《猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：S852.65学校代码：10712UDC：579.62研究生学号：2014060182密级：公开2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究学科专业：预防兽医学研究方向：分子病原学与免疫学研究生李亮亮指导教师：周恩民教授完成时间：2018年10月中国陕西杨凌 Classificationcode:S852.65Universitycode:10712UDC:579.62Postgraduatenumber:2014060182Confidentialitylevel:openDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018INVESTIGATIONOFTHEINTERATIONBETWEENPRRSVANTI-IDIOTYPEANTIBODYMAB2-5G2ANDMYH9Major:PreventiveVeterinaryMedicineResearchfield:MolecularEtiologyandImmunologyNameofPostgraduate:LiangliangLiAdviser:Prof.En-MinZhouDateofsubmission:October2018YanglingShaanxiChina 本研究由国家自然科学基金重点项目（31430084）提供资助ThisstudywassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31430084) 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9互作的研究摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）感染所致的以母猪流产、死胎或木乃伊胎，同时导致育肥猪和仔猪呼吸障碍的高度传染病。目前，PRRS仍在全球大部分地区流行，尤其是自2006年以来，高致病性PRRS（HP-PRRS）的暴发给养猪业造成巨大的经济损失。虽然全球针对PRRS的防控研究已持续进行了30多年，仍然没有安全有效的疫苗及治疗药物得以认证并推广使用。由于PRRSV的高度变异致使有效疫苗的研发存在较大障碍，因此，有必要尝试开发新型抗病毒策略。前期研究证明PRRSV感染猪后会产生特异性针对GP5和M蛋白的自身抗独特型抗体（Auto-anti-idiotypicantibodies，Aab-2s），其中一部分Aab-2s可与抗GP5抗体分子的抗原结合部位决定簇反应，从而阻断其与抗原结合，即为GP5的“内影像”。这类抗体一方面可作为抗独特型抗体疫苗，同时可以作为筛选和鉴定病毒入侵所需受体的工具。本实验室前期利用所制备的针对PRRSVGP5蛋白的单克隆抗独特型抗体（Mab2-5G2）从PRRSV易感细胞PAM和MARC-145中发现了介导病毒进入靶细胞的重要蛋白，非肌肉肌球蛋白II-A（MYH9），由于Mab2-5G2具有模拟PRRSV囊膜糖蛋白GP5的功能，提示MYH9可能是病毒GP5蛋白结合易感细胞的一个功能性受体蛋白因子，基于前期研究基础，本研究主要目标如下：1.Mab2-5G2与MYH9分子互作的关键区域的确定非肌肉肌球蛋白II（Non-musclemyosinII，NMII）在正常细胞中发挥的生物功能主要包括：细胞迁移、有丝分裂、囊泡转移修复、胞质分裂和细胞因子分泌等。哺乳动物的NMII包含3个亚型，根据其重链命名为NMII-A(MYH9)，NMII-B(MYH10)，NMII-C(MYH14)，三者的氨基酸同源性高达64%~80%，序列比对分析发现其氨基酸差异主要位于氨基端和羧基端。为了查找Mab2-5G2与MYH9结合的区域，我们首先设计间并引物扩增猪源MYH9全长序列，然后将MYH9基因分成四部分进行扩增，分别克隆到真核表达质粒pCAGEN-HA，瞬时转染真核HEK-293T细胞48h，收取细胞并借助蛋白免疫印迹试验，初步确定Mab2-5G2的结合区域位于MYH9的羧基端aa1651-1960，将该区域命名为PRA。2.MYH9蛋白羧基端的关键区域PRA可溶表达和阻断PRRSV感染研究为了探究重组表达的PRA蛋白能否作为一种潜在的受体阻断剂抑制PRRSV感染， 我们利用原核表达系统获得可溶的PRA蛋白，通过ELISA和Westernblot试验分别证实抗独特型抗体Mab2-5G2结合PRA蛋白。本研究进一步将PRRSVSD16、VR-2332毒株分别与PRA蛋白或PCV2Cap对照蛋白混合后感染易感细胞，结果显示如下：（1）PRA蛋白在PRRSV易感细胞MARC-145和PAM以及易感细胞系PK-15CD163和CRL-2843CD163上显著阻断PRRSV-2型SD16及VR-2332感染，其阻断效果均呈剂量依赖性。（2）PRA蛋白在PAM和MARC-145细胞中对PRRSV-1型（GZ11-G1和P073-3）和PRRSV-2型（JXA1、VR-2385、CH-1a、GD-HD）的增殖均具有抑制作用。（3）PRA蛋白通过结合PRRSVGP5蛋白来捕获病毒。（4）PRA与PRRSV结合后导致细胞胞浆中MYH9向细胞膜上迁移减少，从而降低PRRSV内化。3.MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的确定PRRSV进入宿主细胞主要依靠相关受体介导，其中CD163和MYH9是作为介导PRRSV吸附内化入胞过程中所必需的两个因子。为了探究不同种属MYH9是否均可作为PRRSV感染的重要介导因子并确定MYH9介导病毒入侵的关键区域，首先，分别构建稳定表达猪源CD163的PK-15（PK-15CD163），HEK-293T（HEK-293TCD163）和BHK-21（BHK-21CD163）的PRRSV易感细胞系，用Blebbistatin（MYH9特异性抑制剂）或siRNA(针对不同种源MYH9)处理这些细胞系，感染病毒48h。间接免疫荧光，qPCR和Westernblot试验结果显示：PRRSV感染水平伴随着MYH9活性或表达下降而降低；然后，用大肠杆菌系统分别表达不同种属的PRA蛋白，证实其对PRRSV感染的均具有阻断作用。比较不同种属PRA氨基酸序列的差异，最后，以猪源PRA为例，对该区域进行逐步截短表达，通过病毒阻断试验筛选获得关键区域为aa1676-1791，同时制备针对该区域的多克隆抗体显著抑制PRRSV感染PAM和MARC-145细胞。由此推断该区域可能是MYH9介导PRRSV入侵的关键区域。4.Mab2-5G2与MYH9结合位点鉴定与功能研究为了探究Mab2-5G2是否可以作为“竞争阻断剂”结合细胞表面MYH9从而影响PRRSVGP5结合MYH9，进而降低病毒的感染。本研究在PAM细胞上初步证实Mab2-5G2具有抵抗PRRSV感染的作用。同时Mab2-5G2对PRRSVSD16，JXA1，CH-1a，VR-2332，VR-2385和GD-HD等不同毒株均具有阻断效果。为查找Mab2-5G2与MYH9的结合位点，首先构建PRA截短体，以及合成多肽，借助ELISA和Westernblot技术逐步缩小与Mab2-5G2结合的范围；通过抗体测序获得Mab2-5G2Fab序列，分别借助同源建模方法获得Mab2-5G2Fab与MYH9结合的空间结构。通过Chimera软件对两者进行分子对接（Docking），初步确定Mab2-5G2结合MYH9的位点位于MYH9的羧基端E1670，K1673，E1679和I1683；通过构建重组表达PRA突变体（PRA1670，PRA1673，PRA1679，PRA1683和PRA1670,1673,1679,1683）进行Mab2-5G2结合活性和病毒阻断的功能验证。结果显示，PRA 突变体蛋白与Mab2-5G2及与病毒粒子结合活性以及阻断PRRSV的内化能力明显下降。由此推断，E1670，K1673，E1679和I1683可能是PRRSV囊膜蛋白GP5结合MYH9入侵易感细胞的结合位点。本研究鉴定出Mab2-5G2的结合区域位于MYH9的羧基端PRA（aa1651-1960），重组表达PRA具有良好的抗PRRSV活性，PRA可通过与细胞內源性MYH9竞争结合病毒的GP5蛋白，降低病毒的内化，抑制PRRSV感染。同时证实不同种属MYH9均参与病毒复制，借助阻断试验确定结合PRRSV的关键区域位于aa1676-1791。进一步研究发现Mab2-5G2对PRRSV感染具有明显地阻断作用，通过同源建模和分子对接预测Mab2-5G2与PRA结合位点为E1670，K1673，E1679和I1683，并进行了相关的功能验证，本研究进一步揭示PRRSV进入机制和开发新型抗病毒制剂提供理论依据。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；抗独特型抗体；MYH9；病毒进入；抗病毒 INVESTIGATIONOFTHEINTERATIONBETWEENPRRSVANTI-IDIOTYPEANTIBODYMAB2-5G2ANDMYH9ABSTRACTPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isthecausativeagentofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)thatcanresultinreproductivefailureinsows,respiratorydistressinnursingpigs,andpoorgrowthperformanceduringinfection.Atpresent,PRRSisendemicandcannotbeeffectivelycontroledandeliminated.Inparticular,thehighlypathogenicPRRSV(HP-PRRSV)outbreakin2006causedsignificantlossesfortheswineindustryinChina.Unfortunately,currentstrategiesforcontrollingPRRSVhavebeenlargelyinadequate,sincenewPRRSVvariantsareconstantlyemerging.Auto-anti-idiotypicantibodies(Aab-2s)weredetectedfrompigsinfectedwithPRRSV.Aab-2sspecificagainsttheidiotypicantibodies(Ab-1s)totheenvelopeglycoproteinGP5orMproteinofPRRSVwereproduced,includingAab-2scouldservedasinternalimageofGP5protein.Anti-idiotypicantibody(Ab-2)couldbeusedasavaccinecandidateandservedasatooltoscreenandidentifyviursreceptorfromsusceptiblecells.OurpreviousstudyhasdemonstratedthatmonoclonalAb2againstantibodytoPRRSVGP5,designatedMab2-5G2,recognizesPRRSVpermissivecellsbyinteractingwithMYH9fromPAMsorMARC-145cells,whichisanovelcellularfactorthatbindstoPRRSVmajorglycoproteinGP5.Basedonthesestudies,theobjectivesofthisresearch:1.IdentificationofthekeydomainofMYH9interactionwithMab2-5G2Non-musclemyosinII(NMII)playsimportantrolesinthebroadrangesofbiologicalfunctions,suchascellmigration,mitosis,vesiclemetastasisrepair,cytokinesisandsecretion.NMIIfamilycontainsthreeisoforms,NMII-A(MYH9),NMII-B(MYH10),andNMII-C(MYH14).Theaminoacidhomologyamongthemis64%to80%.ThedifferencesbetweenthemwerelocatedattheCterminus.InordertofindthebindingdomainofMab2-5G2,wefirstamplifythefulllengthofswineMYH9usingdegenerateprimers,thefull-lengthweretrucatedintothreefragments,andeachfragmentwereconstructedintoeukaryoticexpressionvectorpCAGEN-HA,thetrucatedfragmentofMYH9weretransfectedintoHEK-293Tcellfor48h.ThekeydomainnamedPRA,forMab2-5G2binding,wasdeterminedbywesternblot.2.RecombinantMYH9ProteinC-TerminalDomain(PRA)BlocksPRRSVinfection Inordertotesttheanti-PRRSVactivityofPRAinPRRSVsusceptiblecells.TherecombinantPRAproteinwasexpressedandpurifiedfromaprokaryoticexpressionsystem.ThebiologicalactivityofPRAwasconfirmedusingMab2-5G2byWesternblotandELISA.OurresultsshowthatPRAexhibitedabroad-spectrumanti-PRRSVactivity.(1)PRRSVSD16orVR-2332infectionwasinhibitedbypreincubationwithPRAinadose-dependentmannerinbothsusceptiblemonkeycells(MARC-145)andswinecells(PK-15CD163,CRL2843CD163,andPAMs).(2)PRAinhibitsbothPRRSV-1(GZ11-G1andP073-3strains)andPRRSV-2(JXA1,VR-2385,CH-1a,andGD-HDstrains).(3)PRAcancapturePRRSVvirionsviainterationwithGP5protein.