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博士学位论文（同等学力）消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用与机制初探AStudyonTherapeuticEffectandPreliminaryMechanismofXiaotanJieyuPrescriptioninBreastPrecancerousLesions研究生姓名：赵婧学号：20122427指导老师：俞超芹教授第二军医大学附属长海医院学科、专业：中西医结合临床学位类型：临床医学专业学位答辩日期：2017年5月二〇一七年五月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期年》月斗日：＾学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：日期：年义月＞日日期：年ｓ月￥日 目录摘要......................................................................................................-1-ABSTRACT.................................................................................................-5-缩略词表....................................................................................................-10-前言.....................................................................................................-11-第一部分乳腺癌前病变大鼠模型的建立与评价................................-13-一、DMBA联合雌孕激素序贯法诱导SD雌性大鼠乳腺癌前病变模型..........................................................................................................-13-（一）材料与仪器.............................................................................-13-（二）实验方法.................................................................................-14-（三）实验结果.................................................................................-18-第二部分消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用及干预机制动物实验研究............................................................................................................-24-一、消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠的治疗作用............................-24-（一）材料与仪器.............................................................................-24-（二）实验方法.................................................................................-24-（三）实验结果.................................................................................-26-二、消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白表达的影响.............................................................................................-34-（一）材料与仪器.............................................................................-34-（二）实验方法.................................................................................-35-（三）实验结果.................................................................................-40- 第三部分消痰解郁方对乳腺癌前病变干预机制细胞实验研究........-47-一、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响.......-47-（一）材料与仪器.............................................................................-47-（二）实验方法................................................................................-49-（三）实验结果................................................................................-52-二、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡和周期的影响.................................................................................................................-56-（一）材料与仪器.............................................................................-56-（二）实验方法.................................................................................-56-（三）实验结果.................................................................................-58-三、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3K-AKT信号传导通路相关基因及蛋白表达的影响........................................................-63-（一）材料与仪器.............................................................................-63-（二）实验方法.................................................................................-64-（三）实验结果.................................................................................-69-讨论....................................................................................................-76-结语....................................................................................................-94-参考文献....................................................................................................-95-附件..................................................................................................-102-查新结论..................................................................................................-105-在读期间发表的论文和著作..................................................................-106-致谢..................................................................................................-107- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探摘要【目的】乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，因此乳腺癌的Ⅱ级预防显得十分重要。如果能在乳腺癌前病变阶段将其阻断，将有助于降低乳腺癌发病机率。现代医学一般采用手术切除或者内分泌药物治疗乳腺癌前病变，但受制于手术的局限性和药物的副作用而无法普及，中医药在此可以发挥优势。本课题在前期工作的基础上，应用“消痰解郁方”干预乳腺癌前病变大鼠和乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，进而验证“消痰解郁方”对乳腺癌前病变的疗效；明确PI3K-AKT信号传导通路与乳腺癌前病变的关系。本课题还从PI3K-AKT信号传导通路的角度探讨消痰解郁方可能的作用机制和有效靶点，为“消痰解郁方”在乳腺癌前病变的治疗，提供现代分子生物学依据。【方法】1.体内实验（1）建立乳腺癌前病变大鼠模型：123只SD雌性大鼠按随机数字表分为4组：空白组15只，DMBA低剂量组（5mg/只）36只，DMBA中剂量组（10mg/只）36只，DMBA高剂量组（20mg/只）36只；对造模组采用DMBA联合雌孕激素序贯法诱导大鼠乳腺癌前病变模型。在8周、10周、12周分批处死大鼠，取乳腺组织或者瘤体，观察病理形态学变化，由此筛选出造乳腺癌前病变大鼠模型的DMBA最优剂量和最佳时间结点。（2）消痰解郁方对DMBA联合雌孕激素序贯法诱导SD雌性大鼠乳腺癌前病变治疗作用及作用机制研究：120只大鼠随机分成2组，空白对照组20只，造模组100只，用上述方法造模。第11周，将造模组按随机数字表分为5组，分别为模型对照组，消痰解郁方低剂量组，消痰解郁方中剂量组，消痰解郁方高剂量组，三苯氧胺组，分别给予相对应的药物灌胃4周。实验结束后处死全部大鼠，无菌条件下取大鼠胸部左侧第二对乳腺及其周围皮肤，制作病理切片进行病理观察和分析；采用WesternBlot法和免疫组化法检测PI3K、AKT、PTEN的表达水平。2.体外实验实验分五组，分别为对照组（CON），消痰解郁方组（XTJY），药物浓度11mg/ml（以生药材计），三苯氧胺组（TAM），药物浓度为0.01mg/ml；抑制剂组（LY），给予PI3K抑制剂LY294002，浓度为16.29μM；消痰解郁方和LY294002联合给药组（XTJY+LY），浓度分别为消痰解郁方11mg/ml（以生药材计），LY294002浓度16.29μM。-1- 第二军医大学博士学位论文（1）采用CCK-8法观察消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响，光学显微镜观察乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的生长状态；（2）流式细胞术检测消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡及细胞周期的影响；（3）用Q-PCR和Westernblot技术检测消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞对PI3K-AKT信号传导通路相关基因和蛋白表达的影响。【结果】1.体内实验（1）造模结果：观察发现第8周、第10周和第12周，空白组未出现癌前病变和浸润性癌，而模型组低、中、高剂量组均有不同程度的一般增生、癌前病变和浸润性癌，结果显示，DMBA联合雌孕激素序贯法诱导SD雌性大鼠，能在大鼠上准确模拟乳腺癌前病变过程。在时间上，第12周造模组癌前病变和浸润性癌较第10周有不同程度加深（P<0.05），且DMBA给药浓度越高，癌前病变和浸润性癌程度越深。随着时间延长，造模组大鼠乳腺组织符合由正常细胞→一般增生(UDH)→不典型增生(ADH)→原位癌(DCIS)→浸润性癌的病变过程。DMBA中剂量组在10周时癌前病变的造模成功率能达到91.7%，与其他各组相比差异有统计学意义（P<0.05）。（2）消痰解郁方对大鼠乳腺癌前病变的治疗作用：空白对照组大鼠有18只为正常乳腺组织，占比90%，仅有2只（10%）出现一般增生；模型对照组14只（70%）大鼠出现癌变，6只（30%）呈癌前病变。经三苯氧胺和消痰解郁方各剂量干预后，各治疗组癌变的比例较模型对照组均有不同程度的降低，其中消痰解郁方高剂量组和三苯氧胺组各有4只（20%）大鼠癌变，消痰解郁方中剂量组有7只（36.8%）癌变，低剂量组有11只（57.9%）癌变，大部分均停留在癌前病变阶段，与模型对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。其中消痰解郁方高剂量组和三苯氧胺组的乳腺癌的发病率均为20%，提示二者的防癌效果相当。（3）消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白表达的影响Westernblot检测结果显示：与空白对照组相比，模型对照组与三苯氧胺组和消痰解郁方各剂量组大鼠乳腺组织PI3K、p-Akt蛋白的表达增加，PTEN表达下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组比较，消痰解郁方低、中、高剂量组大鼠乳腺组织PI3K及p-Akt的表达水平明显下降，PTEN表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）。消痰解郁方各剂量组可以下调乳腺癌前病变模型大鼠乳腺组织PI3K及p-Akt蛋白的表达，上调PTEN表达；其中消痰解郁方高剂量组效果最好，反映出消痰解郁方对大鼠乳腺癌前病变的治疗存在一定的量效关系。与三苯氧胺组进行比较，-2- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探消痰解郁方高剂量上调PTEN下调PI3K及p-Akt的作用优于三苯氧胺（P<0.05）。免疫组化结果显示：与模型对照组相比，消痰解郁方低、中、高剂量组、三苯氧胺组的PTEN蛋白，均有不同程度的表达增强，且消痰解郁方高剂量组PTEN蛋白表达最强。消痰解郁方低、中、高剂量组、三苯氧胺组的PI3K和p-Akt蛋白均有不同程度的表达减弱，且随着消痰解郁方组浓度的增加，PI3K和p-Akt蛋白减弱的程度越高，呈剂量效应关系，其中消痰解郁方高剂量组PI3K和p-Akt蛋白表达较其他给药组减弱最为明显。2.体外试验（1）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响CCK-8结果显示：消痰解郁方组、三苯氧胺组、抑制剂组、消痰解郁方+抑制剂组作用于乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，24h和48h的OD值均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。药物干预48h，消痰解郁方组抑制率69.20±2.53%，三苯氧胺组为43.20±3.87%，抑制剂组为75.40±3.52%，消痰解郁方+抑制剂组为77.82±2.64%，各组抑制率较24h均明显增加，抑制作用随着时间的延长而增强。显微镜下观察，48h后对照组细胞密集成片生长且折光性好；各给药组乳腺癌前病变MCF-10AT细胞数量明显减少，且各组细胞均出现不同程度的坏死，同时出现悬浮状细胞，折光性变差。（2）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡和周期的影响用ANNEXINV-FITC/PI双染流式细胞术检测：消痰解郁方组的凋亡率为43.40±2.71%，三苯氧胺组的凋亡率为33.03±1.60%，抑制剂组凋亡率为40.97±5.70%，消痰解郁方+抑制剂组凋亡率为44.83±8.40%，与对照组7.73±1.41%相比明显增高，差异有统计学意义（P<0.05），且随着用药时间延长凋亡率增加。药物作用48h后，消痰解郁方组、三苯氧胺组、抑制剂组、消痰解郁方+抑制剂组的G1/G0期细胞分别为68.93±0.72%、60.50±1.04%、65.10±3.98%、77.37±1.20%，与对照组39.73±2.87%相比，比例明显升高，提示以上各组可能导致乳腺癌前病变MCF-10AT细胞在G1/G0期阻滞，差异有统计学意义（P<0.05）。细胞周期结果显示，各组药物均能阻滞细胞分化且阻滞作用主要发生在G1/G0期。（3）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3K-AKT信号传导通路相关基因及蛋白的影响Westernblot和Q-PCR结果显示，与对照组比较，消痰解郁方组、三苯氧胺组、抑制剂组、消痰解郁方+抑制剂组中PI3K、AKT蛋白及基因水平表达均有不同程度的下降，PTEN蛋白及基因表达量有不同程度的增加，差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】1.DMBA中剂量（10mg/只）是比较理想的造模剂量，10周也是较为合适的造模时间-3- 第二军医大学博士学位论文结点，可以成功制备乳腺癌前病变大鼠模型。2.PI3K-AKT信号传导通路在乳腺癌前病变阶段已被激活，并和乳腺癌前病变的发生发展与逆转密切相关。3.消痰解郁方能诱导乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的凋亡，对DMBA联合雌孕激素诱导的SD雌性大鼠乳腺癌前病变模型有明确治疗作用，其机制与影响PI3K-AKT信号传导通路、诱导细胞凋亡有关。关键词:消痰解郁方；乳腺癌前病变；PI3K-AKT信号通路；PTEN；乳腺癌前病变MCF-10AT细胞；-4- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探ABSTRACTObjectiveBreastcancerhasthehighestincidenceofmalignancyinwomen,sothelevelⅡpreventionofbreastcancerisveryimportant.Ifthebreastcancercanbeblockedintheprecancerouslesionsstage,itwillhelpreducingtheprobabilityofbreastcancer.Modernmedicinegenerallyadoptssurgicalresectionorendocrinedrugsinthetreatmentofbreastprecancerouslesions.However,duetothelimitationsofsurgeryandsideeffectsofdrugs,thetreatmenteffectisrelativelypoor.TraditionalChineseMedicine,whereas,cantakeitsadvantageshere.Onthebasisofthepreliminarywork,thisstudyusedXiaotanJieyuPrescriptiontointerveneratwithbreastprecancerouslesionsandprecancerouslesionsofbreastcancerMCF-10ATcellsandhenceverifiedtheefficacyofXiaotanJieyuPrescriptiononprecancerouslesionsofbreastcancer;clarifiedtherelationshipbetweenPI3K-AKTsignaltransductionpathwayandbreastprecancerouslesion.ThisstudyalsodiscussedthepossiblemechanismandeffectivetargetofXiaotanJieyuPrescriptionfromtheperspectiveofPI3K-AKTsignaltransductionpathwayandhenceprovidedmodernmolecularbiologicalbasisfortreatmentofprecancerouslesionsofbreastcancerwith"XiaotanJieyuPrescription".Methods1.Invivoexperiments(1)Establishmentofratmodelofprecancerouslesionsofbreast:123SDfemaleratswererandomlydividedintofourgroups:blankcontrolgroup,15rats;DMBAlowdosegroup(5mgeachrat),36rats;DMBAmiddledosegroup(10mgeachrat),36ratsandDMBAhighdosegroup(20mgeachrat),36rats.DMBAcombinedwithestrogenandprogesteronewasusedinsequentialmethodtoinduceratprecancerouslesionmodel.Ratsweresacrificedatweek8,week10andweek12,andbreasttissuesortumorsweretakentoobservethepathologicalchangesofmammarygland,thentheDMBAoptimaldoseandoptimaltimenodeofthemodelofbreastcancerwerescreenedout.