《重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
＾户壶医科太孝学号：２０１５２隱ＧｕａｎｇｘｉＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究＿伟．导师姓名：花奇凯专业名称：外科学申请学位类型：学术型学位答辩委员会主席：黄克答辩委员会委员：黄科宗少晖劳山薄占东二〇一八年五月 原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含获得广西医科大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论。与我文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期；｝＾阵Ｚ月知日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规。学校有权保定，即：在校期间论文的知识产权属广西医科大学存论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本论文的部分或全部内容、汇编本论文，，可以采用影印、复印或其它手段保存学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。同意广西医科大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。保密论文在解密后遵守此规定。学位论文作者签名：知导师签字：签字日期：＞丨公年＆月日签字曰期Ａ＜月％日 个人简历基本情况姓名：高伟性别：男民族：汉族出生年月：1990.12籍贯：河南省濮阳市政治面貌：共青团员学习工作经历（从本科学历起，注意时间连续性）起止时间所在院校或单位学历学位职称2009.9-2014.6郑州大学学士无2015.9-2018.6广西医科大学硕士无研究生期间科研经历（单列，用序号注明）项目起止时间项目名称项目来源本人承担任务2017.9-2020.9横向骨搬移治疗糖尿病广西自然科基础实验足机制初探学基金项目 目录摘要.......................................................................................................................1ABSTRACT...............................................................................................................4前言.......................................................................................................................8第一部分胫骨横向骨搬移术促进重度糖尿病足创面愈合的临床观察研究.............................................................................................................................111.1对象及材料............................................................................................111.1.1病历资料.........................................................................................111.1.2试剂................................................................................................111.1.3仪器................................................................................................111.2操作步骤及统计学方法........................................................................121.2.1胫骨横向骨搬移手术方法及术后处理........................................121.2.2病例统计学方法............................................................................121.2.3HE染色...........................................................................................131.3结果......................................................................................................141.3.1术后患者创面情况........................................................................141.3.2创面愈合情况................................................................................151.4讨论........................................................................................................201.5结论........................................................................................................25 第二部分重度糖尿病足创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究.............................................................................................................................272.1材料........................................................................................................272.1.1标本收集........................................................................................272.1.2试剂................................................................................................272.1.3实验溶液配制................................................................................272.1.4仪器.................................................................................................292.2操作步骤................................................................................................292.3统计学方法............................................................................................312.4结果........................................................................................................322.5讨论........................................................................................................422.6结论........................................................................................................49参考文献.............................................................................................................51附录.....................................................................................................................57综述.....................................................................................................................58参考文献.............................................................................................................64致谢.....................................................................................................................71 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究摘要背景糖尿病足是糖尿病病情发展过程中一个极其严重的并发症，目前我国糖尿病的发病率约为10.6%，而约25%的DM患者会在疾病发展的过程中并发足部的感染、溃疡及坏疽。目前已有的内外科治疗手段疗效欠佳，糖尿病足患者往往不得不截肢以阻止病情的进一步发展和恶化。同时，糖尿病足复发率高，在一些中低收入的发展中国家，糖尿病足患者往往面临着创面迁延不愈，医疗费用支出增加，甚至危及生命的现状。胫骨横向骨搬移术是基于Ilizarov技术“张力-应力”法则下开发出的用于治疗下肢慢性缺血性疾病的疗法，被我们首先应用于重度糖尿病足患者以促进其创面愈合，降低患者截肢的风险，取得了良好的治疗效果，患者创面能在较短的时间内愈合。但是其促进创面愈合的机制尚不明确。巨噬细胞是参与机体炎症反应的重要细胞，其在不同环境因素刺激下可转化为表达不同细胞表型和不同功能的细胞亚群，称之为巨噬细胞的极化。巨噬细胞主要极化为M1和M2两种类型的巨噬细胞，前者在炎症反应期可分泌多种促炎因子以杀灭病原微生物，控制感染，但同时可造成对自身组织的损伤；后者在炎症增殖期分泌多种抗炎和生长因子以调节免疫反应，促进组织损伤的修复。作为皮肤组织的特异性干细胞，表皮干细胞不仅维持着皮肤正常新陈代谢，也是皮肤组织和皮肤附属器发生、修复和改建的关键，促进表皮干细胞的增殖与分化，会使创面由解剖修复向功能修复成为可能。我们认为重度糖尿病足患者创面处由于病原微生物持续存在，导致巨噬细胞极化失衡，巨噬细胞主要极化为M1型巨噬细胞而M2型巨噬细胞相对匮乏，同1 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文时表皮干细胞的功能受到抑制，因而创面迁延不愈。而胫骨横向骨搬移术可促进巨噬细胞极化平衡的重建，促进巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，同时促进了表皮干细胞功能的恢复，使得创面处溃疡得以愈合。方法1、收集2014年7月～2017年6月在广西医科大学第一附属医院骨关节外科住院接受胫骨横向骨搬移术治疗的136例重度糖尿病足患者，统计其基本资料（年龄、性别、Wagner分级、糖尿病病程、糖尿病足病程等）、创面愈合平均时间、截肢率、1年内和3年内复发率，初步评估胫骨横向骨搬移术治疗重度糖尿病足疗效；同时有33例患者合并全身感染症状，对比其创面愈合时间与未合并全身感染症状患者创面愈合时间。2、征求患者同意后于术后1月取其创面愈合边缘处组织制成组织切片，行HE染色后镜下观察愈合情况，共10例。3、征求患者同意后于术前及术后1月取其创面边缘处组织制成组织切片，应用免疫组化技术，以CD86单抗标记M1型巨噬细胞，CD163单抗标记M2型巨噬细胞，染色后应用Imageproplus6.0软件对图像中的像素点进行采集分析，计算出M1/M2比值的变化，术前组与术后1月组各10例。4、应用免疫组化技术,以CK19标记表皮干细胞，检测手术前后Ki-67阳性细胞和CK19阳性细胞的分布，术前与术后1月组各5例。结果1、136例重度糖尿病足患者有6例因术后创面愈合不佳而截肢，截肢率4.4%；10例患者创面愈合后1年内溃疡复发，12例患者3年内溃疡复发，1年内和3年内复发率分别为7.7%和9.2%；创面的平均愈合时间为（3.8±2.4）个月；合并全身感染症状患者创面平均愈合时间为（5.3±2.7）个月，未合并全身感染症状患创面平均愈合时间为（3.3±2.1）个月，差异有统计学意义（P＜0.05）。