小反刍兽疫病毒武威分离株N蛋白单克隆抗体的制备

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分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学专业硕士学位论文小反刍兽疫病毒武威分离株N蛋白单克隆抗体的制备PreparationofmonoclonalantibodiestoNucleocapsidProteinsofPPRVWuweistrain王雯指导教师包世俊副教授（甘肃农业大学动物医学院兰州730070）学科专业兽医学研究方向动物传染病学论文答辩日期2018年5月学位授予日期2018年6月答辩委员会主席袁莉刚教授评阅人郭慧琛研究员万学瑞副教授2018年5月 摘要小反刍兽疫病毒(PestedesPetitsRuminantsVirus,PPRV)属副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)，其感染山羊、绵羊和野生小反刍动物而引起的小反刍兽疫（PestedesPetitsRuminants，PPR）是一种以发热、口炎、腹泻为特征的急性、烈性、高度接触性传染病，该病传播迅速，病死率高，给世界养羊业造成了重大经济损失。我国首次PPR疫情于2007年7月在西藏阿里地区发生，但在随后的几年，疫情仅限于西藏地区。2013年11月30日，新疆伊犁哈萨克自治州出现新的疫情，且疫情迅速向外蔓延。迄今为止，我国已有25个省、自治区、直辖市发生小反刍兽疫疫情，给我国养羊业造成巨大经济损失。目前，PPR的防控是在加强执法监督、疫情监测和提高预警能力的基础上采取综合防控的措施，一旦疫情发生，则在确诊的基础上采取封锁和扑杀等措施，以防止疫情的扩散。因此，快速、高效、特异性强、灵敏度高的PPRV检测方法的建立，将为PPR的快速诊断和有效防控提供技术支持。基于此，本研究主要完成了以下工作：（1）小反刍兽疫病毒武威分离株N基因的扩增及序列分析参照GenBank中PPRVNigeria75/1株N基因序列(HQ197753)设计引物，应用RT-PCR扩增获得PPRV武威分离株N基因全长。并在测序的基础上完成了其与GenBank中的53株PPRVN基因序列的生物信息学分析。（2）小反刍兽疫病毒武威分离株N基因的原核表达及多克隆抗体的制备将PPRV武威分离株N基因克隆至pET-28a(+)，构建原核表达质粒pET-PPRV-N，并将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，经IPTG诱导后，获得重组蛋白的可溶性表达，表达产物相对分子量大小约为57.8kDa。纯化表达产物免疫BALB/c小鼠，应用ELISA和Westernblot对抗血清的效价、反应原性进行检测，结果表明，PPRV武威分离株N蛋白具有良好的免疫原性及反应原性。（3）小反刍兽疫病毒武威分离株N蛋白单克隆抗体的制备取免疫后BALB/c小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，经多次亚克隆筛选获得2株能稳定分泌PPRVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B7及3I4；ELISA检测结果表明，杂交瘤细胞2B7和3I4产生的单克隆抗体具有特异性；亚型鉴定结果表明两株细胞分泌单抗重链均为IgG2b型、轻链均为κ型；应用两株杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠，所得腹水，效价分别为1：51200和1：25600。I 关键词：小反刍兽疫病毒；N基因；原核表达；单克隆抗体II SummaryPestedesPetitsRuminantsVirus(PPRV)belongstothegenusMorbillivirusinthefamilyParamyxoviridae,itprimarilyaffectingsheep,goatsandwildsmallruminants.PestedesPetitsRuminants(PPR)isanacute,severeandhighlycontagiousdisease,whichischaracterizedwithnasalandoculardischarges,gastroen-teritis,necroticstomatitis,pyrexia,anderosionofthepulmonarytractmucosa.Thediseasespreadsrapidlyandhasahighmortalityrate,PPRisresponsibleforsevereeconomiclossesinthecountrieswhereitisendemic.InChina,thefirstPPRepidemicoccurredinJuly2007intheAliareaofTibet,butinthefollowingyears,itwaslimitedtotheTibetarea.OnNovember30,2013,anewepidemicoccurredintheXinjiangYiliKazakhAutonomousPrefecture,anditspreadquickly.Sofar,25provinces,autonomousregions,andmunicipalitiesarisedPPR,whichhavecausedtremendouseconomiclossestoChina'ssheep-rearingindustry.Atpresent,thepreventionandcontrolofPPRisconcentratedonthestrengtheningoflegalsupervision,epidemicmonitoring,andearlywarningcapabilities.Intheeventofanoutbreak,measuressuchasblockadesandexclusionswillbeadopted.Therefore,establishafast,efficient,specificandsensitivePPRVdetectionmethod,willprovidetechnicalsupportforrapiddiagnosisandeffectivepreventionandcontrolofPPR.Basedonthis,thisstudymainlycompletedthefollowingwork:(1)AmplificationandsequenceanalysisofNgeneofPPRVWuweistrainTheprimersweredesignedaccordingtotheNgenesequence(HQ197753)ofPPRVNigeria75/1straininGenBank.Thefull-lengthNgeneofPPRVWuweistrainwasobtainedbyRT-PCRamplification.Onthebasisofsequencing,bioinformaticsanalysisof53strainsofPPRVNgenesequencesinGenBankwascompleted.(2)ProkaryoticexpressionofNgeneofPPRVWuweistrainandpreparationofpolyclonalantibodiesTheNgeneofPPRVWuweistrainwasclonedintopET-28a(+)toconstructaprokaryoticexpressionplasmidpET-PPRV-N,whichwasthentransformedintoE.coliRosetta(DE3).AfterinducedbyIPTG,thesolubleexpressionoftherecombinantproteinwasobtained.Therelativemolecularweightwasabout57.8kDa.ImmunizeBALB/cmicewiththepurifiedexpressedprotein.ThetiterandimmunogenicityoftheantiserumweredetectedbyELISAandWesternblot.TheresultsshowedthattheNproteinofPPRVWuweistrainhadgoodimmunogenicity.(3)PreparationofMonoclonalAntibodytoNProteinofPPRVWuweiStrainIII FusionofspleencellsofimmunizedBALB/cmicewithmyelomacells(SP2/0).Screeningfortwohybridomacelllines2B7and3I4thatstablysecretemonoclonalantibodiesagainstPPRVNprotein.TheresultsofELISAshowedthatthemonoclonalantibodiesproducedbyhybridomacells2B7and3I4werespecific;TheresultsofsubtypeidentificationshowedthatthetwocellsecretoryMcAbheavychainswereIgG2btypeandlightchainwereκtype.InjectingcellsintotheabdominalcavityofBALB/cmice,collectandtesthydroperitoniumtiters,andthetestresultsshowthatthetiteris1：51200and1：25600,respectively.Keywords:PPRV;Ngene;Prokaryoticexpression;MonoclonalantibodyIV 外文缩略词表英文缩写英文名称中文全称APSAmmoniumpersulfate过硫酸铵bpbasepair碱基对dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺ddH2ODoubledistilledH2O双蒸水DMEMDulbecco'sminimumessentialmedium达尔伯克必需基本培养基DMSODimethylsulphoxide二甲基亚砜FBSFetalBovineSerum胎牛血清HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HATHypoxathineand,aminopterinandthymidine次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷IPTGIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷LBLauriabrothLB肉汤NCnitrocellulosemembrane硝酸纤维素膜ODOpticaldensity光密度PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液PPRPestedespetitsnuninants小反刍兽疫RTReversetranscription反转录SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝SDS-PAGEelectrophoresis胶电泳TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷VNTVirusneutralizationtest病毒中和试验5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopy-X-gal6-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-糖核苷ranosideg,mg,µgGram,milligram,microgram克，毫克，微克KDaKilodalton千道尔顿L,mL,µLLiter,milliliter,microliter升，毫升，微升MAbMonoclonialAntibody单克隆抗体V 目录摘要..............................................................................................................................................I关键词............................................................................................................................................II外文缩略词表................................................................................................................................V第一章小反刍兽疫研究进展.....................................................................................................11小反刍兽疫概述.........................................................................................................................12病原学研究进展.........................................................................................................................12.1基因组及其编码蛋白..........................................................................................................12.2理化特征..............................................................................................................................23流行病学研究进展.....................................................