(2)StudyonthemechanismofXiaotanJieyuPrescriptiononDMBAcombinedwithestrogenandprogesterone-inducedbreastcancerinSDrats:120ratswererandomlydividedintotwogroups:blankcontrolgroupwith20ratsandmodelgroupwith100rats.Fromthe11thweek,themodelgroupwasrandomlydividedinto5groups:modelcontrolgroup,XiaotanJieyuPrescriptionlowdoesgroup(LDgroup),XiaotanJieyuPrescriptionmediumdosegroup(MDgroup),XiaotanJieyuPrescriptionhighdosegroup(HDgroup),-5- 第二军医大学博士学位论文tamoxifengroup(TAMgroup)andweregiventhecorrespondingintragastricaladministrationfor4weeks.Allratsweresacrificedattheendoftheexperimentandthesecondpairofbreastsandthesurroundingskinweretakenunderthesterilecondition.Thenthepathologicalsectionsweretakenforpathologicalobservationandanalysis.TheexpressionlevelsofPI3K,AKTandPTENweredetectedbyimmunohistochemistryandWesternBlot.2.InvitroexperimentsTheexperimentsets5groups:thecontrolgroup(CON),XiaotanJieyuPrescriptiongroup(XTJY)withadrugconcentrationof11mg/ml(rawmedicine),Tamoxifengroup(TAM)withadrugconcentrationof0.01mg/ml,inhibitorgroup(LY),givenPI3KinhibitorLY294002ataconcentrationof16.29μMandcombinedgroupofXiaotanJieyuPrescriptionandLY294002(XTJY+LY),withaconcentration11mg/ml(rawmedicine)forXiaotanJieyuPrescriptionand16.29μMforLY294002.(1)ObserveeffectsofXiaotanJieyuPrescriptionongrowthinhibitionrateofbreastprecancerouslesionsMCF-10ATcellsbyCCK-8Methodandobservethecells’growthstatewithopticalmicroscope;(2)detecteffectofXiaotanJieyuPrescriptiononapoptoticrateandcellcycleofbreastprecancerouslesionsMCF-10ATcellsbyflowcytometry;(3)detecttheeffectofXiaotanJieyuPrescriptiononPI3K-AKTsignalingpathwayandproteinexpressionwithQ-PCRandWesternblotmethod.Results1.Invivoexperiments(1)Modelingresults：Observationfoundthatthefirst8weeks,10weeksand12weeks,theblankcontrolgroupdidnotappearprecancerouslesionsandinvasivecarcinoma,whilethereweredifferentdegreesofgeneralhyperplasia,precancerouslesionsandinvasivecarcinomainthelow,middleandhighdosegroups.ThisindicatesthatDMBAcombinedwithestrogenandprogesteroneinsequentialmethodcansuccessfullyreplicatethepre-breastcancermodel.Inthe12thweek,theprecancerouslesionandinvasivecarcinomawerethickenedindifferentdegreescomparedwiththe10thweek(P<0.05),andthehighertheconcentrationofDMBA,thedeepertheprecancerouslesionandinvasivecancer.Withtheadvanceoftime,themodelgroupofmammaryglandtissuelesionsisinlinewithbreastcancerstripedcontinuousprocessofNormal→hyperplasia→atypicalhyperplasia→carcinomainsitu→invasivecancer.ForDMBAmid-dosegroup,thesuccessrateofmodelingcanreach91.7%in10thweek.Comparedwiththeothergroups,thiswas-6- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探statisticallysignificant(P<0.05).(2)EffectofXiaotanJieyuPrescriptiononbreastprecancerouslesionsinratsTherewere18normalbreasttissuesintheblankcontrolgroup,accountingfor90%oftherats,andonly2(10%)hadnormalhyperplasiaandinthemodelcontrolgroup,14(70%)ratswerecancerousand6(30%)hadprecancerouslesions.WiththeinterventionbytamoxifenandXiaotanJieyuPrescription,theproportionofcancerineachtreatmentgroupwaslowerthanthatofmodelcontrolgroup.Thereinto,4(20%)ratsinHDgroupandTAMgroupturntocancer,7(36.8%)ratsinMDgroupturntocancer,11(57.9%)ratsinLDgroupturntocancer,andmostofthemremainedintheprecancerousstageandthedifferencesbetweeneachgroupandthemodelcontrolgrouparestatisticallysignificant(P<0.05).TheincidenceofbreastcancerintheHDgroupandTAMgroupwereboth20%,indicatinganidenticalanti-cancereffect.(3)EffectofXiaotanJieyuPrescriptiononexpressionofPI3K-AKTsignaltransductionpathwayinbreastprecancerouslesionrats:WesternBlottestresultsshow:Comparedwiththemodelcontrolgroup,theexpressionofPI3KandP-AktproteininLD,MDandHDgroup,TAMgroupandPI3KandP-Aktproteindecreasedindifferentdegrees,andthedecreaseofXiaotanJieyuPrescriptiongroupandtamoxifengroupwassignificant(P<0.05).PTENproteinexpressionalsoincreasedindifferentdegrees,amongstwhichXiaotanJieyuhighdosegroupandtamoxifengroupincreasedsignificantly(P<0.05).TheexpressionofPI3Kandp-Aktproteininbreasttissueofbreastcancerprecancerousmodelratswasdown-regulatedbyXiaotanJieyurecipeandPTENexpressionwasup-regulateed,wheretheHDgrouphasthebesteffect,whichindicatesthatXiaotanJieyuprescriptionhasadose-effectrelationshipinthetreatmentofbreastprecancerouslesionsinrats.ComparedwithTAMgroup,theeffectofXiaotanJieyuprescriptiononPI3Kandp-Aktwashigherthanthatoftamoxifen(P<0.05).Theimmunohistochemicalresultsshowes:comparedwiththemodelcontrolgroup,theexpressionofPTENproteinwasthehighestinLD,MDandHDgroupsandTAMgroup,andallfourgroupshaveenhancedexpressionsatdifferentextents;theexpressionofPI3KandP-AktinLD,MDandHDgroupsandTAMgroupweredecreasedindifferentdegrees,andwiththeincreaseofthedoseofXiaotanJieyuPrescriptiongroups,PI3KproteinandAKTproteinweakenedtohigherlevels,showingadose-effectrelationship.TheexpressionofPI3KandP-AktproteininHDgroupwasmoreobviousthanthatinothergroups.-7- 第二军医大学博士学位论文2.Invitroexperiments(1)EffectofXiaotanJieyuPrescriptiononproliferationofMCF-10ATcellsinbreastprecancerouslesionsTheCCK-8testresultsindicatethe24hand48hODvaluesofbreastprecancerouslesionsMCF-10ATcellsinthegroupofXiaotanJieyuPrescriptiongroup,TAMgroup,LYgroupandXTJY+LYgroupwerelowerthanthoseincontrolgroupandthedifferencewaswithstatisticalsignificance(P<0.05).Theinhibitoryratesof48hdruginterventionare69.20±2.53%inXTJYgroup,43.20±3.87%inTAMgroup,75.40±3.52%inLYgroupand77.82±2.64%inXTJY+LYgroupandtheinhibitorrateofeachgroupisobviouslyhigherthantheratesof24hdrugintervention.Theinhibitoryeffectispositivelyrelatedwithinterventiontime.Underthemicroscope,thecellsinthecontrolgroupweredenselygrownandtherefractionwasgood;thenumberofbreastprecancerouslesionsMCF-10ATcellsofeachintervenedgroupdecreasedsignificantlyafter24hinterventionandthecellsineachgroupshoweddifferentdegreesofnecrosis,meanwhile,suspendedcellsappearedandtherefractivepropertiesdeteriorated.(2)EffectofXiaotanJieyuPrescriptiononcellcycleandapoptosisofMCF-10ATcellinbreastprecancerouslesionsDetectwiththeemploymentofANNEXINV-FITC/PIdoublestainingflowcytometry:theapoptoticrateofMCF-10ATcellsinthecontrolgroupwas7.73±1.41%,whiletheapoptoticratesofeachdruggroupare43.40±2.71%forChinesemedicinegroup,33.03±1.60%fortamoxifengroup,40.97±5.70%forinhibitorgroup,44.83±8.40%fortraditionalChinesemedicine+inhibitorgroup,whichareobviouslyhigherthanthecontrolgroupandthedifferenceisstatisticallysignificant.Withtheprolongedinterventiontimetheapoptoticrateincreases.ThecellsinG1/G0phaseofXTJYgroup,TAMgroup,LYgroupandXTJY+LYgroupwere68.93±0.72%,60.50±1.04%,65.10±3.98%,77.37±1.20%.Comparedwiththecontrolgroup39.73±2.87%,theproportionwassignificantlyhigher.ThisindicatestheabovegroupsmayleadtobreastprecancerouslesionsMCF-10ATcellsbeingblockedintheG1/G0phase,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).CellcycleresultsshowedeachgroupofdrugscanblockcelldifferentiationandtheblockmainlyoccurredintheG1/G0period.(3)InhibitoryeffectofXiaotanJieyuPrescriptiononPI3K/AktsignalingpathwayinbreastprecancerouslesionsMCF-10ATcells-8- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探WesternblotandQ-PCRresultsshowed,comparedwiththecontrolgroup,theexpressionsofPI3K,P-Akt,AKTproteinandgeneinXTJYgroup,TAMgroup,LYgroupandXTJY+LYgroupweredecreasedindifferentdegrees,PTENproteinandgeneexpressionalsoincreasedtovaryingdegreesandthedifferenceisstatisticallysignificant(P<0.05).Conclusions1.DMBAwith10mgeachratistheidealmodeldose,10weeksisalsomoresuitablemodelingtimenode,andcanbeusedtosuccessfullypreparebreastcancermodelrats.2.PI3K-AKTsignalingpathwayhasbeenactivatedinthestageofprecancerouslesionsofbreastcancerandiscloselyrelatedtothedevelopmentandreversalofbreastprecancerouslesions.3.XiaotanJieyuPrescriptioncaninducetheapoptosisofbreastprecancerouslesionsMCF-10ATcellandithasadefinitetherapeuticeffectonDMBAcombinedwithestrogenandprogesterone-inducedSDfemaleratprecancerouslesionmodel.ItsworkingmechanismisrelatedwithaffectingthePI3K-AKTsignaltransductionpathwayandinducingapoptosisofcells.KEYWORDS：XiaotanJieyuPrescription;Breastprecancerouslesions;PI3K-AKTsignalpathway;PTEN;MCF-10AT-9- 第二军医大学博士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称FBSFetalBovineSerum胎牛血清DMSOdimethylsμlfoxide二甲基亚砜PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素PI3KPhosphoInositide-3Kinase磷脂酰肌醇3-激酶IC50halfmaximalinhibitoryconcentration半抑制浓度ODOpticalDensity吸光度PSPhosphatidylserine磷脂酰丝氨酸PIPropidiumIodide碘化丙啶TEMEDN,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺PMSFPhenylmethanesμlfonylfluoride苯甲基磺酰氟3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-HMTT噻唑蓝-tetrazoliumbromideMNU1-Methyl-1-nitrosourea1-甲基-1亚硝基脲DMBA7,12-Dimethylbenzanthracene二甲基苯蒽-10- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探前言乳腺癌是女性癌症死亡最常见原因之一，其发病率已居全球女性恶性肿瘤的首位，因此，乳腺癌的Ⅱ级预防尤为重要。随着乳腺体检和乳腺自查的普及，以乳腺不典型增生为代表的癌前病变的检出率大大提高。而对乳腺癌前病变的干预是乳腺癌Ⅱ级预防的代表之一。如果在乳腺癌前病变阶段将其阻断，将有助于降低乳腺癌发病率。正常细胞→一般性增生(UDH)→不典型增生(ADH)→原位癌(DCIS)→浸润性癌，被公认为乳腺癌的逐级发展过程。不典型增生可以由量变到质变，发展为恶性肿瘤，但也是可逆与可恢复的。对于乳腺癌前病变采用何种治疗手段，目前饱受争议。手术切除预后好，但患者依从性差、术后影响美观、对患者造成极大心理创伤，也存在过度医疗的争议。药物治疗方面，现代医学多运用以三苯氧胺为代表的选择性雌激素受体拮抗剂，其疗效虽已得到肯定，但此类药物会引起内分泌紊乱，出现一系列不良反应，如子宫内膜癌、子宫肌瘤及肉瘤、静脉血栓栓塞及卵巢癌等，此类风险的存在，也让许多医生和患者对该治疗望而却步。可见，临床上仍缺乏有效治疗乳腺癌前病变的手段。乳腺癌前病变按照传统的中医理论应该归属于“乳癖”与“乳岩”的过渡阶段，不同与一般的乳癖，相比于乳腺癌也是从“量变”发展为“质变”的过程。古代医家认为该病是在正虚邪实的基础上，脏腑功能失调，外感六淫、内伤七情等因素综合作用下，以致毒邪内蕴、血瘀、痰凝、气滞等有形之邪与毒邪相搏结，停滞于乳络而逐渐形成。所以对乳腺癌前病变的病因认识与辨证施治上，与乳腺增生和乳腺癌有区别，但又有一定的相关相续。本课题组前期大量研究表明痰与肿瘤关系密切，用“消痰法”治疗肿瘤效果显著，可以下调多种血管生成因子、粘附分子、致癌基因等，抑制肿瘤细胞生长、复发、转移。在对乳腺癌前病变认识上，魏品康教授认为“痰”和“郁”是乳腺癌前病变产生的基本病机。“消痰解郁方”是魏品康教授总结多年的临床经验确立的中药组方，临床观察发现“消痰解郁方”能有效治疗乳腺癌前病变，减轻甚至逆转病理状态；可延长乳腺癌患者生存时间，预防复发、转移等。但缺乏实验证据，且作用机制尚不明确。研究发现PI3K-AKT信号传导通路在乳腺癌中活化高达70%，其被激活后能产生肿瘤增殖效应，可启动一系列下游基因诱导肿瘤发生发展。学术界对该通路在乳腺癌发生发展及复发转移中的作用机制已深入研究，但在癌前病变中研究甚少，文献鲜有报道。该通路可能与乳腺癌发生过程中的早期事件相关，那能否设想该通路在癌前病变病理状态下就已经启动？-11- 第二军医大学博士学位论文基于以上问题，本研究旨在明确PI3K-AKT信号传导通路与乳腺癌前病变的关系；从体内体外实验研究验证消痰解郁方对乳腺癌前病变的干预作用，并试图从PI3K-AKT信号传导通路揭示该方有效治疗乳腺癌前病变和预防、阻断乳腺癌发生发展的作用机理和作用靶点，为以痰证理论为基础创立的“消痰解郁方”在乳腺癌防治中的指导作用提供现代分子生物学依据。-12- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探第一部分乳腺癌前病变大鼠模型的建立与评价一、DMBA联合雌孕激素序贯法诱导SD雌性大鼠乳腺癌前病变模型（一）材料与仪器1、实验动物6周龄健康未育雌性SD大鼠，体重：190-210g，级别：SPF级，来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号码：SCXK（沪）2013-0016。2、实验药物（1）DMBA东京化成工业株式会社，商品编码：D0677；（2）苯甲酸雌二醇注射液宁波市三生药业有限公司，生产批号：B130902；（3）黄体酮注射液上海通用药业股份有限公司，生产批号：H31021401；（4）0.9％氯化钠注射液浙江天瑞药业有限公司，生产批号：716022605；3、实验试剂名称厂家水合氯醛国药集团化学试剂有限公司甲醛国药集团化学试剂有限公司乙醇国药集团化学试剂有限公司伊红国药集团化学试剂有限公司-13- 第二军医大学博士学位论文苏木素精国药集团化学试剂有限公司硫酸铝钾国药集团化学试剂有限公司一氧化汞国药集团化学试剂有限公司0.02MPBS（pH6.8）武汉谷歌生物科技有限公司4%多聚甲醛武汉谷歌生物科技有限公司二甲苯国药集团化学试剂有限公司中性树脂长征医院病理科提供石蜡上海思域化工科技有限公司4、主要仪器设备名称型号厂家分析天平JA5003NHANGPINGELECTRONICBALANCE医用脱脂纱布上海宏隆医疗用品设备有限公司一次性护理口罩上海宏隆医疗用品设备有限公司无粉乳胶手套海门市如意实验器材厂一次性无菌注射器1ml/2ml/5ml康德莱企业发展集团股份有限公司宠物专用电推剪CP-8000深圳科德士电器有限公司电子数显卡尺上海量具刃具厂电子天平YP1201N上海精密科学仪器有限公司包埋机SYD-BPF誉德电子仪器有限公司石蜡切片机2235德国Leica公司摊片机HI1210德国Leica公司烘片机RL079326DB-B2德国Leica公司显微摄像系统及光学OLYBPUS公司显微镜数码相机860ISCanon公司载玻片上海沪宇生物科技有限公司（二）实验方法1、试剂配制（1）DMBA供试液DMBA溶于食用芝麻油，超声30min，配成DMBA浓度为10mg/ml的混悬液，-14- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探实验中再稀释成相应浓度。