2、创面愈合处可观察到皮纹及一条线形疤痕，组织行HE染色后镜下可观察到表皮层和真皮层结构。3、术前组M1/M2平均值为4.072±0.502，术后1月组M1/M2平均值为3.098±0.548，应用SPSS22.0行独立样本t检验提示差异具有统计学意义（P＜0.05）。4、术前Ki-672 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文阳性细胞主要集中在表皮基底层细胞且只有一两层。术后Ki-67阳性细胞在表皮基底层处增厚，且在真皮层也有散在群性分布。CK19阳性细胞主要在真皮层发现，成管状或团状分布，术后较术前增多。结论1、胫骨横向骨搬移术可缩短糖尿病足创面愈合的时间，降低截肢率和复发率。2、创面愈合处组织经大体和HE染色后镜下均可观察到皮肤组织的基本特征，可初步证明胫骨横向骨搬移手术促进了重度糖尿病足创面处皮肤组织再生。3、胫骨横向骨搬移手术促进了巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，重建巨噬细胞极化的平衡，并促进了表皮干细胞功能的恢复，重度糖尿病足患者创面处溃疡得以愈合。关键词糖尿病足，胫骨横向骨搬移，创面愈合，巨噬细胞极化，表皮干细胞3 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文EFFECTOFTRANSVERSEBONETRANSPORTONSEVEREDIABETICFOOTANDMECHANISMOFWOUNDREGENERATIONWITHMACROPHAGESANDEPIDERMALSTEMCELLSABSTRACTBACKGROUNDDiabeticfootisaveryseriouscomplicationduringthedevelopmentofdiabetesmellitus.TheincidenceofdiabetesinChinaisabout10.6%now.About25%ofDMpatientswillsufferfromfootinfection,ulcersandgangreneinthecourseofdiseasedevelopment.Atpresent,theexistingmethodsofmedicalandsurgicaltreatmentarenotgood,anddiabeticfootpatientsoftenhavetoamputatetheirlimbstopreventfurtherdevelopmentanddeteriorationofthecondition.Atthesametime,therecurrencerateofdiabeticfootishigh.Insomedevelopingcountrieswithlowandmiddleincome,diabeticfootpatientsareoftenfacedwiththesituationofprolongedwoundhealing,increasedmedicalexpensesandevenlife-threatening.TibialtransversetransportisbasedontheIlizarovtechnique"tension-stress"lawforthetreatmentofchronicischemicdiseaseofthelowerextremities,firstappliedtoseverediabeticfootpatientstopromotewoundhealingandreducetheriskofamputation,andhavegotgoodresults.Thewoundhealingwasinashorttime.However,themechanismforpromotingwoundhealingisstillnotclear.Macrophagesareimportantcellsinvolvedininflammatoryresponse.Theycanbetransformedintocellsubsetsthatexpressdifferentphenotypesandfunctionsofcellsunder4 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文differentenvironmentalfactors,whichiscalledmacrophagepolarization.Macrophagesaremainlypolarizedintotwotypesofmacrophages,M1andM2.Theformercansecretevariouspro-inflammatoryfactorsduringtheinflammatoryphasetokillpathogenicmicroorganismsandcontrolinfection,butatthesametimecancausedamagetonormaltissue.Thelattercansecreteavarietyofanti-inflammatoryandgrowthfactorsduringtheinflammatoryproliferationphasetoregulateimmuneresponseandpromoterepairoftissuedamage.Asaspecificstemcellofskintissue,epidermalstemcellsnotonlymaintainthenormalmetabolismoftheskin,butalsoplayakeyroleintheoccurrence,repair,andreconstructionofskintissueandskinadnexa.Itpromotestheproliferationanddifferentiationofepidermalstemcells,andmakesthewoundsurfacefromanatomicalrepairtofunctionalrepair.Wethinkthatduetothepersistentexistenceofpathogenicmicroorganism,themacrophagepolarizationinthewoundofseverediabeticfootisunbalanced.MacrophagesaremainlypolarizedintoM1macrophages,whileM2typemacrophagesarerelativelydeficient.Atthesametime,thefunctionofepidermalstemcellsisinhibited,sothewoundhealingisprolonged.Tibialtransversetransportcanpromotethereconstructionofmacrophagepolarizationbalance,promotemacrophagestotransformintoM2macrophages,makethefunctionofepidermalstemcellsrecovered,andmakethewoundhealed.METHOD1.Atotalof136patientswithseverediabeticfootwhoweretreatedwithtibialtransversetransportattheDepartmentofOsteoarthritisattheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversityfromJuly2014toJune2017werecollected.Thebasicdata(age,sex,Wagnerclassification,durationofdiabetes,durationofdiabeticfoot,etc.),theaveragetimeofwoundhealing,theamputationrate,therecurrenceratewithin1yearsand3yearswerecounted,5 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文andtheeffectoftibialtransversetransportforseverediabeticfootwasinitiallyevaluated.Atthesametime,therewere33patientswithsystemicinfectionsymptoms,comparedtheirwoundhealingtimewiththepatientswithoutsystemicinfectionsymptoms.2.Patientswereaskedtoagreetotakethetissueattheedgeofthehealedwoundat1monthafteroperationtomakeatissuesection.AfterHEstaining,itwasobservedunderamicroscopetoseeifithadskintissuestructurecharacteristics,atotalof10cases.3.Patientswereaskedforconsentandtissuesectionsweremadeontheedgeofthewoundsurfacebeforeandafteroperation.ImmunohistochemicaltechniqueswereusedtolabelM1macrophageswithCD86monoclonalantibodyandM2typemacrophageswithCD163monoclonalantibody.Afterthedyeing,Imageproplus6.0softwarewasusedtocollectandanalyzethepixelsintheimage,andtheratioofM1/M2wascalculated.Therewere10casesinthepreoperativegroupand1monthaftertheoperation.4.ImmunohistochemicaltechniquewasusedtolabelepidermalstemcellswithCK19monoclonalantibodyanddetectthedistributionofKi-67positivecellsandCK19positivecellsbeforeandafteroperation.Therewere5casesinthepreoperativegroupand1monthaftertheoperation.RESULTS1.Ofthe136patientswithseverediabeticfoot,6wereamputatedduetopoorpostoperativewoundhealing,andtheamputationratewas4.4%;10patientshadulcerrecurrencewithin1yearafterwoundhealing,and12patientshadulcerrecurrencewithin3years.Therecurrencerateswithinoneyearandthreeyearswere7.7%and9.2%respectively.Theaveragewoundhealingtimewas(3.8±2.4)months；Themeanwoundhealingtimewas(5.3±2.7)monthsinpatientswithsystemicinfectionsymptoms,and(3.3±2.1)monthsinuncomplicatedsystemicinfections.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).2.Thestriaeandalinearscarwereobservedatthesiteofwound6 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文healing.AfterthetissuewasstainedwithHE,theepidermisanddermiswereobservedunderthemicroscope.3.ThemeanvalueofM1/M2inthepreoperativegroupwas4.072±0.502.ThemeanvalueofM1/M2inthefirstmonthafteroperationwas3.098±0.548.TheindependentsamplettestperformedwithSPSS22.0indicatedthatthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).4.ThepreoperativeKi-67positivecellsweremainlyconcentratedintheepidermalbasalcellswithonlyoneortwolayers.Ki-67positivecellsthickenedatthebasallayeroftheepidermisandalsoscattereddistributionsinthedermisafteroperation.TheCK19-positivecellsweremainlyfoundinthedermisanddistributedintubularorlumps.ThepostoperativeCK19-positivecellsweremorethanthoseinpreoperation.CONCLUSION1.Tibialtransversetransportcanshortenthetimeforthehealingofdiabeticfootwoundsandreducetheamputationrateandrecurrencerate.2.ThebasiccharacteristicsofskintissuecanbeobservedundergeneralandHEstainingafterwoundhealing.Itcanbepreliminarilyprovedthattheoperationoftibialtransversetransportpromotestheregenerationofskintissueinseverediabeticfootwounds.3.TibialtransversetransportpromotesthemacrophagepolarizationtoM2macrophages,reconstructsthebalanceofmacrophagespolarization,andmakethefunctionofepidermalstemcellsrecovered,sotheulcersinseverediabeticfootwoundscanbehealed.KEYWORDSdiabeticfoot,tibialtransversetransport,woundhealing,macrophagepolarization,epidermalstemcells7 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文前言糖尿病足（Diabeticfoot，DF）是糖尿病发展过程中一个常见且极其严重的并发症，近年的文献报道，我国糖尿病（diabetesmellitus,DM）[1]的发病率为10.6%（9.6%～12.9%），而其中约25%的DM患者在疾病发展[2]过程中发生足部感染、溃疡及坏疽等并发症。