................................................................23.1易感动物..............................................................................................................................23.2传染源..................................................................................................................................23.3传播途径..............................................................................................................................23.4流行的季节性......................................................................................................................23.5潜伏期..................................................................................................................................24发病机理.....................................................................................................................................25临床症状.....................................................................................................................................36病理变化.....................................................................................................................................37诊断方法研究进展.....................................................................................................................37.1病毒的分离培养..................................................................................................................37.2血清学检测方法..................................................................................................................37.2.1血凝及血凝抑制试验（HA及HI）............................................................................37.2.2凝胶免疫扩散试验(AGID)...........................................................................................37.2.3对流免疫电泳(CIEP)....................................................................................................47.2.4间接免疫荧光抗体试验(IFAT)....................................................................................47.2.5过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)...............................................................................47.2.6病毒中和试验(VNT).....................................................................................................47.2.7酶联免疫吸附试验(ELISA)..........................................................................................47.3分子生物学检测方法..........................................................................................................67.3.1RT-PCR.........................................................................................................................67.3.2实时PCR(real-timePCR).............................................................................................6VI 7.3.3PCR-ELISA方法..........................................................................................................77.3.4核酸探针杂交试验........................................................................................................77.3.5环介导等温核酸扩增(LAMP)......................................................................................77.3.6反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）..............................................................77.4其他检测技术......................................................................................................................87.4.1荧光素酶免疫沉淀（PPR-LIPS）...............................................................................87.4.2胶体金免疫层析试纸条................................................................................................87.4.3超灵敏荧光免疫层析技术(QD-LFIAS).......................................................................88本研究的目的意义.....................................................................................................................8第二章小反刍兽疫病毒武威分离株N基因的扩增及序列分析............................................91材料.............................................................................................................................................91.1毒株......................................................................................................................................91.2菌种、载体..........................................................................................................................91.3主要仪器..............................................................................................................................91.4主要试剂............................................................................................................................101.5主要试剂及培养基配制....................................................................................................102方法...........................................................................................................................................112.1引物设计............................................................................................................................112.2PPRV武威分离株总RNA的提取...................................................................................112.3N基因RT-PCR扩增........................................................................................................112.4目的基因的回收................................................................................................................122.5载体的构建及目的基因序列测定....................................................................................122.6N基因的生物信息学分析................................................................................................122.6.1遗传进化分析..............................................................................................................122.6.2N基因核苷酸序列分析..............................................................................................122.6.3N蛋白二级结构的预测..............................................................................................122.6.4N蛋白信号肽及跨膜区的预测..................................................................................132.6.5N蛋白亲水性、抗原性的预测..................................................................................133结果...........................................................................................................................................133.1PPRVN基因的RT-PCR扩增........................................................................................133.2N基因遗传进化分析........................................................................................................13VII 