（2）10%水合氯醛溶液水合氯醛10g蒸馏水加至100ml（3）0.5%伊红溶液伊红0.5g95%乙醇25ml蒸馏水75ml（4）Harris苏木素苏木素精1g无水乙醇10ml硫酸铝钾20g氧化汞0.5g蒸馏水200ml2、动物饲养与分组SD大鼠123只，用标准饲料和自来水喂养，室温20～25℃，湿度40～70%，分别接受12h日光与黑暗的环境，并定期进行环境消毒。按照每笼5只分笼饲养，大鼠适应性饲养1周后，所有大鼠按随机数字表随机分为4组，空白对照组（BLA）15只，DMBA低剂量组（DLD）36只，DMBA中剂量组（DMD）36只，DMBA高剂量组（DHD）36只。为避免各种不可预知因素带来的影响，实验全程在第二军医大学实验动物中心SPF级房间进行。3、造模方法DMBA按照5mg/只、10mg/只、20mg/只对各造模组大鼠进行一次性灌胃；空白对照组灌胃2ml/只0.9%氯化钠溶液。造模组从DMBA灌胃后第2天开始计算，设置1个周期为5天：第1天至第3天，注射苯甲酸雌二醇，剂量0.5mg/kg，于造模大鼠的后腿内侧；第4天，注射黄体酮注射液4mg/kg于造模大鼠后腿内侧，第5天观察；重复上述操作12个周期；空白对照组不进行任何处理。于第8周、第10周为时间结点，空白组随机处死5只大鼠，各造模组随机处死12只大鼠，观察各组大鼠乳腺组织病理形态学情况。12周后所有大鼠麻醉后处死，进行病理学观察。实验分组情况-15- 第二军医大学博士学位论文见表1。Tab1.TheexperimentalgroupsdetailsGroupsSampleDoseMethodofadministrationQuantityBLA0.9%NaCl2mleachratGavage15DLDDMBA5mgeachratGavage36DMDDMBA10mgeachratGavage36DHDDMBA20mgeachratGavage364、标本采集与指标观察（1）测量体重从实验开始，分别于0周、4周、8周、10周、12周称重大鼠，观察各组体重变化的趋势。（2）观察大鼠一般情况观察大鼠一般情况如进食量、饮水情况及DMBA药物毒性所致的症状和体征，包括有无腹泻或者便血、活动程度是否活跃、反应是否灵敏、毛发是否光泽等。分别于4周、8周、10周、12周检查每只大鼠乳腺部位有无结节、肿块等。（3）乳腺组织形态学观察于实验第8周、10周、12周，用2%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，腹腔注射，30mg/kg，以乳头为中心切取大鼠第2对乳腺组织和皮下组织，切取大小约1.5cm×1.5cm，出现肿瘤者切取肿瘤组织。I.石蜡切片制作①固定：把大鼠乳腺组织标本放置于写有组别号的大试管中（内含10%的中性福尔马林固定液）48h；②切块：把组织肉眼观察后用手术刀切成适当大小，冲洗固定液24h；③脱水：使用30%～100%浓度乙醇按照从低至高的浓度，逐级脱水各1h。脱水瓶中乙醇与组织比例50:1；④透明：组织块从无水乙醇中取出，浸于二甲苯透明2次，每次30min；⑤浸渗：将组织放入自动恒温箱，浸入55℃软蜡中20min，取出后再重复1次；⑥包埋：将浸渗完成的组织块包埋于蜡槽，自然冷却20min；⑦切片：冷却的蜡块，刀片修剪，去掉多余石蜡，使用手摇切片机把蜡块切片，厚-16- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探度约4μm～5μm；⑧展片和粘片：把切好的蜡片放置于40℃温水箱中的水面上，令其完全展开，用载玻片将蜡片捞起，38℃恒温箱烘干，编号。II.苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色①切片后放入60℃烘干箱内1h；②放入二甲苯I中脱蜡15min→放入二甲苯II中脱蜡15min；③无水乙醇中浸泡10min，再转移至95%乙醇中，浸泡2min，再梯度洗脱至90%乙醇中，浸泡2min，最后放入85%乙醇中，浸泡2min；④自来水冲洗2min；⑤苏木素染色：切片浸入苏木素中5min，取出后，用流水冲洗至少5min，再用HCl乙醇分化1min，分化后用流水冲洗至少2min，加入氨水中，浸泡1min，进行返蓝，取出后流水冲洗5min；⑥伊红染色：入伊红5min→自来水冲洗2min；⑦从80%乙醇至无水乙醇，梯度洗脱，每个梯度1min；⑧切片置于二甲苯中15min×2次；⑨中性树胶封片；⑩切片置于显微镜下观察。IV.大鼠乳腺组织学诊断标准乳腺组织病理学分级标准参照2012年WHO肿瘤分类以及最新文献进行判定，将大鼠乳腺组织分为正常乳腺、单纯增生、非典型增生、乳腺癌四种病理类型。①导管上皮一般增生(UDH)：出现边缘窗孔，不规则的窗孔、细胞桥伸展或扭曲，细胞排列呈流水状，细胞核分布不均匀、互相重叠。乳腺上皮细胞表现多样性，其边界不清，细胞核表现多样性。②乳腺非典型增生（ADH）：乳腺导管高度扩张，其上皮层次增多，细胞为单一型或两型，导管腔隙由增生的细胞充塞，并出现细胞间推挤、重叠现象，细胞大小形态各异，染色质增加，偶见核分裂象。另外，不典型增生时乳腺上皮细胞仍保持某种极性排列方式。③乳腺导管内癌（DCIS）：乳腺上皮增生明显，并出现轻度至重度的细胞异型。④浸润性癌（IC）：导管原位癌突破基底膜，浸润到周围的间质绩者脂肪组织，形成腺样、条索样，或者呈单细胞浸润。详见表2。-17- 第二军医大学博士学位论文Tab2.Diagnosticstandardofbreasthistologicalinrats4、统计学处理数据统计应用SPSS19.0软件，以均数±标准差x±s)表示，符合正态分布的数据分析，多组间均数比较采用One-WayANOVA法；组与组之间的两两比较采用最小差异法（Least-SignificantDifference）；若不符合正态分布的，则采用单因子方差分析法分析（Kruskal-Wallis）；组间阳性率比较采用卡方检验（Chi-SquareTest）。若P<0.05，则认为差异具有统计学意义。（三）实验结果1、大鼠的体重变化结果造模开始前各组大鼠体重组间无明显差异，从第8周开始，DMBA低、中、高剂量组与空白对照组呈显著差异（P<0.05），空白对照组体重增加较快，但DMBA各剂量组组间无明显差异；10周、12周时DMBA低剂量组、中剂量组与高剂量组大鼠体重较空白对照组轻，差异具有统计学意义（P<0.05），DMBA组组间无差异。体重变化见表3、图1。Tab3.Changesinweightofratsineachgroups_GroupWeightsofrats（x±s）：g0week4thweek8thweek10thweek12thweekBLA200.90±7.98273.50±17.90347.20±23.03374.30±22.34404.90±34.47***DLD202.80±5.89255.90±14.60299.10±16.66348.10±18.21370.70±34.86***DMD201.10±5.85253.20±11.59298.20±18.00346.70±15.61369.80±22.42-18- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探***DHD199.30±6.34244.90±14.47295.30±23.70339.70±34.86369.50±34.90*P<0.05comparedtoBLAgroup；****Fig1.Changesinweightofratsineachgroups；（P<0.05comparedtoBLAgroup；）2、大鼠一般情况观察结果在DMBA灌胃后，部分大鼠出现了程度较轻的腹泻症状，基本在持续给药2-4周后，症状逐渐消失。空白对照组大鼠毛色正常，光泽度好，活动度好，反应灵敏，观察乳腺部位无明显增大，未有手摸可触及的病变肿块；各造模组大鼠约4周后出现毛色变暗，反应变缓，情绪上易烦躁激怒；空白对照组大鼠未出现肉眼可见的瘤体，各造模组大鼠随着时间的推移，均陆续出现乳腺瘤体，差异有统计学意义（P＜0.05）。从第8周开始，同一时间，高剂量组出现的肉眼可见瘤数较中剂量和低剂量多，证实DMBA乳腺癌呈量效关系。结果见表4，图2，3。Tab4.VisiblebreasttumorsinratsineachgroupsThenumberofbreasttumorsinratsGroup4thweek8thweek10thweek12thweekBLA0/50/50/50/5***DLD0/123/12（25.0%）5/12（41.7%）7/12（58.3%）***DMD0/127/12（58.3%）11/12（91.7%）12/12（100%）***DHD0/129/12（75.0%）11/12（91.7%）12/12（100%）*（P<0.05comparedtoBLAgroup；）-19- 第二军医大学博士学位论文********Fig2.Theincidenceofvisiblebreasttumorsinratsineachgroups（P<0.05comparedtoBLAgroup；）DLDDMDDHDFig3.ThepictureofVisiblebreasttumorsinratsineachgroups3、大鼠乳腺组织形态学观察结果病理结果显示：第8周，空白对照组无一出现癌前病变和浸润性癌，而DMBA低、中、高剂量组均有大鼠出现癌前病变和浸润性癌，说明DMBA联合雌孕激素序贯法能成功地诱导乳腺癌前病变大鼠模型；第10周时，DMBA低、中、高剂量组大鼠乳-20- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探腺组织癌前病变和浸润性癌例数均有增加，其中DMBA中剂量（10mg/只），癌前病变发生率为91.7％，未见癌变；高剂量组癌前病变发生率为66.7%，癌变发生率为25%；第12周时，DMBA中剂量组大鼠乳腺组织癌变发生率为25％；高剂量组癌变发生率为41.7%，说明随着时间推移，DMBA各组大鼠乳腺组织病变符合乳腺癌谱带式发展规律。DMBA高剂量毒性较强，大鼠有致死可能，而且结合病理形态从上述时间结点来看没有好的癌前病变的时间结点，12周时中剂量组25%的大鼠、高剂量组41.7%的大鼠模型已发展为乳腺癌，失去了造癌前病变模型的最佳时机。中剂量组在10周的时候乳腺癌前病变造模成功率能达到91.7%，故而10mg/只是比较理想的造模剂量，10周也是较为合适的造模时间结点。详见表5、6、7，图4、5、6。Tab5.Resultsofbreasttissuepathologicalmorphologyinratsineachgroupsat8thweekGroupnNormalHyperplasiaLesionsCancerBLA55（100%）000DLD1209（75.0%）3（25.0%）0DMD1205（41.7%）7（58.3%）0DHD1203（25.0%）8（66.7%）1（8.3%）Tab6.Resultsofbreasttissuepathologicalmorphologyinratsineachgroupsat10thweekGroupnNormalHyperplasiaLesionsCancerBLA55（100%）000DLD1207（58.3%）5（41.7%）0DMD1201（8.3%）11（91.7%）0DHD1201（8.3%）8（66.7%）3（25.0%）Tab7.Resultsofbreasttissuepathologicalmorphologyinratsineachgroupsat12thweekGroupnNormalHyperplasiaLesionsCancerBLA55（100%）000DLD1205（41.7%）6（50.0%）1（8.3%）DMD12009（75.0%）3（25.0%）DHD12007（58.3%）5（41.7%）-21- 第二军医大学博士学位论文Fig4.TheincidenceofbreastprecancerouslesioninratsineachgroupsNORMALHYPERPLASIALESIONSCANCERFig5.Thepathologicalmorphologyofbreasthistologicalinratsat10thweek-22- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探BLADLDDMDDHDFig6.Thepathologicalmorphologyofbreasthistologicalinratsat10thweek-23- 第二军医大学博士学位论文第二部分消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用及干预机制动物实验研究一、消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠的治疗作用（一）材料与仪器1、实验试剂、仪器同造模实验2、药物（1）消痰解郁方取制南星、柴胡、杭白芍、炒白术、陈皮、制半夏、茯苓、当归、山慈菇等12味中药，8倍量水提取3次，第一次2h，后两次各1h，收集提取液，过滤，浓缩，浓缩液加2倍量乙醇醇沉48h，取上清液滤过，回收乙醇制得浸膏（每ml浸膏相当于生药材3.35g），根据不同给药剂量，用纯化水稀释成相应浓度。（2）三苯氧胺扬子江药业集团有限公司，国药准字H32021472，批号：140102。三苯氧胺1片（10mg/片）加入到10ml无菌的DMSO溶液中，反复震荡直至完全溶解，备用。（二）实验方法1、动物建模雌性未孕、健康、SD大鼠120只，鼠龄出生后6周，体重190-210g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，大鼠的质量许可证编号为：SCXK（沪）2013-0016，动物饲养场地为第二军医大学实验动物中心SPF级房间进行，用常规标准饲料喂养，相对湿度60%～70%，对实验场地定期进行环境消毒。饲养1周后按随机分成2组，空白对照组20只，造模组100只，以5只为一笼喂养，造模方法参照实验：乳腺癌前病变大鼠模型的建立与评价。-24- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探2、药物浓度和分组（1）药物浓度本试验中消痰解郁方设置低、中、高3个剂量组，按体表面积换算大鼠等效剂量，将消痰解郁方低剂量设置为2g（相当于生药材的量）/kg，每日一次，按1：2：4设置消痰解郁方低、中、高3个剂量组分别为2、4、8g/kg。选用临床治疗乳腺癌前病变的药物三苯氧胺作为阳性对照，按体表面积换算成大鼠等效剂量为8mg/kg，每日一次。（2）实验分组第11周起，将造模组98只实验大鼠（2只死亡），分为模型对照组20只、消痰解郁方低剂量组19只、消痰解郁方中剂量组19只、消痰解郁方高剂量组20只、三苯氧胺组20只共5组，同空白组大鼠20只，按随机数字表随机标记，并用记号笔分别标记动物，称定重量，以5只为一笼饲养：I.空白对照组（BLA）：动物数量20只II.模型对照组（MOD）：动物数量20只III.低剂量组（LD）：动物数量19只；IV.中剂量组（MD）：动物数量19只；V.高剂量组（HD）：动物数量20只；VI.三苯氧胺组（TAM）：动物数量20只；4、给药方法各组大鼠第11周开始每天上午给药，连续4周，给药浓度、方式、给药量如下：I.空白对照组（BLA）：0.9%氯化钠注射液灌胃，给药量10ml/kg；II.模型对照组（MOD）：0.9%氯化钠注射液灌胃，给药量10ml/kg；III.低剂量组（LD）：消痰解郁方低剂量灌胃，给药浓度2g/kg，给药量10ml/kg；IV.中剂量组（MD）：消痰解郁方中剂量灌胃，给药浓度4g/kg，给药量10ml/kg；V.高剂量组（HD）：消痰解郁方高剂量灌胃，给药浓度8g/kg，给药量10ml/kg；VI.三苯氧胺组（TAM）：三苯氧胺灌胃，药物给药浓度为8mg/kg，给药量10ml/kg；5、生物表征与一般情况观察指标（1）体重给药后，每周称量大鼠体重1次。-25- 第二军医大学博士学位论文（2）生物表征观察每天观察各组大鼠的一般情况，如毛色、进食量、大便情况、活动情况、精神状态等。（3）肉眼可见肿瘤的发生率及瘤体情况第14周后，处死各组大鼠，观察乳腺肿瘤的发生情况与瘤体数量。计算肿瘤发生率，各组肿瘤发生率＝（本组肿瘤发生例数/本组大鼠数量）；切下肿瘤组织，用卡尺测量肿瘤的大小，天平称定肿瘤的重量，比较各组间差异。（4）脏器指数第14周后，处死各组大鼠，比较各组大鼠胸腺指数与脾脏指数的差异。6、组织形态学观察第14周后，处死各组大鼠，制作大鼠乳腺组织病理切片，方法与病理分类同实验：乳腺癌前病变大鼠模型的建立。观察各组大鼠的病理情况。7、统计学处理数据统计应用SPSS19.0软件，以均数±标准差x±s)表示，符合正态分布的数据分析，多组间均数比较采用One-WayANOVA法；组与组之间的两两比较采用最小差异法（Least-SignificantDifference）；若不符合正态分布的，则采用单因子方差分析法分析（Kruskal-Wallis）；组间阳性率比较采用卡方检验（Chi-SquareTest）。若P<0.05，则认为差异具有统计学意义。（三）实验结果1、生物表征与一般情况观察（1）体重至实验结束时，各组大鼠每周称一次体重，体重统计结果显示：空白对照组大鼠体重增长幅度较其他组高，差异有统计学意义（P<0.05），各治疗组大鼠体重变化幅度组间未见明显差异。见表8、图7。-26- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探Tab8.WeightsofratsineachgroupsaftertreatmentfordifferenttimeWeightsofratsineachgroups（g）Groups10thweek11thweek12thweek13thweek14thweekBLA372.30±24.70394.90±26.95406.20±28.58427.30±30.75435.50±32.40*****MOD356.90±20.62362.60±21.02365.00±23.21375.70±22.44378.80±23.99*****LD349.00±17.62351.70±31.81359.80±15.53369.00±18.41376.70±18.22*****MD351.50±12.83358.70±11.55361.30±13.54372.00±11.27376.50±17.04*****HD346.80±11.21352.50±11.79359.00±11.60368.30±13.50372.30±13.86*****TAM347.10±11.25356.40±11.18358.90±11.93365.50±13.85370.60±26.76*(P<0.05comparedtoBLAgroup;)**********Fig7.Weightsofratsineachgroupsaftertreatmentfordifferenttime(P<0.05comparedtoBLAgroup;)（2）生物表征观察结果空白对照组大鼠毛色光泽鲜亮，活动敏捷，食量及粪便正常，无死亡。灌胃DMBA的造模大鼠前期出现进食量减少，体重减轻，大便不规律，时有腹泻情况，粪便时干时稀，活动能力下降，弓背、皮毛无光泽等症状，后期逐渐性情烦躁，易激惹，大便干等现象。第11周起，治疗组分别给予三苯氧胺和消痰解郁方后，与模型对照组相比，大鼠上述症状有所改善，饮食行动基本恢复正常。相对三苯氧胺组，消痰解郁方各剂量组大鼠易激惹、烦躁不安等症状明显改善。-27- 第二军医大学博士学位论文（3）肉眼可见瘤的发生率及瘤体情况实验结束时，空白对照组未发现肉眼可见瘤；模型对照组大鼠共发现肉眼可见瘤18个，发生率90%；消痰解郁方低剂量组、消痰解郁方中剂量组、消痰解郁方高剂量组分别发现14个、12个和9个肉眼可见瘤，发生率分别为73.7%、63.2%和45%；三苯氧胺组发现10个肉眼可见瘤，发生率为50%。结果显示，模型对照组发现的肉眼可见瘤数明显多于其他各组，说明各组药物治疗均能有效降低肉眼可见瘤的发生率；消痰解郁方各组随剂量增加，肉眼可见瘤发生率逐步降低，提示消痰解郁方在抑制乳腺癌前病变过程中存在剂量效应正比关系。见表9、图8。Tab9.Thenumbersofvisiblebreasttumorineachgroupsaftertreatmentfor4weeksGroupsNNumbersoftumorIncidencerateBLA2000MOD201890%LD191473.7%MD191263.2%HD20945.0%TAM201050.0%Fig8.Theincidenceofvisiblebreasttumorineachgroupsaftertreatmentfor4weeks；各组大鼠最终瘤体体积和重量比较显示，各药物组治疗4周后，瘤体大小与模型对照组相比均不同程度减小，差异具有统计学意义(P<0.05)，证实消痰解郁方确能抑制乳腺肿瘤细胞增殖，且随着药物浓度的增加，疗效明显。见表10，图9，10。-28- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探Tab10.Thevolumeandweightoftumorsineachgroupsaftertreatmentfor4weeks3GroupVolumex±s)(mm)Weightsx±s)(g)BLA————MOD1.20±0.232.36±0.58**LD1.01±0.262.03±0.32**MD0.88±0.341.87±0.38**HD0.71±0.431.65±0.34**TAM0.68±0.411.43±0.32*(P<0.05comparedtoMODgroup;)A****B****Fig9.Thevolumeandweightoftumorsineachgroupaftertreatmentfor4weeks*（A:Volumeoftumors；B:Weightoftumors;P<0.05comparedtoMODgroup;)-29- 第二军医大学博士学位论文MODLDMDHDTAMFig10.Theshapeoftumorsinratsineachgroupsaftertreatmentfor4weeks（4）脏器指数各组脏器指数比较结果显示：各组大鼠的胸腺指数和脾脏指数，空白对照组、模型对照组、消痰解郁方低、中、高剂量组和三苯氧胺组对比，均无明显差异。见表11，图11。Tab11：Thymusindexandspleenindexinratsineachgroupsaftertreatmentfor4weeksGroupNThymusindexSpleenindexBLA200.36±0.240.67±0.12MOD200.31±0.130.64±0.08LD190.32±0.180.64±0.17MD190.31±0.100.68±0.28HD200.32±0.190.68±0.19TAM200.32±0.160.67±0.08A-30- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探BFig11.Visceraindexinratsineachgroupsaftertreatmentfor4weeks（A:Thymusindex；B：Spleenindex）；2、大鼠乳腺组织病理形态学观察实验大鼠乳腺组织病理形态学观察发现：空白对照组大鼠有18只为正常乳腺，占比90%，仅有2只（10%）出现一般增生，镜下观察导管上皮细胞排列规则，未出现癌前病变和浸润性癌等病理情况。模型对照组14只（70%）大鼠出现癌变，6只（30%）呈癌前病变，镜下观察为以中重度非典型增生和浸润性癌为主，大鼠乳腺腺体呈网状、筛状及乳头状排列，周围肌上皮缺乏，细胞核增大不规则、深染，可见坏死；周围结缔组织反应性增生及淋巴细胞浸润。