尤其是在发展中国家，收入偏低，而且针对糖尿病患者关于糖尿病足的宣教环节薄弱或缺失，导致其预防意识淡薄，加上医疗、护理过程缺乏规范，往往导致糖尿病足患者发生率高和创面迁延不愈，也因此引起医疗费用支出增加，有文献统计表明，糖尿病足患者的治疗费用是糖尿病患者的5.4倍；若溃疡复发，费用[3]可再提高2.8倍。更加值得重视的是，糖尿病足发生表明患者机体相关脏器损伤严重，其中血管、神经和皮肤等组织损伤则可在临床综合表现为糖尿病足溃疡，若迁延不愈或者截肢处理，则加重对患者的打击，也引起护理等诸多方面的不便，严重影响糖尿病足患者的生活质量，甚至导致死亡。在欧美等经济和医学发达国家，目前糖尿病足的宣教和预防干预措施非常得力和细致，如预防糖尿病足专用鞋袜应用等诸多生活细节干预，使其发生率和严重程度均显著降低。但即使这样，以糖尿病足为主的慢性溃疡护理与治疗费用依然是临床关注点，在发达国家总的护理费用份额比例中超[4]过3%。面对如此严峻的糖尿病足治疗与护理局面，目前治疗方法主要有游离带血管蒂皮瓣治疗、同种异体脱水羊膜移植治疗、经皮血管腔内血管成形联合支架植入术治疗、介入溶栓治疗、干细胞移植治疗等，创面愈合率为75%～90%，但在重度糖尿病足（Wagner3级及以上）的溃疡创面治愈[5-8]率效果欠佳，约5%～24%患者需要截肢，以阻止病情进一步发展及恶化。由于糖尿病足是机体损伤严重阶段的临床表现，即使在糖尿病足溃疡（diabeticfootulcer，DFU）愈合的患者中，有约40%会在1年内复发，[9]3年内和5年内的复发率分别可达60%和65%。因此，在糖尿病足患者中，8 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文尤其是针对重度糖尿病足患者（Wagner3级及以上），促进其创面尽快愈合和保肢治疗是至关重要的，同时，进一步降低糖尿病足溃疡复发率和延长复发时间，均是难愈性慢性溃疡的治疗领域中亟待解决的难题。在骨科难治性创面和缺损修复治疗中，如慢性骨髓炎和大段骨缺损等创面处理，常常采用基于“张力-应力”法则的Ilizarov外固定架技术进[10][11]行治疗。早期Ilizarov等多个小组的系列研究发现，在动态观察犬腿牵拉成骨实验时，截骨牵拉的区域首先有大量微血管网再生，作为成骨修复骨缺损的基础；继而有研究表明，在骨搬移的第7～21天时微血管网的再生最为活跃，通过现代血管造影技术也观察到截骨牵拉区有新生血管再[12]生与微循环重建。因此，“张力-应力”法则通常被表述为：生物组织被缓慢牵拉时会产生一定的张力，可刺激组织再生和活跃生长。其生长方式[13]如同胎儿组织一样是细胞分裂。这提示，生物组织在张力作用下，血管、骨骼、肌肉、神经等组织可以启动再生修复程序。从目前再生医学角度来分析，在骨搬移过程中，极有可能触发机体干细胞动员机制，参与搬移处[14]损伤的组织再生修复过程，包括血管、骨骼、肌肉、神经等。鉴于此，[14，15]我们将胫骨横向骨搬移术率先应用于治疗重度糖尿病足中，早期40例重度糖尿病足的临床治疗中，获得了接近100%的创面愈合率。其中大多数病人足部溃疡创面深大，部分创面可达肌腱甚至骨面，而且伴有诸多糖尿病并发症。通常认为，临床这种严重损伤且复杂的组织缺损类型，其修复过程多属二期修复，在坏死清除、感染控制后由创面边缘及底部组织开始进行增生，常由大量瘢痕组织填补缺损来完成创面修复。本研究在前期临床胫骨横向骨搬移术治疗重度糖尿病足的基础上，进一步扩展病例到136例，发现130例创面基本属于再生修复，仅在创面处留下小面积线状疤痕组织，提示在胫骨横向骨搬移术治疗过程中，糖尿病足复杂创面的修复极可能有有相关干细胞参与，但具体机制不清楚。从生物学角度来分析，正常创面修复是一个有序复杂的过程，主要包括炎症、新组织形成和重建三9 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文个阶段，涉及多种细胞的参与，如中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、血管内皮细胞以及不同来源的干细胞等，并且有系统的细胞因子（如IL-1、IL-10和NO等）和生长因子等网络调控创面修复过程。就本研究而言，研究对象是迁延不愈慢性溃疡创面，创伤涉及皮肤、骨、血管和神经多种组织和器官，其修复过程和机制就更加复杂。鉴于此，本研究在总结136例重度糖尿病足胫骨横向骨搬移术治疗的临床疗效基础上，进一步探讨创面愈合的细胞和分子机制，为进一步完善和改良重度糖尿病足骨搬移术治疗体系提供基础研究数据。本研究主要分两部分，第一部分是收集136例重度糖尿病足胫骨横向骨搬移术治疗临床疗效分析，主要包括重度糖尿病足患者溃疡创面损伤程度、并发症情况、创面愈合情况、随访复发情况等；第二部分则重点关注慢性复杂创面愈合机制中巨噬细胞与表皮干细胞的参与情况，包括：①创面巨噬细胞极化状态：由于巨噬细胞参与了创面修复的各个阶段，而且本研究的案例均是慢性迁延不愈的溃疡创面，所以特别关注创面巨噬细胞的变化，应用免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC）观察胫骨横向骨搬移术前后创面皮肤M1和M2巨噬细胞的定位、分布以及两者比例变化，初步明确在手术促进慢性溃疡复杂创面愈合过程中的变化规律。②创面修复过程中，观察创面皮肤细胞增殖与表皮干细胞分布与数量变化情况。10 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文第一部分胫骨横向骨搬移术促进重度糖尿病足创面愈合的临床观察研究1.1对象及材料1.1.1病例资料根据Wagner分级标准，收集2014年7月至2017年6月在广西医科大学第一附属医院骨关节外科住院治疗的重度糖尿病足患者（Wagner3级及以上）136例，其中Wagner3级患者66例，4级患者60例，5级患者10例，基本资料见表1-1。同时，这136例患者中有33例患者合并有全身感染症状。表1-1136例重度糖尿病足患者基本资料项目基本情况总数136男102女34年龄（岁）60.6±10.1（33～85）DM病程（月）115.9±83.3（2～336）DF病程（月）17.2±30.0（0.5～144）Wagner分级3级（例）664级（例）605级（例）101.1.2试剂双蒸水，苏木素，伊红酒精染液，二甲苯，1%盐酸酒精，二甲苯乙醇溶液（1:1），75％乙醇，95%乙醇，无水乙醇。1.1.3仪器切片机（德国LEICARM2235EU型），生物显微镜（OLYMPUSCX21），11 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文载玻片（江苏世泰）及盖玻片，其他：移液器、枪头若干、一次性吸管若干、吸水滤纸若干等。1.2操作步骤及统计学方法1.2.1胫骨横向骨搬移手术方法及术后处理：麻醉消毒铺巾后，在胫骨的中上部偏内侧做一个长约3～5cm的弧形切口，分离皮下组织至骨膜，确定胫骨横向骨搬移的截骨的骨窗范围，长约5cm，宽约1.5cm，用钻头及微型截骨器在截骨骨窗边缘钻孔后在骨窗中心处拧入2枚3mm搬移外固定不锈钢针以搬移骨块，用骨刀沿钻孔凿开搬移骨块，注意严防损伤髓腔内的骨髓。在距骨窗的近、远端约3cm的胫骨上各拧入1枚4mm的外固定不锈钢针，钢针要穿过胫骨两侧骨皮质，安装胫骨横向骨搬移装置并注意防止松动，逐层缝合肌肉、皮下组织及皮肤，手术切口75%酒精消毒后辅料包扎。对合并有感染症状的患者，术中及术后可酌情应用抗生素控制感染症状，术后第3天外固定架安装处未见明显水肿及渗出时可开始调节外固定骨搬移架进行骨搬移，向外搬移骨块1mm/d，分3次完成，调节2周后向回搬移1mm/d，分3次完成，再调节2周后骨块可归位。返院复查X线、血常规、血沉、CRP、肝肾功、血糖、糖化血红蛋白等确认骨块无明显移位，血糖控制良好，全身情况稳定后可拆除外固定架，整个疗程共计约1个月。期间外固定架针口处应用75%酒精消毒，95%酒精纱布湿敷，无渗血后每2天换药一次；足部溃疡处生理盐水冲洗后剪除坏死组织，用乳酸依沙吖啶纱布覆盖创面，每天换药一次至坏死组织基本消失，新鲜肉芽组织长出后可改用碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子等促进创面愈合，注意足部创面新生肉芽组织出现后在换药时严禁使用双氧水，以免损伤新生出的肉芽组织。术后仍需有效控制血糖，戒烟戒酒，下地活动时要严防跌倒。1.2.2病例统计学方法：统计出上述136例患者性别、年龄、糖尿病病程、糖尿病足病程、创12 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文面愈合时间、复发例数、截肢例数；将33例合并全身感染症状者归入全身感染组，其余103例未合并全身感染症状者归入无全身感染组，分别统计两组患者创面愈合时间和手术前后疼痛评分（VAS）。应用SPSS22.0统计软件对上述数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±S）表示。1.2.3HE染色：在征求患者同意及临床伦理委员会许可后，取广西医科大学第一附属医院骨关节外科2017年12月～2018年1月入院经胫骨横向骨搬移术治疗的重度糖尿病足患者术后1月时创面愈合边缘处的组织共10例，大小约1cm×0.5cm×0.3cm，经10%福尔马林固定4～8小时，冲洗、脱水、石蜡包埋、制成组织切片。（1）二甲苯脱蜡五道，每道5分钟；（2）无水乙醇Ⅰ中浸泡5分钟无水乙醇Ⅱ中浸泡5分钟；（3）95%乙醇Ⅰ中浸泡5分钟95%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟；（4）75%乙醇中浸泡5分钟；（5）水化：双蒸水中水化3次，每次2分钟；（6）一次性吸管吸取苏木素液染色5分钟（冬天时可适当延长）；（7）自来水冲洗；（8）1%盐酸酒精分色3～5秒（提插数下），在镜下观察；（9）水洗蓝化15～30分钟（应注意换水）；（10）一次性吸管吸取伊红酒精染液染色3～30秒；（11）95%乙醇Ⅰ中浸泡5分钟95%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟；（12）无水乙醇Ⅰ中浸泡5分钟无水乙醇Ⅱ中浸泡5分钟；（13）二甲苯乙醇溶液（1：1）中浸泡5分钟；（14）二甲苯Ⅰ中浸泡5分钟二甲苯Ⅱ中浸泡5分钟二甲苯Ⅲ中浸泡5分钟；（15）中性树胶封片；13 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文（16）生物显微镜下观察染色结果。注意事项：（1）染色时调节pH值很重要。若组织块在福尔马林中固定时间较长，组织酸化从而影响细胞核着色。因此，在自来水中冲洗时间要长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10～30分钟，这样可以使细胞核着色加深。染伊红染液时胞浆若着色不佳，可在伊红染液中滴加1～2滴冰醋酸。（2）切片染苏木素后，分色这一步是关键，应在显微镜的控制之下进行。一般应以细胞核染色清晰而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将会导致染色太浅，应重新染色之后再进行分色。（3）切片经酒精脱水后，浸入二甲苯时可出现白色不透明状态，出现此情况原因为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。（4）在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响细胞组织形态。（5）切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。（6）最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色；盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。1.3结果1.3.1术后患者创面情况：136例患者均在术后得到随访，有6例手术后创面没有好转而截肢，其余患者创面在术后1～12个月（3.8±2.4个月）内愈合；DFU复发方面，1年内复发10例，3年内复发12例，溃疡的复发主要与血糖控制不佳有关，经严格控制血糖下常规创面换药或再次行胫骨横向骨搬移术后复发的创面均得到愈合，具体情况见表1-2。