3.3N基因编码蛋白序列的生物信息学分析........................................................................143.3.1N蛋白核苷酸序列分析..............................................................................................153.3.2N蛋白二级结构预测..................................................................................................153.3.3信号肽及跨膜区的预测..............................................................................................153.3.4N蛋白亲水性、抗原性的预测..................................................................................164讨论...........................................................................................................................................16第三章小反刍兽疫病毒武威分离株N基因的原核表达及多克隆抗体的制备..................171材料...........................................................................................................................................171.1菌种、载体及实验动物....................................................................................................171.2主要仪器............................................................................................................................171.3主要试剂............................................................................................................................171.4主要缓冲液与试剂配制....................................................................................................181.5PPRV武威分离株N基因的原核表达............................................................................191.5.1重组表达质粒的构建..................................................................................................191.5.2重组蛋白的表达及鉴定..............................................................................................191.5.3表达产物的分析..........................................................................................................191.7多克隆抗体制备................................................................................................................201.8抗体效价的ELISA检测...................................................................................................201.9N蛋白最佳抗原包被量的确定........................................................................................201.10Westernblot检测.............................................................................................................202结果与分析...............................................................................................................................212.1原核表达质粒pET-PPRV-N鉴定....................................................................................212.2诱导表达及SDS-PAGE分析...........................................................................................212.3多克隆抗体的制备............................................................................................................222.4抗原最佳包被量的确定....................................................................................................222.5多克隆抗体的Westernblot分析......................................................................................223讨论...........................................................................................................................................23第四章小反刍兽疫病毒武威分离株N蛋白单克隆抗体的制备..........................................251材料...........................................................................................................................................251.1实验动物及细胞................................................................................................................251.2试验仪器............................................................................................................................25VIII 1.3主要试剂............................................................................................................................251.4试剂配制............................................................................................................................252方法...........................................................................................................................................262.1抗原最佳包被量的确定....................................................................................................262.2细胞的培养及制备............................................................................................................262.2.1SP2/0的培养...............................................................................................................262.2.2饲养细胞的制备..........................................................................................................262.2.3脾细胞的制备..............................................................................................................262.3杂交瘤细胞株的建立........................................................................................................272.3.1细胞融合......................................................................................................................272.3.2细胞筛选......................................................................................................................272.3.3亚克隆及细胞株的建立..............................................................................................282.3.4单克隆抗体特异性检测..............................................................................................282.3.5单克隆抗体稳定性检测..............................................................................................282.3.6单克隆抗体亚类鉴定..................................................................................................282.4单克隆抗体腹水的制备及粗提........................................................................................282.5腹水抗体效价的测定........................................................................................................293结果...........................................................................................................................................293.1抗原最佳包被量的确定....................................................................................................293.2杂交瘤细胞株的建立........................................................................................................293.3单克隆抗体特异性测定....................................................................................................293.4单克隆抗体稳定性测定....................................................................................................303.5抗体亚类鉴定....................................................................................................................303.6腹水抗体效价测定............................................................................................................304讨论...........................................................................................................................................31全文结论.......................................................................................................................................33参考文献.......................................................................................................................................34致谢.........................................................................................................................................41作者简介.......................................................................................................................................42导师简介.......................................................................................................................................43原创性声明...................................................................................................................................44IX 