鸭圆环病毒四川毒株的进化分析及感染性分子克隆的构建

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：粥忐2。f牛年(月f『D日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论

2、文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：孑杉志之导师签名．嘛孺．≯l忙《只ioBpfp每6其《。日万方数据四川农业大学硕士学位论文本论文的创新性工作1．鸭圆环病毒四川毒株GH01的首次分离、鉴定及全基因组序列分析：从四川广汉某鸭场分离获得鸭圆环病毒，命名为GH01株，对GenBank上所有DuCV进行分析，表明鸭圆环病毒可分为2个基因型(DuCV—l和DuCV一2)与6个亚型0a,lb，lc，2a，2b和2c)，并证明了四川GH01株鸭圆环病毒是由早期病毒株经历基因组变异演化而来，基因重组以及选择压力的净化压力在鸭圆环病毒进化过程中起到重要

3、作用。2．利用反向遗传学进行鸭圆环病毒病毒拯救：通过鸭圆环病毒的全基因组扩增及双拷贝连接载体构建携带遗传标记的感染性克隆plC—Mu2DuCV，经试验动物表明，构建的感染性克隆可以拯救出完整鸭圆环病毒，并命名为PMDC，并对拯救毒株PMDC进行了部分生物学特性分析。一㈣2一肿1㈣m㈣纠唧1～㈣塑万方数据四川农业大学硕士学位论文中文摘要鸭圆环病毒(Duckcircovirus，DuCV)是近年来新发现的水禽感染性病原，造成鸭生长迟缓，体重下降等症状。病毒主要侵染鸭淋巴器官，患鸭后会引发免疫抑制及可能的二次感染，对养殖业造成了较大的经济损失。因此，分析我国DuCV的遗传演化规律并构建体外转录的模型

4、具有十分重要的科学意义。1．DuCV的分离、鉴定及全基因组序列分析本研究从疑似感染DuCV的病鸭体内分离到一株DuCV(命名为DuCV-GH01)，通过PCR得到病毒全基因组进行序列分析表明，DuCV．GH01的核苷酸序列与目前GenBank登录的所有DuCV序列相似性高达81．8％～99．4％，根据PASC的P值／频率分布图获得，当不同基因组的P值大于0．170时，可分为DuCVl和DuCV2；当DuCVl和DuCV2的型间P值大于0．032或0．018时，可以将鸭圆环病毒细分为1a、1b、1c和2a、2b、2c6个亚型。这个结果证明DuCV由一个共同祖先经过不同的进化过程分化为DuCV-1

5、和DuCV-2。2．DuCV的基因重组及选择压力分析通过系统进化树分析发现利用全基因组进行分型时的3株DuCV-2a毒株(GenBankNo．EU344802、EU344805和EU499309)在利用Rep基因进行基因分型时结果不同。通过分析发现，是由于这3株毒株的Rep基因的第71至581位碱基序列与DuCV-1a的相同区域的碱基序列发生了重组。利用基因重组分析软件获得DuCV的5个主要基因重组事件，且重组主要发生非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap的编码区，DuCV利用基因重组增加其基因组的多样性。通过对DuCVl型和2型的抗原表位以及糖基化位点分析，表明DuCVl型和DuCV2型的氨基酸的

6、差异，可能造成DuCVl型的抗原性稍强于DuCV2型的抗原性，使其所受到的免疫压力更大。此外，经分析选择压力中的净化选择压也在DuCV的进化中起到了重要的作用。3．DuCV反向遗传学平台的建立及其病毒拯救为了构建含有遗传标记的感染性克隆，进一步研究鸭圆环病毒的致病机制。本研究利用PCR扩增鸭圆环病毒GH01株全基因组CG，将2个基因组IC．1、IC．2顺式连接插入到pUCl9载体中获得串连双拷贝重组质粒plC一2DuCV，并通过同义突变引入酶切标记位点XhoI获得plC-Mu2DuCV。重组质粒plC-Mu2DuCV经过＆D对线性化，以100rtg／kgDNA和200pa／kg的脂质体肌肉注射

7、10日龄DuCV阴性雏鸭。结果显示，成功构建含有分子万方数据四川农业大学硕士学位论文标记XhoI的串连双拷贝重组质粒plC—Mu2DuCV，经肌肉注射雏鸭转染组于转染21d后检出血清阳性，并通过测序经XhoI标记位点将拯救出的病毒与野生毒株进行区分。本试验构建的DuCV全长基因组头尾串联二聚体感染性克隆DNA可以转染雏鸭并增殖出带标记的DuCV病毒，为进一步研究DuCV分子特性和致病机理打下了基础