14 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文33例合并全身感染症状患者创面在术后3～12个月（5.3±2.7个月）内愈合，无截肢病例；103例未合并全身感染症状患者除6例截肢病例外，创面在术后1～12个月（3.3±2.1个月）内愈合，P＜0.05，差异有统计学意义。1.3.2创面愈合情况：除溃疡面积深大（面积大于5cm×5cm，深达肌腱甚至骨组织），感染症状较重患者外，创面处愈合的基本过程过程：在胫骨横向搬移术后的1周～2周时，溃疡处的创面开始有新鲜的肉芽组织形成，质脆，触之易出血；2周～3周时，肉芽组织基本完全填补创面处的组织缺损，继而皮肤开始自创面的四周向中心移行生长；约1个月～2个月后，创面的愈合面积可达到一半以上，而完全愈合约需要1个月～12个月，平均3.8个月，并且肉眼可见皮纹，基本保留一小片带状疤痕。具体过程可见典型病例展示（图1-1）。术后1月创面愈合边缘处组织经HE染色后，胞核可被苏木素染成蓝色，而胞浆、结缔组织、纤维、肌肉等可被伊红染液染成不同程度的红色。镜下可观察到表皮层的上皮组织结构和真皮层的结缔组织等基本结构：表皮层可较清晰地被分为角质层、颗粒层、棘层、基底层；在真皮层结缔组织中，可观察到胶原纤维和血管结构，而纤维结构在镜下少见（图1-2）。表1-2136例重度糖尿病足患者术后疗效Wagner分级例数截肢例数/截肢率1年内复发例数/复发率3年内复发例数/复发率3级661/1.5%5/7.7%5/7.7%4级603/5.0%4/7.0%6/10.5%5级102/20.0%1/12.5%1/12.5%总数1366/4.4%10/7.7%12/9.2%15 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文16 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文EF术前术后1月G术后3月图1-1重度糖尿病足患者创面愈合情况病例一：A.术前可见右足足趾坏疽，足背水肿，创面周围皮肤红肿；B.术后1月，可见原组织缺损处被新鲜肉芽组织填补，皮肤组织已开始由四周向中心爬行生长；C.术后2月，皮肤组织已覆盖大部分创面；D.术后3月，溃疡创面基本完全消失，除少量疤痕组织外，创面基本被皮肤组织覆盖。病例二：E.术前可见左足足趾坏疽，足背腱外露，脓性渗出明显，创面周围皮肤红肿；F.术后1月，可见无脓性渗出，创面由新鲜肉芽组织填补，创面周围无明显红肿；G.术后3月，除少量瘢痕组织外，创面基本被皮肤组织覆盖。Fig.1-1woundhealinginpatientswithseverediabeticfootCase1:A.Itcouldbeobservedbeforetheoperationthattherighttoeswerewithgangrene,thefootwasedematous,andtheskinwasredandswollenaroundthewound;B.Theoriginaltissuedefectwas17 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文filledwithfreshgranulationtissue,andtheskintissuebegantocrawlfromtheperipherytothecenterinthe1-monthpostoperation;C.Theskintissuecoveredmostofthewoundsinthe2-monthpost-operation;D.Theulceralmostdisappeared.Exceptforasmallscar,thesurfaceofwoundwasbasicallycoveredbyskintissueinthe3-monthpostoperation.Case2:E.Itcouldbeobservedbeforetheoperationthatthelefttoeswerewithgangrene,thetendonsofthedorsumofthefootwereexposed,thepurulentexudationwasobvious,andtheskinwasredandswollenaroundthewound;F.Nopurulentexudationcouldbeseen,thewoundwasfilledwithfreshgranulationtissue,andtherewasnoobviousswellingaroundthewoundinthe1-monthpostoperation;G.Exceptforasmallscar,thesurfaceofwoundwasbasicallycoveredbyskintissueinthe3-monthpostoperation.18 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文图1-2创面愈合边缘处组织HE染色A.镜下可见表皮和真皮基本结构。（40×）B,C.表皮由上皮组织构成，可较明显地分为角质层、颗粒层、棘层和基底细胞层。（100×、400×）D,E.真皮层可见血管结构及大量胶原纤维，未发现明显大量纤维组织。（100×、400×）Fig.1-2HEstainingonthetissueattheedgeofwoundhealingA.Thebasicstructureoftheepidermisanddermiscanbeseenunderthemicroscope.（40×）B,C.Theepidermisiscomposedofepithelialtissueandcanbemoreclearlydividedintothestratumcorneum,granularlayer,acantholayer,andbasalcelllayer.（100×,400×）D,E.Thevascularstructureandalargenumberofcollagenfiberswerefoundinthedermis,andnosignificantfibroustissuewasfound（100×,400×）.19 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文1.4讨论1.4.1糖尿病足的分级与病例病情严重程度目前临床上糖尿病足分级主要采用Wagner分级法，而根据Wagner分级，3级以上的DF为重度糖尿病足。Wagner分级法见表1-3。表1-3DF的Wagner分级法分级临床表现0级有发生足部溃疡的危险因素，目前无溃疡1级表面溃疡，临床上无感染2级较深的溃疡，常合并软组织炎，无脓肿或骨的感染3级深度感染，伴有骨组织病变或脓肿4级局限性坏疽（趾、足跟或前足背）5级全足坏疽在我们进行临床观察的136例重度糖尿病足病例中，3级66例，4级60例，5级10例。糖尿病病程约（115.9±83.3）个月，糖尿病足病程约（17.2±30.0）个月。由于创面处迁延不愈，病人在饱受疾病折磨的同时，其日常护理也耗费了大量的人力及财力，一些在外院截肢的病例往往因为截肢后创面仍难以愈合而来我院进一步治疗；并且，患者创面处血供差，极易成为细菌等病原微生物滋生的温床，而其产生的内外毒素入血后会导致全身感染症状甚至感染性休克等严重情况：临床观察中的33例合并全身感染症状的患者创面的平均愈合时间较未合并全身感染症状的患者愈合时间久，提示全身感染症状是创面愈合的一个影响因素，并且这些患者入院时已出现了意识模糊、嗜睡、高烧、心率快、血压低等危及生命的症状，可见糖尿病足并非单纯只是足部的难愈性创面，更是全身多系统在糖尿病的摧残下出现功能障碍所导致的结果。1.4.2胫骨横向骨搬移术治疗重度糖尿病足的疗效及手术术式改良[16]Ilizarov技术最初应用于矫正肢体畸形且获得了良好的效果，受张20 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文力-应力法则的启发，广西医科大学一附院骨关节外科率先于2014年7月开始，应用Ilizarov技术胫骨截骨横向骨搬移术（胫骨横搬术）治疗糖尿[17]病足患者，在临床治疗上取得了良好的效果。冼呈等对2014年12月～2015年6月共18例接受胫骨横向骨搬移术的Wagner3～4级的糖尿病足患[15]者进行总结，花奇凯等对2014年8月～2016年3月共40例接受胫骨横向骨搬移术的糖尿病足患者进行总结，患者足部溃疡均得到愈合，感觉减退症状均得到改善，保肢率达到了100%。通过对收集的2014年7月～2017年6月的136例重度糖尿病足患者的临床疗效进行观察后发现，有6例患者截肢，截肢率4.4%，低于相关文献报道的截肢率（5%～24%）；除截肢病例外，其余130例重度糖尿病足患者的创面在1～12个月内愈合；1年内和3年内分别有10例和12例复发，复发率分别为7.7%和9.2%，远低于ArmstrongDG等的回顾性研究中糖尿病足1年内和3年内的复发率（40%和60%）。33例全身感染患者在一期充分清创引流后，待全身症状得到控制再二期行胫骨横向骨搬移手术，必要时可在清创后应用真空封闭引流（VacuumSealingDrainage，VSD）覆盖创面，促进细菌及毒素流向体外而不进入人体的同时，还可刺激肉芽组织的生长，在清创的过程中，应坚持清创的原则：及时彻底，充分引流，只清创不扩创，具体实施过程为：①清除发黑坏死失去活力的组织，至有鲜血渗出时可认为已清至正常活力组织，无需继续扩大创面；②敞开换药，不留死腔，充分引流。合并全身感染症状的病人在术后其创面均得以愈合。据此，我们可以认为胫骨横向骨搬移术在治疗重度糖尿病足中达到了缩短治疗时间、节约治疗费用、提高保肢率、降低复发率的目的，是治疗重度糖尿病足行之有效的方法。早期我们行胫骨横向骨搬移术时截骨区域大（12cm×2cm），术后患肢由于要等到骨块愈合需安置外固定架达3个月之久，并且术后易发生骨折，对患者的日常生活造成了诸多的不便。在治疗过程中我们不断探索改21 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文进手术方法，目前只需在胫骨中上段做一个5cm×1.5cm的微小骨窗，手术切口也较前缩小，外固定架调节结束后（约1个月）即可返院拆除，术后骨折几率大大减小，骨块愈合时间也得以缩短，并且患者创面愈合时间与改良前没有差别，而促进创面尽快愈合的最小截骨面积仍不明确，需要我们在临床治疗及基础实验中进行探索，但由于伦理等方面的限制，我们无法在病人身上进行相关实验，因此，应用基础实验探索胫骨横向骨搬移手术促进重度糖尿病足溃疡等难愈性慢性创面愈合的机制就显得更为重要。可以预见的是，胫骨横向骨搬移手术必将朝着微创化的方向发展，对减少手术创伤，缩短术后恢复时间，提高患者的就医治疗体验都是十分有意义的。1.4.3胫骨横向骨搬移术后截肢病例及复发病例分析对6例术后截肢的患者进行分析后我们发现，有1例患者术后第2天突然出现左侧（患侧）足部发绀、疼痛、皮温下降的症状，B超检查后提示患侧腘动脉发生急性血栓栓塞，经急诊手术取栓后栓塞再一次出现，患者因难以忍受多次手术的痛苦选择截肢。其余5例患者系因重度糖尿病足合并患侧下肢大中动脉的硬化闭塞，血运无法到达足部而导致术后足部溃疡没有好转，经长期观察或再次手术后溃疡面积依旧无法缩小甚至病情继续恶化，为避免坏死区域扩大甚至引起全身感染症状危及生命，经与家属积极沟通后截肢，截肢范围至皮温明显下降处，尽量保留残肢长度，截肢后创面基本在术后1～３个月愈合。通过上述6例截肢患者给我们临床工作的教训，我们加强了围术期的术前准备工作及术后监护工作：①术前常规行双下肢动脉CTA了解患肢大中动脉闭塞情况，若大中动脉（胫前动脉、胫后动脉等）闭塞，足部未见明显血管影像，即提示其合并下肢动脉硬化闭塞症时，建议其先行前往血管外科将闭塞的大中动脉经手术再通后转回我科行胫骨横向骨搬移手术；②术后常规口服利伐沙班35天，每周复查血常规、血沉、CRP、凝血功能、22 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文D-二聚体等，监测患者血液状态，避免术后动脉栓塞；③嘱患者拄拐下床活动，行走过程中可加强患侧的应力，促进创面更快地愈合，同时可降低深静脉血栓形成的发生。但对创面在足底部，特别是足跟处的患者，应避免患肢负重，防止创面新生的肉芽组织受压，以床上活动为宜；④术后口服贝前列素钠片直至伤口愈合，可营养原有及新生血管，促进患足血运的及早恢复；⑤其他：一般营养支持治疗，对有局部感染或全身感染症状者应用抗生素治疗，消炎止痛及消除水肿药物的应用等。同时，对糖尿病足溃疡复发的病例进行分析后我们发现，溃疡复发的患者在创面愈合后往往忽视了严格调节血糖、戒烟、保持创面清洁等医嘱，与病人及家属沟通的过程中他们往往认为糖尿病足只是足部的溃烂坏死，且多数糖尿病足病人依从性差，本身对糖尿病的防治不重视，忽略了需要长期用药以控制糖尿病，最终导致足部血管再次狭窄闭塞而溃疡复发。因此，糖尿病及糖尿病足的入院宣教，手术前后血糖的调节、严格戒烟、感染的控制、下肢大中动脉（胫前动脉、胫后动脉等）的通畅、一般生命体征的监测与调理、创面清洁换药等，都是重度糖尿病足患者耐受手术、创面愈合、手术起效、防止复发等方面的重要影响与先决因素。因而我们在患者入院时即采取：①积极告知病人及家属糖尿病和糖尿病足的严重性，简要介绍糖尿病足发生的原因，让他们充分了解其所患疾病的病因、危险因素、治疗方案及术后的护理，以取得病人及家属最大程度的理解和信任；②积极监测血糖，必要时请内分泌科会诊，协助指导胰岛素降糖治疗方案，并在病人出院时建议其定期前往内分泌科就诊，保证血糖水平保持在正常状态；③告知病人及家属吸烟会导致血管收缩，导致足部血运不佳而溃烂坏死，嘱其应在入院后即开始戒烟，并严防吸入二手烟；④保持创面清洁，有条件可去当地正规医院就诊换药，自行在家换药时应严格遵守无菌原则，出院前最后一次换药时邀请患者及家属全程在场参观学习，积极解答他们在观察换药时提出的问题，并在出院后通过微信、短信等方式及时随访，23 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文第一时间了解患者创面的情况，调整治疗方案；⑤其他：加强营养促进创面愈合，抗生素抗感染治疗，消炎止痛、消水肿治疗等。