甘肃农业大学硕士学位论文第一章小反刍兽疫研究进展1小反刍兽疫概述PPR是一种由PPRV引起的，以发热、口炎、腹泻为特征的急性、烈性、高度接触性传染病[1]。该病主要感染山羊、绵羊等一些小反刍动物，传播迅速，且病死率高[2]，严重威胁着我国乃至世界养羊业的健康发展。PPR首次发生于1942年非洲西部的科特迪瓦，且在随后几十年内，PPR一直流行于非洲各个国家[3]。1987年印度发生PPR疫情，为第一个发生PPR疫情的亚洲国家，随后的1993~1995年间，阿拉伯半岛及中东地区的一些国家也相继报道了PPR疫情[4,5]。我国首次报道PPR是在2007年7月西藏阿里地区，该次疫情发生后，西藏多个县相继发生了PPR疫情，2008年6月，西藏那曲地区出现疫情，2010年5月，阿里地区再次发生PPR疫情，且自此次疫情报道后截至2013年年底，我国再无新的PPR疫情报道；2013年11月，新疆伊犁哈萨克自治州出现PPR新疫情，且疫情迅速向外蔓延；2014年1月22日，甘肃武威发生PPR疫情；同年2月内蒙古自治区巴彦淖尔市报道PPR疫情发生，患羊病死率为40.55%；2014年3月湖南省邵阳市又发生PPR疫情，且发病羊群的病死率高达65%。目前，我国报道PPR疫情发生的地区有西藏、新疆、甘肃、内蒙古、辽宁、湖南、江西、安徽、黑龙江、吉林、广西、重庆、四川、湖北、山西、重庆、山西、广州等25个省、自治区、直辖市，且疫情呈由西向东蔓延趋势[6,7]。依据N、F等保守基因的核苷酸序列系统进化树分析结果，可将PPRV分为Ⅰ~Ⅳ4个谱系，前三个谱系主要流行于非洲国家，而第Ⅳ谱系主要流行于亚洲国家[8]。我国PPR流行病学调查结果显示，2007西藏PPRV毒株与印度流行株同源性很高，属于Ⅳ系[9]；2013新疆伊犁PPRV毒株与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系较近，属于Ⅳ系，但与西藏PPRV毒株不属于同一小分支[10]；2014东北PPRV毒株既有属于Ⅳ系的也有属于Ⅱ系的[11]。2病原学研究进展PPRV为副黏病毒科、麻疹病毒属的成员之一[12]，为有囊膜的RNA病毒[13]，其病毒粒子多呈圆形或椭圆形，直径为500nm左右，囊膜厚度不一，在8.5~14.5nm之间，囊膜上有8~15nm长的纤突，且只存在血凝素纤突，血清型唯一[14,15]。2.1基因组及其编码蛋白PPRV的基因组不分节段，为单股负链RNA，全长共15948bp，从3'端到5'端依次为N-P-M-F-H-L，共编码六种结构蛋白、两种非结构蛋白[16,17]。其中，N蛋白为核衣壳蛋白，1 甘肃农业大学硕士学位论文在PPRV中，其含量最多、保守性最强，抗原性最稳定；P蛋白是核糖核蛋白的组成部分,也是RNA依赖的RNA聚合酶的辅助因子；M蛋白为基质蛋白，构成病毒囊膜的内层，起到连接N蛋白与表面糖蛋白的作用；F蛋白存在于病毒表面，因其在麻疹病毒属中高度保守，故而可根据该蛋白进行PPRV不同系谱的分类；H蛋白镶嵌于病毒表面，保守性最差，在PPRV感染细胞的过程中只有与F蛋白同时存在时，才可使F蛋白充分发挥其活性；L蛋白在感染细胞内的表达量最少，在复制以及转录、蛋白的帽化、甲基化等过程中起重要作用[18]。2.2理化特征PPRV在自然环境中抵抗力较弱，2%NaOH、苯酚、醇、醚等化学物质以及高温均可将其杀灭，且有研究表明该病毒耐低温[19]。蒙学莲[20]等研究证实，PPRV的毒力易受存储条件等较多因素的影响，若将PPRV强毒株置于-80℃超低温冰箱保存一段时间，则其致病性会大大降低。3流行病学研究进展3.1易感动物PPRV的主要宿主有山羊、绵羊等一些小反刍动物，山羊的易感性大于绵羊，且尤以幼龄山羊最为易感。岩羊、鹿、瞪羚、羚羊[21]、骆驼[22,23]等野生动物也能够发生感染。牛感染后不呈现出明显的症状，但却产生抗体[24]。猪感染后不表现临床症状，亦不传播PPRV。3.2传染源患病动物的眼、鼻、口腔分泌物，精液、胚胎、乳汁以及排泄的粪便等均为主要的传染源。3.3传播途径PPRV主要通过消化道和呼吸道传播，也可经胚胎移植等途径传播[21]。3.4流行的季节性本病一年四季均可发生，但在多雨季节和干燥寒冷季节多发。3.5潜伏期潜伏期一般为4~6天，OIE《陆生动物卫生法典》规定最长潜伏期为21天。4发病机理PPRV有趋淋巴细胞及上皮细胞的特性，在淋巴、上皮等组织中，该病毒极易复制且2 甘肃农业大学硕士学位论文导致细胞发生病变，研究表明，PPRV经呼吸道入侵机体，且在进入动物体后，首先于上呼吸道的咽喉等部位增殖，随后于短期内形成病毒血症，从而促使PPRV到达全身淋巴器官、胃肠道系统及呼吸系统的黏膜或组织中，最终表现出一定的临床症状[25]。5临床症状山羊感染PPRV后的临床症状极为典型。一般表现为初期发热、口炎，后期发生严重腹泻及肺炎[26]；症状较轻时极易将其误判为感冒；较严重时体温可升至41℃以上，口鼻腔分泌出浓性黏液，表面糜烂、坏死，严重病例出现腹泻带血、脱水、流产[27]。6病理变化患畜结膜、口腔发生炎症；鼻甲，气管，支气管黏膜，支气管淋巴结充血、出血；皱胃糜烂；心包积液，并伴有右心衰竭；胸腔亦有炎性渗出物出现；肝脏，结肠，肾脏等组织、器官呈现出充血、出血症状；脾脏肿大、淤血[28]。7诊断方法研究进展随着细胞培养技术和分子生物学技术的发展，灵敏度高、特异性强，以检测病毒基因或抗原、抗体为基础的生物学技术逐步广泛应用于小反刍兽疫的检测。目前已知的方法主要有病毒的分离培养、血清学检测方法及分子生物学检测方法等[29,30]。7.1病毒的分离培养PPRV可繁殖生长于原代绵羊、山羊胎肾细胞，新生羊睾丸细胞，Vero等细胞中，形成以核内包涵体、胞质内包涵体为特征的细胞病变(CPE)[31]，该方法特异性高，但耗时长、对实验条件要求高，故不适用于PPRV的快速检测。7.2血清学检测方法7.2.1血凝及血凝抑制试验（HA及HI）在PPRV检测对比试验中，HA及HI检测方法体现出了比AGID更高的特异性及敏感性，且OsmanNA[32]等证实HA及HI检测方法更加快速、简捷、经济。7.2.2凝胶免疫扩散试验(AGID)AGID在病毒抗原含量较低的PPR检测中表现出较低的灵敏性，故其对于PPR早期诊断的应用价值不高。ObiTU[33]等在1984年将该方法应用于眼鼻分泌物以及粪便等临床样品的检测，且检测结果显示该方法灵敏性低于CIEP检测方法。YangW[34]等在一项PPR检测对比试验中得出了AGID检测方法敏感性低于c-ELISA检测方法的结论。3 甘肃农业大学硕士学位论文7.2.3对流免疫电泳(CIEP)CIEP的敏感性要明显的高于AGID，其反应时间短、可应用于蛋白的定性及半定量，但该方法特异性低，不能鉴别诊断PPRV和牛瘟病毒（RinderpestVirus，RPV）。早在1984年，MajiyagbeKA[35]等在PPRV的检测中就有效地使用了该方法，OsmanNA[36]等的试验结果表明CIEP技术在用于检测PPRV抗体时，其敏感性要优于c-ELISA检测方法。7.2.4间接免疫荧光抗体试验(IFAT)IFAT有较高特异性，但其耗时长、对设备要求高，很难应用于大量样品的检测。该技术以荧光物标记抗体，根据抗原抗体结合原理完成了抗原的定位检测，与其他的血清学方法相比较，快速、简便且敏感性高是该方法最大的优势。蒋梅[37]等以PPRVNigeria75/1减毒疫苗作为抗原免疫山羊，在产生PPRV高免血清后，粗提IgG，并将其以异硫氰酸荧光素标记，继而应用于PPRV的检测，试验结果表明，该方法敏感性高，可检测出1×106倍稀释的病毒转染后的细胞培养物，且该方法当天即可得到检测结果，有一定的临床应用价值。7.2.5过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)IPMA方法能够检测到感染细胞或者组织样品中的病毒抗原，且在定位病毒的靶器官及靶组织时有一定的应用价值，该方法在辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育结束后，又加入了可附着于细胞表面的、能与HRP发生肉眼可见显色反应的底物，该反应物在光学显微镜下便可观察到，可以很快得出检测结果，且其检测结果可长期保存。ZhangJ[38]等在建立了幼仓鼠肾-山羊信号传导淋巴细胞活化分子（BHK-SLAM）细胞系后，结合能够表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组PPRV（rPPRV-GFP），建立了一种能够检测PPRV的IPMA检测方法，研究表明，该方法敏感性、特异性均很高，且与VNT检测方法的有很高的符合率，且其检测结果在4小时内既能得出。7.2.6病毒中和试验(VNT)VNT基于抗原抗体特异性结合原理，使病毒与相应抗体相结合，从而使得病毒失去对易感动物的感染能力。PPRV的VNT试验是国际上认可的PPRV诊断方法，在PPRV及RPV的特异性诊断中，有着较高的可靠性，其较低的检测效率是影响其广范应用于PPRV检测的主要因素，TaylorWP[39]于1979年证实该方法可以准确区分PPRV与RPV。7.2.7酶联免疫吸附试验(ELISA)7.2.7.1间接ELISA(i-ELISA)4 甘肃农业大学硕士学位论文i-ELISA有较高特异性，可以鉴别PPRV和RPV，且其敏感性和特异性均优于c-ELISA，在流行病学研究中有较高的应用价值，但该方法易受待检样品中无关蛋白的干扰。庞文静[40]将N蛋白连接于pET-28a载体，并将其以包涵体的形式进行了原核表达，用复性后的重组蛋白作为包被抗原建立了特异性高且敏感性为98.7%的PPRVi-ELISA检测方法。王东方[41]构建了重组质粒pSumo-mut-N，在将其转化至大肠埃希菌进行原核表达后，建立了敏感性为100%的PPRVi-ELISA检测方法。7.2.7.2竞争ELISA(c-ELISA)c-ELISA检测方法的建立多是以单克隆抗体的制备为基础，而针对于PPRV的检测，则多是基于N、H蛋白的单克隆抗体的制备，该方法也是OIE规定的标准检测方法之一。RajGD[42]等基于PPRVN蛋白的截短基因，制备单克隆抗体，并开发了一种c-ELISA检测方法；ZhangGR[43]等以合成的西藏PPRVN蛋白免疫家兔制备抗血清，继而建立了一种c-ELISA检测方法，该方法与商业c-ELISA试剂盒相比较，其敏感性和特异性分别为96.18%和91.29%；LibeauG[44]等将PPRVN蛋白在重组杆状病毒中表达，继而开发了基于PPRVN蛋白单克隆抗体的c-ELISA检测方法，该方法与VNT相比，其敏感度及特异性分别为94.5%和99.4%。7.2.7.3阻断ELISA(b-ELISA)b-ELISA与c-ELISA的不同之处在于待检血清、单克隆抗体的加入方法，c-ELISA将待检血清、单克隆抗体同时加入，而b-ELISA则是先将待检血清与预先固相包被的PPRV抗原反应，然后再与单抗孵育，其灵敏性和特异性均高于c-ELISA方法[45~47]。且由于其灵敏性及特异性与VNT相当，而在操作快捷性方面又优于VNT，故可以其替代VNT用于PPR的流行病学监测。SalikiJT[48]等使用两种针对PPRV的MAb建立了一种b-ELISA检测方法，且经验证，该方法在敏感性及特异性方面均与VNT相同。郑云霞[49]基于PPRVN蛋白基因构建了原核表达质粒pET-28a-N，制备了抗PPRVN蛋白的单克隆抗体，在此基础上建立了检测PPRV抗体的b-ELISA检测方法。7.2.7.4夹心ELISA(s-ELISA)s-ELISA方法对试验仪器设备要求较低，敏感性、特异性均较其他ELISA检测方法高，在大量临床样品快速检测中有很高的使用价值，且相较于i-ELISA，s-ELISA方法能有效排除待检样品中其他蛋白对检测结果造成的影响。MahajanS[50]等就建立了针对PPRV的s-ELISA方法用以PPRV的临床检测；郭昌明[51]等应用表达纯化的PPRVN蛋白制备的多克隆抗体，建立了检测PPRV抗原的灵敏、特异的s-ELISA方法，且与RT-PCR方法相比，5 甘肃农业大学硕士学位论文该方法更加省时；何红菊[52]等利用制备的针对PPRVNigeria75/1株N蛋白的杂交瘤细胞株，制备出单克隆抗体，并结合多抗和已知的PPRV阳性、阴性的细胞培养物建立了PPRVs-ELISA检测方法，且通过临床试验，验证了其检测方法的特异性及敏感性。7.2.7.5斑点ELISA（dot-ELISA）dot-ELISA是在NC膜上进行底物与酶的显色反应。因其试验结果可以肉眼观察，故而该方法可应用于较大规模的野外以及现场流行病学调查，且相较于夹心ELISA，其敏感性及特异性均较高。7.3分子生物学检测方法7.3.1RT-PCR早在1995年，基于PPRVF基因、P基因设计出多对引物的RT-PCR鉴定方法首次建立，且经验证，该方法可以有效鉴别PPRV和RPV，具有良好的特异性。BalamuruganV[53]等基于PPRVN、M基因建立了一步法多重RT-PCR，且在眼、鼻及口腔拭子中成功检测到了PPRV。