(4)PRApreventsthemembraneredistributionofMYH9andinternalizationofPRRSVvirions.3.IdentificationoftheMYH9proteinkeydomaininvolvedinentryofPRRSVPRRSVentersthetargetcellsviareceptor-mediatedendocytosis,bothCD163andMYH9areindispensablefactorsforPRRSVattachmentandinternalization.However,wedonotknowwhetherMYH9fromotherspecieshastheabilitytomediatePRRSVentryintothetargetcells,andMYH9keydomainthatmediatesPRRSVinfection.Toanswerthesequentions,wefirstconstructedstablepCD163expressioncelllinesfromhuman,murine,andswineoriginsandthentestwhetherMYH9fromotherspeciescouldmediatePRRSVinfection.BlebbistatinorthesmallinterferingRNA(siRNA)againstMYH9swasaddedtoPRRSVsusceptibleHEK-293TCD163,PK-15CD163andBHK-21CD163cells.After48hPRRSVSD16incubation,PRRSVNgeneandproteinsweredetectedusingIFA,qPCRandWesternblot.Next,PRAfromotherspecieswasproducedinE.coliBL21,theblockingeffectonPRRSVinfectionwasdetectedasabove.Further,thecrucialcommondomainofMYH9fromdifferentspeciesforPRRSVbindingwasdeterminedusinginhibitionassayofPRRSVinfectionbytheanalysisofsequencealignmentandPRAstruncation.Finally,thekeydomainforPRRSVinfectionwasdeterminedatMYH91676-1791.Moreover,themousepolyclonalantibodyofMYH91676-1791couldsignicantlyblockPRRSVinfection.4.DeterminationofbindingsitebetweenMab2-5G2andMYH9InordertodeterminewhetherMab2-5G2couldserveasblockingagentforPRRSVinfection.TheresultsshowedthatMab2-5G2blockedPRRSVSD16,JXA1,CH-1a,VR-2332,VR-2385andGD-HDstrainsinfectionofPAM.Inaddition,thebindingsitebetweenMab2-5G2andMYH9wasdeterminedusingtheELISA,andWesternblot.ThespatialstructurebetweenMab2-5G2andMYH9wasanalyedwithHomologousModelingandDockingusingChimerasoftware.ThekeyaminoacidsinthebindingsitewerepredictedatE1670,K1673,E1679andI1683inPRAdomain.WefurtherproducedtherecombinantPRAmutants(E1670A,K1673A,E1679AandI1683A)namedPRA1670,PRA1673,PRA1679, PRA1683,andPRA1670,1673,1679,1683,respectively,totestthebindingactivitytoMab2-5G2andinhibitoryeffectonPRRSVinfection.TheresultsshowedthattheinteractionbetweenPRAmutantsandMab2-5G2wassignificantlyredued,theanti-PRRSVactivityofPRAmutantwassignificantlylowerthanwidetypePRA,whichsuggestthataminoacidsE1670,K1673,E1679,andI1683inPRAmaybealsoinvovedintheinteractionofMYH9andPRRSVGP5.OurstudyindicatesthatthedomainforMab2-5G2bindingweredeterminedattheC-terminalofMYH9(namedPRA),whichexhibitedabroad-spectrumanti-PRRSVactivity,PRAcancapturePRRSVvirionsviainterationwithGP5proteinandreducesthemembraneredistributionofMYH9andinternalizationofPRRSV.MYH9fromotherspeciescouldmediatePRRSVinfection,thekeydomainforPRRSVinfectionwasdeterminedatMYH91676-1791.Mab2-5G2couldserveasanovelcompetitiveinhibitorforPRRSVentry.BasedonhomologousmodelingofMab2-5G2anditsinteractingdomainfromMYH9,severalkeyacidresidueswasidentifiedatE1670,K1673,E1679,andI1683.TheseinformationwilladdvaluableinformationforunderstandingPRRSVentryaswellasdevelopingnovelanti-viralstrategyagainstPRRSVinfection.KEYWORDS:PRRSV;anti-idiotypicantibody;MYH9;virusentry;antiviral 目录第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展.................................................................................11.1猪繁殖与呼吸综合征病毒..............................................................................................11.1.1非结构蛋白..............................................................................................................21.1.2结构蛋白..................................................................................................................31.2PRRSV受体研究............................................................................................................41.2.1硫酸乙酰肝素（HS）.............................................................................................41.2.2唾液酸粘附素（SN）..............................................................................................51.2.3波形蛋白（VIMENTIN）.......................................................................................51.2.4CD151蛋白...............................................................................................................61.2.5CD163蛋白...............................................................................................................61.2.6NMHCII-A(MYH9).................................................................................................71.2.7PRRSV入侵需要病毒受体协同完成.....................................................................81.3抗独特性抗体与病毒受体的研究.................................................................................91.4抗PRRSV感染研究....................................................................................................101.4.1病毒进入抑制剂....................................................................................................111.4.2.microRNA在病毒复制过程中其抑制PRRSV感染作用....................................121.4.3中药提取物，化学药物和免疫激动剂抑制PRRSV感染..................................121.4.4中和抗体抑制PRRSV感染..................................................................................131.4.5疫苗抑制PRRSV感染..........................................................................................131.5本研究的目的与意义...................................................................................................15第二章PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9区域的确定..................................172.1材料与方法...................................................................................................................172.1.1细胞系和菌株........................................................................................................172.1.2主要试剂................................................................................................................172.1.3主要仪器................................................................................................................172.1.4原代PAM细胞收集..............................................................................................172.1.5猪源MYH9全长扩增...........................................................................................182.1.6Mab2-5G2结合MYH9区域的确定......................................................................192.2试验结果.......................................................................................................................202.2.1原代PAM细胞收集与显微镜观察......................................................................202.2.2猪源MYH9全长基因的克隆...............................................................................20 