总之，糖尿病足的治疗需要多学科协作，共同努力，而非只有胫骨横向骨搬移手术这一单一干预因素：①内科治疗是基础：血糖的调控、感染的控制、并发症的治疗、病人最终机体状态能耐受手术等都需要相关内科科室进行指导。②麻醉科、放射科等辅助科室的协助：良好的麻醉是手术顺利实施的前提，而影像学检查对我们评估患者下肢血管情况、评估创面严重程度、确定清创手术范围等有着举足轻重的作用。③其他外科科室的支持：下肢大血管堵塞的再通等。因此整个治疗过程中我们与内分泌科、心内科、神经内科、呼吸内科、血管外科、麻醉科、放射科等科室密切配合，携手攻克了重度糖尿病足慢性创面迁延不愈的难题。1.4.4重度糖尿病足溃疡创面的愈合过程DM会使患者出现继发性的免疫功能减退，出现DF后，易导致患者足部溃疡创面感染，当足部出现坏疽，超过20%的患者不得不通过截肢以阻断病[18]情的继续恶化甚至危及生命，而且某些情况下截肢创面迁延不愈甚至坏死继续发生，患者需要进行扩大切除或者多次手术。重度糖尿病足患者的创面深大，该大小的正常创面应遵循二期愈合的创伤愈合过程，即在感染得到控制，坏死组织清除后再生才可开始发生：最初在伤口底部及边缘长出多量的肉芽组织，伤口收缩明显，愈合后遗留较大的瘢痕组织。但由于糖尿病足溃疡（DFU）创面处炎症反应持续存在，其愈合无法遵循二期愈合的规律，创面难以愈合，表现出慢性炎症性创面的特征。有研究发现在骨搬移的第7～21天时微血管网的再生最为活跃，而在对136例患者的临床疗效观察中我们也发现在手术后的1～2个月时大部分患者创面可缩小至原创面的50%以上，据此我们可以认为此时是术后重度糖尿病足溃疡创面修复最为活跃的时期，同时术后1月患者已完成骨搬移架24 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文的调节，需返院复查并拆除搬移架。因此我们选定术后1月这一时间点，在征求患者同意及伦理委员会许可后切取其创面愈合处的组织材料进行组织病理活检。通过对创面已愈合的患者进行大体观察，可在愈合处的组织发现皮纹及少量的线形疤痕，提示创面处的修复是皮肤再生。并且对愈合处组织材料行HE染色后，镜下可见组织大致分为表皮和真皮两层，具备正常表皮层与真皮层的基本结构特征，而未见明显的胶原纤维分布。因此可以认为重度糖尿病足溃疡创面经胫骨横向骨搬移术治疗后被再生的皮肤组织覆盖，而非大量瘢痕组织填充。但是，创面愈合受多种因素的影响，如：细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）、生长因子、抑素等。胫骨横向骨搬移术促进糖尿病足创面愈合的机制目前仍尚不明确，因此本研究尝试从巨噬细胞不同亚型及表皮干细胞在创面愈合过程中的分布及作用的角度在第二部分进行进一步的探索与研究。1.5结论1、糖尿病足是全身多系统由于糖尿病摧残下出现功能障碍导致的以足部溃烂坏死，难以愈合为主要表现的并发症，对患者及家人的身心和经济状况造成了巨大的压力。胫骨横向骨搬移手术可促进糖尿病足创面的愈合，是治疗糖尿病足，特别是重度糖尿病足溃疡创面行之有效的治疗手段。2、通过观察136例重度糖尿病足患者术后创面的愈合情况，创面完全愈合所需时间较短，截肢率、1年内和3年内复发率均显著降低，且手术简单，手术创伤较小，治疗护理费用均大大降低；合并全身感染症状的33例患者创面愈合时间长于未合并全身感染症状患者，提示我们抗感染治疗在重度糖尿病足治疗过程中的重要性，但经过胫骨横向骨搬移手术其创面均得以愈合。3、早期手术截骨区域大，术后恢复及佩戴外固定架的时间长，截骨区域易发生骨折。而经过改良后，截骨区域大大缩小，佩戴外固定架时间相25 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文应缩短，骨折发生率下降，而疗效与改良前没有差别。因而重视基础实验中胫骨横向骨搬移术机制的研究，对确定最小截骨面积，促使手术向微创化发展，改善患者的治疗体验，是十分有意义的。4、糖尿病足的治疗需要多学科协作支持，血糖的控制、下肢大中动脉的通畅、一般生命体征的监测、创面的彻底清创引流等对患者耐受手术、降低手术失败风险、促进创面良好愈合、减低溃疡复发率等起着举足轻重的作用。5、了解并及时处理急性血栓栓塞和下肢大中动脉闭塞，加强围术期的准备与监测等，是避免重度糖尿病足患者胫骨横向骨搬移术失败的重要环节；而加强宣教，监测与控制血糖，戒烟，创面清洁换药等，则与避免重度糖尿病足患者术后溃疡复发密不可分。6、重度糖尿病足溃疡创面在经过胫骨横向骨搬移术的治疗后，从大体上和HE染色镜下都可观察到覆盖创面的组织主要是皮肤组织及少量线形瘢痕组织。7、创面愈合受多种因素影响，胫骨横向骨搬移术促进重度糖尿病足创面愈合的机制需要我们继续进一步探索，本研究中我们主要尝试对手术前后巨噬细胞及表皮干细胞在创面处组织的分布及作用在第二部分进行探索研究。26 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文第二部分重度糖尿病足创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究2.1材料2.1.1标本收集征求患者同意及临床伦理委员会许可后，在广西医科大学第一附属医院骨关节外科2017年12月～2018年1月入院的重度糖尿病足患者行胫骨横向骨搬移，创面清创手术过程中切取其创面边缘处皮肤组织10例，大小约1cm×0.5cm×0.3cm，经10%福尔马林固定4～8小时，冲洗、脱水、石蜡包埋、切片后备用。以及第一部分中术后1月患者创面愈合边缘处组织的石蜡切片。2.1.2试剂新制0.01MPH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）、新制的3%过氧化氢溶液（H2O2）、新制0.01mol/LPH6.0柠檬酸盐缓冲液、EDTA抗原修复液、兔抗人CD86单克隆抗体（原液，Abcam）、兔抗人CD163单克隆抗体（原液，Abcam）、鼠抗人Ki-67单克隆抗体（工作液，中杉金桥）、鼠抗人CK19单克隆抗体（工作液，GT）、免疫组化染色试剂盒（中杉金桥，内含：10mL/kit封闭用正常羊血清原液、生物素标记羊抗兔IgG、生物素标记羊抗鼠IgG、1mL/kit辣根酶标记链霉卵白素原液）、一抗稀释液（碧云天）、二抗稀释液（碧云天）、苏木素溶液、双蒸水、蒸馏水、盐酸、中性树胶、二氨基联苯（Diaminobenzidine,DAB）、二甲苯、梯度浓度酒精（75%、80%、90%95%、100%）、氯化钠（NaCl）、磷酸一氢钠（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）、枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）、枸橼酸（C6H8O7·H2O）、硫酸铝钾、氧化汞、冰醋酸、碳酸锂粉剂。2.1.3实验溶液配制27 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：氯化钠NaCl36.0g磷酸一氢钠Na2HPO4·12H2O24.0g磷酸二氢钠NaH2PO4·2H2O1.6g双蒸水400ml加热，充分溶解后，加入双蒸水以500ml容量瓶定容，国产0.22μm或0.4μm的滤膜过滤，常温使用2周。若-4℃保存，则需加温溶解后使用。0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液配制：枸橼酸三钠C6H5Na3O7·2H2O3.0g枸橼酸（柠檬酸）C6H8O7·H2O0.4g双蒸水900ml加热，充分溶解后，加入双蒸水以1000ml容量瓶定容，0.22μm或0.4μm的国产滤膜过滤，常温使用2周。若-4℃保存，则需加温溶解后使用。苏木素染液的配制：苏木素1g无水酒精10ml硫酸铝钾20g氧化汞0.5g冰醋酸8ml蒸馏水200ml溶解后，最好储存半年以上，0.4μm国产滤膜过滤后使用。1%盐酸酒精分化液配制：浓盐酸0.5～1.0ml75%酒精99ml28 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文按此比例配制约200~300ml，置洗涤缸中使用。返蓝液配制（饱和碳酸锂溶液）：蒸馏水200～300ml，在常温下少量逐步加入碳酸锂粉末，直至溶解不了，形成饱和溶液，上清液经0.4μm国产滤膜过滤后使用。2.1.4仪器恒温箱、塑料切片架、生物显微镜（OLYMPUSCX21）、一次性吸管、粘附载玻片（江苏世泰）、盖玻片（泡酸处理）、镊子、计时器、切片盒、高压锅、电磁炉、微波炉、免疫组化笔、移液枪（1ml、200ul、10ul）、枪头（1ml、200ul、10ul）、枪头盒（1ml、200ul、10ul）、染液缸（苏木素）、洗涤缸（脱蜡、脱水与水化，约16~20个）、湿盒（2~4个）、洗耳球（2个）、镜头纸等。2.2操作步骤（1）前期处理:脱蜡前将组织切片放入60℃恒温箱中烘烤20分钟（2）脱蜡及水化:将组织切片浸入二甲苯Ⅰ10分钟，接着二甲苯Ⅱ10分钟，随后二甲苯Ⅲ5分钟。然后转入无水乙醇5分钟，95%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，70%乙醇2分钟，蒸馏水5分钟。（3）抗原修复：将准备滴加CD86和CD163单克隆抗体的切片放入0.01mol/LPH6.0柠檬酸盐缓冲液中，准备滴加Ki-67和CK19单克隆抗体的切片放入EDTA抗原修复液中，放入不锈钢压力锅中加热至沸腾盖锅压阀计时5分钟；切片冷却至室温（不可将切片从缓冲液中取出冷却，避免蛋白恢复至原有的空间构型）（4）PBS冲洗3次，每次2分钟，用免疫组化笔在组织周围画上圈，圈可画得较大一些。（5）消除内源性过氧化物酶的活性：加入新鲜配制的3%的过氧化氢溶液,37℃下15分钟。（6）PBS冲洗3次，每次2分钟。29 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文（7）封闭液封闭：加入5～10%正常山羊血清（10mL/kit封闭用正常羊血清原液，蓝色液体，用PBS稀释，与二抗来源一致）封闭，放入湿盒中室温孵育10～30分钟。（8）滴入一抗孵育:甩去血清，勿洗，用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的兔抗人CD86单克隆抗体（1:500）、兔抗人CD163单克隆抗体（1:500）、鼠抗人Ki-67单克隆抗体（工作液）、鼠抗人CK19单克隆抗体（工作液）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，冰箱中取出后需37℃复温45分钟。（9）将一抗倒掉并用PBS洗5次，每次5分钟，必要时可在PBS中加入吐温20以加强洗脱效果。（10）二抗孵育：用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的生物素标记羊抗兔IgG或生物素标记羊抗鼠IgG（1:100，试剂B，黄色液体），用洗耳球吹打均匀后放入37℃恒温烤箱中15分钟。（11）PBS洗3次，每次2分钟。（12）滴加辣根酶标记链霉卵白素稀释液（1:100，试剂C，橙色液体），37℃孵育15分钟。（13）PBS洗3次，每次2分钟。（14）DAB显色：滴入DAB显色1～2分钟。镜下控制显色，胞膜或胞核呈深棕色即可。（15）PBS漂洗2次，每次5分钟。（16）复染：苏木素复染1～3分钟，自来水浸泡。（17）浸入盐酸酒精分化液中数秒至数十秒，自来水浸泡2～3分钟，甩干（分色效果）。（18）浸入返蓝液中数秒，自来水浸泡2～3分钟，甩干（可使细胞核着色紫蓝色更鲜艳）。（19）自来水浸泡数分钟。30 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文（20）梯度酒精脱水：75%、90%、95%、100%乙醇溶液浸泡，每次1～2分钟；二甲苯透明。（21）封片：滴中性树胶，盖玻片封片。（22）显微镜下观察染色结果。（23）染色分析：采用过氧化物酶标记的链霉卵白素染色方法形成底物，在滴加DAB显色剂后，过氧化物酶可与底物发生反应，CD86阳性组织胞膜可被染成棕色，CD163阳性组织细胞的胞膜可被染成棕色，Ki-67阳性组织胞核可被染成棕色，CK19阳性组织胞浆可被染成棕色。（24）运用Imageproplus6.0图片分析软件对所采集图像中CD86、CD163阳性像素点数量进行统计，计算出光密度（IOD）。注意事项:（1）脱蜡要彻底，如果室温较低时脱蜡可在37℃的温箱中进行或适当延长脱蜡时间。（2）应根据一抗的具体要求选择相应的抗原修复方法。除常用的酶消化法外，目前采用微波、高压加热法HIER等。热修复后一定要待工作液冷却后才能将切片从工作液中取出，以便蛋白质恢复到自然结构，保证特异性表达的出现。（3）为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。（4）显色时间可在1～15分钟，如室温较高，时间应缩短；室温较低，则应相应延长一些时间，但也不可超过15分钟，否则背景上色。显色时一定要在显微镜下控制，避免阳性物染色过浅及背景染色过深。2.3统计学方法所有数据应用SPSS22.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±S）表示，比较选用独立样本t检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。31 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文2.4结果CD86及CD163免疫组化染色情况见图2-1，CD86阳性细胞主要分布于表皮层，CD163阳性细胞主要分布于真皮层，且术后1月CD86阳性细胞及CD163阳性细胞分布均明显较术前减少。