郝玉青[54]基于PPRVN基因序列设计特异性引物,建立针对陕北地区PPRVN基因的一步法RT-PCR检测方法，其灵敏度可低至10-2TCID50/mL。7.3.2实时PCR(real-timePCR)实时PCR的定量主要使用荧光色素，目前使用较多的一种是使用荧光探针(probe)，例如Taqman探针，另一种是插入特异的荧光色素，例如SYBRGreen荧光染料。赵文姬[55]等基于PPRVF基因序列设计了一对特异性引物和一条Taqman探针，经验证，该方法最低可检测到490拷贝/µL的RNA模板；BattenCA[56]等基于PPRVN基因设计了特异性引物以及Taqman探针，建立了一种实时PCR检测方法；何世成[57]等对PPRV基因序列进行分析，进而建立了双重荧光RT-PCR鉴别检测方法，且其特异性检测表明，该方法可特异检测野毒株和疫苗毒株，且其可检测到低于10-3稀释度的RNA（27.6ng/mL）；袁向芬[58]等基于PPRVN基因序列建立了能鉴别PPRV野毒株与疫苗毒株的双重荧光实时PCR鉴别检测方法，从而避免了假阳性检测结果的发生；PolciA[59]等人基于PPRVN蛋白基因的保守区设计实时RT-PCR引物和TaqMan探针，建立了一种双引物实时RT-PCR检测方法，且该方法可检测到约为20个拷贝/µL的RNA模版；Vinayagamurthy[60]等基于PPRVM蛋白设计特异性引物，并借助SYBRGreen染料建立了一步法半定量实时PCR检测方法，该方法相较于常规RT-PCR及荧光探针实时PCR法有极高的灵敏性，且其最低检测量可低至0.5fg，在PPRV的早期感染的临床诊断中有很高应用价值；KwiatekO[61]等基于PPRVN6 甘肃农业大学硕士学位论文蛋白基因开发了可以特异性检测PPRV的实时PCR检测方法，其检测量可以低至32个拷贝，与传统的PCR方法相比，其敏感性高出许多，且该检测方法与BaoJ[62]等人开发的检测方法相比，在针对Ⅱ系PPRV的检测时表现出更高的灵敏度。7.3.3PCR-ELISA方法SaravananP[63]等将PCR及ELISA两类检测方法相结合，扩增得到目的基因后，标记以DIG标记物，继而用ELISA方法进行检测，从而建立了一种灵敏性高于普通PCR及s-ELISA的特异性PPRV检测方法，KumarCS[64]等扩增了PPRV核蛋白基因后将探针标记，建立了一种灵敏度高的RT-PCR-ELISA检测方法。7.3.4核酸探针杂交试验基于PPRVN、M、F、P等基因建立的cDNA探针已被设计研发，有些已成功应用于PPRV的检测中。陶春爱[65]等在设计了基于PPRVN基因保守区特异寡聚核苷酸探针后，以纳米金将其标记，建立了针对PPRVN基因的核酸探针杂交检测方法，且经证实，该方法可在约1.5h内对极低浓度的PPRV核酸进行检测，为PPRV的检测提供了新的技术手段。7.3.5环介导等温核酸扩增(LAMP)LAMP技术由Notomi等人研发，该扩增技术仅在链置换DNA聚合酶的作用下于65℃扩增几十分钟即可完成。快速，特异性高，对实验设备、技术操作等方面的要求低，检测结果易于观察、在室外环境中可进行检测等诸多优点[66,67]，使得该方法在许多动物疫病的检测中得到了应用。张忠湛[68,69]等人基于PPRVN基因建立了一种简捷、特异、高灵敏度的LAMP检测方法。7.3.6反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）RT-LAMP不仅保留了LAMP检测方法的优点，还避免了反转录过程中的污染，防止假阳性的发生。LiW[70]等针对PPRVN基因保守区域设计4条引物，进而建立了一种RT-LAMP检测方法，该方法仅需要70min，且其灵敏度是RT-PCR的103倍；LinL[71]等基于PPRV的M蛋白基因序列设计6组LAMP引物，通过在63℃下温育来扩增靶RNA，并进行肉眼观察，经验证，其特异性为100%，敏感性为RT-PCR的10倍；杨卓[72]等合成PPRVN蛋白基因的核酸质粒，进而建立了能鉴别PPRV新疆株和西藏株的RT-LAMP方法，其在65℃50min内即可完检测，且该方法的灵敏度是RT-PCR的10倍。7 甘肃农业大学硕士学位论文7.4其他检测技术7.4.1荧光素酶免疫沉淀（PPR-LIPS）LIPS检测方法是将抗原与荧光素酶融合表达，在检测时，待检血清中抗体先与抗原特异性结合，再与大颗粒物质proteinA/Gplusagarose结合，三者形成复合物，继而加入荧光素酶底物，通过分析复合物上的荧光素酶与底物作用时是否发出荧光来检测血清中是否含有抗体，且其发射的荧光量度与血清中存在的抗体量成正比。Berguido[73]等基于PPRVN蛋白，建立了一种可以检测针对PPRVN蛋白特异性抗体的荧光素酶免疫沉淀检测方法，该方法敏感性强、特异性高，在PPRV检测样品的需要量上甚至可减缩为1μL。7.4.2胶体金免疫层析试纸条何红菊[74]应用柠檬酸三钠还原法制备了试验所需的胶体金，并将制备的小鼠PPRVN蛋白单克隆抗体与山羊多抗相结合，建立了一种用于检测PPRV抗原的胶体金免疫层析试纸条法，该方法可用于PPRV的野外筛查，有利于PPRV的基层防控。7.4.3超灵敏荧光免疫层析技术(QD-LFIAS)SiC[75]等以QDs作为荧光标记，在结合了侧流免疫分析试纸条（LFIAS）后，建立了一种能检测PPRV血清抗体的QD-LFIAS技术，该方法操作简便，有高于c-ELISA的特异性和敏感性，检测结果可在一刻钟之内得出，有较高的使用价值。8本研究的目的意义近年来，PPR在我国时有发生，严重威胁我国养羊业的健康和持续发展，因此，研发稳定性好、特异强、灵敏、快速的小反刍兽疫的诊断和检测方法，特别是能够在野外或现场应用的快速诊断和检测方法，将为该病的有效预防和迅速控制提供技术保障。目前OIE推荐的PPRV诊断方法主要为VNT、PCR、AGID及c-ELISA等，其中，VNT、AGID等方法存在检测周期长、特异性低及操作复杂等缺点，PCR检测方法虽然具有较高的特异性，但其方法的应用需要专门的仪器设备，且多局限于在实验室完成，而c-ELISA、i-ELISA、胶体金免疫试纸条法、超灵敏荧光免疫层析技术等基于单克隆抗体建立的检测方法，除了敏感性高、特异强外，对实验室条件和检测人员技术要求较低，在流行病学调查中使用更便捷，更适用于大量样品的同时检测，因此，本研究根据PPRVN蛋白的特性，在目的蛋白原核表达的基础上，以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠，进而制备N蛋白特异性单克隆抗体，以期为小反刍兽疫快速、便捷诊断方法的建立奠定基础。8 甘肃农业大学硕士学位论文第二章小反刍兽疫病毒武威分离株N基因的扩增及序列分析N蛋白为PPRV的核衣壳蛋白，在PPRV中，其含量最多、保守性最强、抗原性最稳定，已有研究表明，基于PPRVN蛋白建立的血清学、分子生物学等检测方法多具有良好的特异性及灵敏性。因此，本研究参照Nigeria75/1株N基因(HQ197753)全长设计了一对特异性引物，扩增获得了PPRV武威分离株N基因全序列，进而在测序的基础上，将该基因序列与GenBank中53株不同国家、区域的PPRVN基因序列进行比对，并应用ExPASy、SignalP及TMHMM等软件完成了PPRV武威分离株N基因核苷酸序列的生物信息学分析，为PPRVN基因功能的深入研究及其进一步开发利用奠定了基础。1材料1.1毒株PPRV武威分离株为甘肃农业大学兽医传染病学实验室分离保存。1.2菌种、载体大肠杆菌(Escherichiacoli)Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司(Transgen,北京)；pMD19®-T载体购自宝生物工程有限公司(TakaRa,大连)。1.3主要仪器表2-1主要仪器Table2-1Mainequipment名称生产厂家漩涡振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司梯度PCR仪德国Eppendrof公司电热恒温培养箱上海琅玕实验设备有限公司三恒电泳仪北京六一厂凝胶成像仪北京君意东方电泳设备有限公司恒温培养摇床上海南荣实验设备有限公司恒温水浴锅金坛市恒丰仪器制造有限公司金属浴连接仪杭州瑞城仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂9 甘肃农业大学硕士学位论文1.4主要试剂表2-2主要试剂Table2-2Reagent试剂品牌公司TRIzol®ReagentInvitrogen赛默飞世尔科技（中国）有限公司DEPC水SangonBiotech生工生物工程（上海）股份有限公司M-MLV反转录酶Takara宝生物工程（大连）有限公司RNaseInhibitorTakara宝生物工程（大连）有限公司dNTPTakara宝生物工程（大连）有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司PrimerSTAR®MaxDNA聚合酶Takara宝生物工程（大连）有限公司T4DNALigaseTakara宝生物工程（大连）有限公司质粒小提试剂盒TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司IPTGSigma美国氨苄青霉素Biosharp白鲨生物科技有限公司胰蛋白胨（Tryptone）OXOID英国酵母膏（Yeastextract）OXOID英国1.5主要试剂及培养基配制（1）IPTG溶液（1.0mmol/L）：取IPTG2.38g，以少量灭菌蒸馏水溶解后定容至10mL，0.22µm细菌滤器过滤、分装（1mL/管），-20℃保存备用。（2）卡那霉素（100mg/mL）：取卡那霉素粉末1g以灭菌蒸馏水配制成10mL的溶液，0.22μm细菌滤器过滤、分装（1mL/管），－20℃保存备用。（3）LB培养基（200mL）：取1g酵母提取物（YeastExtract）、2g胰蛋白胨（Tryptone）、2gNaCl溶解于适量蒸馏水，定容至200mL，调节pH为7.0后，于121℃15min高压灭菌，冷却、备用。（4）LB固体培养基（100mL）：于100mLLB液体培养基中加入1g琼脂粉，121℃15min高压灭菌，冷却、备用。（5）2YT培养基（200mL）：取2.0g酵母提取物、3.2g胰蛋白胨、1.0gNaCl溶解于适量蒸馏水，并以蒸馏水定容至200mL，调节PH值为7.0，121℃15min高压灭菌，冷却、备用。10 甘肃农业大学硕士学位论文2方法2.1引物设计参照PPRVNigeria75/1株N基因序列，设计并合成特异引物对，在F及R的5′末端分别引入NdeⅠ、SalⅠ酶切位点，送金唯智生物科技有限公司合成。（下划线：限制性内切酶位点NdeⅠ和SalⅠ）PPRV-N-F：ATACATATGGCGACTCTCCTTAAAAGCTTAGCATTGTTPPRV-N-R：ATAGTCGACTTAGCCGAGGAGATCCTTGTCGTTG2.2PPRV武威分离株总RNA的提取应用Trizol法提取病毒RNA，具体步骤如下：（1）于1.5mL无RNA酶离心管中吸取病料200μL，加入1mLTRIzol试剂，混匀后室温放置10min；（2）于上述液体中加入200μL氯仿，用力振荡离心管，使其充分混匀，室温放置10min，随即以11000r/min于4℃离心15min，此时可见分层现象，将上清分离并移至另一干净离心管；（3）加入等体积异丙醇，室温放置10min后以11000r/min于4℃离心10min，弃上清，加入1mL75%乙醇并以8000r/min于4℃离心5min；（4）弃上清，重复步骤（3）；（5）吸尽上清，室温5min风干后加入19μLDEPC水溶解RNA，直接用于RT或于-80℃短暂保存。2.3N基因RT-PCR扩增取上述提取的PPRV总RNA19μL，加入1μL6碱基随机引物，充分混匀，于70℃水浴5min后，冰浴5min，随后依次加入5×ReverseTranscripataseBuffer6μL、2.5mmoldNTPMixture2μL、M-MLV反转录酶1μL、RNaseInhibitor1μL，混匀后于42℃反应1h，产物cDNA可直接用于PCR或于-20℃保存备用。PCR扩增体系为20μL：10μL的2×TaqMasterMixDNA聚合酶、2μL的反转录产物、1μL的上游引物、1μL的下游引物以及6μL的去离子水。反应条件：95℃5min，95℃50s，57℃50s，72℃1min40s，经30个循环后，72℃10min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收。11 甘肃农业大学硕士学位论文2.4目的基因的回收将获得的目的条带尽可能小体积的完全切下并收集，依照胶回收试剂盒说明，回收目的基因、低温保存。2.5载体的构建及目的基因序列测定将pMD®-19T载体0.5µL、10×T4DNA连接酶Buffer1µL、回收PCR产物7.5µL、T4DNA连接酶1µL于0.2mLPCR管中配制成10µL连接体系，置于金属浴连接仪中16℃过夜连接。将连接产物转化至Trans5α感受态细胞，操作步骤如下：（1）将连接产物加入Trans5α感受态细胞（冰浴中放置）中，轻悬该混和物，于冰浴中静置半小时后，置42℃45s，随即冰浴2min；（2）于上述混合物中加入无抗性液体LB培养基补足至1mL，并于37℃恒温振荡培养约60min；（3）在含有20µLIPTG、20µLX-gal的1.5mL离心管中加入上述菌液100µL，混合均匀后，均匀涂布于Amp抗性的LB平板上，置温箱培养10~12小时（直至观察到单菌落长出）。挑取阳性菌落，并将其转移至相同抗性的液体LB中（5mL），恒温培养10~12h，继而进行菌液PCR鉴定，阳性克隆送金维智测序。2.6N基因的生物信息学分析2.6.1遗传进化分析在NCBI中对测序所得PPRV武威分离株N基因序列进行BLAST操作，将获得的53株不同国家、区域的PPRVN基因运用DNAstar软件进行核苷酸序列同源性比对分析，继而构建进化树。2.6.2N基因核苷酸序列分析应用DNAstar及ExPASy软件对PPRV武威分离株N基因全长、分子量以及影响外源基因在原核表达系统中表达效率的GC含量、氨基酸种类、稳定性进行分析。2.6.3N蛋白二级结构的预测蛋白的二级结构特征与其表位分布有密切关系，其α-螺旋以及β-折叠常存在于蛋白的内部，不易变形、亦不易形成抗原表位，而β-转角和无规则卷曲较多呈突出于蛋白表面的形式，较易扭曲和盘旋，与此同时也有利于跟抗体相嵌合。基于此，本试验运用TMHMMServerv2.0软件对N蛋白二级结构进行预测，以了解其抗原表位分布。12 甘肃农业大学硕士学位论文2.6.4N蛋白信号肽及跨膜区的预测应用SignalP及TMHMM软件对PPRVN蛋白氨基酸序列进行信号肽序列以及跨膜区肽段的预测，以初步了解该蛋白是否能在大肠杆菌表达系统中顺利表达。2.6.5N蛋白亲水性、抗原性的预测应用DNAstar中的Protean程序预测N蛋白的亲水性及抗原性。