2.2.3Mab2-5G2结合MYH9区域的探究......................................................................222.3小结................................................................................................................................23第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究.............................................................243.1材料与方法....................................................................................................................243.1.1毒株、细胞系和菌株.............................................................................................243.1.2试验所需主要试剂................................................................................................243.1.3主要仪器.................................................................................................................243.1.4PRA克隆构建........................................................................................................253.1.5蛋白表达.................................................................................................................253.1.6PRA蛋白Ni柱纯化酶切去除标签.......................................................................253.1.7rTEV蛋白酶表达纯化...........................................................................................263.1.8重组PRA蛋白活性的鉴定...................................................................................263.1.9PRA蛋白影响PRRSV复制..................................................................................263.1.10PRA蛋白细胞毒性检测......................................................................................273.1.11PRRS病毒和可溶性PRRSVGP5纯化..............................................................273.1.12病毒捕获试验......................................................................................................283.1.13免疫共沉淀试验..................................................................................................293.1.14PRA预处理PRRSV后减少对宿主细胞MYH9的募集..................................293.1.15PRA抑制PRRSV的内化过程............................................................................303.2试验结果.......................................................................................................................303.2.1PRA片段克隆，重组质粒构建............................................................................303.2.2重组蛋白表达和亲和层析纯化.............................................................................313.2.3PRA蛋白活性鉴定................................................................................................323.2.4病毒阻断试验........................................................................................................333.2.5病毒捕获试验........................................................................................................393.2.6PRA孵育病毒后减少宿主细胞MYH9往细胞膜上运行...................................433.2.7PRA预孵育PRRSV后减少病毒内化..................................................................443.3讨论...............................................................................................................................453.4小结...............................................................................................................................47第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定..............................................484.1材料与方法....................................................................................................................484.1.1细胞系、毒株、抗体.............................................................................................484.1.2主要试剂................................................................................................................484.1.3主要仪器................................................................................................................484.1.4稳定表达PCD163的BHK-21和HEK-293T细胞系构建与鉴定.....................48 4.1.5CD163CD163CD163PK-15，BHK-21和HEK-293T感染PRRSV评价.......................494.1.6特异性siRNA敲低MYH9对PRRSV影响........................................................494.1.7Blebbistatin阻断PRRSV感染.................................................................................504.1.8不同种属MYH9羧基端（PRA）对PRRSV感染的阻断作用.........................504.1.9阻断PRRSV感染有效片段筛选..........................................................................514.1.10Blebbistatin与不同种属PRA蛋白细胞毒性检测................................................524.1.11MYH9结合PRRSV最小区域确定....................................................................524.1.121676-1791MYH9结合PRRSV验证.........................................................................534.1.131676-1791MYH9鼠源多抗血清制备........................................................................534.1.141676-1791MYH9多抗血清阻断PRRSV感染的研究.............................................534.2试验结果.......................................................................................................................544.2.1MYH9在PK-15，BHK-21和HEK-293T细胞的表达鉴定...............................544.2.2稳定表达猪源CD163细胞系构建和鉴定...........................................................544.2.3重组表达PCD163的细胞系感染情况.................................................................554.2.4特异性siRNA敲低MYH9致使易感细胞系的PRRSV感染量下降................554.2.5Blebbistatin处理易感细胞系导致PRRSV感染下降.............................................574.2.6人源和鼠源PRA基因组片段的扩增与质粒构建...............................................594.2.7不同种属PRA蛋白重组表达及纯化...................................................................594.2.8不同种属PRA预处理PRRSVSD16导致易感细胞系的病毒感染下降..........604.2.9不同种属MYH9结合PRRSV最小区域确定....................................................624.2.101676-1791MYH9多克隆抗体抑制PRRSV感染.....................................................684.3讨论................................................................................................................................714.4小结................................................................................................................................72第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测..............................735.1材料与方法....................................................................................................................735.1.1毒株、细胞系和菌株............................................................................................735.1.2主要试剂................................................................................................................735.1.3主要仪器................................................................................................................735.1.4Mab2-5G2抗体制备和Fab序列测定....................................................................735.1.5病毒阻断功能验证.................................................................................................735.1.6PRA兔源多克隆抗体血清制备............................................................................745.1.7病毒捕获试验.........................................................................................................745.1.8间接免疫荧光试验.................................................................................................745.1.9PRA截短体和突变体的表达纯化........................................................................745.1.10间接免疫酶联吸附试验......................................................................................75 