10例术前患者M1/M2比值为4.072±0.502，10例术后1月患者M1/M2比值为3.098±0.548，P＜0.05，差异有统计学意义（表2-1，图2-2）。400倍镜下阳性细胞计数见表2-2及图2-3,术前患者400倍镜下CD86阳性细胞计数为156.270±33.034，CD163阳性细胞计数为39.900±11.120；术后1月患者CD86阳性细胞计数为73.930±15.065，CD163阳性细胞计数为28.950±8.774，术后患者CD86阳性细胞及CD163阳性细胞分布均较术前减少，P＜0.05，差异有统计学意义。Ki-67免疫组化染色情况见图2-4，术前患者Ki-67阳性细胞主要分布在表皮层，且只有1～2层细胞；术后1月患者Ki-67阳性细胞在表皮层处增厚，且在真皮层亦呈散在群性分布；有1例术后创面愈合欠佳的病例术后1月Ki-67阳性细胞分布与术前基本一致。CK19免疫组化染色情况见图2-5，CK19阳性细胞主要在真皮层呈管状或团状分布，术后明显较术前增多。32 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文术前33 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文术后1月34 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文图2-1重度糖尿病足患者手术前后CD86和CD163免疫组化染色情况A,B,C.术前CD86免疫组化染色情况（40×、100×、400×）:CD86阳性细胞主要集中在表皮层D,E,F.术前CD163免疫组化染色情况（40×、100×、400×）:CD163阳性细胞主要集中在真皮层G,H,I.术后1月CD86免疫组化染色情况（40×、100×、400×）J,K,L.术后1月CD163免疫组化染色情况（40×、100×、400×）M,N,O.术前HE染色情况（40×、100×、400×）P,Q,R.术后1月HE染色情况（40×、100×、400×）Fig.2-1ImmunohistochemicalstainingofCD86andCD163inseverediabeticfootpatientsbeforeandafteroperationA,B,C.PreoperativeimmunohistochemicalstainingofCD86（40×,100×,400×）:CD86-positivecellsaremainlyconcentratedintheepidermis.D,E,F.PreoperativeimmunohistochemicalstainingofCD163（40×,100×,400×）:CD163-positivecellsaremainlyconcentratedinthedermis.G,H,I.1-monthpostoperativeimmunohistochemicalstainingofCD86（40×,100×,400×）J,K,L.1-monthpostoperativeimmunohistochemicalstainingofCD163（40×,100×,400×）M,N,O.PreoperativeHEstaining（40×,100×,400×）P,Q,R.1-monthpostoperativeHEstaining（40×,100×,400×）35 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文表2-1重度糖尿病足患者手术前后M1/M2变化情况术前术后1月4.34203.37513.96753.36474.41353.33714.95483.59933.57473.50873.47392.89234.06593.70414.38342.13274.22082.31653.32312.7502平均4.072±0.5023.098±0.548图2-2重度糖尿病足患者手术前后M1/M2变化情况Fig.2-2ChangesofM1/M2inpatientswithseverediabeticfootbeforeandafteroperation36 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文表2-2重度糖尿病足患者手术前后M1及M2细胞计数变化情况术前术后1月M1M2M1M2210.355.367.331.7161.345.087.338.0137.734.098.738.7144.042.394.738.0124.736.774.026.7177.739.353.015.3145.029.771.031.7208.060.366.720.7112.726.758.316.7141.329.768.332.0平均156.270±33.03439.900±11.12073.930±15.06528.950±8.774术前术后1月M1M2图2-3重度糖尿病足患者手术前后M1及M2细胞计数变化情况Fig.2-3ChangesofM1andM2cellscountsinpatientswithseverediabeticfootbeforeandafteroperation37 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文38 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文GHI图2-4重度糖尿病足患者手术前后Ki-67免疫组化染色情况A,B,C.术前Ki-67免疫组化染色情况（40×、100×、400×）：Ki-67阳性细胞主要集中在表皮基底层细胞且只有约一两层D,E,F.术后1月Ki-67免疫组化染色情况（40×、100×、400×）：Ki-67阳性细胞在表皮基底层处增厚，且在真皮层也有散在群性分布G,H,I.术后1月疗效欠佳病例Ki-67免疫组化染色情况（40×、100×、400×）：Ki-67阳性细胞分布与术前基本一致Fig.2-3ImmunohistochemicalstainingofKi-67inseverediabeticfootpatientsbeforeandafteroperation39 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文A,B,C.PreoperativeimmunohistochemicalstainingofKi-67（40×,100×,400×）:Ki-67positivecellsweremainlyconcentratedintheepidermalbasalcellswithonlyaboutoneortwolayers.D,E,F.1-monthpostoperativeimmunohistochemicalstainingofKi-67（40×,100×,400×）:Ki-67positivecellsthickenedatthebasallayeroftheepidermisandalsoscattereddistributionsinthedermis.G,H,I.1-monthpostoperativeimmunohistochemicalstainingofKi-67inpatientswithpoorefficacy（40×,100×,400×）:ThedistributionofKi-67positivecellsisbasicallyconsistentwithpreoperative40 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文图2-5重度糖尿病足患者手术前后CK19免疫组化染色情况A,B,C.术前CK19免疫组化染色情况（40×、100×、400×）D,E,F.术后1月CK19免疫组化染色情况（40×、100×、400×）：CK19阳性细胞主要在真皮层发现，成管状或团状分布，术后较术前增多Fig.2-4ImmunohistochemicalstainingofCK19inseverediabeticfootpatientsbeforeandafteroperationA,B,C.PreoperativeimmunohistochemicalstainingofCK19（40×,100×,40×）D,E,F.1-monthpostoperativeimmunohistochemicalstainingofCK19（40×,100×,400×）:TheCK19-positivecellsweremainlyfoundinthedermisanddistributedintubularorlumps.ThepostoperativeCK19-positivecellsweremorethanthoseinpreoperation.41 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文2.5讨论2.5.1不同巨噬细胞亚型的研究及对创面愈合的意义巨噬细胞是外周血中的单核细胞进入组织定居后分化而来，是机体重要的免疫细胞：其可吞噬、杀灭细菌等病原微生物，提呈抗原激活机体特异性免疫，清除机体衰老死亡细胞，分泌炎性或细胞因子调节机体免疫反[19，20]应与组织修复等。最初，巨噬细胞极化的定义为：在机体受到外界刺激后，T细胞进行应答，招募而来的巨噬细胞会产生出不同的功能和细胞表[21-23]型。现在则是指巨噬细胞在不同微环境的影响下，巨噬细胞的吞噬能力、抗原提呈能力、细胞因子的分泌能力等发生改变，形成了具有不同功能的巨噬细胞亚群，因而又可称之为巨噬细胞表型转换或重新编程,主要包括经[24]典活化型（M1型）巨噬细胞和替代活化型（M2型）巨噬细胞。M1型巨噬细胞是在受到脂多糖（lipoplysaccharides，LPS）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等刺激时由巨噬细胞转化而来，能被CD25、CD68、CD80、CD86、Toll样受体-4（(tolllidereceptor-4，TLR-4）、胶原样结构巨噬细胞受体（macrophagereceptorwithcollagenousstructure，MARCO）等识别，其可以分泌TNF-α、IL-1、IL-6、含氧自由基等炎症因子，因而具有很强的抗菌、杀菌功能，并可增强局部的炎症反应，从而发挥抗原提呈、吞噬杀灭病原微生物的作用；同时这些炎症因子所形成的微环境可正反馈作用于未极化巨噬细胞（M0），促进其向M1型巨[25]噬细胞极化。M2型巨噬细胞则是在M0细胞受到TGH-β、IL-4、IL-10、IL-13等抗炎因子刺激时极化而来，能被CD163、CD209、SR-A、甘露醇受体、FIZZ1（foundininflammatoryzone1）等识别，分泌IL-10、VEGF、类几丁质酶3（chitinase3-like3，Ym1）、精氨酸酶1（arginase1，Arg1）等抗炎因子和细胞因子，从而调节抑制局部炎症反应，促进组织的再生修复和创面的愈合；同样地，这些抗炎因子和细胞因子也可正反馈作用于M0型巨42 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文[26，27]噬细胞，促进其转化为M2型巨噬细胞。M2型巨噬细胞可进一步分为3个亚型：M2a、M2b、M2c。因此巨噬细胞极化在难愈性慢性溃疡修复的整个过程中都发挥着重要的作用。在慢性溃疡创面感染、创伤愈合的早期阶段，巨噬细胞主要极化为M1型巨噬细胞，分泌炎症因子，提呈抗原，诱导Th1和Th17反应，从而激活机体固有免疫和特异性免疫，杀灭侵入机体的病原微生物，控制感染。M1型巨噬细胞促进炎性反应在最初抵御病原体入侵是有积极作用的，但其分泌的活性氧自由基、活性氮等，以及激活的Th1、Th17细胞若长期存在则会对周围正常组织造成损伤，因此若炎症反应不能得到控制，可能会导致疾病发生或加重原有病情。为避免M1型巨噬细胞促进炎症反应对自身组织造成杀伤，需要其在感染得到控制后转化为M2型巨噬细胞以利于组织损伤的修复。M2型巨噬细胞可调节炎症反应，促进组织的修复、血管的再生及纤维化。其促进组织修复基本过程为吞噬作用，细胞因子及生长因子的分泌，细胞外基质重塑。M2型巨噬细胞可增加转化生长因子-β（TGF-β）产生，从而促进纤维母细胞胶原蛋白的产生；同时可以直接合成某些ECM，如：纤[28]维粘连蛋白、βIG-H3、Ⅳ型胶原蛋白等。ECM是组织再生的影响因素之一，其作用主要有：①把组织细胞连接在一起；②支撑和维持组织的生理结构和功能；③影响细胞的形态、分化、迁移、增殖和生物学功能。因而在炎症恢复阶段，巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，抑制炎症反应，诱导Th2反应，参与组织损伤的修复及愈合，促进组织再生。组织再生受两种细胞的生理调节，一种为免疫细胞，而巨噬细胞是典型的免疫细胞，在炎症过程中起着核心的作用：迁移至炎症发生部位，清除死亡细胞，并调节随后的炎症或伤口愈合过程；另一种是与组织再生有关的细胞，如几乎存在于机体所有组织中的间充质干细胞通过分化为几种细胞谱系来诱导组织再生。因此，巨噬细胞与间充质干细胞间的协作对于43 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文调节组织再生的过程至关重要。有研究证明，间充质干细胞自己可产生抗炎物质来调节炎症过程，其在受LPS刺激的巨噬细胞影响下可分泌IL-10，促进M2型巨噬细胞的转化；巨噬细胞和间充质干细胞共培养可抑制促炎细胞因子的产生，但增强了抗炎因子的产生。Kim等应用间充质干细胞募集剂间质衍生因子（SDF-1）和巨噬细胞募集剂磷酸鞘氨醇-1受体激动剂（SEW2871）制备成水凝胶，通过体外实验和体内实验来评估体内间充质干细胞和巨噬细胞募集对小鼠皮肤创伤模型组织再生的影响。体外实验发现，在存在SDF-1的情况下增加SEW2871的量，巨噬细胞迁移可得到增强，但无论SEW2871的量如何，间充质干细胞的迁移都受SDF-1的促进；体内实验发现，在SDF-1联合0.4mgSEW2871胶束的情况下可募集到最大量的间充质干细胞和巨噬细胞，与体外实验结果不相匹配，认为可能是由于体内存在许多复杂的信号，但是间充质干细胞和巨噬细胞对调节巨噬细胞表型和细胞因子产生的作用在体外和体内是一致的。