亲水性预测中亲水性指数越高，则其作为抗原表位的可能性越大。抗原性预测中，蛋白质抗原性越高，则该肽段中有抗原表位的概率较大。3结果3.1PPRVN基因的RT-PCR扩增将PPRV武威分离株中提取的RNA作为模板，经RT-PCR法扩增获得N基因全长，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果显示PCR产物为一条约1593bp大小的条带，与理论值相同（图2-1）。（1%琼脂糖凝胶配制：取0.4g琼脂糖溶解于40mL1×TAE缓冲溶中，微波炉加热使其充分融化至完全清亮状态，室温放置冷却约5min，加入1.6µL溴化乙锭、混匀，倒入事先插好梳子的板子中，待其凝固、备用。）1Mbp20001593bp1000750500250100图2-1PPRVN基因的RT-PCR扩增Fig.2-1RT-PCRamplificationofPPRVNgeneM：DNA分子质量标准；1：PPRVN基因的RT-PCR扩增产物M:DL2000DNAMarker;1:TheproductofNgeneamplifiedbyRT-PCR3.2N基因遗传进化分析13 甘肃农业大学硕士学位论文将PPRV武威分离株N基因核苷酸序列与NCBI中BLAST操作获得的所有PPRV毒株的N基因核苷酸序列进行比对，其结果显示：该基因与2013~2014年在我国山西、陕西、四川、重庆、云南、广西、广州、江西、湖北、河南、安徽、浙江、江苏、吉林、新疆伊犁引起PPR疫情的15株中国PPRV毒株以及2016蒙古株的核苷酸序列同源性最高，可达99.0%；与2008西藏株、2014印度株、2015印度株、2016印度株、1996荷兰株同源性均为98.0%；与2008孟加拉株、土耳其株、2008摩洛哥株、2016格鲁吉亚株、2010埃塞俄比亚株、2014伊斯梅利亚株同源性为97.0%；与1969贝宁株、尼日利亚株同源性为94.0%；与2011塞拉利昂株、2010加纳株、2009科特迪瓦、2015黎巴嫩株、1969西非株同源性为93.0%；与1989科特迪瓦株同源性最低，为92%。系统进化树显示PPRV武威株与亚洲25个毒株同属Ⅳ系。（图2-2）。图2-2PPRV武威株N基因同源性分析Fig.2-2HomologyanalysisoftheNgeneofPPRV武威strain14 甘肃农业大学硕士学位论文3.3N基因编码蛋白序列的生物信息学分析3.3.1N蛋白核苷酸序列分析DNAstar及ExPASy软件分析结果显示，N基因全长1578bp，其中包含A碱基439个（27.82%），G碱基437个（27.69%），T碱基335个（21.23%），C碱基367个（23.26%），G＋C碱基含量占50.95%，A+T碱基含量占49.05%。其编码的N蛋白共有525个氨基酸，分子量约为57779.80Da，不稳定指数显示为46.62，属于不稳定蛋白。3.3.2N蛋白二级结构预测预测结果显示PPRV武威分离株N蛋白的α-螺旋区为236个氨基酸，占44.95%；延伸链为63个氨基酸，占12.00%；无规则卷曲为226个氨基酸，占43.05%（图2-3）。图2-3N基因编码蛋白二级结构的预测Fig.2-3PredictionofsecondarystructureofPPRVNgene注:蓝色：α螺旋；红色：延伸链；紫色：无规则卷曲Note:blue:alphahelix;red:extendedchain;purple:randomcurl3.3.3信号肽及跨膜区的预测SignalP及TMHMM软件对N基因编码氨基酸序列的预测结果显示，该蛋白不存在信号肽（图2-4）及跨膜区（图2-5）。图2-4N蛋白信号肽预测图2-5PPRVN蛋白跨膜区预测Fig.2-4PPRVNproteinsignalpeptidepredictionFig.2-5PPRVNproteinpredictareasacrossthemembrane15 甘肃农业大学硕士学位论文3.3.4N蛋白亲水性、抗原性的预测Protean程序对PPRV武威分离株N蛋白亲水性及抗原性的预测结果显示，该蛋白N末端及C末端均有较多抗原表位聚集（图2-6）。..图2-6PPRV武威株N蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数分析Fig.2-6Analysisofhyrophilicity,antigenticindexofNProteinaminoacid4讨论首先，本试验将PPRV武威分离株N基因核苷酸序列与GenBank中获得的不同国家、地区的PPRV毒株的N基因核苷酸序列进行同源性比对，分析结果显示，PPRV武威分离株N基因核苷酸序列与属于Ⅳ系的亚洲PPRV毒株同源性最高，在98%～99%之间；与属于Ⅱ系的贝宁株、尼日利亚株等毒株同源性为94.0%；与属于Ⅰ系的加纳株、科特迪瓦株等毒株同源性最低，为92.0%~93.0%。该分析结果与赵亚等[76]、苗书魁等[77]基于PPRVN基因、张路瑶[78]等基于PPRVM基因构建的进化树得到的分析结果基本一致，并进一步丰富了我国PPRV的流行病学资料。其次，本研究对PPRV武威分离株N蛋白氨基酸序列的生物信息学分析结果显示，PPRV武威分离株N蛋白为可溶性蛋白，且其抗原性分析结果显示，PPRV武威分离株N蛋白氨基酸序列的氨基端及羧基端均存在大量抗原表位区域，且Dechamma[79]、曾少灵[80]、印春生[81]、YuR[82]等对PPRVN蛋白氨基酸序列的研究亦证实，PPRVN蛋白氨基酸序列中存在多段保守且高度特异的抗原表位，在PPRV的检测中有很高的应用价值，基于此，本试验选取了PPRV武威分离株N蛋白全基因序列作为靶基因用于特异性抗体的制备，以期获得多种可识别不同抗原表位的单克隆抗体，为高特异性检测方法的建立提供良好的材料。16 甘肃农业大学硕士学位论文第三章小反刍兽疫病毒武威分离株N基因的原核表达及多克隆抗体的制备原核表达系统是应用最早且目前掌握最为成熟的表达系统，相较于真核表达系统，该表达系统成本较低、可以在短时间内表达外源基因。基于此，本试验将构建的pET-PPRV-N质粒转化至Rosetta(DE3)表达菌，并在IPTG的诱导作用下将目的蛋白大量表达，进而以纯化的表达产物免疫4~6周龄的BALB/c小鼠、制备出特异性多克隆抗体，随即用ELISA和Westernblot方法研究其免疫原性及反应原性，为PPRV武威分离株N蛋白的进一步研究及应用奠定基础。1材料1.1菌种、载体及实验动物大肠杆菌(Escherichiacoli)Trans5α、Rosetta(DE3)感受态细胞、原核表达载体pET-28a(+)由本实验室保存；BALB/c小鼠、昆明鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所。1.2主要仪器表3-1主要仪器Table3-1Mainequipment名称生产厂家半干转印仪美国伯乐公司脱色摇床郑州南北仪器厂超声波细胞破碎仪浙江宁波新芝生物科技股份有限公司台式高速冷冻离心机广州安邦生物科技有限公司1.3主要试剂表3-2主要试剂Table3-2Reagent试剂品牌公司IPTGSigma美国丙烯酰胺（Acr）SangonBiotech生工生物工程（上海）股份有限公司4xTris×HCl/SDS，pH8.8溶液SangonBiotech生工生物工程（上海）股份有限公司4xTris×HCl/SDS，pH6.8溶液SangonBiotech生工生物工程（上海）股份有限公司弗氏佐剂Sigma美国甘氨酸Biosharp白鲨生物科技有限公司17 甘肃农业大学硕士学位论文ThermoFisher预染蛋白分子质量标准赛默飞世尔科技（中国）有限公司Scientific四甲基联苯胺显色液（TMB）TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司二氨基联苯胺显色试剂盒（DAB）TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒碧云天碧云天生物技术（南京）有限公司羊抗鼠HRP-IgGBioss北京博奥森生物技术（北京）有限公司溴化乙锭（EB）VETEC上海桥星贸易有限公司Ni-NATHisBindNovagen美国Novagen公司限制性内切酶NdeⅠTakara宝生物工程（大连）有限公司限制性内切酶SalⅠTakara宝生物工程（大连）有限公司10×HbufferThermo美国卡那霉素Biosharp白鲨生物科技有限公1.4主要缓冲液与试剂配制（1）10×PBS缓冲液：取NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO45.8g、KH2PO40.4g，以蒸馏水定溶至1L，调节pH为7.4，室温保存。（2）PBST缓冲液：于PBS缓冲液中加入Tween-20，配制成含0.05%Tween-20的溶液，于室温保存。（3）BindingBuffer：取NaH2PO40.78g、NaCl1.75g、咪唑0.068g溶解于蒸馏水中配制成100mLpH值为8.0的溶液，4℃保存。（4）WashingBuffer：取NaH2PO40.78g、NaCl1.75g、咪唑0.136g溶解于蒸馏水中配制成100mLpH值为8.0的溶液，4℃保存。（5）EluteBuffer：取NaH2PO40.78g、NaCl1.75g、咪唑0.17g溶解于蒸馏水中配制成100mLpH值为8.0的溶液，4℃保存。（6）包被液：取Na2CO30.159g、NaHCO30.293g溶解于蒸馏水中配制成100mLpH值为9.6的溶液，4℃短暂保存。（7）终止液（2molH2SO4）：取浓H2SO422.2mL，以蒸馏水定溶至200mL。（8）转印缓冲液：取甘氨酸2.9g、Tris5.8g、SDS0.37g、甲醇200mL，以蒸馏水定容至1L，4℃保存。（9）抗原封闭液（5%）：于10mLPBST缓冲液中加入0.5g脱脂奶粉。（10）蛋白电泳缓冲液：取3.02gTris-base、18.8g甘氨酸、1gSDS溶解于适量蒸馏水解后定容至1L，室温保存。18 甘肃农业大学硕士学位论文1.5PPRV武威分离株N基因的原核表达1.5.1重组表达质粒的构建（1）以NdeⅠ及SalⅠ对阳性鉴定质粒和pET-28a(+)载体分别进行双酶切，酶切体系20μL，包括各1μL的NdeⅠ及SalⅠ、2μL的10×Hbuffer以及16μL的阳性鉴定质粒或pET-28a(+)载体。酶切条件：37℃恒温水浴锅，4h。（2）用DNA纯化回收试剂盒将酶切产物分别回收。（3）取酶切后的PPRVN基因7μL、酶切后的pET-28a(+)1μL进行连接（连接方法及其他试剂用量与第二章1.5中给出的方法、用量完全相同）。（4）将连接产物转化至Trans5α感受态细胞，具体操作步骤如下：将连接产物加入Trans5α感受态细胞（冰浴中放置）中，轻悬该混和物，于冰浴中静置30min后，换以42℃恒温水浴将其热激约45s，最后，再将其放回冰浴、静置2min；于上述混合物中加入无抗性液体LB培养基补足至1mL，并于37℃恒温振荡孵育60min后，取100µL上述菌液均匀涂布于卡那抗性的LB平板，于37℃温箱培养10~12小时（直至观察到单菌落长出），挑取单菌落接种于卡那抗性的液体LB中（5mL），37℃恒温摇床振荡培养10~12h，继而进行菌液PCR及双酶切鉴定，并将阳性重组质粒命名为pET-PPRV-N。1.5.2重组蛋白的表达及鉴定将pET-PPRV-N转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中（方法同上），取单个菌落于37℃振荡培养10~12h，提取质粒进行鉴定。将阳性鉴定菌液50µL接于5mL卡那抗性的液体LB中，同样温度及振荡条件培养约6h，直至OD600为0.6，为优化表达条件，设置不同的IPTG及温度梯度，200r/min诱导培养6~12h后通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况，进而进行可溶性表达分析。1.5.3表达产物的分析取诱导表达的菌液1mL于1.5mL离心管，12000r/min离心1min，弃上清，以80µLPBS重悬沉淀并加入20µL5×蛋白上样Buffer，吹打混匀后于沸水浴中静置10min，继而置于-50℃静置2min，12000r/min离心10min，离心后的样品直接进行SDS-PAGE分析或于-20℃保存。1.6表达产物的纯化用Ni-NATHisBind法进行重组蛋白的纯化。纯化步骤：（1）将小量诱导后的阳性表达菌液2mL加入200mL卡那抗性2×YT培养液中，振荡培养约6h（OD600约为0.6）后加入200µL1.0mmol/LIPTG，并于20℃低温振荡诱导19 甘肃农业大学硕士学位论文约10~12h；（2）将诱导表达后的菌液低温高速离心10min，收集沉淀并以无菌PBS缓冲液离心洗涤2~3次；（3）以8mL1×Binding缓冲液重悬菌体，应用超声破碎仪进行20min的破碎(工作3s，间歇3s)；（4）将破碎后的菌液高速低温离心20min，收集上清，低温保存；（5）将超声破碎后的重组蛋白上清和树脂（1mL）于无菌离心管中混匀（以1×BindingBuffer补足至15mL），4℃200r/min振荡结合1h；（6）将结合物吸入镍柱，待液体完全过滤后，依次以6mL1×Binding缓冲液洗涤2次，4mL1×Washing缓冲液洗涤2次，1mL1×Elute缓冲液洗涤1~2次；（7）收集最终的洗涤液于2~4个无菌离心管中，分别取80μL纯化后的蛋白制样，经SDS-PAGE分析后，以BCA蛋白定量试剂盒定量、分装备用。1.7多克隆抗体制备将上述处理后的蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合，充分混匀至油包水状态，计算后以大约100μg/只的量经颈部以及背部皮下多点注射，对BALB/c小鼠进行第一次免疫；间隔两周后以弗氏不完全佐剂等体积混合纯化后的重组蛋白，50μg/只进行第二次免疫；之后每间隔1周加强免疫1次，剂量同第二次免疫，待第四次或第五次免疫后的第4~5d进行断尾采血、分离血清并于-20℃保存。1.8抗体效价的ELISA检测将纯化的重组蛋白作为包被抗原，以每孔5μg/100µL的量预先包被ELISA板，以倍比稀释的方法，将采集于BALB/c小鼠的多抗血清进行稀释，并作为一抗孵于ELISA板，1:6000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，应用ELISA方法进行多克隆抗体效价的检测。试验以未经处理同系小鼠血清及PBS分别为阴性、空白对照。1.9N蛋白最佳抗原包被量的确定以纯化的PPRVN重组蛋白为包被抗原，倍比稀释的BALB/c小鼠阳性、阴性血清为一抗，用棋盘法确定该间接ELISA检测方法的最佳抗原包被量。