5.1.11免疫印迹试验.......................................................................................................755.1.12细胞毒性试验.......................................................................................................765.1.13圆二色谱仪分析PRA结构.................................................................................765.2试验结果.......................................................................................................................765.2.1Mab2-5G2抗体纯化及其序列确定.......................................................................765.2.2Mab2-5G2阻断PRRSVSD16感染PAM............................................................765.2.3Mab2-5G2结合MYH9区域查找..........................................................................795.2.4预测Mab2-5G2Fab与PRA结合位点..................................................................815.2.5PRA结合位点突变功能验证................................................................................835.3讨论................................................................................................................................885.4小结................................................................................................................................90全文总结..................................................................................................................................91本研究创新点和研究展望......................................................................................................93创新点..................................................................................................................................93未来研究展望......................................................................................................................93参考文献..................................................................................................................................94附录................................................................................................................................107中英文对照缩略词表............................................................................................................111致谢................................................................................................................................112作者简介................................................................................................................................114 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展1第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是严重影响世界养猪业的疾病之一，其病原为繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），该病毒分别于1987年和1991年首次在美国和欧洲被分离到(Wensvoortetal.1991)，PRRSV全球暴发至今30年之久，给养猪业造成巨大的经济损失。最近的研究数据显示，PRRS在美国给养猪业带来的的损失已超越6亿美元大关，尤其值得注意的是，在中国2006年暴发的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）更是给养猪业造成几乎“毁灭性”的打击(Hanetal.2017a;Tianetal.2007)。PRRSV属于有囊膜单股正链RNA病毒（图1-1），国际病毒分类委员会于1996年将PRRSV划归尼多病毒目中的动脉炎病毒科，属于动脉炎病毒属，该家族还包括猴出血热病毒、马动脉炎病毒和鼠乳酸脱氢酶增高病毒，PRRSV分为两种亚型即欧洲型（PRRSVⅠ型）和北美型（PRRSVⅡ型）(Mardassietal.1994;Wensvoortetal.1991)，两个亚型之间核苷酸序列同源性仅为60%(Forsberg2005;vanWoenseletal.1998)。图1-1动脉炎病毒科成员病毒粒子示意图（引自(Expasy2014)）Fig.1-1SchematicdiagramofArteriviridaevirions(citedfrom(Expasy2014))PRRSV呈球形或卵圆形，有被膜蛋白复合物嵌入其外表面比较圆滑（图1-2），直径约50~65nm。其基因组为15~15.5kb，5'和3'各有一个非编码区，同时包括至少11个开放阅读框（ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7）。 2猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图1-2PRRS病毒粒子冷冻电镜图示意图（引自(Expasy2014)）Fig.1-2CryoelectronmicroscopeimageofPRRSVvirion(citedfrom(Expasy2014))5’非翻译区后连接两个复制酶基因ORF1a与ORF1b，约占整个基因组四分之三，这两个区域编码两个非结构多聚蛋白，pp1a和pp1b，这两个非结构蛋白用于复制酶和蛋白酶的功能，而基因组的3’主要编码病毒的结构蛋白（图1-3）。图1-3PRRSV基因组结构示意图（引自(Expasy2014)）Fig.1-3SchematicdiagramofPRRSVgenome(citedfrom(Expasy2014))1.1.1非结构蛋白PRRSV基因组ORF1a和ORF1b两个结构域负责编码2个多聚蛋白复合体pp1a和pp1ab，伴随着PRRSV基因组合成，两者多聚蛋白被加工成至少14个非结构蛋白，主要包括nsp1α/β，nsp2-nsp12(Fangetal.2010a)。如上图1-3所示，关于非结构蛋白功能目前研究主要集中在以下几个蛋白：非结构蛋白Nsp1在PRRSV感染宿主细胞过程中至少具有两个功能：第一，调控病毒亚基因组mRNA转录；第二抑制宿主细胞天然免疫，前期研究表明非结构蛋白nsp1α和nsp1β参与抑制I型干扰素反应(Hanetal.2014)，最新研究表明非结构蛋白nsp1β在 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展3PRRSV复制过程中，限制宿主细胞mRNA出细胞核，抑制宿主蛋白合成(Hanetal.2017b)。最新研究表明非结构蛋白全长nsp2，nsp2TF和nsp2N均具有抑制I型干扰素反应的作用，尤其是nsp2TF和nsp2N抑制效果更明显，体内实验显示nsp2TF和nsp2N缺失毒株可以增强机体免疫反应(Lietal.2018b)。最新研究表明PRRSV感染猪体导致猪白细胞抗原类I（sla-I）抗原递呈途径发生紊乱，主要由于病毒的NSP4蛋白参与下调β2-微球蛋白（B2M）基因表达造成(Qietal.2017)。同时相关研究表明NSP4是导致PRRSV感染宿主细胞引起细胞凋亡的主要诱因(Yuanetal.2016)。关于NSP9的最新研究显示该蛋白是调控PRRSV复制的关键蛋白，其第519和544氨基酸位点突变可以显著增强高致病性PRRSV感染力(Zhaoetal.2018)，同时相关研究显示NSP9的第586和592两个关键氨基酸决定着HP-PRRSV对仔猪的致病性(Xuetal.2018)。另外，NSP9蛋白可与PRRSVN蛋白互作调控病毒自身RNA的合成和转录(Liuetal.2016)。1.1.2结构蛋白PRRSV的结构蛋白主要由其基因组3’编码，主要包含以下八个蛋白：囊膜糖蛋白GP2，GP3，GP4，和GP5；囊膜非糖基化整合膜蛋白蛋白（E，ORF5a和M）以及核衣壳蛋白（N），这些蛋白由基因组羧基端的sgmRNA编码。GP5由ORF5编码，该蛋白包含病毒主要的中和表位。M蛋白由ORF6编码，GP5-M以异源二聚体形式存在，是病毒脂质包膜主要组成部分，两者病毒感染早期吸附宿主细胞的主要结构模块；GP2，GP3和GP4作为次要结构蛋白主要形成一个多聚体，并入脂质包膜，GP2a与GP4是结合宿主细胞受体介导病毒入侵的重要蛋白（图1-4）(Popescuetal.2017)。核衣壳蛋白由ORF7编码，该蛋白以同源二聚体形式存在，主要在病毒内部，不含胞外域，其主要功能是包装病毒基因组RNA(Spilmanetal.2009)。图1-4病毒结构蛋白与宿主细胞受体因子Fig.1-4Viralproteinsinteractwithcellreceptors 4猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究1.2PRRSV受体研究PRRSV感染具有严格的细胞嗜性，这种特性取决于细胞表面是否存在特异的病毒入侵所需受体，病毒囊膜蛋白首先结合细胞表面的受体分子，进而利用宿主细胞自身内吞作用而完成感染，目前已知的PRRSV感染和增殖的主要靶细胞主要包括非洲绿猴肾细胞（MARC-145）和猪肺泡巨噬细胞（PAM），目前已报道的介导PRRSV入侵的潜在细胞受体和关键因子（如图1-5）包括硫酸乙酰肝素（Heparansulphate，HS）(Delputteetal.2002)，树突特异性跨膜蛋白（DC-SIGN，CD209）(Huangetal.2009;Pineyroetal.2016)，唾液酸粘附素（Sialoadhesin，Sn）(Delputteetal.2007)，CD151蛋白(Wuetal.2014)，波形蛋白（Vimentin）(Kimetal.2006)，非肌肉肌球蛋白重链II-A（nonmusclemyosinheavychainII-A，MYH9）(Gaoetal.2016)和清道夫蛋白（CD163）(Calvertetal.2007;Guoetal.2014)。图1-5PRRSV潜在的受体和关键分子（引自(VetMicrobiol.2015)略加改动）Fig.1-5PutativereceptorsorkeyfactorforPRRSV(citedfromVetMicrobiol.2015withmodification)1.2.1硫酸乙酰肝素（HS）硫酸乙酰肝素（Heparansulphate，HS）属于糖胺聚糖家族中一员，其作为氧合糖基化蛋白-蛋白聚糖类分子的一部分广泛分布于细胞的表面，硫酸乙酰肝素糖蛋白可以作为一个独立单位分布在哺乳动物细胞表面，在维持细胞外基质的完整性，屏障作用以及细胞与胞外基质互作中发挥重要作用(Rivaraetal.2016)，HS作为内吞受体转运大分子生物的作用(Nagamineetal.2012;SimonDavisetal.2013)。另外，探究表明HS可以结合一系列生长因子，细胞因子，趋化因子(Goodalletal.2014)。用肝素或降解肝素或乙酰肝素的肝素酶-I处理细胞显著降低PRRSV感染MARC-145细胞(Jusaetal.1997)及PAM(Delputteetal.2002)。相关研究表明，在PRRSV感染早期，当肝素存在时，宿主细胞对PRRSV吸附能力遭受严重破坏，这时病毒吸附明显下降(Delputteetal.2011)，因此推断HS为PRRSV进入细胞一个受体，但是其并不是一个起决定性因子，在PRRSV进 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展5入靶细胞的过程中，仅起到吸附作用，与PRRSV内化无关，该蛋白主要通过结合病毒的GP5/M异源二聚体完成对PRRSV吸附作用(Delputteetal.2005)。XiaohongLiu等最新发现HS可以参与PRRSV释放，当用siRNA敲低HS表达时，PRRSV感染过程会激活NF-KB和组织蛋白酶L，激活乙酰肝素酶从而降解HS，进而促进PRRSV的释放，当用siRNA干扰乙酰肝素酶，可以增强HS的表达，从而抑制PRRSV复制，当在MARC-145细胞中过表达乙酰肝素酶时，细胞表面的HS明显减少，导致PRRSV复制和释放明显增加(Guoetal.2017)。1.2.2唾液酸粘附素（Sn）唾液酸粘附素（Sialoadhesin，Sn）又称为CD169或者SIGLEC1，又被称之为绵羊红细胞凝集受体（SRBCR），该蛋白大小为210kDa，其包含多个结构域：N端唾液酸结合区，17免疫球蛋白样的区域，一个跨膜区和一段“尾巴”存在细胞质内。Sn属于SIGLEC家族中一种能结合唾液酸的类免疫球蛋白外源凝集素类分子，是巨噬细胞限制性受体(Crockeretal.1986)。尤其是人和小鼠的Sn只在脾脏、淋巴结、骨髓、肝脏、结肠及肺脏等组织巨噬细胞亚群中有明显表达(Crockeretal.1989;Hartnelletal.2001)。Duan等人利用特异性抗PAM细胞表面蛋白的单克隆抗体及质谱分析发现了猪唾液酸粘附素蛋白为PRRSV的细胞受体(Duanetal.1998a;Duanetal.1998b)。在所有PRRSV毒株表面都会有唾液酸，其可作为Sn受体的配体，Sn通过结合唾液酸的方式来结合PRRSV，其N端150氨基酸是结合病毒所必需的，在非易感细胞PK-15上仅表达该部分氨基酸，就足以介导PRRSV吸附和内化(Anetal.2010;Delputteetal.2007;Jiangetal.2013)。Sn作为PRRSV感染过程中重要受体之一，主要在吸附和内化过程中发挥作用，但是不参与病毒脱壳(VanGorpetal.2010)，在此过程主要是Sn的N端结合PRRSVM/GP5复合体(Delputteetal.2004)。最新研究表达CD169同系物（猪源，鼠源和人源）均具有介导PRRSV进入易感细胞的活性，而且其胞外域即唾液酸结合活性是其发挥受体作用的关键区域(VanBreedametal.2013)。然而Pratheretal.等研究表明在猪体模型敲除Sn后，发现与对照组相比，PRRSV感染的临床症状未发生明显改变。且细胞表面CD163表达水平亦未发生改变。因而从该试验的角度上讲，PRRSV感染猪过程中Sn并非起决定作用(Pratheretal.2013)。HansJ.Nauwynck等最新研究表明SIGLEC-10作为凝集素超家族重要一员，在PRRSV感染过程中具有类似SIGLEC-1（Sn）的作用，在PK-15细胞系中过表达SIGLEC-10仅支持PRRSVⅡ毒株内化，但是对PRRSVⅠ型不是敏感，这一定程度说明在细胞系中存在一些协同因子，可以促进PRRSV感染(Xieetal.2017)。1.2.3波形蛋白（Vimentin）波形蛋白（Vimentin），属于Ⅲ型中间丝纤维蛋白的一种，其作为一种细胞骨架蛋白，分子量为54kDa，其广泛分布在细胞质和细胞膜，其在维持细胞及细胞器形态的稳态，参与有丝分裂和细胞分化，以及细胞粘附和移动等过程中发挥重要作用(Nieminenet 6猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究al.2006)。波形蛋白主要分布在哺乳动物细胞如：单核细胞，巨噬细胞，白细胞和肌肉细胞，并在细胞质、高尔基体、细胞核和细胞膜上均有表达(Cainetal.1983)。