脱抗逆转录药物或免疫反应的选择。组织固有的巨噬细胞和单核细胞来源的巨噬细胞均能感染HIV。病毒颗[19]粒聚集在巨噬细胞内吞囊泡系统的晚期内涵体中。在正常情况下，内涵体要与溶酶体融合，继而发生降解。然而，HIV感染的巨噬细胞能抑制内涵体与溶酶体的融合，从而保存HIV颗粒在细胞内。同时，与T细胞相比，巨噬细胞释放病毒是一个相当慢的过程。由于没有HIV诱导的致细胞病变作用，巨噬细胞可长期持续释放HIV。3展望生物技术和医学的不断进步有效的降低了HIV的新发感染，各种抗病毒药延长了感染者的寿命。HIV也在不断的进化与变异来获取生存。在不久的将来，不断地了解病毒与宿主之间的关系，新型药物靶点的不断发现，人类与HIV的“战争”终将以人类的胜利而告终参考文献[1]GALLORC,MONTAGNIERL.ThediscoveryofHIVasthecauseofAIDS.[J]NEnglJMed,2003,349(24):2283-5.[2]FariaNR,RambautA,SuchardMA,etal.HIVepidemiology.TheearlyspreadandepidemicignitionofHIV-1inhumanpopμlations.[J]Science,2014,346:56-61[3]丁龙飞，何涌泉，陈健的等.HIV-1的隐身术：变异和进化.[J]生命科学,2016,28(3):367-376.[4]KorberB,GaschenB,YusimK,etal.EvolutionaryandimmunologicalimplicationsofcontemporaryHIV-1variation.[J]BrMedBμll,2001,58:19-42[5]SimonF,MauclereP,RoquesP,etal.Identificationofanewhumanimmunodeficiencyvirustype1distinctfromgroupMandgroupO.[J]NatMed,1998,4:1032-7[6]RoquesP,RobertsonDL,SouquiereS,etal.PhylogeneticcharacteristicsofthreenewHIV-1NstrainsandimplicationsfortheoriginofgroupN.[J]AIDS,2004,18:1371-81[7]PlantierJC,LeozM,DickersonJE,etal.Anewhumanimmunodeficiencyvirusderivedfromgorillas.[J]NatMed,2009,15:871-2[8]AyoubaA,MauclereP,MartinPM,etal.HIV-1groupOinfectioninCameroon,1986to1998.[J]EmergInfectDis,2001,7:466-7[9]VallariA,HolzmayerV,HarrisB,etal.ConfirmationofputativeHIV-1groupPinCameroon.[J]JVirol,2011,85:1403-786 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