1.10Westernblot检测将纯化后的重组N蛋白、PPRV疫苗株和PPRV武威分离株通过SDS-PAGE分离后，转印至NC膜，经脱脂奶粉（5%）溶液低温封闭10~12h后，敷以1:6000稀释阳性血清20 甘肃农业大学硕士学位论文（常温，1~2h），进而再敷以1:10000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP（常温，1h），最终以DAB显色试剂盒在避光环境中显色约1~3min，以蒸馏水冲洗、浸泡进而终止显色，观察显色结果。2结果与分析2.1原核表达质粒pET-PPRV-N鉴定双酶切重组质粒pET-PPRV-N后，以琼脂糖凝胶电泳（浓度为1%）进行分析，并以凝胶成像仪观察扩增结果，成像结果显示出两条不同大小的条带，分别为5900bp、1593bp大小，符合预期结果（图3-1）。bpM120001593bp1000750500250100图3-1重组表达质粒pET-PPRV-N的双酶切鉴定Fig.3-1EndonucleasedigestionidentificationofrecombinantexpressionplasmidpET-PPRV-NM：DNA分子质量标准；1：重组质粒pET-PPRV-N双酶切产物M:DL2000DNAMarker;1:DoubleendonucleasedigestproductofrecombinantplasmidpET-PPRV-N2.2诱导表达及SDS-PAGE分析SDS-PAGE分析结果显示，目的蛋白分子量约为57.8kDa，主要以可溶性形式存在，其大小与预期值相吻合（图3-2）。M12345116.066.257.8kDa45.035.025.018.414.4图3-2重组融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3-2SDS-PAGEanalysisofrecombinantfusionproteinM：预染蛋白分子质量标准；1：pET-28a（+）经IPTG诱导；2：pET-PPRV-N经IPTG诱导；3：pET-PPRV-N裂解后上清；4：pET-PPRV-N裂解后沉淀；5：纯化的上清21 甘肃农业大学硕士学位论文M:PrestainedproteinmolecularweightMarker;1:pET-28a（+）inductionwithIPTG;2:pET-PPRV-NexpressionwithIPTGinduction;3:SupernatantofpET-PPRV-NwithIPTGinduction;4:PrecipitationofpET-PPRV-NwithIPTGinduction;5:Purifiedsupernatant2.3多克隆抗体的制备根据OD450判断出经5次免疫后的BALB/c小鼠的血清抗体效价可达1：64000以上。2.4抗原最佳包被量的确定以棋盘法确定出该ELISA检测方法中，重组蛋白的最佳包被浓度为50μg/mL（表3-3）。（结果判断：OD450≥1.0时为强阳性，取P/N最大的值作为抗原最佳工作浓度。）表3-3重组N蛋白最佳包被浓度筛选Table3-3ScreeningofconcentrationforRecombinantNproteinantigen抗原包被阳性血清稀释度阴性空白浓度1:10001:20001:40001:80001:160001:320001μg/孔0.83250.75800.60030.53980.45170.36730.15220.13062μg/孔0.96460.84450.71260.64580.59560.40990.15130.12843μg/孔1.15390.93340.77630.61590.51520.45760.14490.13734μg/孔1.10050.92050.76070.64580.52950.45560.15060.12615μg/孔1.18471.08650.86890.68380.62730.45230.14240.12456μg/孔1.08961.02250.96600.78770.63050.50110.14960.13162.5多克隆抗体的Westernblot分析Westernblot检测结果显示，制备的鼠血清多克隆抗体可与pET-PPRV-N重组蛋白、PPRVNigeria75/1株、PPRV武威分离株结合，具有良好反应原性（图3-3）。M12341709572554334261710图3-3多克隆抗体的Western-blot检测22 甘肃农业大学硕士学位论文Fig.3-3Western-blottestforthepolyclonalantibodyM：预染蛋白分子质量标准；1：1:pET-28a（+）经IPTG诱导；2：pET-PPRV-N经IPTG诱导；3：PPRVNigeria/75/1株总蛋白；4：PPRV武威株总蛋白M:PrestainedproteinmolecularweightMarker;1:pET-28a（+）inductionwithIPTG;2:pET-PPRV-NexpressionwithIPTGinduction;3:PPRVtotalproteinofNigeria/75/1strain;4:PPRVtotalproteinofWuweistrain3讨论本试验选取pET-28a（+）为表达载体、大肠埃希菌原核表达系统为该蛋白的表达系统。外源基因在pET-28a（+）载体中能够获得有效的表达，且其较小的His标签对目的蛋白的结构及功能影响很小、在应用Ni-NATHisBind法获得较高纯度重组蛋白过程中有很重要的作用[83]；E.coli原核表达系统在外源基因表达系统中可操作性强、高效且简单[84]，因此多被广泛应用于外源基因的表达。但有研究指出，该系统在进行外源蛋白的表达时，常因蛋白生成速度过快而形成无活性的包涵体，而包涵体形式的蛋白在后续试验中需要进一步复性，使得试验步骤变得繁琐，因此，许多基于外源蛋白表达的试验，首先要解决的问题就是选择出适宜的表达条件，以减少、甚至避免包涵体的形成。有研究表明，低温条件可降低蛋白在E.coli原核表达系统中的生成速率、有利于减少包涵体的形成，从而获得高浓度、可溶性表达的蛋白[85]，例如，有研究者在进行外源基因表达时选择了携带cspA低温诱导启动子的低温诱导体系ArcticExpress作为表达菌株，并在11℃低温诱导蛋白表达，大大提高了蛋白的可溶性表达的程度。关于PPRVN蛋白的原核表达形式，有可溶性表达的报道，也有包涵体形式表达的报道，孙雨[86]等表达的PPRVN蛋白为95%以上可溶，而庞文静[87]等表达的PPRVN蛋白则以包涵体的形式存在。基于此，本试验在PPRV武威分离株N蛋白的诱导表达过程中，除了对诱导时间及IPTG浓度做了相应的测试外，还主要对诱导温度进行了调整，最终确定在诱导时间为10h、诱导剂IPTG终浓度为1.0mmol/L时，以20℃作为诱导温度对重组蛋白进行了诱导表达，且SDS-PAGE验证结果表明，其表达形式主要为可溶性表达。在确定PPRV武威分离株N蛋白诱导表达条件的基础上，本试验应用Ni-NATHisBind法将重组蛋白纯化，并将其作为抗原免疫BALB/c小鼠5次，在初步建立ELISA检测方法的基础上，对小鼠血清进行了抗体效价的检测，并以Westernblot检测方法对重组蛋白的免疫原性进行了验证。试验结果表明，ELISA检测方法的最佳抗原包被量为50μg/mL，小鼠血清效价约为1：64000，制备的多克隆抗体可以与重组蛋白、疫苗株、武威分离株结23 甘肃农业大学硕士学位论文合，具有良好的反应原性，为后续试验提供了较好的材料。24 甘肃农业大学硕士学位论文第四章小反刍兽疫病毒武威分离株N蛋白单克隆抗体的制备目前，以i-ELISA、b-ELISA、c-ELISA、胶体金免疫层析试纸条法等为代表，基于特异性单克隆抗体建立的快速、特异的检测方法已被广泛应用于多种动物疫病的检测，因此，本研究以PPRVN重组蛋白免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与同系SP2/0细胞应用细胞融合技术进行了杂交瘤细胞的制备，筛选获得了两株可稳定分泌针对PPRV武威分离株N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而对其产生的抗体进行特异性、稳定性及亚型的检测，为基于PPRVN蛋白单克隆抗体建立灵敏性高、特异性好的检测方法奠定了基础。1材料1.1实验动物及细胞BALB/c经产母鼠以及昆明鼠均购于兰州兽医研究所；SP2/0细胞，由本实验室保存。1.2试验仪器CO2培养箱购自美国Thermo公司；倒置显微镜购自重庆光电仪器有限公司；-80℃超低温冰箱购自美国Thermo公司；细胞培养瓶，96孔、24孔、6孔细胞培养板、细胞冻存管购自美国corning公司。1.3主要试剂表4-1主要试剂Table4-1Reagent试剂品牌公司胎牛血清元亨北京元亨圣马生物技术有限公司二甲基亚砜（DMSO）SangonBiotech生工生物工程（上海）股份有限公司HAT（50×）sigma美国HT（50×）sigma美国8-氮鸟嘌呤（50×）sigma美国PEGsigm美国小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定用佰奥通洛阳佰奥通实验材料中心ELISA试剂盒1.4试剂配制（1）完全营养液（200mL）：取高糖DMEM培养液180mL、FBS20mL、双抗1mL25 甘肃农业大学硕士学位论文于无菌瓶混匀，4℃保存、备用。（2）HAT选择培养液：取完全营养液98mL，加入2mL50×HAT，混匀、4℃保存。（3）HT选择培养液：取完全营养液98mL，加入2mL50×HT，混匀、4℃保存。（4）细胞冻存液（10mL）：7mLDMEM培养液、2mL胎牛血清、1mLDMSO，混匀、4℃保存。2方法2.1抗原最佳包被量的确定以我国PPRVNigeria75/1株弱毒疫苗、PPRV武威分离株作为抗原包被ELISA板，以倍比稀释的小鼠免疫后阳性血清为一抗，用棋盘法确定ELISA法中包被抗原的最佳工作浓度。未经处理同系小鼠血清及PBS分别为阴性、空白对照。2.2细胞的培养及制备2.2.1SP2/0的培养在细胞融合前2周左右开始培养SP2/0（37℃，5%CO2），隔天观察，若细胞碎片较多，可进行细胞换液，以利于细胞生长。2.2.2饲养细胞的制备本试验选取昆明鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，其具体制备方法如下（融合前1天之内）：（1）处死小鼠，对小鼠体表进行充分的消毒；（2）将小鼠移入超净台并保定于蜡板，以眼科剪轻轻剪开腹部皮肤使腹膜充分暴露，用灭菌眼科镊子于腹腔中部轻轻夹起腹膜，以另一把眼科剪剪开一个长约0.5cm的小口；（3）以一次性灭菌吸管每次吸取约3~4mLDMEM培养液注入腹腔，不断轻轻吹打，并用镊子钝性轻揉小鼠腹腔，随后将细胞悬液吸入无菌融合管；（4）重复（3）的操作3～4次，收集约15mL细胞悬液，离心、弃上清，并以HAT培养液将其重悬；（5）按需要将饲养细胞用HAT培养液稀释至足量（每个细胞板约需12~13mL），以50-100μL/孔的量加入96孔细胞培养板，置于细胞培养箱培养。2.2.3脾细胞的制备（1）选取高效价BALB/c小鼠1只，于制备脾细胞前3~5d腹腔加强免疫(不加佐剂)一次；26 甘肃农业大学硕士学位论文（2）采集小鼠的血清并保存，将其处死后进行充分的体表消毒（浸泡约10min）；（3）消毒后的小鼠移入超净台，保定于蜡板；（4）摘取小鼠脾脏，放入灭菌平皿中以高糖DMEM培养液清洗2~3次；（5）将处理后的脾脏置于灭菌滤网，以5mL医用针管的内芯缓慢研磨，边研磨边滴加DMEM培养液，并以灭菌平皿将含有脾细胞的DMEM培养液收集；（6）将收集的脾细胞悬液转移至灭菌融合管后（50mL规格），以DMEM培养液常温、低速离心洗涤1~2次，重悬细胞，计数、备用。2.3杂交瘤细胞株的建立2.3.1细胞融合（1）将细胞培养瓶内生长至对数期、细胞形态饱满的SP2/0用无菌吸管以DMEM培养液吹打下来，并转移至高压灭菌后的无菌融合管中（50mL规格），1000r/min离心洗涤后重悬细胞并计数；（2）将按1：5~10倍比例混合的SP2/0、脾细胞重悬于灭菌融合管中，常温、低速离心洗涤两次，吸尽上清。以右手垂直固定融合管，于左手手掌轻扣管底，直至细胞沉淀呈松散状态；（3)将融合管缓慢转动，与此同时逐滴加入1mL37℃充分预热的50%的PEG溶液，1min内完成次操作后，迅速转移至37℃温箱静置3~5min（融合管置于37℃水浴烧杯中）；（4）将融合管移入超净工作台，先将2mL37℃充分预热的DMEM培养液绕壁缓慢滴入，用时2min；再将8~10mLDMEM培养液继续加入，以充分终止融合，用时3min。（5）轻轻悬起融合管底部的融合细胞，室温下低速离心10min，轻弃上清，以预热好的HAT培养液重悬并稀释至50~60mL，并用无菌吸管以每孔约2滴的量加入提前铺好饲养细胞的细胞板中，置于细胞培养箱内培养；（6）融合7～10d后，可见小的克隆出现，以HAT培养液每隔3~5d半量换液1次，直至克隆簇长至培养孔约30%~40%。2.3.2细胞筛选以杂交瘤细胞生长孔中细胞培养液为一抗，用ELISA方法检测其OD450值。SP2/0细胞培养液为阴性对照；小鼠抗重组N蛋白血清为阳性对照。根据ELISA检测结果，挑出P/N值较高的孔，继续扩大培养，以备亚克隆筛选。（在检测后4~5d，可再次吸取细胞培养液以进行再一次的筛选。）27 甘肃农业大学硕士学位论文2.3.3亚克隆及细胞株的建立根据细胞筛选结果，将OD450数值较高的孔扩大培养，待细胞集落的生长面积大约为孔底面积1/2时对其进行亚克隆，操作方法：（1）饲养细胞的制备（本次饲养细胞的制备除了将HAT营养液以HT营养液替换外，其余操作方法均同于2.2.2中饲养细胞的制备过程）；（2）将需要亚克隆的杂交瘤细胞吹下，吸取30μL细胞悬液计数。以10倍比稀释的方法将杂交瘤细胞稀释至铺好饲养细胞的细胞板中（稀释约1016倍，同时进行两组克隆），剩余细胞继续扩大培养；（3）一周后观察96孔板，标记出只有一个杂交瘤细胞的孔，待其生长至孔低约30%～40%时，取细胞孔中培养液进行ELISA检测，将阳性孔细胞继续培养，重复上一步的操作2～4次，直至所有孔中细胞均为阳性，完成杂交瘤细胞建株。2.3.4单克隆抗体特异性检测以PPRV疫苗、PPRV武威分离株、绵羊支原体、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为抗原包被ELISA板，以阳性杂交瘤细胞生长孔中细胞培养液为一抗，应用ELISA检测方法对制备的单克隆抗体进行特异性检测。SP2/0细胞培养液为阴性对照，小鼠抗重组N蛋白血清为阳性对照。2.3.5单克隆抗体稳定性检测将筛选出的杂交瘤细胞每传三代后，以ELISA检测方法测定其细胞上清效价，以确定杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。SP2/0细胞培养液为阴性对照，小鼠抗重组N蛋白血清为阳性对照。2.3.6单克隆抗体亚类鉴定采用洛阳佰奥通实验材料中心提供的鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定ELISA试剂盒，测定细胞上清中抗体的亚型。