Kim等研究发现Vimentin主要在PRRSV易感细胞MARC-145的细胞膜和细胞浆表达，在病毒感染过程中该蛋白可与PRRSVN蛋白结合，同时针对Vimentin的单克隆抗体(7G10)可以阻断PRRSV感染细胞，将猴源Vimentin转导入BHK-21和CRFK等PRRSV非易感细胞可将其变为易感细胞(Kimetal.2006)。这些试验结果提示波形蛋白是PRRSV感染过程中的一个细胞受体，而且其被认为参与到病毒的复制和转录过程中与其他中间纤丝形成复合体。1.2.4CD151蛋白CD151蛋白，隶属于跨膜四超家族，大小为29kDa，四次跨膜糖蛋白，糖基化位点在N端。CD151蛋白广泛表达在组织和细胞上，主要包括上皮细胞、肌肉细胞、血小板、巨核细胞、激活T淋巴细胞和血旺细胞(Fitteretal.1999;Sincocketal.1999);Shanmukhappa等研究显示，CD151与PRRSVRNA的3’UTR结合，从而影响病毒基因的转录、翻译和RNA运输(Shanmukhappaetal.2007)。Wu等研究结果显示在MARC-145细胞中过表达针对3′UTRmRNA的小RNA（miR-506）可以抑制PRRSV感染(Wuetal.2014)。Huang等在MARC-145细胞内敲低或过表达CD151均显著影响PRRSV的感染能力；在PRRSV非易感细胞BHK-21细胞内表达CD151蛋白可以使其变为易感细胞(Shanmukhappaetal.2007;Wuetal.2014)。研究者近期发现猪呼吸道上皮细胞（SJPL）和永生化的猪子宫内膜上皮细胞（PEE）可以被PRRSV感染，这两个细胞检测不到CD163，但都含有CD151(Provostetal.2012)，综上研究表明CD151是PRRSV的一个细胞受体。1.2.5CD163蛋白CD163为I型跨膜糖蛋白，属于清道夫受体，富含半胱氨酸（SRCR）超级家族，蛋白分子量为130kDa，其为胞外蛋白，由一条肽链构成，包含9个串联的SRCR重复单元，1个跨膜区和1个位于细胞内的胞质尾巴，其主要在单核/巨噬细胞中表达(Martinezetal.2011;Sanchezetal.1999;VandenHeuveletal.1999)。Calvert等对PAM细胞cDNA表达文库进行筛选时获得CD163，将CD163cDNA转染PRRSV非易感细胞猪肾细胞（PK032495），中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1，猫肾细胞（NLFK）以及幼仓鼠肾（BHK-21）可使其成为易感细胞，并产生子代病毒(Calvertetal.2007;VanGorpetal.2008)，近些年来，相关研究人员陆续将猪源CD163导入细胞系PK-15(Wangetal.2013b;Xieetal.2018)，BHK-21(Zhangetal.2016a)，MH-S以及RAW264.7(Lietal.2017)，分别开展与病毒进入与复制相关研究。作为PRRS易感细胞MARC-145也含有CD163，抗CD163抗体能够显著降低PRRSV感染MARC-145细胞。同时用针对CD163的抗体与PAM在37oC孵育后能够显著阻断PRRSV感染，但当孵育温度改为4oC时不能阻断病毒的感染。因此CD163在PRRSV感染过程中不是参与病毒的吸附过程，而可能是病毒的脱壳 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展7与基因释放(Provostetal.2012)，同时相关研究提示不同种属CD163均具有介导PRRSV入侵能力(Calvertetal.2007)，有研究发现CD163SRCR5是介导病毒入侵的关键区域(VanGorpetal.2010)。前期有研究证实CD163可作为PRRSVI和II的主要受体，而且PRRSV感染过程中该蛋白表达明显上调(Wangetal.2011)，相关研究人员对CD163的不同SRCR模块进行区域性删除和替换试验，结果发现SRCR5为病毒感染所必需的区域(Wellsetal.2017)，而且SRCR5与细胞膜之间的距离具有严格的限制，同时SRCR6-9为该蛋白与PRRSV互作的关键区段，而SRCR1-4和胞质尾巴区为病毒感染非必需的区域，SRCR6-9在PRRSV感染过程中可以被其它种属的CD163SRCR替换，并在PRRSV感染中不发挥作用(VanGorpetal.2010)。有研究发现在PRRSV进入易感细胞过程中，CD163被证实与GP2a和GP4互作起到病毒吸附作用，而且病毒GP4蛋白与CD163共定位与脂阀中(Dasetal.2011)。而Wei等2012年报道了利用双分子荧光互补技术发现与CD163相互作用的PRRSV蛋白是GP4，而可能不是GP2(Weietal.2012)。最新研究就表明用CRISPR-Cas9技术编辑pCD163，获得CD163缺失的猪，PRRSV感染试验发现与未敲除CD163猪对比，敲除CD163试验组，未发现明显PRRSV感染后的高热和呼吸症状，且肺脏病理切片未有明显病理变化，这说明CD163缺失可以使猪体抵抗PRRSV感染(Wangetal.2010)。ChristineBurkard等通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪体受精卵中精准编辑CD163SRCR5，获得的CD163SRCR5缺失的猪，从这些猪体内分离PAM和PBMC细胞，这些细胞可以抵抗PRRSV感染，这些说明CD163是PRRSV感染所必需的因子之一(Burkardetal.2017)。同时，Yang等最新研究表明，用CRISPR/Cas9编辑技术和体细胞核移植技术，获得CD163受体敲除的猪体，用高致病性PRRSVTP毒株对这些试验猪群进行攻毒试验，结果发现与正常对照组比较发现，基因敲除猪可以完全抑制病毒的感染，检测不到病毒血症，抗体反应以及高热等PRRS感染的特征(Yangetal.2018)。1.2.6NMHCII-A(MYH9)非肌肉肌球蛋白II型（NMII）广泛存在于自然界，哺乳动物的NMII包括3个不同的亚型，根据其重链命名为NMII-A(MYH9)，NMII-B(MYH10)，NMII-C(MYH14)。三者的氨基酸有64%~80%的同源性。该蛋白参与整个细胞周期，尤其是在细胞吸附和维持细胞形态变化，胞质分裂以及细胞迁移过程中发挥作用，其主要分布在细胞浆内，细胞膜上也有少量分布。NMII与其它型肌球蛋白一样有2个重链（NMHC）和4个轻链（MLC）。每个230kDa的重链组成一个二聚体，与两对轻链结合成一对轻链称为调节轻链（20kDaMLC或MLC20），另一对轻链称为基础轻链（17kDaMLC或MLC17），如图： 8猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图1-5MYH9分子模式图Fig.1-5SchematicillustrationofMYH9protein.前期研究发现NMHCII-A可以作为关键蛋白参与多种病毒复制，其中包括I型单纯疱疹病毒(Ariietal.2010)和血小板减少综合征病毒的细胞受体(Sunetal.2014)。另外，DanXiong等报道NMHCII-A是介导Epstein-Barr病毒感染鼻咽上皮细胞的因子(Xiongetal.2015)。我们实验室前期制备了针对PRRSVGP5的单克隆抗独特型抗体（Mab2-5G2），该抗体具有模拟GP5的功能，试验发现Mab2-5G2结合PRRSV易感细胞MA-104和原代PAM，并特异性识别从MA-104细胞和PAM裂解液获得分子量约为230kDa的蛋白MYH9，Gao等将猪源CD163转染转入PRRSV非易感细胞COS-7中，发现COS-7CD163细胞并不感染PRRSV，但是将NMHCII-A从MARC-145细胞克隆后，并将其导入COS-7CD163后，发现PRRSV可以感染该细胞(Gaoetal.2016)。这提示PRRSV感染宿主细胞过程中需要CD163和MYH9协调作用。同时，Fangying研究表明：PRRSV可以利用细胞骨架蛋白微丝微管实现细胞间的病毒传播，而微丝微管主要有F-actin和NMHCII-A组成，这些都是MYH9调控PRRSV感染宿主细胞的良好佐证，提示MYH9是PRRSV感染过程中不可缺少的重要因子(Guoetal.2016)。1.2.7PRRSV入侵需要病毒受体协同完成PRRS病毒入侵易感细胞产生有感染性的子代病毒，整个过程需要多个受体蛋白合力完成，即在PRRSV感染的早期，HS和Sn负责吸附病毒粒子，而且两个吸附能力是叠加的，而且这种吸附力可以被肝素和Sn特异性抗体41D3消除到99%(Delputteetal.2011)。紧接着Sn或MYH9与CD163合力进入宿主细胞，其中Sn主要发挥吸附内化病毒，MYH9负责PRRSV内化和传播，CD163负责吸附PRRSV和病毒脱壳，VanGorpetal.2010等发现在非易感细胞中共表达Sn和CD163可以明显提高子代病毒感染，其感染量比单独表达CD163的细胞系高约10-100倍，同时针对于Sn和CD163的特异性抗体可以完全阻断PRRSV感染(Delrueetal.2010)。值得注意是，仅有Sn表达不能产生子代病毒，如图1-6所示： 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展9图1-6CD163与Sn协同介导PRRSV感染进入非易感细胞(引自VeterinaryMicro2015)Fig.1-6CD163andSnconfersPRRSVnon-permissivetopermissivecells(citedbyVeterinaryMicro2015)MYH9在PRRSV进入宿主细胞的早期阶段会发生重排（由细胞浆往细胞膜运动），其主要参与PRRSV内化和传播(Gaoetal.2016)，同样仅MYH9蛋白存在不能介导PRRSV感染，必须有CD163的参与，如图1-7所示，在稳定表达CD163细胞系中敲低MYH9，病毒感染会显著下降（该部分研究详见第四章），这说明PRRSV感染需要MYH9与CD163两者的协同进入。图1-7CD163与MYH9协同介导PRRSV感染进入非易感细胞Fig.1-7CD163andMYH9confersPRRSVnon-permissivecellstopermissivecells1.3抗独特性抗体与病毒受体的研究病毒受体是病毒入侵细胞的关键因素，鉴定宿主易感细胞表面的受体对研究病毒入侵机制是必需的。抗独特型抗体（AId）作为Ab2是针对抗体的高变区产生抗抗体，AId与初始抗原分子表面的决定簇存在互为“内影像”关系，因而Ab2具有一定程度上模拟初始抗原功能和结构的特性（图1-8），许多学者利用这一特性，制备针对病毒表面膜蛋白的抗独特型抗体来鉴定易感细胞系上的受体。 10猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图1-8抗独特型抗体“内影像”的产生(引自GlenN1985)Fig.1-8Generationof“internalimage”anti-idiotypicantibody(citedbyGlenN1985)ManSungCO等利用标记的抗独特型抗体模拟病毒筛选到呼肠弧病毒的受体(Coetal.1985)，JanKopecky等利用针对蜱传脑炎病毒的抗独特型抗体从易感细胞筛选到35kDa大小的受体蛋白(Kopeckyetal.1999)。ZhouEM等前期研究发现PRRSV感染导致猪产生针对PRRSVGP5和M的自身抗独特型抗体（auto-Ab2）(Jiangetal.2003;Zhouetal.2004)因而专门制备了模拟PRRSVGP5的单克隆抗独特型抗体（Mab2-5G2），进一步研究发现Mab2-5G2可以特异性结合PRRSV易感细胞MA-104和PAM中的MYH9(Gaoetal.2016;Zhouetal.2008)，这说明MYH9可能是潜在的介导PRRSV感染重要的细胞受体因子。1.4抗PRRSV感染研究全球科研人员对PRRSV防控投入大量研究，目前为止，相关研究主要从PRRSV感染过程中的几个环节进行：进入抑制剂；激活TOLL-LIKE受体药物；抑制转录和基因组合成；增强干扰素Ⅰ型干扰素信号；抑制复制和转录复合体组装；下调宿主细胞受体表达；Ⅰ型和Ⅱ型免疫激活剂(Duetal.2017c)，如图1-9所示： 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展11图1-9抑制PRRSV感染的几种途径（引自TrendsinMicrobiology,2017）Fig.1-9TheinhibitionpathsofPRRSV(citedfromTrendsinMicrobiology,2017)1.4.1病毒进入抑制剂Christiansen和Lim前期研究表明，体外表达可溶细胞受体蛋白可与宿主细胞上受体蛋白竞争结合病毒，减少病毒受体对病毒吸附，进而达到中和病毒效果(Christiansenetal.2000;Limetal.2006)。PRRSV感染宿主细胞主要依靠受体介导实现其宿主细胞的特异性，目前已经报道的是受体和关键因子主要包括heparinsulfate（HS）、vimentin、CD151、CD163、sialoadhesin（CD169，Sn）、DC-SIGN（CD209）和MYH9(Lietal.2017)。YangChen等前期研究表明，腺病毒融合表达Fc片段Sn4D和SRCR5-9，均能体外结合PRRSV，并中和病毒感染，而且Sn4D和SRCR5-9两者混合处理PRRSV后，中和病毒感染效果更加明显(Chenetal.2014)，基于体外试验，该研究团队进一步用rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59-Fc免疫仔猪，5天后分别攻JXA1，JS07或者SH1705毒，试验结果显示，重组腺病毒表达Sn4D和SRCR5-9可以在猪体内有效降低PRRSV感染临床症状，同时病毒载量明显下降(Xiaetal.2018)。最新研究发现可溶表达MYH9羧基端PRA，具有结合PRRSVGP5蛋白明显阻断病毒内化(Lietal.2018a)。针对PRRSV进入易感细胞的抑 12猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究制剂，除了体外表达病毒受体蛋白，许多新开发的化学制剂同样可以阻断病毒进入，WangHM等最新研究发现用异补骨脂查尔酮（Isobavachalcone）预先处理MARC-145后，可以明显抑制PRRSV感染，深入探究发现该药物可以减少PRRSV吸附和进入(Wangetal.2018)。Du等最新研究表明姜黄色素（curcumin）可以广谱的抑制PRRSVII型毒株感染MARC-145和PAM，该药物主要抑制PRRSV内化到易感细胞，同时可以阻断PRRSV脱衣壳(Duetal.2017d)。1.4.2.microRNA在病毒复制过程中其抑制PRRSV感染作用正常动物体内存在的小RNA在调控病毒复制过程中其发挥重要作用，具体分为两种促进病毒感染和抑制病毒感染，目前关于小RNA在抑制PRRS病毒复制大致分为三大类：直接靶向PRRSV基因组、靶向宿主细胞蛋白和靶向信号通路关键蛋白。1.4.2.1microRNA直接靶向病毒基因组最新研究显示，哺乳动物自身可以编码一些小RNA抑制PRRSV感染，microRNA181可以作用于PRRSVⅡ型毒株ORF4的保守区，从而减少病毒复制(Guoetal.2013)。JiaX.等人研究发现miRNA-23靶向PRRSVORF3，miRNA-378靶向PRRSVORF7，miRNA-505靶向PRRSVORF3和ORF5来减少PRRSV的感染(Jiaetal.2015)，童光志研究员前期报道，细胞中存在miR-130b通过靶向PRRSV基因组非翻译区第155-162碱基，其模拟物可以在体外和体内明显抑制多种PRRSVⅡ型毒株感染(Lietal.2015b)。