经三苯氧胺和消痰解郁方各剂量干预后，各治疗组癌变的比例较模型对照组均有不同程度的降低，其中消痰解郁方高剂量组和三苯氧胺组各有4只（20%）大鼠癌变，消痰解郁方中剂量组有7只（36.8%）癌变，低剂量组有11只（57.9%）癌变，大部分均停留在癌前病变阶段，有个别大鼠逆转为一般增生。镜下观察，乳腺组织以轻中度非典型增生为主，细胞增生呈实性、筛状、乳头状等，导管可见轻度扩张，细胞增大有一定异型性，细胞极性略紊乱；部分可见单纯增生。与模型对照组比较，三苯氧胺组、消痰解郁方低、中、高剂量组大鼠乳腺组织癌变发生率降低，且剂量效应呈正比关系。其中消痰解郁方高剂量组和三苯氧胺组的乳腺癌发病率均为20%，提示二者的治疗效果相当。见表12，图12，13。-31- 第二军医大学博士学位论文Tab12：Resultsofbreasttissuepathologicalmorphologyinratsineachgroupsaftertreatmentfor4weeksGroupnNormalHyperplasiaLesionsCancerBLA201890%210.0%0000MOD200000630%1470%LD190000844.4%1157.9%MD1900210.5%1052.6%736.8%HD2000525%1155%420%TAM2000420%1260%420%BLAMODLDMDHDTAMFig13.Resultsofbreasttissuepathologicalmorphologyinratsineachgroupsaftertreatmentfor4weeks-32- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探BLAMODLDMDHDTAMFig14.Thepathologicalmorphologyofbreasthistologicalinratsaftertreatmentfor4weeks-33- 第二军医大学博士学位论文二、消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白表达的影响（一）材料与仪器1、试剂TAM名称厂家RIPA裂解液碧云天公司过硫酸氨国药集团化学试剂有限公司Tris国药集团化学试剂有限公司丙烯酰胺国药集团化学试剂有限公司TEMED国药集团化学试剂有限公司DNAEraser百奥莱博生物科技有限公司PMSF国药集团化学试剂有限公司丽春红国药集团化学试剂有限公司ECL显影液Thermo公司MD2、抗体名称货号厂家Anti-PTENantibody（PTEN抗体）货号ab31392，兔多抗Abcam公司Anti-PI3Kp85antibody（PI3K抗体）货号ab189403，鼠单抗Abcam公司Anti-AKT(phosphoT308)antibody货号ab38449，兔多抗Abcam公司（AKT抗体）Anti-betaActinantibody（β-actin抗体）货号ab8226，鼠单抗Abcam公司3、仪器用具名称型号厂家PVDF膜美国Bio-Rad公司电泳仪美国Bio-Rad公司化学发光检测仪LAS-4000Fujifilm公司其余仪器同造模实验-34- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探4、药物同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠的治疗作用。（二）实验方法1、试剂的配制（1）分离胶（10ml）灭菌水3.5ml30%丙烯酰胺3.8ml1.5mol/mlTris-cl2.3ml10%十二烷基硫酸钠0.2ml10%AP0.2mlTEMED4.0μl（2）浓缩胶（4ml）灭菌水2.8ml30%丙烯酰胺0.6ml1.0mol/lTris-cl0.5ml10%十二烷基硫酸钠53.3μl10%AP40μlTEMED5.33μl（3）电转缓冲液：甘氨酸2.9gTris5.8g十二烷基硫酸钠0.37g甲醇200ml蒸馏水加至1000ml（4）TBS缓冲液1mol/LTris.HCl(pH=7.5)30ml氯化钠（NaCl）26.4g蒸馏水加至3000ml-35- 第二军医大学博士学位论文（5）TBST缓冲液20%Tween204.95mlTBS2100ml（6）封闭液脱脂奶粉5gTBST100ml2、动物建模、药物浓度和分组同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠的治疗作用。3、Westernblot检测大鼠乳腺组织PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白（1）操作步骤I.样品准备：切取动物乳腺组织或肿瘤后提取细胞全蛋白。II.全蛋白的提取①蛋白裂解液制备：每1ml预冷的RIPA裂解液中加入4μl蛋白酶抑制剂混合物和10μlPMSF，混匀后放在冰上备用。②使用胰蛋白酶消化液，在4℃温度下，1000rpm/min，离心5min，吸弃培养液，尽可能吸干，收集组织细胞。③用已经预冷的PBS洗涤组织细胞两次，每次洗涤后都尽可能地吸干上清液。6④每5×10个细胞中加入500μl准备好的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡20min；4℃，14000rpm/min，离心15min。⑤离心后迅速把含有组织细胞全蛋白的上清液吸入已预冷的另一支干净EP管中，-80℃保存以供后续实验。III.BCA法蛋白定量①BCA工作液配制：根据样品数量，按50个单位体积BCA试剂A，加入1个单位体积的BCA试剂B，即A:B=50:1的比例，配制适量BCA工作液，使两种试剂充分混匀，临用新配。②取10µl完全溶解的蛋白标准品，稀释至100µl，使蛋白标准品的最终浓度为500µg/ml。③在准备好的96孔板的标准品孔中将分别加入0，1µl，2µl，4µl，8µl，12µl，16µl，20µl已经稀释好的蛋白标准品，不足20µl的用标准品稀释液补足到20µl。-36- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探④在96孔板的样品孔中每孔加入组织细胞所提细胞全蛋白5µl，加标准品稀释液15µl补足到20µl。⑤然后在各孔加入200µl已配制好的BCA工作液，用锡纸包好避光，37℃放置30min。⑥用酶标仪测定各孔在A562的吸光度，并确定标准曲线，根据标准曲线计算出各组全蛋白浓度。IV.Westernblot样品准备①蛋白变性：将样品蛋白按5μg/ml，配制100ml，加入20mlloadingbuffer，混匀，封口后沸水浴变性10-15min，使抗原位点充分暴露。②采用微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，将玻璃板对齐夹好，并先用超纯水检测有无是否漏水，确定无漏水后用干滤纸擦干玻璃板。③按比例配制5ml，10%分离胶备用。④灌胶a)在玻璃板间隙中缓缓加入分离胶，留出一定空间，立即在液面上小心覆盖一层超纯水以隔绝空气，室温下放置15～20min，观察分离胶和水平面处出现明显的分界线时即提示分离胶聚合完成。b)分离胶聚合后，把超纯水倒掉，用滤纸吸干残留在玻璃板上的液体。c)按比例制备3ml，5%浓缩胶。d)把浓缩胶浇灌至玻璃板顶部剩余空间，马上小心插入干净的梳子，避免气泡的出现，如有空隙应补足空隙，室温静置约10～15min。e)浓缩胶聚合后，小心拔出梳子，用微量进样器冲洗梳孔以利于加入蛋白样品。⑤SDS-PAGE电泳a)把配制好的凝胶小心固定到电泳槽上，在电泳槽的内外都加入Trsi-甘氨酸电泳缓冲液。b)将样品加入2×SDSloadingbuffer，20μl蛋白上样，5μlMarker（Prestainedprotieinladder），加入到梳孔中。c)把电源线连接好电泳装置，初始电压80V，观察预染Marker迁移至浓缩胶和分离胶分界处时，把电压调整到110V，按不同蛋白分子量的要求至溴酚兰开始析出后，即为电泳终点，停止操作，时间约55~70min。d)电泳结束后，将玻璃板从电泳装置上卸下。⑥转膜a)将转膜用的膜和滤纸，与胶一同放入转移缓冲液中平衡不少于10min。b)PVDF膜用甲醇浸泡10s，使其饱和并激活，激活后，PVDF膜放入缓冲液中，-37- 第二军医大学博士学位论文平衡不少于5min。c)根据Marker条带的分子量大小做参考，将PAGE胶中含有目标蛋白分子量大小的条带切下，并做好标记，以防方向颠倒。d)依层放置转移装置，装配顺序为海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵，装配后，将气泡赶尽。e)将做好“装置”用夹子夹紧，注意PAGE胶在负极，PVDF膜在正极。将转移缓冲液倒入电转槽中，然后将电转槽置于冰浴中，加入转移缓冲液及冰盒，插上电极，200mA横流转膜1.5h，小分子蛋白转膜时间约为60min，大分子蛋白转膜的时间约90~120min，取出膜。⑦丽春红染色：将取出的膜用丽春红染色3min，初步染色后，用双蒸水进行漂洗，根据不同的大小对目的条带进行裁剪。⑧封闭：将膜置于用脱脂奶粉用、TBST液配制成5%浓度的封闭液中进行封闭，摇匀低速封闭约2h。⑨孵育一抗a)用TBST配制成5%浓度的脱脂奶粉作为抗体稀释液。b)一抗溶液：使用配制好的5%脱脂奶粉抗体稀释液按1:1000稀释一抗。c)孵育一抗：将封闭液中的PVDF膜夹起放入配好的一抗溶液中，4℃过夜，摇床低速慢摇，不超过18h。d)回收一抗：把一抗溶液装入准备好的干净小瓶子里，-20℃保存。⑩孵育二抗a)洗膜：使用1×TBST溶液室温洗膜3次，每次5min，以把残留在PVDF膜上的一抗洗干净。b)稀释二抗：按1：3000的比例稀释二抗。c)孵育二抗：在室温环境下，孵育二抗，不少于2h。○11ECL显色a)使用1×TBST室温洗抗体3次，每次不少于5min。b)将PVDF膜取出，加入化学发光底物（A液：B液=1：1，混匀）。加入ECL显影液后放入化学发光检测仪中进行检测，得值与内参（β-actin）的密度值进行比较V.WesternBlot结果分析用Microteck扫描仪扫描图像对WesternBlot结果进行量化分析，利用Image-J软件记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行分析。-38- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探4、免疫组化法检测大鼠乳腺组织PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白（1）免疫组织化学染色载玻片防脱片剂处理把免疫组化实验用的载玻片放入盛有重铬酸钾和浓硫酸的清洗液中，浸泡清洗24h后取出，置于流水下彻底冲刷干净，再用蒸馏水冲洗3次，然后置于95%乙醇中浸泡12h。取出载玻片，擦干备用。使用APES为防脱片剂，用丙酮：APES=1：49的比例稀释APES，把已清洁的载玻片浸泡于稀释后APES溶液，放置30min。（2）免疫组化染色步骤①脱蜡至水：100％二甲苯脱蜡2次，各5min；无水乙醇浸泡2次，每次5min；95％乙醇，5min，80％乙醇，浸泡5min；70％乙醇，浸泡5min；②蒸溜水冲洗切片5min，再用PBS冲洗2次，每次5min；③将切片放入3%过氧化氢，20min后取出。④PBS冲洗3次，每次5min。⑤切片泡在加热煮沸后的柠檬酸液体里，加热2min后，冷却至室温。⑥切片用PBS进行冲洗，时间为5min×3次。⑦在切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，常温孵育15min后用PBS冲洗3min×3次。⑧除去PBS，将FBS滴加在切片上，室温孵育10min。⑨除去FBS，滴加一抗，37℃，孵育60min。PBS冲洗3min×3次。⑩滴加BCIP/NBT显色试剂，显色30min，蒸馏水冲洗，PBS冲洗3min×3次。⑪除去PBS后，切片上滴加双染増强试剂，常温孵育10min。PBS3min×3次。⑫滴加兔抗大鼠抗体，常温孵育50min。PBS冲洗3min×3次。⑬除去PBS，切片上滴加AEC显色试剂，37℃，显色30min。⑭流水冲洗后，苏木素快速染色15s后取出切片，PBS返蓝，封固，烘干，将切片多余的二甲苯擦拭干净，滴加中性树胶2滴，加盖盖玻片，排空气泡，晾干后进行镜下观察。（3）统计学处理数据统计应用SPSS19.0软件，以均数±标准差x±s)表示，符合正态分布的数据分析，多组间均数比较采用One-WayANOVA法；组与组之间的两两比较采用最小差异法（Least-SignificantDifference）；若不符合正态分布的，则采用单因子方差分析法分析（Kruskal-Wallis）；组间阳性率比较采用卡方检验（Chi-SquareTest）。若P<0.05，则认为差异具有统计学意义。-39- 第二军医大学博士学位论文（三）实验结果1、Westernblot法检测PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白（1）消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠乳腺组织PTEN蛋白表达的影响Westernblot结果显示，给药4周后，各给药组PTEN蛋白表达量分别为空白对照组1.71±0.07，消痰解郁方低剂量组0.35±0.11，消痰解郁方中剂量组0.52±0.05，消痰解郁方高剂量组0.89±0.04，三苯氧胺组0.76±0.05，与模型对照组0.15±0.04比较均显著增强，差异有统计学意义（P＜0.05），消痰解郁方高剂量组表达强于其他各给药组，显示消痰解郁方增强PTEN蛋白表达效果与剂量成正比关系，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表13，图15。Tab13.ExpressionofPTENproteinaftertreatmentfor4weeksGroupnGrayvaluex±s)*BLA31.71±0.07MOD30.15±0.04*LD30.35±0.11*MD30.52±0.05*ΔHD30.89±0.04*TAM30.76±0.05（*P<0.05，comparedtoMODgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）**Δ***-40- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探Fig15.GrayvaluesofPTENproteinaftertreatmentfor4weeks（*P<0.05，comparedtoMODgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）（2）消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠乳腺组织PI3K蛋白表达的影响各给药组PI3K蛋白表达量，空白对照组为0.09±0.02，消痰解郁方低剂量组为0.75±0.09，消痰解郁方中剂量组为0.63±0.10，消痰解郁方高剂量组为0.22±0.04，三苯氧胺组为0.34±0.08，较模型对照组0.92±0.04均有减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中组间比较结果：消痰解郁方高剂量组相比减弱最为明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表14，图16。Tab14.ExpressionofPI3Kproteinaftertreatmentfor4weeksGroupnGrayvaluex±s)BLA30.09±0.02*MOD30.92±0.04LD30.75±0.09*MD30.63±0.10*HD30.22±0.04*ΔTAM30.34±0.08*（*P<0.05，comparedtoMODgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）****Δ*-41- 第二军医大学博士学位论文Fig16.GrayvaluesofPI3Kproteinaftertreatmentfor4weeks（*P<0.05，comparedtoMODgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）（3）消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠乳腺组织p-Akt蛋白表达的影响结果显示：消痰解郁方低剂量组p-Akt蛋白灰度值为0.56±0.07，消痰解郁方中剂量组灰度值为0.39±0.08，消痰解郁方高剂量组灰度值为0.23±0.02，三苯氧胺组灰度值为0.31±0.08，较模型对照组1.12±0.05均显著减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）；消痰解郁方高剂量组较其他各给药组，p-Akt蛋白表达量减弱程度最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表15，图17。Tab15：Expressionofp-Aktproteininratsaftertreatmentfor4weeksGroupnGrayvaluex±s)BLA30.11±0.03*MOD31.12±0.05LD30.56±0.07*MD30.39±0.08*HD30.23±0.02*ΔTAM30.31±0.08*（*P<0.05，comparedtoMODgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）****Δ*-42- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探Fig17：Grayvaluesofp-Aktproteininratsaftertreatmentfor4weeks（*P<0.05，comparedtoMODgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）2、免疫组化法检测PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白（1）消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠乳腺组织PTEN蛋白表达的影响免疫组织化学双重染色法观察细胞增殖状态的分布及形态变化。结果显示PTEN主要表达于细胞浆和细胞膜。显微镜下阳性细胞呈棕黄色，和模型对照组相比，消痰解郁方低剂量组、消痰解郁方中剂量组、消痰解郁方高剂量组、三苯氧胺组均有不同程度的表达增强，图中显示棕黄色区域变大，且消痰解郁方各剂量组中，随着剂量的增加，蛋白的表达逐渐增强；各给药组组间比较结果显示，消痰解郁方高剂量组PTEN蛋白表达最强。见图18。BLAMOD-43- 第二军医大学博士学位论文LDMDHDTAMFig18.ImmunohistochemicalresultsofPTENpotienaftertreatmentfor4weeks（2）消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠乳腺组织PI3K和p-AKT蛋白表达的影响结果显示PI3K主要表达于细胞浆和细胞膜，p-AKT蛋白表达于细胞核。显微镜下阳性细胞呈棕黄色，和模型对照组相比，消痰解郁方低剂量组、消痰解郁方中剂量组、消痰解郁方高剂量组、三苯氧胺组均有不同程度的表达减弱，图中显示棕黄色区域变小，颜色变淡，组间比较结果表明：随着消痰解郁方组的剂量增加，PI3K蛋白和p-AKT蛋白减弱的程度越高，呈剂量效应关系，而各给药组组间比较消痰解郁方高剂量组PI3K和p-AKT蛋白表达较其他给药组减弱最为明显。见图19，20。-44- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探BLAMODLDMDHDTAMFig19.ImmunohistochemicalresultsofPI3Kpotienaftertreatmentfor4weeks-45- 第二军医大学博士学位论文BLAMODLDMDHDTAMFig20.Immunohistochemicalresultsofp-Aktpotienaftertreatmentfor4weeks-46- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探第三部分消痰解郁方对乳腺癌前病变干预机制细胞实验研究一、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响（一）材料与仪器1、试剂名称厂家DMEM/F-12培养基Invitrogen公司FBSInvitrogen公司胰蛋白酶(Trypsin)消化液Invitrogen公司DMSOAmresco公司CCK-8试剂盒日本同仁化学公司EDTA国药集团化学试剂有限公司碳酸氢钠国药集团化学试剂有限公司Hepes国药集团化学试剂有限公司氯化钾国药集团化学试剂有限公司氯化钠国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司无水乙醇国药集团化学试剂有限公司甲醇国药集团化学试剂有限公司甘氨酸国药集团化学试剂有限公司Tris盐酸国药集团化学试剂有限公司2、仪器仪器名称型号厂家CO2培养箱——Thermo公司光学显微镜Ck31Olympus公司普通离心机5415REppendrof公司振荡器Vortexgenie-2基因公司超纯水系统sgavplus型Super-Qplus公司-47- 第二军医大学博士学位论文超净工作台ClassII2085型ThermoForma公司微量移液枪10μl/20μl/100μl/200μl/1000μlEppendrof公司电子天平JJ300G&G公司精密pH计STARTER2100/3CProOHAUS公司酶标仪ELx800Biotek公司细胞培养瓶371Thermo公司恒温水浴箱HWS12上海一恒科技有限公司压力灭菌容器LDZM上海申安医疗器械厂培养板孔数（6孔板）NUNC公司生物显微镜IX73Olympus公司多功能提取罐300L常熟市制药化工机械总厂薄膜蒸发器——前洲干燥机成套设备厂管式分离机GF105-A辽阳制药机械股份有限公司冷冻干燥箱——前洲干燥机成套设备厂平板振荡器TS-1Kylin-bell公司微孔滤膜0.22μmMillipore公司3、细胞乳腺癌前病变MCF-10AT细胞购自上海舜田生物公司4、药物（1）消痰解郁方取制南星、柴胡、杭白芍、炒白术、陈皮、制半夏、茯苓、当归、山慈菇等12味中药，8倍量水提取3次，第一次2h，后两次各1h，收集提取液，过滤，浓缩，浓缩液加2倍量乙醇醇沉48h，取上清液滤过，回收乙醇制得浸膏（每ml浸膏相当于生药材3.35g）。浸膏加5倍量水，1200rpm/min，10min，离心，弃去残渣，上清液过滤，-80℃冻干，培养液流通蒸汽灭菌30min，将浸膏冻干粉溶解其中，0.22μm微孔滤膜除菌过滤，即得消痰解郁方浸膏保存液，浓度为10mg/ml(每ml保存液相当于生药材0.22g)。（2）三苯氧胺扬子江药业集团有限公司，国药准字H32021472，批号：140102。取三苯氧胺片剂1片（10mg/片）加入到10ml无菌的DMSO溶液中，反复震荡直至完全溶解，备用。-48- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探（3）LY294002（PI3K激酶选择性抑制剂）Sigma公司提供，货号L9908-1MG。将LY294002干粉5mg，溶解于无菌的DMSO溶液325μl中，配制成50mmol/L的LY294002溶液，并将溶液在-20℃冰箱储存，使用前稀释成指定的浓度。