并且，单纯SEW2871作用可不断诱导M1型巨噬细胞的募集，而SDF-1和SEW2871共同作用时，在1天内与单纯SEW2871作用相似，大量招募了M1型巨噬细胞；而第3天开始，M1巨噬细胞数量减少而M2型巨噬细胞数量增多，表明M1型和M2型巨噬细[29]胞与皮肤组织再生具有时间相关性。然而，M2型巨噬细胞调节组织修复的机制仍需我们进行进一步的探索。2.5.2巨噬细胞亚型与糖尿病及糖尿病足糖尿病足是糖尿病患者因体内高血糖状态及自身免疫力下降而合并神经病变及各种不同程度的末梢血管病变，导致下肢感染、溃疡形成和深部组织的坏死。巨噬细胞的极化在糖尿病的产生、足部创面慢性炎症反应以及糖尿病足创面难愈等方面均有作用。有研究发现，脂肪组织中浸润着脂肪组织巨噬细胞（adiposetissuemacrophages，ATMs），而在肥胖的个体中，ATMs高表达IL-1β、IL-6、诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS）、TNF-α44 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文等促炎因子，具有M1型巨噬细胞的特征，而由M2型巨噬细胞分泌的抗炎因子减少，导致胰岛素抵抗和2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）的发生；而非肥胖的个体中，ATMs高表达IL-10、Ym1、Arg1等由M2巨噬细胞分泌的抗炎因子，拮抗由TNF-α等促炎因子引起的胰岛素抵抗[30，31][32]。同时，Fujisaka等经研究发现，M1型巨噬细胞计数的升高及M1/M2比值的异常升高与胰岛素抵抗的发生与发展息息相关，最终导致T2DM的发生。因此，通过调节巨噬细胞极化在糖尿病，特别是2型糖尿病的治疗领域是一个可以尝试的新领域，可从源头避免糖尿病足的发生，对糖尿病足患者手术前后血糖的控制也十分有意义。由于周围神经血管病变，并且足部由于处在远端且血管分布不如机体其他部位丰富，糖尿病患者易出现足部的缺血性坏死和溃疡及细菌等病原微生物的感染，导致糖尿病足的发生。同时，由于糖尿病患者免疫力低下，足部滋生的病原微生物难以清除，导致局部溃疡创面炎症反应持续存在而迁延为慢性炎症，因此DFU表现出炎性细胞因子表达增加的慢性促炎性表型，其愈合不遵循正常组织愈合的系统顺序；而且，内外毒素可经血进入人体，导致患者出现全身感染症状、脓毒血症、甚至感染性休克。在慢性炎症反应中，巨噬细胞取代中性粒细胞成为炎症细胞的主要组成部分，因病原微生物的不断刺激，巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，从而杀灭病原微生物，抑制感染。但因病原微生物无法被彻底清除，M1巨噬细胞可长期存[33]在。Mirza等发现，在人和小鼠的糖尿病伤口组织样品中炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）增加，而抑制IL-1β途径可诱导巨噬细胞从促炎型转变为修复型，使得小鼠的伤口得到改善；而在人类受试者中，高水平的IL-1β，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）与糖尿病足创面难以愈合有关。同时，M1型巨噬细胞分泌的活性氮、活性氧以及其诱导的Th1和Th17反应亦会对自身组织造成损伤，加重足部溃疡及坏死。因此，控制糖尿病足溃疡坏死创面处的炎症反应，使其在保证杀灭病原微45 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文生物，控制感染的同时，减少对机体自身组织的损伤，从而促进糖尿病足感染创面的愈合。糖尿病足溃疡与坏死创面的迁延不愈除与M1型巨噬细胞分泌和诱导的促炎因子和Th1、Th17反应对创面周围组织造成损伤有关外，还与生长因子的破坏及生成减少、血管再通或再生障碍、皮肤屏障功能损害、肉芽组织质量与数量的异常、胶原沉积、表皮神经数量减少、角质形成细胞以及[34-38]成纤维细胞迁移和增殖的减弱等有关，而M2型巨噬细胞分泌的抗炎因子及细胞因子和诱导的Th2反应可介导炎症的促炎反应期向炎症反应的细胞增殖期转变，从而使创面破损愈合，组织修复与再生。长久以来一直认为，伴随着炎症阶段的结束及愈合时的“组织形成”阶段的开始，伤口处的巨噬细胞表型从促炎症表型（通常以小鼠中的Ly6CHi细胞为特征;人类中的CD14+CD16-细胞;在功能上以炎性细胞因子群为特征）转换为抗炎症表型（典型地以小鼠中的Ly6CLo细胞为特征;人类中的CD14+CD16+细胞为功能性;在功能上以抗炎细胞因子群为特征）。但是，在2型糖尿病中，这种巨噬细胞的功能/表型转换不容易发生，且巨噬细胞主要保持在促炎症状态并且发生着慢性炎症，导致糖尿病足患者溃疡坏死[39，处巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞不足，炎症反应期无法顺利转为增殖期40]。因此，控制糖尿病足创面处的炎症反应，促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，分泌更多量的生长因子，是可以考虑的加速创面愈合的治疗方法。经大体观察及HE染色后镜下观察我们发现应用胫骨横向骨搬移术治疗重度糖尿病足患者后，其原有创面被皮肤组织覆盖而非大量疤痕组织填充，是典型的组织再生现象。而巨噬细胞，特别是M2型巨噬细胞与组织损伤的修复与再生密切相关。因此我们考虑胫骨横向骨搬移术促进了创面处巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，使原有的巨噬细胞极化失衡重归平衡。在免疫组化实验中我们选用CD86标记M1型巨噬细胞，用CD163标记M2型巨噬细胞，在高倍视野下（400×）对阳性细胞进行计数，并应用Image46 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文proplus6.0图片分析软件对免疫组化染色的切片中CD86阳性细胞和CD163阳性细胞的像素点进行采集分析，半定量测出胫骨横向骨搬移术前与术后1月患者M1/M2的变化，结果发现术后1月患者愈合组织处的M1和M2细胞计数及M1/M2相较于术前明显降低，可以认为胫骨横向骨搬移术后1月时炎症反应已由不可控转变为可控，并且手术促进了重度糖尿病足患者体内巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，从而促进了其创面处溃疡的愈合。前面已经提到，间充质干细胞可产生抗炎因子（如IL-10）调节炎症反[14]应，而IL-10可促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。武黎黄英等对经胫骨横向骨搬移术术前、术后1月和术后3月的重度糖尿病足患者外周血单个核细胞提取和培养及血清中SDF-1含量测定后发现，术后机体内循环的干细胞含量水平和SDF-1含量均显著高于术前，考虑是胫骨横向骨搬移术促进了间充质干细胞的募集，而间充质干细胞可促进巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞，在两者之间协同作用下糖尿病足患者的创面得以较快愈合。综上所述，巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞增多而M2型巨噬细胞减少的巨噬细胞极化失衡是导致糖尿病，特别是2型糖尿病，以及糖尿病足创面溃疡迁延不愈的重要因素，而胫骨横向骨搬移术通过促进巨噬细胞极化平衡的重建从而促使重度糖尿病足的创面得以愈合。2.5.3表皮干细胞与创面愈合表皮干细胞是皮肤组织的特异性干细胞，其不仅维持着皮肤正常新陈代谢，也是皮肤组织和皮肤附属器发生、修复和改建的关键，促进表皮干细胞的增殖与分化，会使创面由解剖修复向功能修复成为可能。在哺乳动物的表皮中，包含两种特征明显的终末分化途径，其终点分别为毛干细胞和最外面的角膜间表皮层。在正常稳态条件下，存在着维持每个谱系的不同干细胞群体。然而，当表皮受损时，毛囊角质形成细胞可以在裸露的滤泡间基底膜上迁移以重新填充滤泡间表皮；相反，当毛囊间角质形成细胞移植到与真皮乳头细胞接触的空毛囊时，它们则能够形成毛干。这表明表47 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文皮干细胞是双能性的，它们也可能与其他表征较差的表皮区分如汗腺有关[41-43][44]。付小兵等通过对比应用重组人表皮生长因子和未使用重组人表皮生长因子治疗腿部溃疡发现，在正常表皮中，表皮干细胞在基膜中形成单层，体内表皮干细胞组成了1%～10％的基底层，且应用了重组人表皮生长因子的病例表皮干细胞更多，特别是在rete脊（延伸到真皮中的表皮投影）处。表皮干细胞可以通过其最重要的特征来识别——慢细胞周期和高增殖[44，45]潜力，并且其可被β1整合素、CK10、CK19等单克隆抗体标记，本研究中我们用CK19来标记胫骨横向骨搬移术前及术后1月的重度糖尿病足患者创面边缘处组织中的表皮干细胞，对比手术前后CK19的免疫组化染色情况以比较手术前后表皮干细胞的变化。免疫组化实验中我们发现手术前后各5例患者创面边缘切片的CK19染色阳性细胞主要在真皮层内呈管状或团状分布，CK19不仅可标记表皮干细胞，其亦在腺体细胞中表达，临床上可用于腺癌（主要为肺腺癌等）的检查。而Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，其在细胞增殖中是不可缺少的。因此，在真皮层组织中发现有CK19阳性细胞呈管状分布，我们认为此处为汗腺等腺体组织。术后CK19阳性细胞和Ki-67阳性细胞分布明显较术前增多，表明术后患者创面处细胞增殖活跃；并且，术后创面恢复欠佳病例的Ki-67阳性细胞分布与术前基本一致，表明其术后创面处细胞无明显增殖反应，据此，可以认为胫骨横向骨搬移术促进了表皮干细胞的增殖而促进了创面的愈合；而发现腺体结构则表明创面在术后被皮肤组织覆盖。2.5.4本研究的不足与展望本研究对胫骨横向骨搬移术治疗重度糖尿病足手术前后巨噬细胞亚型和表皮干细胞分布的变化进行了探索，初步明确了胫骨横向骨搬移术可促进巨噬细胞极化重新平衡及表皮干细胞的增殖，从而促使糖尿病足患者溃疡处炎症反应得到控制、创面损伤得以修复这一机制。48 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文但是巨噬细胞极化受多种信号通路的调控，如：PI3K/Akt、氨基末端蛋白激酶(C-JunN-terminalkinases，JNK)、JAK/STAT、Notch、TLR/NF-κB以及TGF-β/SMA等信号途径。因胫骨横向骨搬移手术部位与足部创面是相隔较远的两部位，故而我们认为胫骨横向骨搬移术治疗重度糖尿病足是一个全身性的反应，必然涉及信号通路的激活而促使组织细胞迁移至创面后增殖促进创面的修复与愈合。那么胫骨横向骨搬移术激活了上述哪些信号通路，通过何种方式来激活这些信号通路，激活信号通路的是何因子等都是我们可以继续深入研究的。并且，胫骨横向骨搬移手术治疗重度糖尿病足的机制是多方面的，可能涉及干细胞的迁移分化、巨噬细胞的极化、组织再生等多种领域。可以预见的是，当这些机制被一一探索揭示出来，将会对指导我们手术的改良、降低患者手术痛苦、缩短创面愈合的时间、改善患者的治疗体验等方面具有重大意义。2.6结论1、巨噬细胞可极化为M1型和M2型巨噬细胞，在机体创面处局部炎症反应的整个过程中发挥重要作用：早期M1巨噬细胞发挥抗感染的促炎作用，杀灭病原微生物；感染得到控制后M2型巨噬细胞分泌抗炎因子和细胞因子，拮抗炎症反应，促进创面的愈合。2、巨噬细胞极化失衡是导致糖尿病，特别是2型糖尿病发生和糖尿病足发生及其创面处迁延不愈的重要原因，因慢性炎症存在，巨噬细胞主要极化为M1型巨噬细胞并长期在创面处存在，其分泌的促炎因子在抗感染的同时会对自身组织造成损伤，导致胰岛素抵抗及难愈性慢性溃疡创面的迁延不愈。3、胫骨横向骨搬移术后巨噬细胞计数及M1/M2比例较术前降低，表明术后炎症由不可控变为可控，并且其促进了巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞，重建了巨噬细胞极化的平衡，从而促进重度糖尿病足患者创面处溃疡的愈49 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文合。4、胫骨横向骨搬移术促进了表皮干细胞功能的增殖与分化，从而促进重度糖尿病足创面的愈合。而CK19阳性细胞在取材组织中呈管状分布则表明组织中存在腺体，证实了覆盖创面的组织为皮肤组织。5、巨噬细胞的极化及表皮干细胞的增殖受到多种信号通路调控，胫骨横向骨搬移术激活了哪些通路目前仍尚不明确，值得我们进一步去深入研究。6、胫骨横向骨搬移术治疗重度糖尿病足的机制是多方面而复杂的，在其被明确后，我们有理由相信手术方式将得以改良，治疗时间将得以缩短，患者的治疗体验将得以改善。50 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文参考文献[1]InternationalDiabetesFederation.IDFDiabetesAtlas-7thEdtion[EB/OL].http://www.diabetesatlas.org,2017-08-06.[2]SuhHS,OhTS,LeeHS,etal.ANewApproachforReconstructionofDiabeticFootWoundsUsingtheAngiosomeandSupermicrosurgeryConcept[J].Plastic&ReconstructiveSurgery,2016,138(4):702e.