1.4.2.2microRNA直接靶向宿主细胞受体蛋白针对宿主细胞上存在PRRSV的受体，设计不同的microRNA调控不同受体的表达，从而达到PRRSV复制的目的，例如：调控CD163表达的microRNA181(Lietal.2015b)，调控CD151的miRNA-506(Wuetal.2014)以及调控MYH9的miRNAlet-7f-5p均可以在体外减少PRRSV感染易感细胞(Lietal.2016)。另外，孙怀昌等最新研究用腺病毒表达系统表达针对两个重要的受体蛋白Sn和CD163的miRNAs，发现两个在转录水平明显下降，而且当两者同时应用时对PRRSV感染阻断作用呈现叠加效应(Zhuetal.2014)。1.4.2.3microRNA直接靶向病毒感染过程信号通路关键蛋白PRRSV感染宿主细胞过程中，许多信号通路参与其中，为此很多科研人员设计不同通路的关键节点蛋白的microRNA，通过调节这些关键蛋白的表达来调控病毒的感染。miR-26a和miR-30c可以诱导Ⅰ型干扰素反应，从而抑PRRSV复制(Jiaetal.2015;Lietal.2015c)，另外，WangD等研究发现miR-125b通过调控NF-kB信号通路来抑制PRRSV感染(Wangetal.2013a)。1.4.3中药提取物，化学药物和免疫激动剂抑制PRRSV感染中草药作为中华民族对人类文明的巨大贡献，对疾病的防治发挥着重大作用，尤其是在抗病毒研究上取得众多硕果，近些年中药提取物也被广泛的应用到治疗与预防PRRSV相关研究。儿茶素作为茶叶的提取物可以抑制PRRSV感染MARC-145(Lietal. 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展132015a)；丹参酮作为丹参提取物，可以减少PRRSV复制，并能相应减少凋亡细胞(Zhaoetal.2014)；黄酮类酸AB(FA-AB)可以诱导PAM细胞产生IFN-a、IFN-β和IL1-β从而减少PRRSV感染(Yangetal.2013)。1.4.4中和抗体抑制PRRSV感染众所周知，PRRSV感染早期，宿主体内存在抗体依赖的增强（antibodydependentenhancement，ADE）现象，即猪体免疫反应所产的抗体不仅不利于PRRSV清除，反而加剧病毒感染，最新研究表明猪体产生针对PRRSV的中和抗体是清除病毒所必需的(Robinsonetal.2015)。起初，科学家认为PRRSVGP5被认为是主要产生中和抗体的蛋白，GP5的第37-45氨基酸是B细胞表位(Fanetal.2015;Kimetal.2013)。然而相关研究针对该区域的抗体几乎没有任何中和PRRSV的活性(VanBreedametal.2011)。正常病毒组成GP5和M蛋白形成异源二聚体，从PRRSV感染阳性血清中分离针对GP5和M蛋白胞外区的抗体，但是试验验证这些抗体仅能结合病毒，却无法中和病毒感染(Lietal.2012)。到目前为止，仅有针对PRRSVGP4和GP2的中和抗体有效(Costersetal.2010;Vanheeetal.2010)。自PRRS出现，针对PRRSV疫苗的研发一直在进行，但是至今仍未发现有效的疫苗，目前市面上的疫苗在PRRS防控上有一定效果，但是PRRSV具有高度变异性和感染过程存在“抗体依赖性增强效应”，导致现有疫苗无法满足交叉保护(Nanetal.2017)。1.4.5疫苗抑制PRRSV感染PRRSV全球范围内流行，而且变异毒株不断出现，目前为止，PRRSV至少有9个不同的遗传谱系，主要归为I型，Ⅱ型和Ⅲ亚型(Murtaughetal.2010;Shietal.2010)，一直是困扰着养猪业一大难题，近些年，为了防控PRRS，许多针对该病的疫苗相继被研发同时投入临床应用，其中主要包括：减毒活疫苗，灭活疫苗，核酸疫苗，以及病毒载体疫苗(Nanetal.2017)。减毒活疫苗（ModifiedLiveVirus）主要是利用多种技术手段致使PRRSV的毒力致弱或者彻底丧失，猪体接收疫苗注射后，会刺激产生相应的的体液和细胞免疫反应，从而保护猪体免于以后病毒感染，进而降低死亡率。由于血清学及基因序列差异，PRRSV分为两种亚型，因此针对PRRSVI型毒株的疫苗：PorcilisPRRS(默克公司)，IngelvacPRRSFLEXREU（勃林格殷格翰公司），Amervac-PRRS（海博莱），Pyrsvac-183（百灵诊断有限公司）和ReproCycRPRRSEU（勃林格殷格翰公司）等主要在欧洲多个国使用，针对PRRSVII型毒株的疫苗：IngelvacPRRSRRRMLV（勃林格殷格翰），ReproCycRRRPRRSPLE（勃林格殷格翰），IngelvacPRRSATPRRR（勃林格殷格翰）和FosteraRRRPRRS（辉瑞硕腾）等主要在美洲大陆和中国使用。另外，中国作为养猪大国，生猪存栏量全球领先，国内学者研发出保护效果比较好的疫苗：CH-1R株和R98株两种主要用于防控经典毒株(Liuetal.2014;Zhangetal.2016b)，自2006年以来，中国暴发高致病 14猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究性PRRS，给中国的生猪产业造成不可估量的经济损失，国内学者相继开发的JXA1-R株、HuN4-F112株和TJM-F92株主要用于防控猪群免于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的困扰(Liuetal.2017;Liuetal.2015;Xuetal.2012)。虽然减毒活疫苗在防控PRRSV传播发挥着重大作用，但是其自身仍存在一定缺陷：第一，其防控PRRS的有效性仍需要提升，最新研究数据显示，现有针对PRRSVI和II毒株的活疫苗，免疫猪体以后，会产生较弱的体液和细胞免疫反应(Diazetal.2006;Zuckermannetal.2007)，而且免疫后仅对同源毒株保护较大，对于异源差异较大的毒株保护率极低(Charerntantanakul2012;Rocaetal.2012)；第二，活毒疫苗还要注意“安全性”的问题，即减毒活疫苗存在“返强”的可能(Nielsenetal.2001)，兽医临床研究报道，免疫后IngelvacPRRSRRRMLV猪体后，采集PRRS发病后期的病料分离得到地方毒株，测序后发现这些毒株的核苷酸序列与疫苗株一样，说明弱毒疫苗株出现“返祖”现象(Wangetal.2010)，另外，相关研究发现：疫苗株和野毒株出现重组现象，这些都是导致其不安全的潜在因素；第三，弱毒疫苗免疫可能加剧导致猪体抗体依赖性增强作用（Antibody-DependentEnhancementADE）的出现，病毒猪体感染后会刺激机体产生中和抗体和亚中和抗体，其中中和抗体有利于PRRSV清除，但是，由于PRRSV弱毒株免疫早期，产生中和抗体很少，此时机体会有一些亚中和抗体(Yoonetal.1996;Yoonetal.1997)，当野毒感染，这些亚中和抗体会结合野毒株形成复合物，由Fc受体介导入肺泡巨噬细胞，反而加剧PRRSV感染(Nanetal.2017)。灭活疫苗，是通过物理或者化学工艺使病毒的活性丧失，其相对于减毒弱毒苗更安全，自PRRS暴发以来，许多灭活疫苗面世用于控制PRRSV，相关研究表明，针对PRRSV的众多灭活疫苗保护猪群免于野毒感染的效果较差(Renukaradhyaetal.2015)，主要表现在：灭活疫苗免疫后，仅表现为抗体水平提高，但是猪体检测不到针对PRRSV的特异性抗体（包括中和抗体），同时细胞免疫的效果较差(Bassaganya-Rieraetal.2004;Pirasetal.2005;Vanheeetal.2009;Zuckermannetal.2007)。科研人员为了弥补上述缺陷开发出许多佐剂，用于提高灭活苗的免疫效果，针对PRRSV两种基因型的灭活疫苗：例如由○R梅里亚实验室研发的KV/ADJ，主要针对PRRSV-1毒株，同时由英特威PRRomiSe用于防控PRRSV-2毒株，虽然这两种疫苗与以前灭活苗相比，能明显提升猪体的体液免疫，产生较高的中和抗体，但是由于产生的中和抗体水平较低，仍不足以清除PRRSV(Niluboletal.2004;Zuckermannetal.2007)。最新研究发现，用聚乳酸乙醇酸或者结核分支杆菌的全细胞裂解液作为佐剂与纳米颗粒级的灭活疫苗混合，通过滴鼻途径给药，可以激发猪体产生交叉免疫保护反应，可以抵抗多种病毒的感染(Binjawadagietal.2014a;Binjawadagietal.2014b)。但是由于灭活疫苗自身局限性，其注射机体后激发的免疫反应有限，对于疫病防控的有效性较差，因而后期开发研制过程仍然需要大力改进。病毒载体疫苗抵抗PRRSV的研究，目前用于制备PRRSV的复制缺陷型的病毒载体主要包括，痘病毒和腺病毒载体，例如：GagnonCA等用腺病毒载体表达GP5皮下 第一章PRRSV受体及抗病毒研究进展15免疫猪，攻毒后，在第10天和21天进行血清学和中和抗体检测，试验结果发现，与空白组对比我们发现腺病毒表达GP5组会产生较高的中和抗体(Gagnonetal.2003)。ShenG等报道用重组痘病毒载体表达PRRSVORF3和ORF5免疫猪后，攻同型毒60天后，与对照相比，试验组免疫重组GP3和GP5组猪体在体温，病毒血症和淋巴结组织中病毒载量等方面明显低于对照组，这些研究说明病毒载体疫苗可以提供一定保护作用(Shenetal.2007)。对于亚单位疫苗抵抗PRRSV的研究，主要将病毒的ORF3，ORF5和ORF7作为候选基因，例如，利用转基因技术将PRRSVM蛋白导入玉米，给BALB/c小鼠口服，试验结果表明小鼠产生较高水平的中和抗体和细胞因子IFN-γ(Huetal.2012)，本研究给PRRSV防控提供新的思路。研究人员用猪热休克蛋白gp96作为免疫佐剂，辅助多抗原表位疫苗Cp1andCp2免疫，试验结果发现，与弗氏佐剂对照组相比，gp96在能够明显增强针对猪体PRRSV亚单位疫苗体液和细胞免疫应答，其中TNF-α，IFN-γ，和IL-12明显升高(Chenetal.2012)。另外，有研究人员用大肠杆菌表达获得PRRSVGP5亚单位疫苗进行免疫猪两次，做攻毒试验，试验结果表明，与对照组相比，免疫组猪群临床呼吸症状减轻明显、且猪体产生中和抗体含量提高(Prietoetal.2011)。关于核酸疫苗抵抗PRRSV的研究，最新研究先用针对PRRSVN蛋白的核酸疫苗提前免疫后，两周后用弱毒疫苗继续免疫，可以明显改善猪体针对PRRSV的免疫力，主要表现在中和抗体水平和针对PRRSV产生的IFN-V明显提升，同时IL-10表达明显下降(Sirisereewanetal.2017)。另外研究发现用密码子优化过的PRRSVGP5的DNA疫苗pCA-U-optiGP5免疫猪体，可以诱导产生明显Th1型细胞免疫反应，攻毒后与对照组相比，免疫pCA-U-optiGP5疫苗组，其病毒复制和组织分布明显降低(Houetal.2008)。DuL等构建猪谷胱甘肽过氧化物酶-1（GPX1）和病毒GP5蛋白共表达的核酸疫苗载体pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5免疫鼠和猪体，可以刺激机体产生针对较高GP5的抗体，中和抗体以及IFN-γ水平，与弱毒苗JXA1-R免疫组相比，pcDNA3.1-GPX1-LSynORF5核酸疫苗组虽然诱发的细胞免疫很高，但是体液免疫较差，不足以保护猪体抵抗强毒感染(Duetal.2017a;Duetal.2017b)，虽然核酸疫苗能对猪体产生一定保护作用，但是其抵抗野毒的感染仍然非常有限。1.5本研究的目的与意义PRRS自暴发至今30年之久，每年都给全球范围内的养猪业带来的巨大的经济损失。由于PRRSV具有高度变异性，持续性感染以及感染过程中机体存在ADE效应(Duetal.2017c)，现有的疫苗并不能彻底地控制该病，因此必须尝试新型抗病毒药物。MYH9作为细胞受体或者重要细胞因子参与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），疱疹病毒（HSV-1），血小板减少综合征病毒（SFTSV）以及Epstein-Barrvirus（EBV）的入侵和感染过程。但是，MYH9结合病毒区域作为病毒进入的抑制剂筛选目前尚未见报道。 16猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究综上所述，本课题延续前期研究基础：利用针对PRRSVGP5的抗独特型抗体Mab2-5G2从PRRSV易感细胞鉴定出重要的受体因子MYH9，PCR扩增获得猪源MYH9全长序列，并且从中鉴定出其参与PRRSV入侵的关键区域位于MYH9的羧基端aa1651-1960（命名为PRA），同时原核表达获得重组表达PRA蛋白，发现其具有广谱的抗PRRSV作用，并深入探索其抗病毒机制，更重要的是，证明Mab2-5G2可以竞争抑制PRRSV感染宿主细胞，同时借助结构生物学方法预测Mab2-5G2与MYH9的结合位点位于E1670，K1673，E1679和I1683，功能验证这几个位点可能是MYH9参与介导病毒入侵的重要位点，本研究为进一步阐述PRRS入侵机制和研发新型的抗病毒制剂提供科学依据。 第二章PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9区域的确定17第二章PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9区域的确定为了鉴定Mab2-5G2与猪源MYH9结合区域，本研究通过比对分析人源、猴源和鼠源的MYH9序列，设计间并引物，PCR扩增获得猪源MYH9基因全长，同时利用HEK-293T细胞真核表达猪源MYH9不同截短体，借助免疫印迹试验初步确定Mab2-5G2结合区域。2.1材料与方法2.1.1细胞系和菌株试验所需MARC-145细胞，由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室保存；原代PAM细胞取自于PRRSV阴性仔猪（6周龄），该细胞用含10%胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）的RPMI1640培养；MARC-145用含10%胎牛血清的DMEM培养，在37oC、5%CO2的温箱中培养；TOP10和DH10B感受态细胞购自博迈德公司。2.1.2主要试剂FBS购自Gibco公司；“舒泰®麻醉剂”购自西安京西宠物医院；PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2由本实验室制备和保存；鼠源Anti-HA购于Sigma-ALDRICH，PVDF膜购自Millipore公司；ECL化学发光检测试剂盒和Trizol试剂盒购北京东方生物有限公司；pMD-18T克隆载体和反转录酶PrimeScriptRTmastermix(RT-PCR)购自Takara公司；T4DNA连接酶、Q5®HotStartHigh-Fidelity2×MasterMix购自NEB公司；质粒提取试剂盒、普通胶回收试剂盒购自北京全式金公司；Sepharose4FF琼脂糖凝胶购自GE公司。2.1.3主要仪器倒置荧光显微镜（LeicaAF6000）；水平离心机（BeckMan）；培养细胞用生物安全柜（ESCO）；PCR仪（AppliedBiosystem）；高速低温离心机（Thermo）；凝胶成像系统（伯乐）；核酸电泳(北京六一)；蛋白电泳仪和半干转膜仪（Bio-Rad）；CO2细胞培养箱（ESCO）；超低温冰箱（thermo）和高压蒸汽灭菌锅（SANYO）。2.1.4原代PAM细胞收集将6~8周龄SPF级的仔猪用“舒泰®麻醉剂”按照体重给药进行全身麻醉后，前腔静脉放血致死，打开胸腔后逐步用剪刀和刀柄小心地剥离出肺脏，主要用线绳扎紧肺气管上端，做好与外界空气隔绝，防止污染，同时将心脏和肺脏分离，用含10倍双抗PBS清洗肺脏表面，同时用无菌的酒精棉包裹肺部气管，尽可能减少肺表面红细胞对PAM收集造成污染，将肺脏放置于玻璃托盘中，迅速移至细胞间生物安全柜，剪开气管后，用含有双抗的无菌PBS从气管切口灌入肺脏，每次400mL，轻轻揉捏或者反复拍打肺 18猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究脏后，轻轻提起肺部底部，将灌洗液由肺脏倒入收集瓶中，反复灌洗5次；用400目细胞筛过滤收集的PAM灌洗液，室温600g离心10min，弃掉上清PBS，用无菌的PBS洗涤两遍，弃去上清，用含有10%DMSO的FBS重悬细胞，按照1×107个/支分装冻存至液氮备用。