（二）实验方法1、试剂的配制（1）DMEM/F-12培养基的配制取灭菌蒸馏水，加入DMEM/F-12培养基粉末，按0.27g/100ml的比例加入NaHCO3，0.25g/100ml的比例加入Hepes搅拌至完全溶解，定容，0.22μm的微孔滤膜除菌过滤，滤液储存于4℃的冰箱内。（2）1XPBS的配制氯化钠（NaCl）8g氯化钾（KCl）0.2g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）1.44g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g蒸馏水加至1000ml调整溶液pH至7.2~7.4，高压蒸汽灭菌20min（3）细胞冻存液（5ml）FBS1mlDMEM/F-123.5mlDMSO0.5ml2、细胞培养5乳腺癌前病变MCF-10AT细胞是单层贴壁细胞，42℃水浴复苏后按4x10个/ml的量铺板，使用含10%FBS的DMEM/F-12培养液，5%二氧化碳细胞培养箱37℃培养细胞。2~3天换液一次，每天显微镜下察看乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的生长状况。-49- 第二军医大学博士学位论文（1）细胞冻存取将处于对数生长期的乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，置于离心管，使用胰蛋白酶(Trypsin)消化液，消化单层生长的乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，使之脱壁，800xg离心5min，弃去上层的胰蛋白酶消化液和培养液，加入预先调配好的细胞冻存液约2ml；胶头滴管将细胞轻轻吹打均匀，小心倒入冻存管，密封保存，在显著位置写上细胞名称和冻存时间；将冷冻管依次放入4℃冰箱放存30min，-20℃冰箱放存3h，-80℃冰箱中过夜，最后浸入液氮容器内存放。（2）细胞复苏为了防止冻伤，从液氮罐中拿取冻存管时，应佩戴专用的眼镜和手套，取出后应该以最快地速度置于42℃水浴箱中解冻，一边加热一边摇晃，尽量使细胞在1min全部融化，置于无菌环境下，按无菌操作将解冻的乳腺癌前病变MCF-10AT细胞吸至已加入5ml培养液的离心管中，800xg，离心4min，将上清液倒弃后，重新加入培养液并吹打细胞，使之成悬浮单胞状，最后接种培养。（3）细胞传代由于乳腺癌前病变MCF-10AT细胞生长较缓慢，可2~3天换液一次，4~6天传代一次。传代开始后，首先，将原培养液倒弃，用预先配制好的1×PBS，清洗乳腺癌前病变MCF-10AT细胞2次；细胞用胰蛋白酶(Trypsin)消化液消化1-3min，由于乳腺癌前病变MCF-10AT细胞生长体积较大，贴壁能力强，传代时用胰酶消化充分；在消化的同时，用显微镜观察细胞，当细胞形态开始变圆时，加入5%FBS/DMEM/F-12培养液结束消化。用胶头滴管吹打细胞，使之完全脱壁，将吹打好的单细胞悬液转入干净的EP管中，调整离心机转速至500xg，离心5min，按1：2传代。3、药物浓度和分组（1）药物浓度筛选4将培养状态良好，处于对数生长期的乳腺癌前病变MCF-10AT细胞按1×10个/ml的密度接种至96孔板中，每孔接种100μl，完全培养基培养24h。I.消痰解郁方药物浓度筛选：消痰解郁方保存液倒入50ml离心管中，2000rpm/min离心10min后去除沉淀，取上清液移至另外的50ml离心管中，分别按1：5、1：10、1：20、1：30、1：50及1：100稀释，稀释后溶液相当于生药材分别为44mg/ml、22mg/ml、11mg/ml、7.3mg/ml、4.4mg/ml和2.2mg/ml，稀释好的中药分别加入上述-50- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探的细胞，待药物作用24h后，换液并每孔加入10μl的CCK-8试剂，设置阴性对照后继续培养2h，将培养完全的细胞吸入新的96孔板中，用酶标仪于450nm分别检测各组吸光度值，每个浓度重复3次。II.三苯氧胺组药物浓度筛选：取配制好的三苯氧胺供试液，按照1：20、1：50、1：100、1：200、1：500及1：1000进行稀释，分别对应的药物浓度为0.05mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.002mg/ml和0.001mg/ml，加入培养好的细胞内处理。待药物作用24h后，换液并每孔加入10μl的CCK-8试剂，设置阴性对照后继续培养2h，将培养完全的细胞吸入新的96孔板中，用酶标仪于450nm分别检测各浓度吸光度值，每个浓度重复3次。通过Granfpadprism软件计算出各组的IC50值，绘制标准曲线。实验结果表明：消痰解郁方的IC50值的浓度为11mg/ml，三苯氧胺IC50值的浓度为0.01mg/ml，两者均对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞有抑制作用，且随着浓度的增高，对细胞增殖的影响越大，成剂量依赖关系，并将上述药物浓度确定为体外细胞实验的消痰解郁方和三苯氧胺的药物浓度。见图1。ABFig1.EffectofXTJYgroupandTAMgrouponproliferationinMCF-10ATcellswithdifferentconcentrationafter24h(A:XTJYgroup;B:TAMgroup)（2）实验分组I.对照组（CON）II.消痰解郁方组（XTJY）：消痰解郁方组，药物浓度以生药材计为11mg/ml；III.三苯氧胺组（TAM）：三苯氧胺组，药物浓度为0.01mg/ml；IV.抑制剂组（LY）：LY294002组，药物浓度为16.29μM（0.005mg/ml）；V.消痰解郁方+抑制剂组（XTJY+LY）：消痰解郁方和LY294002联合给药组，浓-51- 第二军医大学博士学位论文度分别为消痰解郁方11mg/ml（以生药材计），LY294002浓度16.29μM。4、CCK-8法检测药物对细胞的抑制率4将乳腺癌前病变MCF-10AT细胞调整浓度为1×10个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，细胞分组、给药。细胞培养于37℃、5%CO2培养箱，24h及48h后，更换培养基，加入10μlCCK-8继续培养3h，设置空白组，450nm处检测OD值，重复3次。计算细胞抑制率：细胞抑制率(%)=(1-（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值)）×100%。5、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞生长状态的影响4取处于对数生长期的乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，将细胞调整浓度为1×10个/ml，每孔100μl接种于96孔板。置于37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养24h。然后依次加入药物，设置对照组，继续培养24h后，置显微镜下观察各组细胞生长及形态变化。6、统计学处理数据统计应用SPSS19.0软件，以均数±标准差x±s)表示，符合正态分布的数据分析，多组间均数比较采用One-WayANOVA法；组与组之间的两两比较采用最小差异法（Least-SignificantDifference）；若不符合正态分布的，则采用单因子方差分析法分析（Kruskal-Wallis）；组间阳性率比较采用卡方检验（Chi-SquareTest）。若P<0.05，则认为差异具有统计学意义。（三）实验结果1、消痰解郁方对乳腺癌前病变细胞MCF-10AT的生长抑制作用药物作用24h细胞的OD值：消痰解郁方组为0.82±0.03，三苯氧胺组为1.22±0.03，抑制剂组为0.89±0.02，消痰解郁方+抑制剂组为0.55±0.04与对照组1.68±0.02相比明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。48h细胞的OD值：消痰解郁方组为0.54±0.02，三苯氧胺组为0.98±0.03，抑制剂组为0.61±0.02，消痰解郁方+抑制剂组为0.36±0.04，各组与对照组2.48±0.03相比显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。24h、48h结果显示，消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的增殖抑制作用，与三苯氧胺相比效果更明显，差异有统计学意义（P<0.05）；消痰解郁方+抑制剂组对细胞增殖影响最为显著。24h消痰解郁方组抑制率为51.20±4.27%，三苯氧胺组为27.38±3.07%，抑制剂组-52- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探为46.40±2.85%，消痰解郁方+抑制剂组为67.90±4.67%，显示各组药物对细胞均有抑制作用，消痰解郁方+抑制剂组较其他组效果明显；48h消痰解郁方组抑制率69.20±2.53%，三苯氧胺组43.20±3.87%，抑制剂组75.40±3.52%，消痰解郁方+抑制剂组77.82±2.64%，各药物组抑制率较24h均明显增加，显示各药物对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞抑制作用随着时间的延长而增强，消痰解郁方组与三苯氧胺组组间相比，抑制效果更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表16，图21，22。Tab16.EffectofeachgroupsonproliferationandinhibitionrateinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor24hand48h;24h48hDvaluex±s)Inhibitionratex±s)Dvaluex±s)nhibitionratex±s)*Δ**#Δ*#ΔXTJY0.84±0.0351.20±3.11%0.54±0.0269.20±3.19%***#*#TAM1.22±0.0327.38±2.93%0.98±0.0343.20±2.39%***#*#LY0.89±0.0246.40±3.91%0.61±0.0275.40±3.69%***#*#XTJY+LY0.55±0.0467.90±2.66%0.36±0.0477.82±3.54%CON1.68±0.02——2.48±0.03——#（*P<0.05，comparedtoCONgroup;P<0.05，comparedto24hofsamegroups;ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）**#***#Δ*#**#Fig21.EffectofeachgroupsonproliferationinMCF-10ATcells（*P<0.05，comparedto#CONgroup;P<0.05，comparedto24hofsamegroups;ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）-53- 第二军医大学博士学位论文*#*#*#Δ****#*#Fig22.EffectofeachgroupsoninhibitionrateinMCF-10ATcells（P<0.05，comparedto24hofsamegroups；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）2、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞生长状态的影响在显微镜下观察，对照组乳腺癌前病变MCF-10AT细胞生长状态良好，大小均一，连接紧密，密集成片生长且折光性好。各给药组作用48h后，显微镜下观察可见，乳腺癌前病变MCF-10AT细胞数量明显减少，且各组细胞均出现不同程度的坏死，同时逐渐出现悬浮状细胞，折光性越来越差。见图23。XTJYTAM-54- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探LYXTJY+LYCONFig23.MorphologyofeachgroupsinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h-55- 第二军医大学博士学位论文二、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡和周期的影响（一）材料与仪器1、试剂名称厂家FITC-AnnexinVapoptosisdetectionkitBDPharmingen公司Tween-20国药集团化学试剂有限公司多聚甲醛国药集团化学试剂有限公司叠氮化钠国药集团化学试剂有限公司RNaseABDPharmingen公司其余同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响2、仪器仪器名称厂家流式细胞仪BDPharmingen公司其余同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响（二）实验方法1、试剂的配制（1）0.1mol/L的PBS氯化钠（NaCl）8.5g氯化钾（KCl）0.2g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.85g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.27g蒸馏水100ml调整溶液pH至7.2~7.4，高压蒸汽灭菌20min（2）4%多聚甲醛溶液称取0.4g多聚甲醛，置于容量瓶中，加入5ml，0.1mol/L的PBS，水浴加热至约65℃，-56- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探不停搅拌，使多聚甲醛完全溶解在PBS中，滴加1～2滴1mol/L氢氧化钠，使溶液清澈，加0.1mol/L的PBS至10ml，充分混匀，即得。（3）0.25mg/mlRNaseA取2.5mgRNaseA置于10mlEP管中，加入8ml灭菌水，充分混合溶解之后定容至10ml，100℃煮沸15min，缓慢冷却至室温，1ml/管分装后，置于-20℃冰箱内保存。其余试剂配制同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响。2、细胞培养、药物和实验分组同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响3、流式细胞术检测消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的凋亡和周期影响（1）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡的影响4I.将乳腺癌前病变MCF-10AT细胞浓度调整为1×10个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，置于5%二氧化碳培养箱中培养，培养温度37℃，观察细胞是否贴壁生长，若细胞贴壁后，立即更换对照组的培养液。各药物组加入各实验用药，分别继续培养24h及48h后，用胰蛋白酶(Trypsin)消化液消化乳腺癌前病变MCF-10AT细胞。II.取1ml的乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，1000rpm/min，4℃离心10min，弃去上清液。III.沉淀加入1ml预冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm/min，4℃离心10min，弃去上清液，重复2次。IV.细胞沉淀用200μl1X标记缓冲液，将乳腺癌前病变MCF-10AT细胞重悬。V.每管分别加入5μl的FITCAnnexinV和5μl的PI，轻轻摇晃，均匀后室温（25℃）避光孵育30min。VI.每管加入400μl的1X标记缓冲液，在1h内用流式细胞仪上机分析，每组重+-++复3次。以FITC/PI为早期凋亡的判断指标，FITC/PI为晚期凋亡的判断指标，以ModFitLT软件分析计算细胞凋亡率。（2）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞周期的影响4将乳腺癌前病变MCF-10AT细胞浓度调整为1×10个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，置于5%二氧化碳培养箱中培养，培养温度37℃，观察细胞是否贴壁生长，若细胞贴壁后，立即更换对照组的培养液。各药物组加入各实验用药，细胞在继续培-57- 第二军医大学博士学位论文养24h及48h后，用胰酶消化后，4℃，1000rpm/min离心5min，弃去上清液，细胞沉淀用预冷的PBS洗2-3遍。加入15μl4%多聚甲醛及200μl预冷的PBS，立即混匀，4℃孵育30min后，4℃，2000rpm/min离心5min。用200μl含0.2%Tween-20的PBS，室温下重悬，37°C的环境下，孵育30min。加入300μl的含1%FBS、0.1%叠氮化钠的PBS洗液，4℃1500rpm/min，离心5min。除去上层清澈液体，沉淀物用100μlPBS重新震荡悬浮细胞，同时加入10μg/mlPI和0.25mg/mlRNaseA，4°C，置于避光环境下，孵育不少于30min。加入1ml预冷的PBS后，4℃，2000rpm/min离心5min，进行清洗，弃去上清液，沉淀用200μlPBS重悬后上流式细胞仪进行分析，每组重复3次。4、统计学处理数据统计应用SPSS19.0软件，以均数±标准差x±s)表示，符合正态分布的数据分析，多组间均数比较采用One-WayANOVA法；组与组之间的两两比较采用最小差异法（Least-SignificantDifference）；若不符合正态分布的，则采用单因子方差分析法分析（Kruskal-Wallis）；组间阳性率比较采用卡方检验（Chi-SquareTest）。若P<0.05，则认为差异具有统计学意义。（三）实验结果1、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，给药48h后，消痰解郁方组的凋亡率为43.40±2.71%，三苯氧胺组的凋亡率为33.03±1.60%，抑制剂组凋亡率为40.97±5.70%，消痰解郁方+抑制剂组凋亡率为44.83±8.40%，与对照组7.73±1.41%相比均有明显增高，差异有统计学意义（P<0.05），组间比较，消痰解郁方组对细胞凋亡的影响优于三苯氧胺组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表17，图24、25。Tab17.ApoptosisratesofeachgroupsinMCF-10ATcellsafter48hNApoptosisrate*ΔXTJY343.40±2.71%*TAM333.03±1.60%*LY340.97±5.70%*XTJY+LY344.83±8.40%CON37.73±1.41%（*P<0.05，comparedtoCONgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）-58- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探**Δ**Fig24.ApoptosisrateofeachgroupsinMCF-10ATcellsafter48h（*P<0.05，comparedtoCONgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）XTJYTAMLYXTJY+LY-59- 第二军医大学博士学位论文CONFig25.FlowcytometryapoptosispicturesofeachgroupsinMCF-10ATcellsafter48h2、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞周期的影响药物作用48h后，消痰解郁方组、三苯氧胺组、抑制剂组、消痰解郁方+抑制剂组的G1/G0期细胞分别为68.93±0.72%、60.50±1.04%、65.10±3.98%、77.37±1.20%与对照组相比39.73±2.87%相比，比例明显升高，提示以上各组可能导致乳腺癌前病变MCF-10AT细胞在G1/G0期阻滞，差异有统计学意义（P<0.05）；各给药组S期的细胞为，消痰解郁方组14.27±0.42%，三苯氧胺组18.07±0.65%，抑制剂组15.13±1.56%，消痰解郁方+抑制剂组7.94±0.37%，较对照组22.67±3.01%均有所减少，差异有统计学意义(P<0.05)；各给药组G2/M期细胞分别为消痰解郁方组12.63±0.97%，三苯氧胺组16.67±0.59%，抑制剂组16.07±2.57%，消痰解郁方+抑制剂组5.02±0.54%与对照组31.03±2.44%相比亦呈明显下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；细胞各期结果显示，各组药物均在阻滞细胞周期上具有作用，消痰解郁方组与三苯氧胺组相比，阻滞效果更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表18、图26、27。Tab18.EffectofeachgroupsonchangeofcellcycleinMCF-10ATcellsafter48hG0/G1SG2/MXTJY68.93±0.72%*Δ14.27±0.42%*Δ12.63±0.97%*ΔTAM60.50±1.04%*18.07±0.65%*16.67±0.59%*LY65.10±3.98%*15.13±1.56%*16.07±2.57%*XTJY+LY77.37±1.20%*7.94±0.37%*5.02±0.54%*CON39.73±2.87%22.67±3.01%31.03±2.44%（*P<0.05，comparedtoCONgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）-60- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探**Δ***Δ*****Δ**Fig26.EffectofeachgroupsonchangeofcellcycleinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h（*P<0.05，comparedtoCNgroup;ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）XTJYTAMLYXTJY+LY-61- 第二军医大学博士学位论文CONFig27.FlowcytometrypicturesofcellcycleinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h-62- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探三、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3K-AKT信号传导通路相关基因及蛋白表达的影响（一）材料与仪器1、试剂名称厂家RIPA裂解液碧云天公司过硫酸氨国药集团化学试剂有限公司Tris国药集团化学试剂有限公司丙烯酰胺国药集团化学试剂有限公司TEMED国药集团化学试剂有限公司DNAEraser百奥莱博生物科技有限公司PMSF国药集团化学试剂有限公司丽春红国药集团化学试剂有限公司ECL显影液Thermo公司BCA(BicinchoninicAcid)蛋白定量试剂盒碧云天公司（货号：BCA1-1KT，Sigma）焦碳酸二乙酯国药集团化学试剂有限公司其余同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响。