[3]DriverVR,FabbiM,LaveryLA,etal.Thecostsofdiabeticfoot:Theeconomiccaseforthelimbsalvageteam[J].JournaloftheAmericanPodiatricMedicalAssociation,2010,52(3):17S-22S.[4]VågesjöE,ÖhnstedtE,MortierA,etal.Acceleratedwoundhealinginmicebyon-siteproductionanddeliveryofCXCL12bytransformedlacticacidbacteria[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2018,115(8):1895-1900.[5]Ji-XiangYU,FanLL,YuLI.AnalysisofDiabeticFootGangrenePatientswithLowerExtremityArterialInterventionalTreatmentIndicationsofOcclusion[J].DiabetesNewWorld,2016.[6]ShuX,ShuS,TangS,etal.Efficiencyofstemcellbasedtherapyinthetreatmentofdiabeticfootulcer:ameta-analysis.[J].EndocrineJournal,2018.[7]RosenblumBI.ARetrospectiveCaseSeriesofaDehydratedAmnioticMembraneAllograftforTreatmentofUnresolvedDiabeticFootUlcers.[J].JournaloftheAmericanPodiatricMedicalAssociation,2016,106(5):328.[8]毛启东,张喜婷,吴丹.经皮血管球囊成形术联合支架植入术治2型糖尿病足病的临床分析[J].重庆医学,2017(A02):212-213.[9]ArmstrongDG,AjmB,BusSA.DiabeticFootUlcersandTheir51 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重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文综述骨搬移技术的应用进展与前景骨搬移（bonetransport）技术，自1989年由Ilizarov提出后，便以其可治愈大部分棘手的难治性骨科疾病的独特魅力，迅速在世界各国得以推广开展。按搬移部位，骨搬移技术可分为：胫骨骨搬移、股骨骨搬移、腓骨骨搬移等；按搬移方向与肢体长轴的位置关系，可分为：纵向骨搬移和横向骨搬移。目前，骨搬移技术主要用于治疗骨折、骨感染、骨缺损、骨不连、肢体畸形、下肢缺血性疾病等，现将不同疾病的骨搬移技术治疗汇总如下。1.骨折的治疗骨折的治疗原则可概括为复位、固定、早期功能锻炼，在骨折的各种治疗方式中，Ilizarov骨搬移技术不仅可单纯当做外固定架对骨折部位进行固定，还可早日进行功能锻炼，并通过随时对外固定架进行调整以达到复位和促进骨折愈合的效果。具有外科干预少、组织损伤小、出血量少、[1-6]术后护理简单的优点，降低了骨折后并发症的发生率。同时，根据对Ilizarov骨搬移技术的应用，诸如单边外固定架、手部迷你外固定器、锁定钢板和髓内钉、Taylor架、Orthofix外固定器等多种器械的出现以及多种工具的联合使用使得骨折的治疗向微创化、简易化、[7-13][14]智能化的方向发展。Rodriguez-Collazo等通过联合应用骨搬移技术、浓缩骨髓穿刺细胞、富血小板血浆以达到缩短双踝骨折愈合时间，较单纯[15]运用Ilizarov骨搬移技术治疗骨折平均愈合时间缩短8周；Popkov等通过在胫骨干骨折犬模型上联合应用骨搬移技术和弹性髓内钉治疗骨折，治愈时间上亦少于单纯应用骨搬移技术。58 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文2.骨感染的治疗目前我国骨感染的发生率呈上升趋势。骨感染常由外伤后引发病原微生物侵入骨等组织中并增生繁殖而导致。当感染进入关节腔内，或迁延为慢性炎症等时，则导致形成化脓性关节炎、慢性骨髓炎等难治性骨感染的出现。骨感染，特别是难治性骨感染具有复发率高、窦道形成、骨组织内死腔难愈、严重瘢痕形成、致残率高甚至危及生命等特点，成为骨科医生[16,17]颇为头痛的疾病。骨感染的治疗包括清创后灌注冲洗、抗生素骨水泥置入、VSD等，清创时往往因顾虑去除过多组织导致骨缺损、骨不连等而存在[18,19]未彻底清创、创面愈合不佳、易复发，疗效不佳等不足。Ilizarov骨搬移技术促进骨等组织再生使得上述难题迎刃而解，术中彻底清创后行骨搬移术可有效降低骨感染的复发率，并且手术简单，术后便于护理，患者痛苦小，大大提高了骨感染，特别是难治性骨感染的治愈率。3.骨缺损的治疗骨缺损易发生于：①高能损伤后，诸如四肢粉碎性开放性骨折后；②开放性损伤导致骨等组织的严重感染，术中不得不为彻底清创而摘除较多骨块；③慢性骨髓炎、骨坏死术中清除过多的坏死骨后；④易复发的骨肿瘤行根治性瘤段切除术后等。自体松质骨移植作为治疗局部骨缺损的金标[20]准，存在术后感染、骨愈合不良、取骨量无法满足大段骨缺损的治疗等不足，使得骨缺损，特别是大段骨缺损成为骨科专业的治疗难题。而通过Ilizarov张力-应力法则，在缺损处的一端或两端截取自体骨段进行搬移，在持续、缓慢的张应力作用下，骨组织得以再生，为大段骨缺损的治疗带来可能，彻底清除病灶及感染组织后行骨搬移术亦已成为目前治疗感染后[21][22]骨缺损的金标准。鲁秀国等对7例胫骨感染后骨缺损患者应用Orthofix单边外固定器进行骨搬移，达到了控制感染，治愈骨缺损的效果。郝光亮、[23,24]魏星等分别对40例和27例胫骨骨折术后感染致大段骨缺损的患者应用环形外固定搬移架和Orthofix单边外固定器治疗，取得了良好的治疗效果，并通过对比后得出环形外固定架利于畸形的矫正，而应用Orthofix外固定59 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文器手术时间短、出血量少、患者耐受性好的结论，从而要求术者需要根据实际情况进行术前严谨设计，术中精细操作，术后耐心随访。近年来我国交通事业发展，交通事故的发生率逐年增高，常导致胫腓骨的开放性、粉碎性骨折，术后易发生胫腓骨的大段骨缺损，而对胫骨骨缺损的骨搬移治疗，搬移方式主要有单向搬移、胫骨双向搬移以及腓骨横向搬移。对胫骨中段的大段骨缺损，应用双向搬移较单向搬移可缩短搬移治疗时间，减轻患者痛苦，但并发症的发生率会提高；对胫骨两端残余不足以行纵向骨搬移时，可应用腓骨横向骨搬移术将腓骨胫骨化，但由于该种方法对软组织损伤大，搬移处不可有感染，且腓骨的支撑能力有限目前[25-29]只有较少尝试。同时，单纯应用骨搬移技术治疗骨缺损的周期较长，易并发断端不愈[30]合、关节活动受限、对线不良、钉道感染、成骨不良等并发症，因而联[31]合应用其他疗法以缩短治疗周期可以降低并发症的发生风险。曹建明等联合应用骨搬移、皮瓣、VSD技术治疗骨缺损的16例患者，骨折愈合时间[32]平均为9.8个月，并发症发生率低，骨折愈合时间短。朴成哲等应用骨搬移术结合骨髓间充质干细胞复合胶原-壳聚糖材料支架对骨缺损兔模型进行实验，尝试将两种方法结合使用后对缺损处的再生修复能力进行评价，之后进行临床研究以期获得更好的治疗效果。4.骨不连的治疗骨不连难以愈合一直是困扰骨科医生的难题。骨搬移术符合“骨科自[33,34][35]然重建理念”，在骨不连的治疗中起到了良好的效果。Khanfour等对19例股骨干感染性骨不连患者的治疗中，通过骨搬移技术在感染得到控制后使得骨性结合率达到94.7％；经过平均3.5年的随访时间后，根据美国足踝外科协会踝-后足评分系统（AOFAS），14例患者完美愈合，3例愈合良[36]好，合格与不合格各1例。Shahid等回顾性研究经过骨搬移术的12例感染性胫骨骨不连患者，平均愈合时间为46周，无一例截肢；根据AOFAS，660 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文例完美，4例良好，2例不合格。5.肢体畸形的治疗肢体畸形可发生于先天遗传性疾病，如：先天性马蹄内翻足、先天性假关节、小儿麻痹后遗症等；亦可发生在后天因素导致的骨与（或）神经损伤后，如：骨折、烧伤、创伤性马蹄内翻足等。由于上述肢体畸形常形成关节挛缩与僵硬，非手术治疗在牵引过程中极易损伤相应挛缩或缩短的肌肉、血管、神经等组织；而单纯的松解术也面临松解范围小疗效不佳，松解范围过大关节活动失稳，松解过程中并发损伤血管、神经等难题。因而应用骨搬移技术，在截骨后通过缓慢、持续的作用将挛缩的关节慢慢牵引拉开，避免了肌肉、血管、神经等软组织的损伤；同时，根据张力-应力法则，在搬移过程中由于力的作用从而促进骨、血管、神经等组织的恢复[37,38]延长与再生重建。先天性马蹄内翻足（congenitalclubfoot,CCF）是小儿骨科最为常[39,40]见的肢体畸形之一，发病率高达1‰以上。自1948年Ponseti法被提出应用于治疗马蹄内翻足以及之后的普及推广，大部分患儿的CCF得以改[41]善甚至治愈。但对于年龄较大，早期非手术治疗失败，或合并神经源性的畸形严重的患儿，传统手术治疗极易带来感染、皮肤难愈性溃疡、肌肉[42,43][44]萎缩与肌力不平衡等并发症。对于该类患儿，张志军等应用Ilizarov技术对243例重度马蹄内翻足患儿进行矫正，术后6~8周后踝关节恢复至中立位，经6个月以上的随访后优良率为91％。Ilizarov技术应用于CCF治疗，具有创口小、费用低、术程短，个性化定制及便于调整，利于足踝[45-47]处各骨正常解剖关系的恢复等优势。6.下肢缺血性疾病的治疗[1,2]Ilizarov等研究证实，在对实验犬模型进行牵拉成骨的过程中，搬移区域丰富的微血管网再生先于成骨发生。受此启发，近年来应用骨横向搬移促进微、小血管再生以治疗肢体，特别是下肢缺血性疾病应运而生。61 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文6.1脉管炎的治疗血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitisobliterans,TAO）亦称Buerger病，为病因未明的血管的炎性、阶段性、反复发作的闭塞性疾病，多侵犯下肢的中、小动脉，临床上以肢端皮温降[48,49]低、间歇性跛行，严重时静息痛、皮肤溃疡并坏疽等为主要表现。以往的内外科治疗主要包括药物，如前列地尔、西洛他唑等，干细胞移植，大[50-55]隐静脉、股浅静脉动脉化，化学性腰交感神经切除术等，取得了一定成效，但存在药物治疗无效、手术时间长、术式复杂、术中易损伤血管神经等软组织等问题。[56]根据张力-应力法则，曲龙等率先于2000年11月开始对1名病程7年的TAO病人尝试运用胫骨横向骨搬移术进行治疗，术中在胫骨中段内前方进行长方形截骨（大小约12cm×2cm），通过对截骨块进行每天1mm的横向搬移，搬移期间患者的间歇性跛行、静息痛、肢体麻木等症状即得以改善，22天后搬移结束后行血管造影时可发现搬移区域周围有丰富微血管网[57]络形成，继续随访3个月未发现已改善症状反弹的现象。花奇凯等亦于2012年4月~2014年1月用上述方法对21例TAO患者（共25肢）行胫骨横向骨搬移的治疗，20例患者的下肢缺血症状得到改善，1例患者因疗效欠佳失去治疗信心至当地医院行小腿中下段截肢手术，术后创面顺利愈合。6.2糖尿病足的治疗糖尿病足（Diabeticfoot，DF）是糖尿病发展过程中一个严重的并发症，根据2015年第7版的IDF糖尿病概览，我国糖[58]尿病（DM）的发病率为10.6%（9.6%～12.9%），而约12%～25%的DM患[59]者会在疾病发展的过程中并发足部的感染、溃疡及坏疽。根据世界卫生组织（WHO）1999年对糖尿病足的定义可知，糖尿病足的发生主要是由于周围神经及足部末梢血管的病变而导致，通常是糖尿病终末期的表现，其治疗非常棘手，以往的内外科治疗手段疗效欠佳，重度糖尿病足的患者往往需要截肢以阻止病情的进一步发展，避免危及生命。自2014年8月至2017年7月，花奇凯等应用胫骨横向骨搬移术治疗62 重度糖尿病足横向骨搬移疗效与创面再生机制中巨噬细胞及表皮干细胞作用研究硕士学位论文重度（Wagner3级及以上）糖尿病足患者共140例，3例患者术后缺血症状无明显改善而截肢，糖尿病足的保肢率达到97.9％。同时课题组内成员首先对其中40例患者的治疗进行总结，所有患者的溃疡均在术后3~8月内[60]痊愈。早期胫骨横向骨搬移手术截骨区域大（12cm×2cm），总戴架时间长达12周，搬移时间需6周，搬移后需再固定6周后才可拆除外固定架，易发生胫骨骨折、皮瓣坏死等并发症；经过长期实践，目前手术改良后截骨区域缩小（5cm×1.5cm），位置上移至胫骨中上1/3处，搬移时间缩短至4周，搬移完成后即可拆除外固定架同时应用下肢护具固定胫骨截骨区域，上述并发症发生率亦有下降，患者所受痛苦减轻，而疗效依然满意。7.展望骨搬移技术为解决许多棘手的骨科难题提供了有力的支持，可以预见未来骨搬移手术在向简易化、微创化、智能化发展。骨搬移术不仅可以用于治疗诸如骨折、骨缺损、骨不连、肢体畸形等骨科疾病，在TAO、DF等下肢缺血性疾病中也取得了良好的效果，拓展了其应用领域，为更多棘手疾病的治愈提供了思路。在TAO、DF的治疗中，骨搬移处与溃疡坏死处是两个远隔的部位，可以设想骨搬移的效应是一个全身性的反应。但其中的机制尚不明确，因而我们也已开始着手于其机制的探索，并有信心能够揭开骨搬移神秘的面纱，从而以基础理论反哺临床工作，达到改良手术，缩短疗程，降低并发症发生率等目的，提高患者的治疗体验。而随着骨搬移手术向微创化发展，在治疗各种难治性疾病的同时，我们更期望其能够成为一种保健性的手术，在一处进行横向骨搬移而达到修复组织损伤、更新新老细胞、提高机体免疫力的目的，最终能够帮助全人类预防恶性疾病，摆脱亚健康状态，延长寿命，成为渗透各学科各领域的治疗手段。63 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