2.1.5猪源MYH9全长扩增复苏原代PAM细胞后，室温500g离心10min后弃掉上清，收集细胞，用Trizol试剂盒提取PAM细胞总RNA，反转录成cDNA，体系如下：表2-1反转录体系Table2-1Reversetranscriptionsystem反转录体系体积（μL）ReversetranscriptionsystemVolume(μL)PrimeScriptRTmastermix5.0RNA4.0DEPCH2O1.0Total10.037oC反应30min，85oC作用5s，最后4oC保持10min，反转录产物可直接用于PCR反应。表2-2PCR体系Table2-2PCRreactionsystemPCR体系体积（μL）PCRreactionsystemVolume(μL)Q5®HotStartHigh-Fidelity2×MasterMix15.0上游引物（10µM）2.0下游引物（10µM）2.0cDNA2.0ddH2O9.0PCR反应程序如下：98oC30s，98oC8s，58oC15s，72oC2min，30个循环，72oC延伸10min最后4oC保存。我们参考人源（GenBank:CR456526.1），鼠源（GenBank:AJ312390.1）和猴源MYH9（本实验室前期扩增保存）序列，设计间并引物，将猪源MYH9全长分为3段，而且3个片段之间重叠150~200碱基，扩增引物如下：sMYH9-1-F：5’ATGGCACAGCAAGCTGCCGA-3’sMYH9-1-R：5’AGCTTGGCCAGCTGCTCCTTGTA-3’sMYH9-2-F：5’AGGGCACCCACCCCAAGTTCCAGAAGCC-3’sMYH9-2-R：5’CTGCTTGAGCTTGGTGCTCAGGCTC-3’ 第二章PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9区域的确定19sMYH9-3-F：5’GCCGACAAGGTCACCAAGCTGCAGGT-3’sMYH9-3-R：5’GCTCTAGATTATTCGGCAGGTTTGG-3’分别用针对sMYH9-1-F1和sMYH9-1-R，扩增片段1：sMYH9-1，用sMYH9-2-F和sMYH9-2-R扩增片段2：sMYH9-2，用sMYH9-3-F和sMYH9-3-R扩增片段3，用1%核酸胶分析后，切胶回收目的片段后，分别将sMYH9-1，sMYH9-2和sMYH9-3片段克隆pMD-18T载体，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，拼接获得猪源MYH9基因全长序列，同时设计扩增全长MYH9引物：XbaI-MYH9-Forward：5’-GTCTAGAATGGCACAGCAAGCTGCCGA-3’BamHI-MYH9-Reverse：5’-GGATCCTTATTCGGCAGGTTTGGCCTCA-3’通过OverlapPCR技术扩增获得MYH9基因，并且通过XbaI和BamHI酶切位点克隆构建到pTrip载体上，双酶切鉴定后，由上海生工测序分析正确后，将质粒命名为pTrip-MYH9。2.1.6Mab2-5G2结合MYH9区域的确定我们实验室前期用针对PRRSVGP5抗独特型抗体Mab2-5G2从易感细胞PAM和MARC-145鉴定出NMHCII-A（MYH9）分子，NMⅡ是由3对多肽组成：两条分子量为230ku的重链（NMHC），两条20ku的调节轻链（MLC20）和两条17ku的必需轻链（MLC17）。依据重链的不同，可将NMⅡ分为NMⅡ-A、B、C3个亚型，三者的氨基酸同源性高达64%~80%，其氨基酸差异主要位于氨基端和羧基端。为此分别设计引物扩增氨基端片段MYH9-1（aa1-665），羧基端片段MYH9-3（aa1275-1960）和PRA(aa1651-1960)，引物如下：MYH9-1-F：5’GGGGTACCATGGCACAGCAAGCT3’MYH9-1-R：5’CCGCTCGAGGTTGGTGTTTCTCAGTGTG3’MYH9-3-F：5’GGGGTACCCCAAGCTGCAGGTG3’MYH9-3-R：5’CCGCTCGAGTTCGGCAGGTTTGGC3’PRA-F：5’GGGGTACCATGCGGGAGCTGGAGGACA3’PRA-R：5’CCGCTCGAGTTCGGCAGGTTTGGC3’分别将3个片段克隆构建到真核表达载体pCAGEN-HA，通过内切酶KpnI和XhoI酶切鉴定，将测序正确的质粒，分别按照PEI和质粒1:6比例混合后，转入HEK-293T，6~8h后换液10%DMEM，48h后，收取细胞，加入2×SDSloadingbuffer，裂解细胞，煮样10min，跑10%SDS-PAGE胶两块，点样顺序按照MYH9-1HA、MYH9-3HA和PRAHA转膜后分别用抗HA标签的抗体和Mab2-5G2检测，PBST洗涤3遍，二抗用辣根过氧化物酶标记抗鼠抗体，PBST洗涤3遍，最后用ECL发光显色。 20猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究2.2试验结果2.2.1原代PAM细胞收集与显微镜观察图2-1原代PAM细胞观察（200×）Fig.2-1PAMscellmorphologyobservation(200×)将分离的PAM细胞按照1×106个/铺入12孔板，将细胞板放置显微镜下观察（放大倍数200倍），如图2-1所示，试验分离的PAM细胞呈现圆形，个个饱满、透亮，大小均一，几乎没有红细胞和细胞碎片。2.2.2猪源MYH9全长基因的克隆收取正常的PAM细胞，提取细胞总RNA，利用反转录酶PrimeScript™RT.mastermix进行cDNA合成。按照猪源MYH9示意图（图2-2）所示，设计简并引物，通过PCR扩增得到了带有重叠区域的3个片段（图2-3），片段长度分别为1995bp（MYH9-1）、2325bp（MYH9-2）和2058bp（MYH9-3），电泳结果显示所扩增片段与设计大小相符。图2-2MYH9截短示意图Fig.2-2SchematicillustrationoftheMYH9truncation 第二章PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9区域的确定21图2-3MYH9三个片段PCR扩增片段凝胶电泳Fig.2-3GelelectrophoresisofMYH9amplifiedfragmentsbyPCR将扩增的3个片段分别克隆pMD-18T载体中，通过OverlapPCR扩增MYH9基因全长（图2-4），将MYH9基因通过XbaI/BamHI双酶切后克隆到pTrip载体上的质粒命名为pTrip-MYH9，挑阳性质粒使用限制性内切酶XbaI/BamHI酶切鉴定（图2-5），鉴定结果表明酶切出的条带与预期大小一致，说明质粒pTrip-MYH9构建成功。图2-4MYH9全长Overlap-PCR扩增凝胶电泳Fig.2-4GelelectrophoresisofMYH9amplifiedfragmentsbyOverlap-PCR图2-5pTrip-MYH9质粒双酶切凝胶电泳Fig.2-5DoubledigestofpTrip-MYH9plsmids 22猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究2.2.3Mab2-5G2结合MYH9区域的探究哺乳动物的NMII包括3个不同的亚型，根据其重链命名为NMII-A、NMII-B、NMII-C。三者的氨基酸同源性高达64%~80%，其氨基酸差异主要位于氨基端和羧基端，基于此分析，分别构建MYH9的羧基端MYH9-1（aa1-665）、氨基端的片段MYH9-3（aa1275-1960）和PRA（aa1651-1960）融合HA标签的重组质粒，双酶切结果如图2-6所示，说明重组质粒pCAGEN-MYH9-1、pCAGEN-MYH9-3和pCAGEN-PRA构建成功。图2-6pCAGEN-MYH9-1，MYH9-3和PRA质粒双酶切凝胶电泳Fig.2-6doubledigestofpCAGEN-MYH9-1,MYH9-3andPRA将3个重组质粒分别转染HEK-293T细胞48h后，分别收细胞进行免疫印迹检测，先用鼠源抗HA抗体检测，结果如图2-7所示，相对应的3个重组蛋白均获得有效表达。图2-7Anti-HA抗体检测pCAGEN-MYH9-1，MYH9-3和PRA质粒表达Fig.2-7DetectionofthepCAGEN-MYH9-1,MYH9-3andPRAplasmidsexpression 第二章PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9区域的确定23withanti-HAantibody同时用Mab2-5G2作为一抗进行免疫印迹检测，结果如图2-8显示：MYH9的氨基端片段MYH9-1HA不与Mab2-5G2结合，Mab2-5G2的结合区域大致区域位于MYH9羧基端aa1651-1960，即PRA蛋白。图2-8Mab2-5G2检测pCAGEN-MYH9-1，MYH9-3和PRA质粒表达Fig.2-8DetectionofthepCAGEN-MYH9-1,MYH9-3andPRAplasmidsexpressionbyMab2-5G22.3讨论抗独特型抗体（AId）与初始抗原分子表面的决定簇互为“内影像”关系，因此其具有模拟初始抗原功能和结构的特性，许多病毒的受体蛋白就是借助这一特性鉴定出，例如，呼肠弧病毒的受体Mr67,000就是利用针对于病毒结构蛋白的抗独特型抗体模拟病毒筛选(Coetal.1985)，另外，针对蜱传脑炎病毒的抗独特型抗体从易感细胞筛选到受体蛋白(Kopeckyetal.1999)。相关研究表明病毒受体的筛选不仅有利于解释该病毒入侵机制，而且体外表达相关受体蛋白可以作为病毒阻断剂来抑制其感染(Xiaetal.2018)。基于上述研究理论，我们实验室前期针对PRRSVGP5蛋白制备抗独特型体Mab2-5G2，该抗体可以特异地识别宿主细胞表面MYH9分子(Zhouetal.2008)，首先，我们比对不同种属MYH9序列，设计简并引物扩增猪源MYH9，同时构建MYH9的3个截短体重组质粒pCAGEN-MYH9-1、pCAGEN-MYH9-3和pCAGEN-PRA，分别转染真核细胞HEK-293T，借助免疫印迹试验初步确定Mab2-5G2大致结合区域位于MYH9的羧基端即aa1651-1960，命名该区域为PRA。2.4小结本研究通过设计间并引物扩增获得猪源MYH9基因全长（序列详见附录），借助免疫印迹试验确定Mab2-5G2与MYH9结合区域位于PRA（aa1651-1960）。 24猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究最新研究发现，体外表达与PRRSV囊膜蛋白互作CD163SRCR5-9以及CD169N150可以显著阻断病毒感染(Chenetal.2014;Xiaetal.2018)。由此推断，Mab2-5G2作为PRRSV囊膜蛋白GP5模拟物(Zhouetal.2008)，Mab2-5G2与MYH9的结合区域初步鉴定位于其羧基端PRA（aa1651-1960），本章研究为了探讨重组表达PRA蛋白是否具有阻断PRRSV感染的能力，并进一步揭示其阻断病毒感染的机制。3.1材料与方法3.1.1毒株、细胞系和菌株试验用PRRSV-2型毒株VR-2332（GenBank:EF536003.1），VR-2385(Mengetal.1994)，CH-1a（GenBank:AY032626）以及3个高致病PRRSV毒株SD16（GenBank:JX087437.1），JXA1（GenBank:EF112445.1）和GD-HD（GenBank:KP793736.1）毒株，MARC-145，PK-15CD163和CRL-2843CD163细胞系由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室保存；PRRSV-1毒株：GZ11-G1由中国农业大学杨汉春教授惠赠，PRRSVP073-3由河南农业大学田克恭教授惠赠，sfGFP-TEV-His6Nd2质粒由复旦大学丁澦副教授惠赠；原代PAM细胞取自于PRRSV阴性仔猪（6~8周龄）；CRL-2843CD163细胞由含10%胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）的RPMI1640培养；MARC-145、PK-15CD163用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养，在37oC、5%CO2的温箱中培养；感受态细胞Top10、BL21（DE3）由本实验室保种和制备。3.1.2试验所需主要试剂针对PRRSVGP5蛋白鼠源多克隆抗体，针对N蛋白单克隆抗体6D10和PRRSV阳性血清由本实验室制备和保存；抗β-actin单克隆抗体和DAPI购自Sigma公司；红色荧光染料或绿色荧光染料标记的羊抗鼠抗体，红色荧光染料标记羊抗猪抗体购自JacksonImmunoResearch公司；细胞培养液DMEM，RPMI1640以及胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司；反转录酶PrimeScriptRTmastermix购自Takara公司；T4DNA连接酶、Q5®HotStartHigh-Fidelity2×MasterMix购自NEB公司；质粒提取试剂盒，TMBELISA显色液购自天根生化科技有限公司；普通胶回收试剂盒购自北京全式金公司；Ni填料cOmpleteHis-tagPurificationColumn购自Roche；strep-tactin填料购自GE；转染试剂脂质体2000（Lipofectamine®2000）购自invitrogen，其他试剂参考2.1.2。3.1.3主要仪器超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物科技有限公司；超微量分光光度计（BioTek）；GEAKTAPure蛋白质层析纯化系统；labscaleTFF超滤系统购自密理博公司；其余参考 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究252.1.3。3.1.4PRA克隆构建收集1×106个原代PAM细胞，按照Trizol操作说明提取细胞总RNA，获得RNA后立即将其反转录为cDNA。反转录体系以及PCR反应体系参见步骤2.1.5。其中PRA扩增引物序列如下：PRA-F：5’ACGCGTCGACATGCGGGAGCTGGAGGA3’PRA-R：5’GCTCTAGATTATTCGGCAGGTTTGG3’将扩增的PCR产物回收，用SalI和XbaI酶切，通过T4连接酶将目的基因克隆到pCold-SUMO载体中，挑选阳性克隆交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的质粒命名为pCold-SUMO-PRA。3.1.5蛋白表达将pCold-SUMO-PRA质粒转入BL21（DE3）感受态细胞中，将其涂到含氨苄抗性的固体LB平板，挑取单克隆后，接种含抗性LB摇菌，及时冻存菌种，取菌种加入5mL液体LB中，37oC活化2~3h待OD600值达到0.6时，按照1:50比例扩大到1升LB中，待OD600值达到0.6后，加入0.1MIPTG，将菌液转入15oC诱导16~18h，离心收菌后，弃掉上清，留沉淀，加入预冷的20mL裂解液（50mMTris，50mMNacl，1mMEDTA，1mMAEBSF，pH8.0，5%glycerol和蛋白酶抑制剂（Cooktail）菌体，超声仪低温条件下破碎菌体，12000g4oC离心30min，将大肠杆菌裂解上清放冰上，用0.22µm滤膜过滤后，准备过Ni柱纯化。