2、抗体名称货号厂家Anti-PTENantibody（PTEN抗体）货号ab31392，兔多抗Abcam公司Anti-PI3Kp85antibody（PI3K抗体）货号ab189403，鼠单抗Abcam公司Anti-AKT(phosphoT308)antibody货号ab38449，兔多抗Abcam公司（AKT抗体）Anti-betaActinantibody（β-actin抗体）货号ab8226，鼠单抗Abcam公司3、仪器名称型号厂家PVDF膜美国Bio-Rad公司电泳仪美国Bio-Rad公司-63- 第二军医大学博士学位论文化学发光检测仪LAS-4000Fujifilm公司蛋白电泳仪——Bio-Rad公司化学发光检测仪——Fujifilm公司Real-TimePCR仪7500型ABI公司其余同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响。（二）实验方法1、试剂的配制（1）浓度10%分离胶（10ml）三重蒸馏水3.5ml丙烯酰胺溶液（30%）3.6ml1.5MTris2.6ml十二烷基硫酸钠（10%）0.12ml过硫酸氨溶液（10%）0.13mlTEMED4μl（2）浓度5%体积3ml/胶灭菌用水2.2ml丙烯酰胺溶液（30%）0.4ml1MTris0.4ml十二烷基硫酸钠（10%）0.02ml过硫酸氨溶液（10%）0.02mlTEMED3μl2、细胞培养、药物浓度与实验分组同实验：消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖的影响。3、Q-PCR检测PI3K-AKT信号传导通路相关基因的表达（1）检测方法I.引物设计与合成根据GeneBank中查找PTEN、PI3K、AKT基因序列，送交上海舜田生物科技有-64- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探限公司合成引物，引物序列如下II.实验样本的制备当细胞生长融合至50％～60％时，向乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的培养液加入不同药物，作用48h。细胞总RNA的提取与纯化：①细胞收集：在装有RNA酶的6EP管中，收集乳腺癌前病变MCF-10AT细胞5×10个，置于离心机上，以1000rpm/min的速度，离心5min，用1×PBS洗涤细胞2次，2000rpm/min的速度，离心5min，将细胞收集完成。②RNA抽提：a)吸弃培养液，将1mlTRIzol加入离心管中，使细胞重新悬浮，并反复振荡离心管，使乳腺癌前病变MCF-10AT细胞与裂解液充分接触，室温放置10min，使乳腺癌前病变MCF-10AT细胞核酸蛋白复合物能充分裂解。b)再加入200μl体积的氯仿，用力上下振摇15秒，室温放置10~15min；4°C，12000rpm/min离心15min，此时样品分成三层：下层红色有机相，中间层和上层无色水相，乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的总RNA主要在水相中。c)收集400μl含RNA上层水相转移至另一新的RNA酶free1.5ml的离心管中，一定注意不要吸到中间层和红色有机相层。d)加入异丙醇400μl，颠倒混匀，室温环境静置20min，使之充分反应；10000rpm/min，4°C，离心机离心15min，将上清液倒去，吸干，此时，细胞总RNA沉于离心管管底；-65- 第二军医大学博士学位论文e)向细胞沉淀加入75%乙醇-焦碳酸二乙酯溶液1ml，将离心管置于离心机内，以10000rpm/min转速，4°C离心15min，倒去上层澄明液体，自然晾干，注意不要过于干燥，否则很难溶解；加入40μlDEPC水充分溶解RNA56°C溶解沉淀；用紫外分光光度计在260nm波长处，检测RNA浓度。③电泳鉴定：对所提取的RNA定量检测，变性胶电泳后，检查是否降解。III.逆转录与Real-timePCR操作步骤①目的基因逆转录与Q-PCR检测反应体系：5xgDNAEraserbuffer4μlTotalRNA2uggDNAEraser2μlRnaseFreewater加至20μl反应条件：42℃3min4℃∞按照上述反应体系4℃保存。以上这一步为去除RNA中可能混有的基因组DNA，去除基因组DNA后进行逆转录反应。反应液配制全程在冰上操作。反应体系：5xPrimescriptbuffer8μlRTPrimermix2μlPrimescriptEnzymemix12μl上一步的反应液20μlRnaseFreewater加至40μl反应条件：37℃20min85℃7s4℃∞按上述反应体系，在PCR扩增仪上进行，37℃孵育15min，然后85℃孵育5s，之后放置于4℃保存备用。IV.进行荧光定量PCR反应逆转完成后，按1：20进行稀释。-66- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探反应体系：SYBRPremixEXTaq（2x）20μlForwardPrimer0.8μlReversePrimer0.8μlROXReferenceDyell0.8μlDNA4.0μl蒸馏水（流通蒸汽灭菌）13.6μl反应条件：第一阶段：预变性Reps：195℃30s第二阶段：PCR反应Reps：4095℃5s60℃34s第三阶段：溶解曲线Reps：195℃15s60℃1min95℃15s将目的基因与内参（β-actin）进行比较后，得到目的基因RNA表达量。V.Q-PCR实验结果分析△△Ct结果使用Bio-RadCFXManager荧光定量软件进行分析用公式2-方法进行相对定量。首先计算△Ct=（基因Ct值-β-actinCt值），然后计算△△Ct=（实验处理组的△Ct-△△Ct-△△Ct对照组的△Ct），再计算2-，以空白组基因表达水平为1，2次幂，即是实验组目的基因表达相对于空白组的变化倍数。（3）各相关基因扩增动力学曲线样品中PTEN、PI3K、AKT及内参GAPDH的扩增动力学曲线有明显的指数增长期，曲线整体具备较好的平行性，基线基本保持水平，扩增曲线的指数期在低浓度样本中依旧明显。见图28、29、30。-67- 第二军医大学博士学位论文Fig28.AmplificationcurveandmeltingcurveofPTENFig29.AmplificationcurveandmeltingcurveofPI3KFig30.AmplificationcurveandmeltingcurveofPI3K4、Westernblot检测PI3K-AKT信号传导通路相关蛋白的表达（1）操作步骤I.细胞准备：选取对数生长期乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，当细胞生长融合至50％～60％时，向乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的培养液加入不同药物，作用48h后提取细胞全蛋白。后续步骤同动物实验Westernblot操作方法。-68- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探5、统计学处理数据统计应用SPSS19.0软件，以均数±标准差x±s)表示，符合正态分布的数据分析，多组间均数比较采用One-WayANOVA法；组与组之间的两两比较采用最小差异法（Least-SignificantDifference）；若不符合正态分布的，则采用单因子方差分析法分析（Kruskal-Wallis）；组间阳性率比较采用卡方检验（Chi-SquareTest）。若P<0.05，则认为差异具有统计学意义。（三）实验结果1、Q-PCR检测结果（1）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PTENmRNA表达的影响Q-PCR结果显示：PTENmRNA表达倍数值消痰解郁方组为2.49±0.07，三苯氧胺组为1.53±0.12，抑制剂组3.24±0.09，消痰解郁方+抑制剂组3.77±0.43，均较对照组1.09±0.10明显增加（P<0.05），显示各组均可增强PTENmRNA的表达，组间比较结果：消痰解郁方组较三苯氧胺组增加明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见表19，图31。Tab19.ResultsofReal-timeQuantitativePCRdetectingonmRNAofPTENinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48hnMμltiplevaluesx±s)*ΔXTJY32.49±0.07*TAM31.53±0.12*LY33.24±0.09*XTJY+LY33.77±0.43CON31.09±0.10（*P<0.05，comparedtocontrolgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）-69- 第二军医大学博士学位论文***Δ*Fig31.ResultsofReal-timeQuantitativePCRdetectingonmRNAofPTENinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h（*P<0.05，comparedtoCONgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）（2）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3KmRNA表达的影响PI3KmRNA表达倍数值：消痰解郁方组0.64±0.04，三苯氧胺组0.71±0.06，抑制剂组0.29±0.01，消痰解郁方+抑制剂组0.13±0.02，较对照组0.91±0.09明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。证实消痰解郁方能有效抑制PI3KmRNA表达，且消痰解郁方+抑制剂组抑制能力最强。组间比较结果，消痰解郁方组与三苯氧胺组相比无统计学差异。见表20，图32。Tab20.ResultsofReal-timeQuantitativePCRdetectingonmRNAofPI3KinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48hnMμltiplevaluesx±s)*XTJY30.64±0.04*TAM30.71±0.06*LY30.29±0.01*XTJY+LY30.13±0.02CON30.91±0.09（*P<0.05，comparedtoCONgroup；）-70- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探****Fig32.ResultsofReal-timeQuantitativePCRdetectingonmRNAofPI3KinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h（*P<0.05，comparedtoCONgroup；）（3）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞AKTmRNA表达的影响AKTmRNA表达倍数值：消痰解郁方组0.81±0.06，三苯氧胺组为0.87±0.08，抑制剂组为0.87±0.04，消痰解郁方+抑制剂组0.77±0.06，较对照组0.94±0.06有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果显示：消痰解郁方能有效抑制AKTmRNA表达，且消痰解郁方+抑制剂组抑制能力最强。组间比较结果，消痰解郁方组与三苯氧胺组相比无统计学差异。见表21，图33。Tab21.ResultsofReal-timeQuantitativePCRdetectingonmRNAofAKTinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48hnMμltiplevaluesx±s)XTJY30.83±0.06*TAM30.87±0.08*LY30.79±0.04*XTJY+LY30.67±0.06*CON30.94±0.06（*P<0.05，comparedtoCONgroup；）-71- 第二军医大学博士学位论文****Fig33.ResultsofReal-timeQuantitativePCRdetectingonmRNAofAKTinMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h（*P<0.05，comparedtoCONgroup；）2、Westernblot检测结果（1）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PTEN蛋白表达的影响Westernblot结果显示，药物作用乳腺癌前病变MCF-10AT细胞48h后，各给药组PTEN蛋白的表达量分别为消痰解郁方组1.66±0.04，三苯氧胺组1.40±0.12，抑制剂组1.61±0.04，消痰解郁方+抑制剂组2.28±0.17与对照组1.00±0.01比较均显著增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，消痰解郁方组表达强于三苯氧胺组；消痰解郁方与抑制剂联合使用，PTEN蛋白的表达较单一用药组明显增强。见表22，图34。Tab22.ExpressionofPTENproteininMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48hnGrayvaluex±s)*ΔXTJY31.66±0.04*TAM31.40±0.12*LY31.61±0.04*XTJY+LY32.28±0.17CON31.00±0.01（*P<0.05，comparedtoCONgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）-72- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探**Δ**Fig34.ExpressionofPTENproteininMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h（*P<0.05，comparedtoCONgroup；ΔP<0.05，comparedtoTAMgroup）（2）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3K蛋白表达的影响各给药组PI3K蛋白表达量均有减弱，其中消痰解郁方组+抑制剂组灰度值为0.68±0.08，与各给药组相比减弱最为明显；消痰解郁方组为0.88±0.09，三苯氧胺组为0.91±0.04，抑制剂组为0.85±0.09，与对照组的1.00±0.01比较均有所减弱，差异有统计学意义（P＜0.05），消痰解郁方组和三苯氧胺组比较结果无明显差异。见表23，图35。Tab23.ExpressionofPI3KproteininMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48hnGrayvaluex±s)*XTJY30.88±0.09*TAM30.91±0.04*LY30.85±0.09*XTJY+LY30.68±0.08CON31.00±0.01（*P<0.05，comparedtoCONgroup；）-73- 第二军医大学博士学位论文****Fig35.ExpressionofPI3KproteininMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h（*P<0.05，comparedtoCONgroup；）（3）消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞p-Akt蛋白表达的影响消痰解郁方组p-Akt蛋白灰度值为0.72±0.10，三苯氧胺组灰度值为0.66±0.08，抑制剂组为0.57±0.06，消痰解郁方+抑制剂组为0.42±0.11，较对照组的1.00±0.01均显著减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。组间比较结果：消痰解郁方组和三苯氧胺组比较结果无明显差异，消痰解郁方+抑制剂组较其他各给药组，p-Akt蛋白表达量减弱程度最明显。见表24，图36。Tab24.Expressionofp-AktproteininMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48hnGrayvaluex±s)*XTJY30.72±0.10*TAM30.66±0.08*LY30.57±0.06*XTJY+LY30.42±0.11CON31.00±0.01（*P<0.05，comparedtoCONgroup）-74- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探****Fig36.Expressionofp-AktproteininMCF-10ATcellsaftertreatmentfor48h（*P<0.05，comparedtoCONgroup；）-75- 第二军医大学博士学位论文讨论一、乳腺癌前病变研究现状[1][2]乳腺癌是造成女性死亡最常见的恶性肿瘤，居女性恶性肿瘤发病率首位，在癌症死亡原因位居第六，且目前有年轻化的倾向。作为严重威胁女性健康的恶性肿瘤，寻求有效治疗乳腺癌的方法一直是广大医学界重视和努力的目标。随着广大女性对乳房健康的重视和医疗水平的不断提高，以及乳腺体检和乳腺自查的普及，以乳腺不典型增生为代表的癌前病变的检出率大大提高。现在大部分学者认为，降低乳腺癌的发病率，预防重于治疗，对乳腺癌前病变的干预是目前乳腺癌预防的典型代表。如果能在乳腺癌前病变阶段将其阻断，对其进行早期诊断与治疗，可有效的降低乳腺癌的发病率，更好的保障女性健康。（一）乳腺癌前病变的概述1、癌前病变是指有可能转变为癌的一些病变。WHO规定，发展成癌可能性超过20％的病变[3]为癌前病变。癌前病变属于恶性肿瘤发生发展过程中的一个过渡期，它们多数不稳[4]定，在受到一些因素的持续刺激作用时，将有可能发展为癌。如果能剔除致癌因素，这些病变也有可能停留在癌前保持稳定，停止发展，甚至可以恢复正常或者相对正常[5]的情况，不同部位和不同组织，有其不同类型的癌前病变。2、乳腺癌前病变乳腺增生性疾病包括导管上皮增生、乳腺小叶增生、囊性增生、乳腺腺病、囊肿、[6]大汗腺样化生以及导管内乳头状瘤等。传统上认为，乳腺癌前病变是指形态学有一定程度的异形增生或增生活跃或分化异常，经随访观察有可能发展成癌的病变。关[7]于乳腺癌前病变的概念早在1914年，Ewing在他的著作《PrecancerousDiseasesandprecancerouslesions，Especiallyinbreast》中有这样的描述：“乳腺的某些病理状态会[8]导致不同的但却是较高的乳腺癌发生率。”这可看作乳腺癌前病变的萌芽。Page等在上世纪末对于乳腺癌发生的机制提出多阶段发生发展谱带式模式的假说，即正常细胞→一般性增生UDH)→不典型增生ADH)→原位癌DCS)→浸润性癌。上述模式图中，正常细胞、UDH、ADH以及DCIS之间的箭头，应该都是双向的，可逆的，而不只是单向变化。不典型性增生是癌变过程中的一个阶段，这一阶段在某些因素持续[9]作用下，可以由量变到质变，最终发展为恶性肿瘤；但也可能是可逆与可恢复的。-76- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探这一观点的提出为药物治疗乳腺癌前病变，阻断甚至逆转癌前病变提供了理论依据。（二）乳腺癌前病变的分类[10]学术界目前对于癌前病变的具体界限一直存在不同的看法。WHO2012版肿瘤[11]组织学分类认为乳腺癌指的是浸润性癌。乳腺癌前病变病理组织学被分为：(1)非典型导管增生(ADH)；(2)小叶肿瘤：非典型小叶增生(ALH)、小叶原位癌(LCIS)；(3)[12]导管原位癌(DCIS)。现在，Costo等学者研究认为乳腺癌前病变是指柱状上皮不典型增生、小叶及导管不典型增生、小叶原位癌、放射状瘢痕、乳头状病变，这五种也[13]是国际上大家普遍公认的分类方法。Sanders等学者对880例放射状瘢痕患者随访20年，研究发现：其中有7%的患者在随访期间发展为乳腺癌，10年的相对危险度为1.82，这其中有92%乳腺癌患者都同时患有乳腺增生性病变，由此可见，该病发生癌[14]变的危险性相对不高，所以放射状瘢痕不应该属于癌前病变的范畴。刘标等也报道：根据临床随访资料结果，非典型性平坦型上皮增生、柱状细胞病变虽然有可能进展为浸润性乳腺癌，但是该类疾病的相对危险度大约为1.5，相比非典型增生要低很多，因此，也不能确切的认为平坦型上皮非典型性增生就属于癌前病变。复旦大学附[15]属肿瘤医院沈镇宙团队研究认为，小叶原位癌作为浸润性乳腺癌的高危因素，发生癌变的危险比正常人群高出7～10倍，但并不一定进展为浸润性乳腺癌。Kusama[16][17]等认为非典型囊性导管增生属于癌前病变。BockerEs认为不典型导管增生的病[18]理状态发展为乳腺癌的危险性会大大增加。阚秀等认为只有非典型增生才能被确诊为癌前病变。目前，多数学者的意见认为：非典型导管上皮增生、非典型小叶增生及乳腺导[19][20]管内乳头状瘤病为确切的乳腺癌前病变。Page等认为乳腺非典型增生与原位癌相类似，但却不足以诊断为原位癌。病理学上，乳腺非典型增生是指：可见明显扩张的乳腺导管径，增生的腺管彼此贴近，乳腺上皮层次丰富，细胞染色质增加，偶可见核分裂象，有一定的异型性。细胞排列紊乱、细胞结构可能消失，增生的细胞填充于乳腺导管的腔隙重，细胞间相互重叠或者[21]相互推挤；但仍在一定程度上保持着极性排列。傅西林等将乳头状瘤病以及非典型增生按照乳腺组织结构及细胞的异型程度，分成轻、中、重度，随着病变的加重乳腺细胞核异型越来越明显，细胞核着色由浅到深，染色质的分布状态也由均匀到不均匀。临床中根据乳腺癌前病变10-20年癌变发生的危险性，将非典型增生性分成轻、中、重度三类。其中危险度是正常女性的1.2-2倍，称轻度癌前病变；中度癌前病变[22]的相对危险度为正常女性的4-5倍。-77- 第二军医大学博士学位论文（三）乳腺癌前病变的诊断乳腺癌前病变及乳腺癌的早期诊断可以对高危人群进行常规普查，如果患者乳房出现肿块、乳晕湿疹或者乳头溢液，就有乳腺癌或者癌前病变的可能性，就要进行癌前筛查，这样的疾病有很多，例如：乳腺囊性增生病、导管内乳头状瘤病、乳头乳晕湿疹样癌、乳管内乳头状癌等等。常见的乳腺检查包括：乳腺体格检查、乳腺超声、钼靶X线、乳腺CT、乳腺MRI、乳腺纤维导管镜等等，临床可根据具体情况灵活选择。其中超声检查因其时效性、便捷性、无创性和经济性的优点，可短期内多次反复[23]进行观察，目前己经广泛应用于临床中乳腺良恶性肿瘤的筛查及辅助诊断。早期发现乳腺癌非常有效的手段之一是对妇女进行乳腺钼靶检查，钼靶检查非常灵敏，它可发现临床上70%乳房未扪及肿块的导管内癌。一般临床中可先进行乳腺超声，再拍摄钼靶，一旦发现可疑病灶，马上用细针、空心针进行穿刺或手术活检，细胞学检查或病理切片。病理组织学检查是乳腺癌前病变最重要的诊断依据。诊断癌前病变意义重大，诊断过程就是发现筛查早期乳腺癌的过程。诊断时，首先应判断出癌前病变的不同病理类型；若为癌前病变，再观察是不是已经存在微小浸润癌，因为相比癌前病变该病治疗方法和预后完全不同。当患者进行了钼靶检查，做了活检，仍然不能诊断为癌前病变时，医生可以定期复查超声，重新评估，密切随访。