2.4单克隆抗体腹水的制备及粗提（1）致敏小鼠（每只经产BALB/c母鼠腹腔注射灭菌液体石蜡约0.8mL）；（2）致敏后10天左右，每只小鼠腹腔注射约5×106个杂交瘤细胞（杂交瘤细胞的准备：于注射前培养杂交瘤细胞至细胞形态饱满且处于对数生长期，并于注射前一天换液）；（3）约一周后可见小鼠腹部膨胀，收集腹水。28 甘肃农业大学硕士学位论文2.5腹水抗体效价的测定将稀释后的疫苗作为包被抗原，以每孔10.0μg/mL的量预先包被ELISA板，以倍比稀释的方法，将粗纯的小鼠腹水进行稀释，并作为一抗孵于ELISA板，1:6000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP为二抗，应用ELISA方法进行腹水抗体效价的检测。SP2/0细胞培养液为阴性对照；小鼠抗重组N蛋白血清为阳性对照。3结果3.1抗原最佳包被量的确定采用第三章1.9中采用的最佳抗原包被量确定方法，进行PPRV疫苗株作为包被抗原的ELISA检测方法的建立，并最终确定其最佳包被浓度为10.0μg/mL（表4-2）。表4-2疫苗最佳包被浓度筛选Table4-2Screeningofconcentrationforvaccine阳性血清稀释度抗原包被量阴性空白1:1001:2001:4001:8001:16001:32000.25μg/孔0.90390.80760.82050.81570.81580.80280.15130.12690.50μg/孔0.92780.88920.88870.86080.80630.75230.14320.12510.75μg/孔0.98770.90830.89810.89110.88320.83350.15010.13311.00μg/孔1.11121.09341.05960.90360.89470.89420.15130.12691.25μg/孔1.06291.04280.98490.89960.86200.84833.2杂交瘤细胞株的建立6次细胞融合中，有融合细胞生长的孔共计为534孔，经ELISA检测初步得到疑似阳性孔为11孔，对该11孔细胞分别进行亚克隆后，获得了两株能够分泌抗PPRV武威分离株N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2B7及3I4。3.3单克隆抗体特异性测定ELISA检测结果显示，2B7及3I4两株杂交瘤细胞株产生的特异性单克隆抗体与PPRV疫苗株、武威分离株的特异性反应结果呈阳性，而与绵羊支原体、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌的特异性反应结果呈阴性，表明2B7和3I4两株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体具有良好特异性（表4-3）。29 甘肃农业大学硕士学位论文表4-3单克隆抗体特异性测定Table4-3Determinationofmonoclonalantibodyspecificity病原微生物OD450（2B7）OD450（3I4）PPRV疫苗株0.49000.3885PPRV武威分离株0.52350.4401绵羊支原体0.09290.1079口蹄疫病毒0.08630.1011牛病毒性腹泻病毒0.10190.1169肺炎克雷伯菌0.20510.2101巴氏杆菌0.16770.1526沙门氏菌0.14830.1332金黄色葡萄球菌0.17220.1887阳性对照0.92370.8991阴性对照0.16000.1621空白对照0.12940.13363.4单克隆抗体稳定性测定ELISA检测结果显示，2B7和3I4两株杂交瘤细胞株均可较稳定产生特异性单克隆抗体（表4-4）。表4-4单克隆抗体稳定性测定Table4-4Determinationofmonoclonalantibodystability第4代第7代第10代阴性阳性2B70.47660.49690.47920.15991.00103I40.39180.36550.38090.16271.13433.5抗体亚类鉴定收集细胞上清，应用鼠源单克隆抗体分型试剂盒进行抗体亚型检测，检测结果表明2B7及3I4均为IgG2b型，轻链均为κ型。3.6腹水抗体效价测定将粗纯的腹水以ELISA检测方法进行两组平行试验以检测其效价，检测结果表明：细胞株2B7及3I4制得的腹水效价分别为1：51200和1：25600（表4-5）。30 甘肃农业大学硕士学位论文表4-5单克隆抗体效价测定（腹水）Table4-5Determinationofmonoclonalantibody(Ascites)2B73I4阴性阳性11：512001：256000.15911.187521：512001：256000.15771.13454讨论目前，PPR快速、灵敏且特异性强的检测方法的建立多基于单克隆抗体的制备。已有研究表明，PPRVN蛋白单克隆抗体可以有效区分PPRV和RPV。郑云霞[88]基于PPRVN蛋白制备了六株可分泌针对PPRVN蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并在此基础上建立了能够检测PPRV抗体的b-ELISA检测方法，且临床血清样品检测结果表明，该方法与已经应用于临床检测的PPRV检测试剂盒的检测结果符合率在94%以上；程思[89]筛选获得了一株能产生针对PPRVN抗原特异性MAb的杂交瘤细胞株后，利用该细胞株建立了检测血清中PPRV抗原的s-ELISA检测方法，特异性检测结果显示，该方法特异性为100%，且其对临床样品的检测结果与RT-PCR检测方法检测结果的符合率高达98.1%；ChoiKS[90]等使用7种单克隆抗体和缺失突变体对PPRVNigeria75/1株的核衣壳蛋白的抗原表位进行了鉴定和定位，筛选出了针对特异性表位和结构域的单克隆抗体，为建立更加灵敏、特异的PPRV诊断方法奠定了基础；龙云凤[91]等以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，进而制备了两株可分泌针对PPRVN蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，且其获得的腹水效价分别为819200和12800。单克隆抗体制备的关键步骤是细胞融合，在细胞融合过程中PEG的作用浓度、作用温度及反应时间是影响融合效率的主要因素。赵咏梅[92]等在对PEG浓度和反应时间对细胞融合率影响的试验中指出，细胞融合率与反应时间呈正相关，而与PEG浓度呈负相关。除此之外，终止融合时DMEM营养液是否充分预热至37℃，对细胞的融合成功与否有着决定性的作用。本试验中共进行了7次细胞融合，有1次融合失败，其失败原因初步确定是终止融合时使用的DMEM没有得到充分预热，损伤了细胞膜。本试验在完成杂交瘤细胞的融合后，筛选出了2B7及3I4两株可稳定分泌PPRVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，且单克隆抗体的亚型鉴定结果显示，两株单克隆抗体重链均为IgG2b型，轻链均为κ型，特异性检测结果表明该单克隆抗体只与PPRV疫苗株、PPRV武威分离株发生特异性结合，具有较高特异性，且在将生长状态良好的杂交瘤细胞分别注入致敏BALB/c母鼠腹腔后，成功制备出了腹水，两株杂交瘤细胞产生的腹水效价分别为1：51200和1：25600。31 甘肃农业大学硕士学位论文以上试验结果为基于PPRV武威分离株N蛋白单克隆抗体的后续研究及应用提供了良好的材料。32 甘肃农业大学硕士学位论文全文结论1.提取PPRV武威分离株总RNA，经RT-PCR扩增获得N蛋白全基因序列（GenBank登录号：KY429031）。2.成功构建重组表达质粒pET-PPRV-N，并主要以可溶性形式将其表达；制备的多克隆抗体经ELISA检测表明，其效价约为1：64000；Western-blot结果表明，该多克隆抗体可以与重组蛋白、疫苗株、武威分离株结合，具有良好反应原性。3.经杂交瘤细胞技术获得了两株特异且可稳定分泌PPRVN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B7和3I4，且其制备获得的腹水效价分别为1：51200及1：25600，亚型鉴定结果显示，两株单克隆抗体重链均为IgG2b型，轻链均为κ型。33 甘肃农业大学硕士学位论文参考文献[1]韩红,王莉莉,唐伟静,等.小反刍兽疫病毒的研究进展[J].畜禽业,2016(2):4-6.[2]李林杰,谢军,徐文凯,等.小反刍兽疫病毒的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2018(1).[3]GargadennecL,LalanneA.Lapestedespetitsruminants[J].BulletindesServicesZootechniquesetdesEpizootiesdeI’AfriqueOccidentaleFrancaise,1942,5:16-21.[4]ÖzkulA,AkcaY,AlkanF,etal.Prevalence,Distribution,andHostRangeofPestedespetitsruminantsvirus,Turkey[J].EmergingInfectiousDiseases,2002,8(7):708-712.[5]罗静，何宏轩.小反刍兽疫病毒的分子生物学特性及其在全球的流行[J].河北师范大学学报(自然科学版),2009,4:543-550.[6]赵柏林,孔冬妮,孙雨,等.我国小反刍兽疫流行情况及防控措施[J].畜牧与兽医,2017,49(3):108-110.[7]DharP,SreenivasaBP,BarrettT,etal.Recentepidemiologyofpestedespetitsruminantsvirus(PPRV)[J].VeterinaryMicrobiology,2002,88(2):153-159.[8]李金明,吴晓东,王志亮.我国小反刍兽疫的历史与现状[C].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会论文集,2015.[9]印春生,支海兵.小反刍兽疫研究进展[J].中国兽药杂志,2007,41(8):22-27.[10]向蓉,黄勉,向华,等.小反刍兽疫流行状态及检测方法研究进展[J].中国动物检疫,2017(10):46-49.[11]WangJ,WangM,WangS,etal.Pestedespetitsruminantsvirusinheilongjiangprovince,china,2014[J].EmergInfectDis,2015,21(4),677-680.[12]DialloA.Morbillivirusgroup:genomeorganisationandproteins[J].VeterinaryMicrobiology,1990,231(1-4):155.[13]GibbsPJ,TaylorWP,LawmanMJP,etal.ClassificationofPestedesPetitsRuminantsVirusastheFourthMemberoftheGenusMorbillivirus[J].Intervirology,1979,11(5):268-274.[14]刘佩红,沈素芳,黄忠.动物外来疫病—小反刍兽疫防控技术研究进展[J].上海畜牧兽医通讯,2008(6):14-15.[15]包静月,李林,王志亮,等.一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立[J].中国动物检疫,2007,24(8):27-29．[16]南文金,王清华,吴晓东,等.小反刍兽疫病毒分子生物学与疫苗研究进展[J].中国动物检疫,2009,26(1):62-65.34 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甘肃农业大学硕士学位论文致谢本论文是在导师包世俊副教授的悉心指导下完成的，包老师对我论文的研究方向给予了指导性的意见，在论文撰写过程中也及时对我遇到的困难和疑惑给予了悉心的指点，提出了许多有益的改善性意见，投入了大量的心血和精力，包老师严于律己的实验精神值得我一生学习，在此，请允许我对包老师的帮助和关怀表示诚挚的谢意和感激！同时，还要感谢伏小平副教授、邢小勇老师、温峰琴老师两年来对我学习和生活上的帮助！此外，感谢甘肃农业大学兽医传染病学实验室所有同学给予我的帮助，感谢肖敏、冯娜、高翔、宁建刚、张懿、李丹、安凯师兄师姐们对我试验过程中的指导，感谢胡荣斌、陈文龙等硕士研究生对我试验和生活中给予的帮助及支持，是你们对我的帮助和启发让我顺利完成硕士阶段的学习、工作和生活，谢谢你们！同时，也要感谢参考文献中的作者们，基于你们良好的试验方法及理论依据，我才得以顺利完成试验内容及论文撰写，谢谢！最后，谢谢论文评阅老师们、参与毕业答辩教授们的辛苦工作，谢谢你们！41 甘肃农业大学硕士学位论文作者简介王雯，女，1992年10月生，汉族，甘肃天水人，中国共青团团员，2016年6月毕业于甘肃农业大学动物医学院，获学士学位，2016年至2018年于甘肃农业大学动物医学院兽医传染病学研究室包世俊副教授课题组完成毕业论文。42 甘肃农业大学硕士学位论文导师简介包世俊，男，汉族，1970年2月生，甘肃漳县人，中共党员。1996年，毕业于甘肃农业大学兽医系，获兽医学学士学位并留校任教；2000年至2003年，就读于中国人民解放军军需大学军事兽医研究所，获预防兽医学硕士学位；2011年至2014年，就读于中国农业科学院研究生院上海兽医研究所，获预防兽医学博士学位。现为甘肃农业大学动物医学院副院长、副教授，硕士研究生导师，兼任中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会理事。自工作以来，一直从事兽医病原分子生物学的教学和科研工作，先后承担《兽医传染病学》、《动物防疫与检疫》、《禽病学》、《兽医生物制品学》和《动物医学概论》等本科课程的理论和实验实习教学任务，新开设并承担动物医学本科专业的《分子生物学》及《兽医生物技术》课程的理论教学工作。承担的硕士研究生课程有《兽医病原分子遗传学》、《动物防疫与检疫》、《兽医生物制品工程》、《兽医学前沿》及《兽医实践与案例（病例）分析》等。以第二完成人参与建设的甘肃农业大学重点课程建设项目“家畜传染病学综合课程体系建设”通过验收；以第三完成人参与建设的《动物性食品卫生学》课程被评为2013年省级精品课程。目前，指导培养的在读硕士研究生11人。主持和参与科研项目9余项，共发表研究论文30多篇，其中被SCI收录5篇（3篇为一作）；副主编《肉牛常见病特征与防控知识集要》，参与制定国家标准《牛出血性败血病诊断技术》、《牛出血性败血病诊断技术》(GB/T27530-2011)。申报的两项国家发明专利已进入实质审查阶段；参与申报的一项实用专利已获授权。43 甘肃农业大学硕士学位论文44