必要时再进行空心针穿刺、局部区段手术病理活检、细胞学检查等等，而病理诊断是乳腺癌前病变诊断的金标准。二、关于乳腺癌前病变动物模型的研究虽然动物模型所表现出来的乳腺癌前病变不能完全等同于人乳腺癌前病变，但是动物模型的重要作用是比较和推论到人类疾病。所以，建立可靠的、科学的、能反映乳腺癌病变过程和癌前病变特点的动物造模方法有非常深远的意义。乳腺癌前病变动物模型主要就是在动物身上模拟人乳腺癌前病变病理状态、进展变化等，是研究乳腺癌前病变病因、发病机制，评价治疗效果的实验条件和基础，好的动物模型将为防治乳腺癌搭建更好实验平台。目前认为，好的动物模型应该符合以下几点：1.能较真实地模拟人乳腺癌前病变的病因、发病机制、病理变化、病程等；2.模型稳定，具有较强的可重复性；3.实验动物及药品试剂易获得，具有较强的可操作性；4.造模时间相对较短，能节省人力物力。但综合目前研究概况，乳腺增生和乳腺癌的动物造模相对成熟，而对乳腺癌前病变动物模型的研究，国内虽然报道的造模方法较多，但却存在造模方法各异，实验药物用法用量、造模时间结点不一，设计的动物模型成功率较低等弊端。-78- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探（一）造模方法选择[24][25]目前动物肿瘤造模建立方法有诱发型、移植型等。1、化学致癌剂诱导癌前病变动物模型在实验动物中可使用化学物质、生物因素、物理刺激等诱发乳腺癌前病变的发生。正常乳腺组织在化学诱癌剂的作用下发展为乳腺癌的过程分以下几个步骤进行：首先是化学物质致使DNA、染色体损伤，改变基因稳定性，使中心体扩增、有丝分裂期纺锤丝失常，与此同时AuroraA蛋白表达上升，凋亡率下降，随之乳腺组织出现增[26]生、非典型性增生，当局部病变出现浸润和转移时则发展成乳腺癌。2、异种移植造癌前病变动物模型MCF-10AT细胞是异种移植造乳腺癌前病变动物模型通常使用的细胞株，方法是直接将该细胞接种在裸鼠的乳房垫上。MCF-10AT细胞又称为MCF10-AneoT细胞，是正常乳腺细胞MCF-10A经H-RasT24突变转染后而得到，属于乳腺癌前病变细胞。MCF-10A是由美国癌症研究所研究成功的，它来源于乳腺纤维瘤患者的乳腺上皮良性导管结构。接种造模的优点是用人的癌前病变细胞株进行造模，相对而言更贴近于人的乳腺组织结构，但弊端是没有能复制乳腺从正常到癌变的整个过程，所以未被学[27]术界广为接受。相比之下，化学诱导剂利用致癌因素与实验动物直接或间接接触，能最大程度上重现乳腺癌产生的完整过程，模拟乳腺癌发生发展的内环境，这也是目前学术界最常用的造模方法。本实验结合文献，本着对乳腺癌整个发展过程还原的角度，选用化学致癌剂诱发型造模方法。（二）实验药物选择目前对于乳腺癌的诱导致癌剂，常用的有两种：DMBA和MNU。二者对乳腺组[28]织均具有极高的特异性和选择性，可重现完整的乳腺癌发生发展的整个过程，现[29][30]已在乳腺癌的动物造模中得到广泛应用。1、MNU1-甲基-1亚硝基脲（1-Methyl-1-nitrosoureaMNU），通过单个点突变，染色体丢失，激活H-ras-1基因，诱发大鼠出现乳腺癌，是一种强烈致癌剂。2、DMBA1961年Huggins等首先报道了用化学诱癌剂DMBA诱导大鼠乳腺癌，被誉为乳-79- 第二军医大学博士学位论文腺癌造模史上划时代的一页。多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons)类化合物二甲基苯蒽(7，12-Dimethylbenzanthracene，DMBA)。它的作用机制是，在体内发生代谢激活最终与正常细胞的DNA形成共价键，引起DNA损伤，导致基因突变，阻碍[31]正常细胞的分化而发生异常增生，最终导致形成肿瘤。研究表明MNU的毒性较强，癌前病变窗口期较窄，病变检出率低，而DMBA对乳腺的选择作用更强，特异性高达70-80%，毒性相对较小，癌前病变的窗口期相对[32][33]较宽，检出率较高，动物模型比较稳定，而且容易复制，符合乳腺癌发展的规律。结合文献研究，本实验选用了DMBA作为动物造模的致癌诱导剂。（三）大鼠品系的选择DMBA诱导乳腺癌前病变最常选用的实验用鼠是SD大鼠和Wistar大鼠。SD(spraguedawley)大鼠生长发育快，对疾病抵抗力强。Wistar大鼠性情温顺，性周期[34]稳定，早熟多产，生长发育相对SD大鼠较慢。李静蔚等对比Wistar和SD两种品系大鼠造模成功率，结果显示：比较二者对DMBA造模的敏感性、动物死亡率、肉眼肿瘤出现率、癌前病变和乳腺癌发生率等方面，Wistar大鼠低于SD大鼠。但也有学者对DMBA诱导两种品系大鼠乳腺癌前病变的发生率分别进行比较，发现二者差[35][36][37]异无统计学意义（P>0.05）。结合文献报道和实验条件，本次实验选用了封闭群雌性SD大鼠作为动物实验用鼠，该品系大鼠生长发育快，抗病能力强，对致癌剂耐受性较强，对激素敏感性也相对较高。（四）DMBA的剂量选择[38]DMBA作为致癌剂，诱导剂量的选择也尤为重要。19世纪60年代，DAO等研究结果表明：DMBA对成年大鼠的最大致癌剂量（能使大鼠100%致癌的最低剂量）[39]为20mg/只，致死剂量为30mg/只。McCormick等研究发现，大鼠恶性肿瘤发生率和成瘤数量与诱导剂的剂量呈正比关系，且诱导剂的剂量越大肿瘤的发生时间越早。Russot等学者研究发现：DMBA单一剂量(80-100mg/kg)对SD大鼠灌胃，发现大鼠发生乳腺癌的潜伏期为8~21周。但是一个好的乳腺癌前病变大鼠模型，需要较长的恶性肿瘤发生潜伏期，这样可获得更准确、更宽的乳腺癌前病变时间窗，以便于观察到更多癌前病变。所以从这个理论出发，需要相对低剂量DMBA的干预；但面临的问题是，如果剂量太小，不但动物成模率较低，而且造模的时间往往超过半年，浪费大量人力物力，不能满足科学研究的需要。目前国内外学者对DMBA大鼠乳腺癌前病变的造模剂量报道不一，5-20mg/只均-80- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探有报道。Russo等给予大鼠大于1mgDMBA的致癌剂，均可诱导出乳腺肿瘤，当DMBA给予1mg时，肿瘤发生率为10%；5mg时，肿瘤发生率为50%；15mg时，肿瘤发生率为100%；在造模时间上，当DMBA给予20mg时，给药后28天即发生肿瘤，[40][41]到60天时，所有造模大鼠均被诱发出乳腺癌。高玉彤等研究报道，选用SD大[42]鼠DMBA油溶液70mg/kg一次性灌胃，诱发大鼠乳腺癌前病变模型。杨光伦等用DMBA低剂量(5mg/只)、一次性灌胃的给药方式进行诱导造模，90天后大鼠乳腺增[43]生发生率为75%，其中不典型增生与增生活跃各占25％。宋爱莉团队研究发现，采用SD大鼠100mg/kg一次性灌胃DMBA油溶液诱导大鼠乳腺癌前病变模型，结果大鼠乳腺非典型增生发生率为92.5％。为摸索出最佳剂量造模剂量，本研究结合国内外文献，在预实验阶段采用DMBA低（5mg/只）、中（10mg/只）、高（20mg/只）三个浓度组，通过8周、10周、12周动态连续观察，结合病理情况，最终确定DMBA中剂量组10mg/只为大鼠乳腺癌前病变模型的最佳剂量，在这个条件下，可成功制备大鼠乳腺癌前病变模型。（五）造模其他影响因素（饮食、给药方式、雌孕激素等）DMBA属于亲脂性化学物质，只有在机体内代谢后方能转化为致癌剂，因此如果[44]要对大鼠进行灌胃，DMBA需溶解于植物油或吐温。DMBA诱导大鼠乳腺癌前病变动物模型的方法有：口服(灌胃)、肌肉注射、直[45]接涂抹乳房表面(或乳管)等。本实验采用学术界现常用灌胃的方式，此方式操作简单，易于重复，药物吸收率较直接涂抹好，且能有效避免肌肉注射的毒性大、致死率高等缺点。此外，乳腺癌的发生发展与体内雌孕激素水平密切相关，在诱导乳腺癌变的过[46]程中，内源性或者外源性雌孕激素发挥着重要作用。如果将雌二醇与化学诱导致[47]癌剂联合应用，乳腺肿瘤的发生率将会大大提高。近年来，在此理论的基础上，[48]DMBA联合雌孕激素诱导乳腺癌前病变大鼠模型被广大学者所采用。王峰等对比了三组不同的给药方法，DMBA单药组、DMBA加雌孕激素序贯5天组，DMBA加雌孕激素序贯30天组，结果发现在诱导大鼠乳腺癌前病变的发生率上，DMBA联合雌孕激素序贯5天组明显高于单用DMBA，同时也高于DMBA加雌孕激素序贯30天组。基于以上研究，本课题组采用的造模方法是：DMBA联合雌孕激素序贯5天法，用以上药物作用于对激素敏感的SD大鼠乳腺组织，此种方法促使对激素敏感的乳腺癌前病变的发生率更高，该法也是学术界较为认可和普遍采用的方法。-81- 第二军医大学博士学位论文（六）造模终点时间的确定乳腺癌前病变是乳腺增生发展为乳腺癌中间一个动态的、过渡性的阶段，如何严格准确地把握乳腺癌前病变的时间终点是成功造模的关键点。若终点过早，则多数动物模型还处于乳腺增生的阶段，乳腺癌前病变尚未出现，造模成功率低；但如若终点过晚，大多数动物模型又已经发展为乳腺癌，又失去了造模和研究的目的和意义。关于癌前病变的终点时间，以DMBA致癌剂诱导的大鼠，学术界研究报道在8周-14周之间阻断疾病进程可有望获得乳腺癌前病变的模型。姜军等用DMBA诱导Wistar大鼠乳腺癌发生的连续动态过程发现：乳腺正常导管上皮细胞从一般上皮增生发展为不典型增生，呈逐渐加重的过程。实验第9周时，大鼠乳腺出现了不同程度的导管上皮增生和不典型增生，大于3mm的乳腺癌大约出现在第13周，第24周大鼠乳腺癌的发病率为70%。为了更好地为后续实验提供依据，更好地提高造模成功率，结合前期的理论文献研究，本实验在研究过程中选择第8周、10周、12周3个时间节点进行取材送检、病理分析，动态观察乳腺从正常→增生→癌前病变→癌的整个发展过程，能较为准确地把握乳腺癌前病变的形成和发展时间。结果表明，10周时乳腺癌前病变的检出率最高，结果有统计学意义（P<0.05）。本课题对于此模型的优化，在以下两个方面进行了改进：1)明确DMBA的诱导剂量为10mg/只，有助于缩短造模时间，提高成瘤率。2)明确癌前病变的时间结点。在第8周、10周、12周动态连续检测病理状态，最终确定10周为理想的乳腺癌前病变模型的时间终点，在本实验中造模的成功率为91.7%。综上，本课题的造模方法能很好地复制出大鼠乳腺癌前病变动物模型，呈现了大鼠乳腺组织从正常→一般增生→癌前病变→癌的整个病理过程，是研究乳腺癌前病变和乳腺癌形成机制的重要模型，可作为研究乳腺癌前病变病变机理和药物疗效评价的动物模型。三、乳腺癌前病变的现代医学干预对于乳腺癌前病变到底该采用何种治疗手段，目前饱受争议。（一）手术治疗[49]手术仍是乳腺癌前病变的主要治疗手段，可有效阻止病变进一步发展。临床可以根据不同情况灵活选用不同的手术方式，不同类型的癌前病变需要不同手术方法，对于相同病理类型也有可能需要因人而异，但是也要严格掌握手术适应症。临床上对疑似乳腺癌前病变的病灶可区段切除或针刺活检进行病理检测。当确诊癌前病变-82- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探时，临床医生要根据病灶大小、程度、病理类型及其他相关危险因素对患者进行评价，不应盲目进行预防性乳腺切除，随意扩大乳腺切除的指征。虽然手术切除预后好，但患者心理依从性差、术后影响美观、对患者造成极大心理创伤，而且也存在过度医疗的争议。（二）药物治疗与手术切除相比，药物治疗更易被医患接受，其作用值得重视。作为雌孕激素的靶器官，乳腺癌是激素依赖性肿瘤，女性内分泌系统在其发生发展中起着举足轻重的作用，乳腺上皮细胞分裂增殖与雌孕激素关系密切。雌激素受体拮抗剂是目前广泛使用的治疗乳腺癌及乳腺癌前病变的药物，常用的药物有：1、雌激素受体（ER）拮抗剂——三苯氧胺(Tamoxifene，TAM)对于ER阳性患者较为适用。大部分乳腺癌前病变在早期即过度表达雌激素受体，三苯氧胺的作用机制是竞争性结合雌激素受体，抑制基因转录，延缓细胞分裂，进而停止乳腺癌细胞的生长，可显著降低ER阳性患者的风险。大量研究结果证实，雌激[50]素受体拮抗剂三苯氧胺可降低高危人群乳腺癌发病率。美国临床肿瘤学会试验显示，与安慰剂组对比，三苯氧胺组，原位小叶腺癌发病率降低了56％，乳腺非典型增生发病率降低了88％。2、芳香化酶抑制剂研究表明，芳香化酶抑制剂具有双重的阻断作用，在初始阶段和促进阶段均能阻[51]断乳腺癌前病变向乳腺癌的发展，与雌激素受体拮抗剂相比有可能会更有效。此[52]外催乳素受体拮抗剂、HER-2拮抗剂等，都可以用于乳腺癌前病变的药物治疗，但这些手段和药物大多处于实验研究阶段，临床中并未推广应用。但是，此类药物作用于机体内分泌系统，导致内分泌失调，副作用很多，如子宫[53][54]内膜癌风险升高，深静脉血栓、子宫肌瘤及卵巢癌。上述风险的存在，让许多临床医生和患者对该治疗望而却步。因此，临床上迫切需要有效治疗乳腺癌前病变的药物，中医药在此发挥着很大优势。四、祖国医学对乳腺癌前病变的认识中医药对乳腺病的治疗一直有独特优势，挖掘中医药特色对乳腺癌前病变的药物治疗和个体化诊治可提供新的思路。-83- 第二军医大学博士学位论文（一）古代文献对乳腺癌前病变的认识乳腺癌在历代中医文献中被称为“乳岩”、“乳石痈”等。乳腺癌前病变按照传统的中医理论应该归属于“乳癖”（乳腺增生病）与“乳岩”的过渡阶段，不同与一般的乳癖，相比于乳腺癌也是从“量变”到“质变”的过程。所以对乳腺癌前病变的认识与辨证施治上与乳腺增生和乳腺癌都有一定的相关相续。关于乳腺癌前病变在古文献中已有记载，对于该病的认识可以在乳岩和乳癖中见到。余听鸿在《外证医案汇编》中曰“乳中癖核，乃肝脾二经气凝血滞而成……”，提到“少阳行经之地，气血皆薄，加以情怀失畅，气血痹郁，故难治……日久恐成岩证”，对乳癖岩变的病因病机以及发展过程做了精辟地阐述。垄居中在《外科活人定本》中首次提出本病有恶变倾向“此症生于正乳之上，乃厥阴、阳明经之所属……何谓之癖，硬而不痛，如顽核之类，过久则成毒”。宋代《疮疡经验全书》明确指出乳岩早期诊断与治疗的重要性，“早治得生，迟则内溃肉烂，见五脏而死”。明代《外科正宗》指出乳房出现无痛性肿块以至发展为乳腺癌的整个过程，内曰“初如豆大，渐若围棋子；半年一年，二载三载不痛不痒，渐渐而大，始生疼痛，痛则无解，日后肿如堆栗，或如覆碗，色紫气秽，渐渐溃烂，深者如岩穴，凸者若泛莲，疼痛连心，出血则臭，其时五脏俱衰，四大不救，名曰乳岩”。以上记载可以看出，古代医家很早就认识到乳腺癌前病变有可能岩变。乳腺癌前病变的产生是在正虚邪实的基础上，脏腑功能失调，外感六淫、内伤七情等因素综合作用，以致毒邪内蕴、血瘀、痰凝、气滞等有形之邪与毒邪相搏结，停滞于乳络而逐渐发为乳岩。除有形之邪外，乳腺疾病的发生与情志不畅、肝气郁结等因素相关。陈实功在著作《外科正宗》提出：“忧虑伤肝，思虑伤脾，积想在心。所愿不得者，致经络痞涩，聚结成核”，该书中强调了忧虑、思虑等情志因素在乳腺疾病中的作用。（二）现代中医临床对乳腺癌前病变的认识与治疗在认识上，宋爱莉等认为乳腺癌前病变主要是因为肝气郁结、冲任失调而致气滞，气滞则血瘀，结于乳络而成肿块，且临床观察发现：乳腺不典型增生总人数的65％为“血瘀证”，治疗以活血化瘀为基本原则。裴晓华等认为：乳腺癌发展的核[55]心病机是“痰毒瘀结”；马婷等通过对60例乳腺癌、乳腺增生和乳腺癌前病变患[56]者进行辨证，发现痰瘀互结型是乳腺癌前病的主要证型。李琳等在临床中分析了55例非典型增生患者，认为冲任失调在乳腺癌变中起重要的作用。[57]在治疗中，邓卫芳等用金贝乳康片干预乳腺癌前病变模型大鼠，发现该药对乳腺癌的发病率有明显的降低作用，可逆转乳腺癌前病变向一般增生转变。洪日、陈-84- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探[58]红风等实验发现复方仙蓉颗粒对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的增殖有明显抑制，[59]其作用优于三苯氧胺。黄梅等应用疏肝化痰法治疗乳腺不典型增生，发现有助于控制甚至逆转乳腺不典型增生癌变进程。综上所述，目前中医对乳腺癌前病变病机的认识主要集中在血瘀、痰凝、气郁以及冲任失调等方面，治疗上以活血、化痰、理气、调冲任为主要手段。（三）本课题组对乳腺癌前病变的认识及“消痰解郁方”的理论依据1、课题组对乳腺癌前病变的认识（1）肿瘤痰证学说中医的“痰”有广义和狭义之分。“狭义之痰”是指可见的呼吸道的有形之痰，这与现代医学所言之痰相仿，而中医言之更多则为“广义之痰”，指脏腑功能失调，体内津液代谢紊乱而不正常停留于体内的代谢产物，既是病理产物又是致病因素。课题组指导老师魏品康教授将“痰”分为“良痰”和“恶痰”。“良痰”主要是指呼吸道的痰液以及代谢障碍性疾病所产生的高血脂和良性肿瘤；“恶痰”主要指各种恶性肿瘤。古来就有“怪病多痰”，“久病多痰”，“百病皆因痰作祟”之言。痰的这些特性与现代肿瘤的瘤体形成、复发转移、病程迁延难愈极为相似。结合多年的临床肿瘤治疗经验，魏品康教授提出“肿瘤痰证学说”，认为痰在肿瘤的发生发展和复发转移中起重要作用，是肿瘤的重要致病因素。外感六淫、内伤七情等因素等导致气滞津停，郁而化热，内生痰邪。痰、气、火三邪相互博结，导致肿瘤发生。患者在进行肿瘤切除术后，体内生痰环境并未发生改变，痰邪再生肿瘤复发，痰邪流注它脏肿瘤转移。魏师在此学说的基础上，确立了“消痰”的抗癌治则。课题组前期大量的临床研究表明，用“消痰”法治疗肿瘤效果显著，不仅抑制肿瘤生长，还提高生存质量，证实了痰与肿瘤的相关性。（2）从“痰”“郁”论治乳腺癌前病变本课题组认为，乳腺癌作为恶性肿瘤的一种与痰密切相关，乳腺癌前病变是乳腺癌的前期，其发病与痰的因素亦是密不可分。此外，根据肝的脏象和经络循行路线，乳房属肝，乳腺疾病还与肝有密切关系。肝主疏泄，调节全身气机活动的同时，也调畅乳房气血运行。肝喜条达恶抑郁，忧虑郁怒易伤肝，则肝失疏泄，气机运行失调，脾胃升清降浊功能紊乱，水湿内停，聚而成痰，气滞痰浊博结于乳房，造成经络痞塞，形成乳房肿块。《外证医案汇编》云：“治乳症，不出一气字，……无论新久虚实，温凉攻补，各方之中，挟疏络理气之品，-85- 第二军医大学博士学位论文使其乳络通。”陈自明在《外科精要》中有云：“内结小核，或如棋子，不赤不痛，……积之岁月渐大，其生峻岩崩破如熟石榴……内溃深洞，血水滴沥……此属肝脾郁怒，气血亏虚，名曰乳岩”，他认为肝脾郁怒是乳癖发生岩变的重要因素。朱丹溪在《格致余论》有云：“忧怒抑郁，朝夕积累……脾气消阻，肝气横逆，遂成隐核，如大棋子，不痛不痒，数十年后方疮陷，名曰乳岩。”由此可见，“郁”是乳腺肿块癌变的重要病因之一。结合以上认识，魏品康教授认为“痰”和“郁”是乳腺癌前病变产生的基本病机。该病的基本治则是在消痰散结的基础上辅以行气解郁。消痰以祛除肿瘤产生的内环境为主要治疗原则，辅以疏肝解郁，畅气机，通乳络，调理脏腑功能。气机调畅，痰瘀难生，癌细胞无生之源头。2、消痰解郁方的理论基础“消痰解郁方”是魏品康教授经过多年的临床观察及经验总结确立的经验处方，该方是根据药物功效命名。处方组成：制半夏、制南星、山慈菇、炒白术、茯苓、陈皮、柴胡、杭白芍等。制半夏、制南星、陈皮、茯苓为方中君药，制半夏主治肠胃湿痰，制南星专属经络风痰，二者相须消痰散结；茯苓健脾除湿，陈皮理气消痰，二者合用杜绝生痰之源；炒白术、柴胡、杭白芍等，养阴柔肝，行气解郁；佐以薄荷，升发郁滞，调畅气机。综合全方，诸药合用共凑消痰解郁之功，以化痰为主，兼顾理气，[60]使得痰消气畅，气达郁解。大量临床工作发现“消痰解郁方”有效治疗乳腺癌前病变，减轻甚至逆转病理状[61]态；可延长乳腺癌患者生存时间、预防复发、转移等。初步药效学实验也证明“消[62]痰解郁方”而且对S180荷瘤小鼠还具有一定的抑瘤作用。此外，我科前期对“消痰法”为代表的方剂抗肿瘤机制做了较深入的探究，证明消痰方剂可以下调多种血管生成因子、粘附分子、致癌基因等抑制肿瘤细胞生长、复发、转移。魏品康教授认为，通过积极的中医药治疗，可以预防乳腺癌前病变发展为乳腺癌。在治疗过程中主张“祛邪务尽”，务求廓清邪毒。乳腺癌前病变是乳腺癌的前-86- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探期，祖国医学有“未病先防”、“既病防变”两个方面的防病思想，该防病思想对于预防肿瘤发生发展有重要的临床意义。魏师提出：应该将辨病和辨证有机结合，通过更全面、更深刻、更正确地认识乳腺癌前病变的发病本质，在“治未病”思想的指导下，首先应“未病先防”。临床观察到大多数患者确实有“邪实”情况存在，故而在乳腺癌前病变的治疗过程中应重视祛邪，以“消痰”“解郁”等祛邪大法治疗为先，调整脏腑、阴阳、气血平衡，使内环境达到稳定，做到“截断扭转”从而避免乳腺癌的发生。结合现代临床实践，特别是对于那些具有病理组织学分化较差等不良预后指征的患者，辨病与辨证相结合，在辨病的基础上考虑辩证，加大“祛邪”之力度。此外，在针对乳腺癌前病变患者的治疗中，考虑到乳房属肝经循行之地，“肝病传脾”，为达到“未病先防”的目的，治疗中要重视兼顾脾胃功能，方中常加炒莱菔、生米仁等健脾之品。五、消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用及可能机制探讨（一）消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用验证本课题的研究对象消痰解郁方，临床应用可有效缓症状，逆转病理状态，但缺乏动物和细胞实验的作用证据，基于此，本课题从体内和体外两方面结合，试图对消痰解郁方的疗效加以证实。1、消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠乳腺组织病理状态的影响邓卫芳等对用金贝乳康片水溶液对乳腺癌前病变大鼠模型灌胃，发现金贝乳康片可以促使模型大鼠乳腺癌前病变向一般增生逆转，也可以降低模型大鼠的乳腺癌发生率。陈红风团队用乳宁冲剂干预乳腺癌前病变裸鼠移植瘤，发现可抑制瘤体的生长，促使非典型增生细胞向正常细胞进行转变，降低浸润乳腺癌的发生率、使其发展过程[63]减慢。吴凯南等通过对乳腺不典型增生大鼠用云芝多糖治疗观察，发现其有抑制DMBA诱导中重度不典型增生的作用。本实验在造模成功的前提下，设立空白对照组、模型对照组、三苯氧胺组、消痰解郁方低、中、高剂量组进行各自干预，通过观察大鼠的一般状态、乳腺组织病理情况来验证消痰解郁方对乳腺癌前病变的作用疗效。（1）大鼠一般情况观察从大鼠的一般情况可以观察到：给药后药物组与模型对照组相比，大鼠的进食量、活动程度、毛发、大便等基本状态均有好转，相对三苯氧胺组，消痰解郁方各组大鼠-87- 第二军医大学博士学位论文的易激惹、烦躁等表现改善明显，说明消痰解郁方可改善乳腺癌前病变大鼠的一般生理情况的同时，中药行气解郁改善情绪的作用也有充分体现。（2）病理学诊断结果模型对照组大鼠乳腺癌的发生率为70%，说明没有药物干预的情况下，乳腺癌前病变一直在不断地进展以至发展为乳腺癌；治疗组经三苯氧胺和消痰解郁方各剂量干预后，与模型对照组比较，消痰解郁方低、中、高剂量组大鼠乳腺组织乳腺癌的发病率均有所降低，具有统计学意义（P<0.05），说明消痰解郁方抑制了乳腺癌前病变的发生发展，能降低乳腺癌发生率。其中消痰解郁方高剂量组和三苯氧胺组乳腺癌的发病率均为20%，提示二者的防癌效果相当，但消痰解郁方高剂量组的癌前病变大鼠占55%，略低于三苯氧胺组（60%）；乳腺增生大鼠占25%，略高于三苯氧胺组（20%），差异无统计学意义（P>0.05），但从数值上也提示消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗效果和逆转为正常乳腺组织的疗效，稍优于三苯氧胺组。2、消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖、凋亡的影响[64]李静蔚，刘晓菲等研究发现中药阳和化岩汤可以有效抑制乳腺癌前病变MCF-10AT细胞生长，与三苯氧胺诱导MCF-10AT细胞凋亡能力相近，呈现时间依赖[65]效应，阻滞细胞周期于S期；梁世杰等研究发现应用乳岩内消霜能促进乳腺癌前[66]病变MCF-10AT细胞发生凋亡；洪日等通过细胞实验发现中药复方仙蓉颗粒对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞有抑制增殖的作用，作用优于三苯氧胺，结果有统计学[67]差异（P<0.05）。陈红风团队研究报道：乳宁冲剂对MCF-10AT细胞株的生长有抑制和诱导凋亡作用。本研究中，消痰解郁方作用于人乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，利用CCK-8法和流式细胞仪观察到消痰解郁方对MCF-10AT细胞有抑制增殖和促凋亡作用，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），且随着药物作用时间延长(24h、48h)，平均抑制率逐渐增加，与三苯氧胺组对比差异有统计学意义（P<0.05），也说明消痰解郁方在对MCF-10AT细胞抑制增殖和促凋亡上，作用优于三苯氧胺。细胞周期结果也显示：消痰解郁方可诱导乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡，阻滞细胞于G0/G1期。从抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的角度佐证了消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用。（二）消痰解郁方对乳腺癌前病变作用机制初探近年来，对于乳腺癌前病变的癌变机制，科研工作者进行了大量详尽的研究。目前大多数学者认为癌前病变的癌变机制与以下几个方面关系密切，如肿瘤血管的新-88- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探生、癌基因表达、细胞超微结构改变、细胞凋亡、内分泌紊乱、微量元素变化等等。细胞凋亡是指在正常生理或病理状态下细胞自发产生的、程序化的死亡过程，机体会对细胞凋亡的发生和整个过程进行严密调控。正常细胞发展为有癌性特征的癌前病变，再发展成为恶性肿瘤，在这个过程中，细胞凋亡起了非常重要的作用。学术界普遍认为：细胞外因素通过信号传导通路影响细胞内基因的表达或活化，对细胞凋亡起到间接调控作用，而细胞内基因对细胞凋亡的发生和发展起着直接调控作用。大量文献报道，肿瘤中广泛存在PI3K-AKT信号传导通路的失调，主要原因是[68]PI3K扩增以及其他因素导致的AKT出现过度活化，或者是PI3K-AKT信号传导通路某些调控成分出现功能缺失，如PTEN产生突变。研究发现，与这条通路相关的[69][70][71][72]恶性肿瘤很多，如鼻咽癌、卵巢癌、恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤、乳腺癌、[73][74]结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、骨髓增生异常综合征等。1、PI3K-AKT信号传导通路与肿瘤的关系（1）PI3K-AKT信号传导通路的组成PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶，phosphoinositide3-kinase）广泛分布于体内各种细胞，是一种脂激酶，能磷酸化细胞膜上的磷脂酰肌醇家族成员，募集和激活下游的靶物质而启动一系列信号联级反应，把底物PIP2转化为PIP3。在细胞骨架的重塑与构型、细[75][76][77]胞的有丝分裂、分化、存活、血管新生等方面起重要作用。PI3K属于原癌基因，目前根据结构，有3种PI3K的同工酶，即I型、II型、III型，其中I型分为IA类和IB类两个亚型。AKT（核心蛋白）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，存在于人类染色体的鼠类胸腺病毒，又被称为蛋白激酶B，已被定义为癌基因。它与蛋白激酶A和蛋白激酶C高度同源，由480个氨基酸残基组成，AKT分子的氨基酸由C端到N端依次为短的羧基端调节结构[78]域、中心催化结构域和PH结构域。AKT目前分为3个亚型：AKT1，AKT2、AKT3。许多种细胞因子、生长因子、PTEN失活、激素变化和ras基因激活，均可刺激AKT的活化，AKT被激活后称为磷酸化AKT（p-Akt），将从细胞膜转移到细胞质和细胞核，进一步激活或抑制其下游靶蛋白如Caspase-9、核转录因子NF-γB、Tuberin、cyclin-D1、GSK3b、Bcl-2家族、Forkhead和mTOR等，从而发挥各种生物学效应，参与调节细胞的生长增殖、抑制凋亡以及促进新生血管、促进侵袭转移迁移等。它属于PI3K下游作用的靶蛋白，是PI3K-AKT信号传导通路的核心，其持续活化与肿瘤的发生发展密切相关。PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物基因，phophataseandtensinhomologdeletedonchromosomelo），有抑制生长、促进细胞凋亡、参与细胞周期调控、抑制细胞的黏附-89- 第二军医大学博士学位论文[79][80]和肿瘤转移的作用。在许多肿瘤中，这个基因区域有杂合性丢失和突变，是迄今为止研究发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN包括9个外显子，位于细胞质。PTEN基因蛋白过表达可以导致CDK2和CDKI结构比例紊乱，CDK2活性降低，导致使细胞周期停滞在G0/G1期。研究显示，PTEN基因的缺失和突变出现在许多原发性肿瘤中。在正常组织中，高表达的PTEN可以抑制PI3K-AKT信号传导通路的活性，在恶性肿瘤中，PTEN蛋白出现表达下降或缺失，抑制PBK的作用下降，进而促进p-Akt水平升高，导致恶性肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促使肿瘤细胞的粘附。PTEN可负调控PI3K-AKT信号[81]传导通路，抑制肿瘤血管新生和促进细胞凋亡。Depowski运用免疫组化法检测151[82]例乳腺癌PTEN蛋白表达，患者中有73例(48％)PTEN表达缺失。Perren等研究[83]发现PTEN在乳腺癌中的缺失率为30～40％。（2）PI3K-AKT信号传导通路与乳腺癌的关系[84]目前研究发现PI3K-AKT信号传导通路在乳腺癌中活化高达70%。PI3K-AKT信号转导通路是调节乳腺细胞存活、生长、增殖的主要通路，与正常细胞相比PI3K-AKT信号传导通路通过对肿瘤细胞的高度激活，进一步对乳腺癌细胞的生长、增殖起促进作用。这条通路最主要基因变异在乳腺癌中体现在PI3K激活点的突变，[85][86]AKT的突变以及PTEN活性缺失，其中乳腺正常组织发展到原位癌甚至浸润性癌的分子标志有可能是p-Akt的过表达。[87]Wang等用丹参酮干预MCF-7和MDA-MB-453两种人乳腺癌细胞，发现丹参酮通过PI3K-AKT/mTOR信号通路上调相关凋亡因子，下调抗凋亡因子来有效治疗乳[88]腺癌。Yang等研究发现AKT高表达对临床用药和乳腺癌的预后有很重要的影响。[89]高建军等研究表明，在乳腺正常组织和乳腺良性瘤中，阳性率对比无明显差异，但是PI3K在乳腺癌中阳性率与乳腺良性瘤及乳腺正常组织之间进行对比，有明[90]显差异，差异有统计学意义；陈菊英等对人乳腺癌MCF-7细胞使用可不同浓度的紫-90- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探草素进行干预，观察该药对细胞活力的损伤及对细胞自噬的影响，研究结果显示经过紫草素干预后，MCF-7的细胞活力下降，PI3K、AKT的表达水平及p-PI3K，p-Akt（二者的磷酸化水平）也有明显降低。以上研究结果表明，PI3K-AKT信号传导通路与乳腺癌关系密切，诱导乳腺癌细胞凋亡的重要目标，就是阻断PI3K-AKT信号传导通路，进一步防止其发生侵袭和转[91]移。2、PI3K-AKT信号传导通路在乳腺癌前病变中的作用结合目前现状，学术界普遍认为PI3K-AKT信号传导通路，在肿瘤的发生发展转移过程中发挥着十分重要的作用，对该通路在乳腺癌的发生发展、转移侵袭上的作用也有深入研究，但是PI3K-AKT信号传导通路在乳腺癌前病变中鲜有研究，那是否该通路在乳腺癌前病变病理状态下就已经启动，已被激活而发生作用？这是本课题要研究的关键问题之一。本研究通过体内和体外实验，借助Westernblot和免疫组化等检测手段进行研究，结果显示：PI3K-AKT信号传导通路中的关键蛋白PI3K、p-Akt、PTEN等与对照组比较，PI3K、p-Akt蛋白表达显著下降（P<0.05）；PTEN蛋白的表达显著增加，此外我们用Q-PCR方法检测了PI3K-AKT信号传导通路相关基因的表达，结果显示：相比对照组，各给药组的PI3KmRNA、AKTmRNA表达减少，PTENmRNA表达增强，结果有统计学差异（P<0.05）。以上结果证实：PI3K-AKT信号传导通路不只是在乳腺癌的发生发展转移方面起重要作用，而且在乳腺癌的提前一步——乳腺癌前病变阶段，该通路已被激活，且发生作用。对该通路的研究有助于在乳腺癌前病变阶段进行干预，有望使乳腺癌前病变停滞发展甚至逆转为一般增生甚至正常乳腺组织，此研究对预防乳腺癌的发生、降低乳腺癌的发病率起着至关重要的作用。3、消痰解郁方对PI3K-AKT信号传导通路的影响及机制探讨围绕PI3K-AKT信号传导通路对治疗乳腺癌及乳腺癌前病变的机制探讨，国内学[92]者也有相关研究。张刚等研究发现乳腺癌组织中PTEN蛋白水平降低，p-Akt蛋白水平升高，PTEN与p-Akt表达呈负相关，提示在乳腺癌的发生发展过程中PTEN蛋白表[93]达缺失、AKT信号传导通路持续活化有可能发挥着重要的作用。王爱英，林晓燕等研究发现p-Akt过表达与PTEN低表达均与肿瘤分化、复发转移和5年生存率有关。刘[94]东良等以乳腺癌术后261例患者为研究对象，采用免疫组化法检测其p-Akt的表达，结果显示：p-Akt的异常表达与乳腺癌的肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期呈显著相[95]关性。赵林等采用RT-PCR和Westernblot方法检测PTEN和AKTmRNA和蛋白，在-91- 第二军医大学博士学位论文64例乳腺癌组织和15例癌旁正常乳腺组织中的表达。发现AKTmRNA在乳腺癌中表达高于癌旁正常组织、且PTEN和AKT表达呈负相关，PTEN失活解除抑制AKT，促进[96]乳腺癌的发生发展。关于乳腺癌前病变研究中，郑雪连等通过临床研究发现，PI3K蛋白在人乳腺组织中按照正常乳腺→一般增生→乳腺不典型增生→乳腺癌逐级升高；体内实验结果显示阳和化岩汤能降低PI3K蛋白表达，部分阻断逆转乳腺癌变，对癌前病变有治疗和预防作用。本实验结果显示：体内实验：与空白对照组相比，模型对照组、三苯氧胺组和消痰解郁方各剂量组大鼠乳腺组织PI3K、p-Akt蛋白的表达增加（P<0.05），差异具有统计学意义。提示乳腺癌前病变大鼠乳腺组织中PI3K、p-Akt表达水平会按照增生→癌前病变→癌的发展方向表达逐步增加；也说明PI3K-AKT信号传导通路与乳腺癌前病变及乳腺癌逐级发展的病理过程关系密切。与模型对照组比较，消痰解郁方低、中、高剂量组大鼠乳腺组织PI3K及p-Akt的表达水平明显下降，PTEN表达升高（P<0.05）。提示：消痰解郁方各剂量组可以下调乳腺癌前病变大鼠乳腺组织PI3K及p-Akt蛋白的表达，上调PTEN表达。各剂量组对以上蛋白的作用有组间差异，其中以消痰解郁方高剂量组，对下调PI3K及p-Akt表达，上调PTEN表达效果最好，反映出消痰解郁方对大鼠乳腺癌前病变的治疗存在一定的量效关系。与三苯氧胺组进行比较，消痰解郁方高剂量组上调PTEN下调PI3K及p-Akt的作用优于三苯氧胺。体外实验中消痰解郁方干预乳腺癌前病变MCF-10AT细胞，Westernblot和Q-PCR检测结果显示，相比对照组，消痰解郁方组PI3K与PI3KmRNA，p-Akt、AKTmRNA表达量均有下降，PTEN以及PTENmRNA的表达均增加，差异有统计学意义（P<0.05），说明消痰解郁方对PI3K-AKT信号传导通路有影响，与三苯氧胺组进行对照发现，消痰解郁方对PTEN以及PTENmRNA的表达上调，二者差异有统计学意义（P<0.05），作用优于三苯氧胺。但在对PI3K、PI3KmRNA、p-Akt、AKTmRNA的调节，消痰解郁方组和三苯氧胺组没有明显的差异（P>0.05），二者作用相当。（三）消痰解郁方与PI3K抑制剂LY294002LY294002是最早、最广泛的PI3K-AKT信号通路抑制剂，通过竞争性抑制PI3K[97]的ATP结合位点，对AKT磷酸化的过程进行抑制并诱导细胞凋亡。研究结果表明：LY294002能抑制对蛋白水解酶Caspase-9的磷酸化，促进细胞凋亡；能抑制AKT对其下游靶蛋白如Bc1-2家族成员、Bad、Bax等的磷酸化；LY294002[98][99]可以降低NF-KB抑制剂IKB的降解，抑制NF-KB的释放，促进细胞凋亡。本实验中，LY294002组、消痰解郁方组和消痰解郁方+LY294002组的PI3K蛋白、PI3KmRNA，p-Akt蛋白、AKTmRNA均较对照组有显著差异，消痰解郁方-92- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探+LY294002组表达较消痰解郁方组和LY294002组强，印证消痰解郁方在与抑制剂联合用药时，能更有效地通过信号通路抑制细胞凋亡，影响基因与蛋白表达。也进一步说明，中药复方制剂是多靶点多通道发挥对乳腺癌前病变的治疗作用。消痰解郁方与LY294002的对比，从分子水平和蛋白水平证实消痰解郁方逆转乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的作用机制与PI3K-AKT信号传导通路可能密切相关，可能是一种PI3K-AKT信号传导通路的天然抑制剂，为临床用药提供理论依据。综上所述，本研究证明了消痰解郁方能够抑制PI3K、AKT、p-Akt等的表达，同时增加PTEN表达，发挥治疗乳腺癌前病变、防治乳腺癌的作用。由此可推断消痰解郁方是通过对PI3K-AKT信号通路中相关分子的调节而治疗乳腺癌前病变大鼠、促进乳腺癌前病变MCF-10AT细胞凋亡。我们下一步将通过消痰解郁方对AKT通路的下游靶点进行检测，进一步证明其对PI3K-AKT信号传导通路的影响。-93- 第二军医大学博士学位论文结语一、结论1.DMBA中剂量（10mg/只）是比较理想的造模剂量、10周也是较为合适的造模时间结点，可以成功制备乳腺癌前病变大鼠模型。2.PI3K-AKT信号传导通路在乳腺癌前病变阶段已被激活，并和乳腺癌前病变的发生发展与逆转密切相关。3.消痰解郁方能诱导乳腺癌前病变MCF-10AT细胞的凋亡，对DMBA联合雌孕激素诱导的SD雌性大鼠乳腺癌前病变模型有明确治疗作用，其机制与影响PI3K-AKT信号传导通路、诱导细胞凋亡有关。二、创新点1．提出“痰”和“郁”是乳腺癌前病变产生的基本病机；2．提出乳腺癌前病变时，PI3K-AKT信号传导通路已被激活；3．从PI3K-AKT信号传导通路角度揭示消痰解郁方治疗乳腺癌前病变的机制：选用具有良效的消痰解郁方对乳腺癌前病变大鼠及乳腺癌前病变MCF-10AT细胞进行研究，利用Q-PCR、Westernblot、免疫组化等技术，通过检测PI3K-AKT信号传导通路相关基因及蛋白表达水平的变化，揭示了消痰解郁方有效治疗乳腺癌前病变和预防乳腺癌发生的作用机制。国内外鲜有报道，具有创新性。三、展望本实验通过体内外实验进一步证实消痰解郁方对乳腺癌前病变的发展有抑制作用，并初步明确了消痰解郁方作用机制。为进一步明确消痰解郁方抑制乳腺癌前病变PI3K-AKT信号传导通路中最关键信号分子，下一阶段我们将使用SiRNA开展对PI3K-AKT信号传导通路中关键信号分子的沉默实验，寻找消痰解郁方对PI3K-AKT信号传导通路中抑制乳腺癌前病变发展的最关键点，揭示消痰解郁方治疗乳腺癌前病变的作用靶点。-94- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探参考文献[1]赵玉沛，孙强，等．北京协和医院医疗诊疗常规（乳腺疾病诊疗常规）[M]北京：人民卫生出版社，2012：18．[2]罗友成，王鋆植，曹丹，朱姝，涂璇，吴方方，罗华军，邓张双．忍冬木层孔菌对乳腺癌前病变大鼠的保护作用[J]．中药药理与临床，2013，29(1)：93-97．[3]吴高春，王小燕，张瑞峰．乳腺癌前病变的研究进展[J].中国冶金工业医学杂志，2016，33(3)：269-271．[4]吴凯南.乳腺癌癌前病变的新概念[J].中国肿瘤，2009，18(06):461-466.[5]牛昀．中心体γtubulin、Nek2及染色体异常与乳腺癌发生发展关系研究[D]．天津：天津大学，2012．[6]张珺.乳腺癌前病变的中西医研究概况[J].中医学报，2014，(01)；9-10.[7]EwingJ．PrecancerousDiseasesandprecancerouslesions，Especiallyinbreast[M]．MedRecord，1994，86：951—958．[8]PageDL，SalhanyKE，JensenRA，etal.Subsequentbreastcarcinomariskafterbiopsywithatypiainabreastpapilloma[J]．Cancer，1996，78:258-266.[9]LakhaniSR．Thetransitionfromhyperplasiatoinvasioncaneinomaofthebreast[J].JPathol，1999，187(3)：272-278．[10]陈瑞雪，廖锐，梁世杰，别凤杰，马凯敏，叶仲秋，马民．乳腺癌前病变临床分型标准化研究进展[J]．中国老年学杂志，2014，09（25）：5308-5310．[11]杨红鹰.乳腺癌的癌前病变和早期乳腺癌[J].中国临床医生，2003，(02)：2-3．[12]CostaA，ZaniniV．Precancerouslesionsofthebreast[J]．NatureRevClin0ncol，2008，5(12)：700．[13]SandersME，PageDI，SimpsonJF，eta1．Interdependenceofradialsearandproliferativediseasewithrespecttoinvasivebreastcarcinomariskinpatientswithbenignbreastbiopsies[J]Cancer，2006；7(106)：1453．[14]刘标，周晓军．解读2012年WHO乳腺肿瘤分类[J]，临床与实验病理学杂志，2012，11：1185．[15]沈镇宙，夏川江．乳腺癌肿瘤体积、淋巴结情况与预后的关系[J]．《中华外科杂志，1991，9(7)：554-557．[16]KusamaR，FujimoriM，MatsuymaI，LiuTH，TsuchiyaS．ClinicopathologicalCharacteristicsofatypicalcysticduct(ACD)ofthebreast:assessmentofACDasaprecancerouslesion[J]．PatholInt，2000，50(10)：793-800．-95- 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第二军医大学博士学位论文附件一、药物作用24h后MCF-10AT细胞流式细胞图对照组消痰解郁方组三苯氧胺组抑制剂组消痰解郁方+抑制剂组-102- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探二、药物作用24h后MCF-10AT细胞周期图对照组消痰解郁方组三苯氧胺组抑制剂组消痰解郁方+抑制剂组-103- 第二军医大学博士学位论文三、病理切片正常组织小叶增生导管不典型增生乳头状瘤不典型增生小叶原位癌乳头状癌变-104- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探查新结论-105- 第二军医大学博士学位论文在读期间发表的论文和著作一、发表论文情况：[1]赵婧，魏品康，修丽娟，矫健鹏，俞超芹.消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3K/AKT通路的影响及机制.第二军医大学学报.2017，38（4）：22-24.[2]赵婧，魏品康，修丽娟，矫健鹏，俞超芹.消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞增殖和凋亡及对PTEN蛋白及mRNA的影响.中华航海与高气压医学杂志.2017，24（1）：45-47.[3]赵婧，魏品康.魏品康运用消痰解郁方治疗乳腺癌前病变经验.上海中医药杂志，2015(5):15-17.[4]赵婧，施俊，矫健鹏，秦志丰.关于西医院校中医教学目的的思考，中医教育，2014，（02）：82-83.[5]赵婧，施俊，矫健鹏，秦志丰.启发式教学在方剂教学中的应用，医学信息(上旬刊)，2014，（9）二、参与课题[1]上海市卫生局课题青年课题、2010Q049A、“消痰解郁方对肿瘤并发抑郁症患者的疗效及预后的影响”2011/1-2013/12、2万元、结题，参与。[2]上海长征医院院青年启动基金、2015CZQN11、基于NF-kB/IL-6/STAT3信号通路探讨从痰论治结直肠癌前病变的作用及机制研究2015/01-2016/12、5万元、在研、参与。三、参编著作[1]参编《抗癌必修课——乳腺癌》上海科学技术出版社[2]参编《魏品康治胃癌》人军医出版社[3]副主编《中医杂症心悟》西安出版社四、获奖情况[1]2016年获得中华医学会主办的“第六届全国高等医学院校青年教师教学基本功大赛”一等奖[2]2016年荣获中央军委政治部颁发的“三等功”一项[3]2015年获得第二军医大学“A级优秀教员”称号-106- 消痰解郁方对乳腺癌前病变的治疗作用和机制初探致谢时光荏苒，终于到了快毕业的季节，曾经无数次的渴望，今天终于站在了这个殿堂的门口，再回首，感慨万千……在职的女博士，一边是繁重的临床工作，一边是嗷嗷待哺的孩子，在夹缝中去努力追逐自己的目标……备考时已身怀六甲，现在毕业，孩子也已经快上小学了，漫长的6年的时间……有时候真的觉得自己坚持不下来，想要放弃了，曾经失落，失望，失掉所有方向……太多的痛苦，夹杂着泪水，承受着来自内心巨大的压力和父母的期望……很庆幸，我，终于还是来到了终点！能走到现在，我要感谢太多帮助过我的人，生命中的感动不能忘怀，也不敢忘怀！感谢我的论文总指导魏品康教授，如父亲一样指引和关爱着我，让只身一人在上海打拼的外地姑娘不觉得孤立无援。坚定着我作为一名医生的职业品格，坚定着我的中医梦想，是我学术上的导师，更是我的人生导师，您对事业的无比热爱和崇高医德，让我敬佩不已。您是我心中的高山，让我仰止；是我身后的大树，让我踏实；是我迷途中的明灯，指引我方向；是我无助时的双手，给我温暖……感谢导师俞超芹教授，在我迷茫的时候伸出援手，给了我雪中送炭的帮助。感谢您在我论文写作过程中的悉心指导，对课题设计的精准建议，牺牲休息时间逐字逐句为我修改把关博士论文，您身上的严谨求实的治学态度和科研作风，让我敬佩，您对待学生的认真负责和关爱更让我感动。感谢岳小强主任，秦志丰主任，孙大志副教授，施俊医师，李勇进医师对我课题设计和实施过程中的指导，感谢好友矫健鹏，修丽娟对于我实验方法，统计分析和论文撰写过程中无私帮助，我们一起同舟共济；感谢我亲爱的兄弟姐妹顾雨芳，刘煊，叶敏，张映城，王小伟，张慈安，曾贵刚，武峰，有你们在，让我前进的道路不再孤单，苦中有乐；感谢同事陆烨，赵颖，张璇，徐晶钰，唐继贵给予的各项帮助；感谢药材科庞涛，药学院陈大贵在药材制备和动物实验上付出的辛勤汗水，保证了课题的顺利完成。感谢病理科余宏宇主任，您对事业的执着和付出至今依然感动着我，鼓舞着我的前行。最后感谢一直在我身后无限爱我的父母，我的弟弟妹妹，提供给我无比强大的精神动力，竭力为我解除所有前进路上的障碍，从精神到物质，事无巨细。感谢我的公公婆婆，我的丈夫照顾我的生活，照顾抚养我们的孩子，解除我的后顾之余，让我能把精力投入到工作中……至此搁笔，内心仍然不能平静，博士虽毕业，但前进的脚步不会停歇，梦想希望还留在心中，人生就是不断翻越高山的过程，继续加油吧！-107-
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