3.1.6PRA蛋白Ni柱纯化酶切去除标签（1）平衡Ni柱，先用50mL超纯水将Ni柱的保存液置换出，同时加入5倍柱体积的缓冲液BufferA（50mMTris，150mMNacl，20mM咪唑，pH8.0）平衡Ni柱。（2）将收集的大肠杆菌体加入BufferA重悬后，超声破碎菌体，12000g离心30min后留上清加入Cooktail和PMSF，将大肠杆菌上清样品上柱，速度约1mL/min，柱子流出液为样品用SDS-PAGE胶。（3）用10倍柱体积BufferA洗Ni柱上杂蛋白，速度约1mL/min，至流出液蛋白指示剂CBB指示无色为止，流出液样品，留样品用SDS-PAGE胶分析。（4）用BufferB（50mMTris，150mMNaCL，250mM咪唑，pH8.0）速度约为1mL/min，以洗脱目的蛋白，将PRA蛋白样品放至50mL离心管，同时留取少量样品用蛋白胶分析。（5）将重组烟草蚀纹病毒(TobaccoEtchVirus，TEV)蛋白酶按照1：200体积比，加入目的蛋白SUMO-PRA中，添加终浓度为3mM的DTT，25oC酶切过夜，切去SUMO标签，将酶切后蛋白加入10kDa透析袋子中，放入2L透析液（50mMTris，50mMNacl， 26猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究pH8.0）中，4oC透析过夜，每6h换液一次。（6）将透析后的样品再过Strep-Tactin柱，流速1mL/min，重复挂Strep-Tactin柱两次，收集流出液为目的蛋白，最后用含2.5mM脱硫生物素清洗柱子上的SUMO标签，同时留样品准备SDS-PAGE胶分析。3.1.7rTEV蛋白酶表达纯化关于蛋白内切酶rTEV的表达纯化，步骤严格参照丁澦副教授前期研究报道(Wuetal.2009)。操作步骤简言如下：将sfGFP-TEV-His6Nd2质粒转入Rosetta（DE3）pLysS感受态细胞中，涂到氨苄抗性的固体LB平板，挑取单克隆菌落活化后，及时冻存菌种，取适量菌种加入5mL液体LB中，37oC摇8~12h，将菌液按照1:50比例扩大到1L自诱导型培养基中，待OD600值达到0.6后，直接将摇瓶放置冰水混合物中预冷15min，将菌液转入19oC摇床诱导表达18~20h，4oC高速离心收菌后，弃掉上清，留下亮绿色的菌体沉淀。将菌体沉淀用PBS重悬，超声破碎后，将rTEV蛋白酶的上清借助Ni柱纯化，纯化过程中所需buffer和纯化步骤参考SUMO-PRA的纯化，每一步留样品借助12%SDS-PAGE胶和考马斯染色分析。3.1.8重组PRA蛋白活性的鉴定3.1.8.1ELISA检测PRA结合抗独特型抗体Mab2-5G2将纯化的PRA蛋白用PBS稀释按照400ng包被ELISA板子上，放置4oC过夜，5%BSA37oC封闭2h，Mab2-5G2（浓度1mg/mL）按照10倍比稀释，鼠抗MYC标签抗体作为阴性对照，PBST洗涤3遍，二抗用辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体（1:5000），PBST洗涤5遍后，加入TMB显色液，避光室温放置10min，加入3MH2SO4终止反应，将ELISA板子放到酶标仪中读取OD450读数值。3.1.8.2免疫印迹检测PRA与抗独特型抗体Mab2-5G2结合将纯化好的SUMO-PRA蛋白去除标签的样品跑12%SDS-PAGE胶，转PVDF膜后，用5%BSA封闭，加入一抗Mab2-5G2（浓度1mg/mL）按1:2000稀释，辣根过氧化酶标记鼠源抗体作为二抗（1:5000），PBST洗涤3遍后，将免疫印迹膜滴加ECL发光液后显色。3.1.9PRA蛋白影响PRRSV复制3.1.9.1相对定量（QPCR）检测PRRSV的感染情况将PRA蛋白与PRRSVs分别混合37oC放置1h，分别孵育MARC-145和PAM细胞1h后，PBS洗涤3遍，换成3%DMEM24h，收取细胞后加入Trizol，提取RNA，用反转录酶PrimeScriptRTmastermix按照1µg反转录成cDNA，用GAPDH作为内参，针对PRRSVN基因的特异引物，引物序列如下：aN-F：5’ATGGCCGGTAAAAATCAGAGCC3’(PRRSV-2型)N-R：5’TTAATTCGCACCCTGACTGG3’ 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究27bN-F：5’ATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGC3’(PRRSV-1型)N-R：5’TCATGCTGAGGGTGATGCTGTG3’GAPDH-F：5’CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC3’GAPDH-R：5’GACGCCTGCTTCACCACCTTCT3’与对照组相比，测定PRRSV感染情况。同时收取细胞上清，提取RNA，反转录为cDNA，以pMD18T-ORF7a和Nb为模板，评价PRRSV感染上清子代病毒拷贝数。3.1.9.2蛋白免疫印迹评价PRRSV的感染情况将PRRSV易感细胞MARC-145，PAM，PK-15CD163和CRL-2843CD163分别铺入6孔板中，PRRS病毒按照一定的病毒量与PRA蛋白混合，接毒24h后，分别收取细胞，加入NP40裂解液，冰上裂解30min，加入Cooktail，14000g离心10min，上清加入5×SDSloadingbuffer，沸水煮样品10min，跑12%SDS-PAGE胶，转PVDF膜，一抗用抗PRRSVN蛋白抗体6D10，二抗用辣根过氧化酶标记抗鼠二抗（1:5000），PBST洗涤3遍后，用ECL发光液显色。3.1.9.3病毒上清TCID50测定病毒接种易感细胞后，按照不同时间点收取细胞上清液，病毒滴度测定使用96孔细胞培养板进行，首先将MARC-145细胞按照1×105个/孔铺布于96孔细胞板，上清病毒液用无血清DMEM培养基作10倍稀释后，接种于单层细胞孔中（每个梯度8孔重复），置于37oC，5%CO2培养箱中培养3-5天，根据Reed-Muench法计算各个样品的TCID50，并最终绘制病毒生长曲线。3.1.10PRA蛋白细胞毒性检测将PRRSV易感细胞MARC-145，PK-15CD163，CRL-2843CD163和原代PAM细胞计数铺到96孔板过夜，加入不同浓度（0.5µM，1µM，2.5µM和5µM）PRA蛋白，每个样品做五个重复孔，24h后，加入10µLCCK-8试剂，37oC作用2h，此过程要注意蒸发问题，在96孔板周围一圈加相同量的PBS，同时把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发，将细胞板放入酶标仪波长读取OD450数值。3.1.11PRRS病毒和可溶性PRRSVGP5纯化为了进一步探讨PRA蛋白阻断PRRSV感染机制，我们借鉴LiuBohua等人前期研究的PRRSV纯化方法(Bohuaetal.2016)。首先，用MARC-145增殖PRRSVSD16毒株2L，反复冻融1次后，12000g高速离心留上清，弃去沉淀，然后，将病毒培养上清用密理博切向流超滤系统100kDa浓缩包，去除一部分杂蛋白，进一步将浓缩液借助GEAKTAPure层析纯化系统用GE4FF琼脂糖凝胶进行分离，收集第一个峰即为PRRS病毒，最后用100kDa蛋白浓缩管浓缩PRRSV，用蛋白胶分离后，借助考马斯亮蓝法和银染色法分析，同时转PVDF膜，用PRRSV阳性血清检测，剩余病毒分装冻存-80oC备用。 28猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究基于我们实验室前期的研究基础，针对PRRSVGP5抗独特型抗体Mab2-5G2具有模拟GP5的功能，我们推测PRA阻断病毒感染可能与PRRSVGP5蛋白互作，为了进一步验证我们的设想，首先用偶联鼠抗flag抗体溴化氢激活的4B柱子从稳定表达PRRSVGP5的MARC-145-GP5flag细胞系，纯化得到可溶GP5蛋白，取少量GP5蛋白用SDS-PAGE胶分离，转PVDF膜用PRRSV阳性血清鉴定。可溶性PRRSVGP5蛋白纯化：首先将鼠源抗flag抗体偶联到溴化氢激活的琼脂糖凝胶柱上，流程如下：（1）称取溴化氢激活4B冻干粉0.1g，用1mM盐酸重悬（1g冻干粉对应3.5mL体积），待琼脂体积膨胀后，用超纯水冲洗2个柱体积，再用NaHCO3pH8.5缓冲液平衡填料。（2）将透析过的抗flag单克隆抗体根据比例与凝胶偶联过夜4oC（琼脂糖凝胶：anti-flagantibody=1mL:10mg）；用偶联液漂洗5~10倍柱体积。（3）加入10倍柱体积0.1MpH8.0Tris-HCL缓冲液终止偶联反应。（4）用5倍柱体积bufferA(0.1M醋酸、0.5MNaClpH4.0)和bufferB(0.1MTri-HCL、0.5MNaClpH8.0)交替漂洗各5遍，PBS缓冲液平衡后待用。（5）收取MARC-145-GP5flag细胞系（约2×109个），加入NP40细胞裂解液，冰上裂解30min，加入蛋白抑制剂Cooktail，14000g高速离心15min，将细胞上清与偶联好的填料在4oC进行抗原和抗体结合6h。（6）用PBS缓冲液冲洗5倍柱体积后，加入一定量的甘氨酸（pH2.4）洗脱目的蛋白，马上用NaHPO4（pH11）中和。BCA试剂盒测定蛋白浓度后，SDS-PAGE胶分析，同时做免疫印迹，PRRSV阳性血清作为检测抗体。（7）洗脱的可溶GP5蛋白留存以备下一步ELISA用。3.1.12病毒捕获试验前期试验证明PRA蛋白可直接作用PRRS病毒粒子，为了探讨PRA作为受体阻断剂是否可以直接结合病毒，（1）取100µL纯化好的PRRSV（滴度：7×107.875pfu）包被到96孔ELISA板子上；（2）6%脱脂奶封闭1h，PBST洗涤5遍；（3）取PRA蛋白和对照蛋白PCV2Cap各1µg，分别加入96孔中，37oC孵育1h，同时鼠抗PRRSVGP5多抗血清血清作为阳性对照，PBST洗涤3遍；（4）加入anti-His抗体作为一抗，37oC，2h，PBST洗涤3次；（5）加入HPR标记羊抗鼠抗体作为二抗，37oC，2h，PBST洗涤3次；（6）加入100µLTMD显色液后，25oC避光静置10min，加入3M硫酸终止反应，酶标仪读取OD450数值。我们进一步设计反向ELISA，即用纯化PRA和PCV2Cap蛋白包被ELISA板，4oC 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究29过夜，将5%脱脂奶37oC封闭2h后，加入纯化好的PRRS病毒，反应1h后，PBST洗涤5次，加入Trizol200µL，提取RNA，进行RT-PCR，用针对PRRSVGP5基因引物进行PCR扩增，用1%核酸胶鉴定。为了验证GP5蛋白与PRA结合。首先，将纯化好的PRA蛋白400ng包被到ELISA板子上，5%脱脂奶封闭过夜，PBST洗涤3次，加入上面从MARC-145-GP5flag细胞裂解液纯化PRRSVGP5蛋白，同时鼠抗PRRSVGP5多抗血清作为阳性对照，正常MARC-145细胞裂解液作为阴性对照，用小鼠抗GP5血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的抗体作为二抗，ELISA显色和数据采集参照上述操作。3.1.13免疫共沉淀试验构建融合表达myc标签的PRA真核质粒，引物如下PRA-F：5’TATGAATTCATGCGGGAGCT3’；PRA-R：5’TATGCTAGCTTATTCGGCAGGTTT3’。将PRA通过EcoRI和NheI克隆到pCAGEN载体上，将测序正确的PRA质粒，转染COS-7-GP5flag细胞系中，转染48h后收细胞用NP40裂解液，冰上裂解30min，离心13000g15min，裂解上清一分为二分别加入鼠源抗flag和无关IgG，过夜4oC，第二天加入预处理的DynabeadsproteinG，同时加入10%DMEM，4oC混合2h，离心收取Dynabeadsbeads，加入2×loadingbuffer煮样跑胶转膜，5%脱脂奶粉封闭后，同时分别用anti-myc和兔源anti-flag检测目的蛋白，同时孵育相应二抗，ECL曝光采集数据。3.1.14PRA预处理PRRSV后减少对宿主细胞MYH9的募集原代PAM细胞按照2×104个/mL铺到带有爬片的6孔板，待细胞贴壁后，分别加入PRRSVSD1650MOI和PRRSV（50MOI）+PRA（50µM）蛋白混合物，放置4oC，吸附2h，转移到37oC，分别按照0min，5min，15min用4%多聚甲醛固定细胞10min，细胞用PBS洗3次，加入5%BSA封闭，37oC1h后，细胞用PBS洗3次，加入鼠抗Mab2-5G2（1:2000）一抗，特异识别MYH9，同时用PRRSV阳性血清（1:1000）作为识别病毒颗粒的抗体，二抗用绿色荧光标记羊抗鼠（1:5000）和红色标记羊抗猪抗体（1:5000），最后DAPI染色10min后，PBS洗涤5遍，将带有细胞的爬片加上Dako封到玻片上，用激光共聚焦显微镜拍摄照片。同时，为了探讨PRA蛋白处理PRRSV后，对宿主细胞内源性MYH9迁移的影响，我们将原代PAM细胞铺入10cm细胞培养皿中，24h后，加入PRRSVSD1650MOI和PRRSV+PRA蛋白混合放置于4oC，吸附2h，转移到37oC，分别按照0min，15min收取细胞，用膜提取试剂盒提取细胞膜蛋白，加入5×SDSloadingbuffer，煮样后跑SDS-PAGE胶转PVDF膜后，用膜蛋白Na+K+-ATPasein作为内参，Mab2-5G2作为MYH9检测抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠和抗兔的抗体作为二抗。为了评价PRA处理PRRSV后，MYH9总蛋白水平变化，我们将原代PAM细胞铺入10cm细胞培养皿中，24h后，加入PRRSVSD1650MOI和PRRSV+PRA蛋白混合 30猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究放置于4oC，吸附2h，转移到37oC，分别按照0min，15min，30min和60min收取细胞，加入NP40，冰上裂解30min，12000g离心30min，将上清加入5×SDSloadingbuffer，煮样后跑SDS-PAGE胶转PVDF膜后，用GAPDH作为内参，Mab2-5G2作为MYH9检测抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠和抗兔的抗体作为检测二抗。3.1.15PRA抑制PRRSV的内化过程病毒吸附试验：将原代PAM细胞按照2×105个/mL铺到6孔板，待细胞贴壁后，分别加入PRRSVSD1650MOI和PRRSV（50MOI）+PRA（50µM）蛋白混合组，PRRSV（50MOI）+Cap作为对照蛋白，4oC吸附2h，用PBS洗涤5次，去除细胞表面未结合的病毒，直接加入Trizol提取细胞总RNA，反转录cDNA，以GAPDH为内参，利用相对定量PCR方法检测进入PAM细胞内的病毒量。病毒内化实验：将原代PAM细胞按照2×105个/mL铺到6孔板，待细胞贴壁后，加入PRRSVSD1650MOI和PRRSV（50MOI）+PRA（50µM）蛋白混合组，4oC吸附2h，转移到37oC，15min后，用PBS洗涤3次，去除细胞表面未结合的病毒，胰酶消化收集后PBS洗涤3次以除掉细胞表面未进入的病毒。加入Trizol提取细胞总RNA，反转录cDNA，以GAPDH为内参，利用相对定量试验检测进入PAM细胞内的病毒量。3.2试验结果3.2.1PRA片段克隆和重组质粒构建提取PAM细胞的总RNA，cDNA的合成由PrimeScript™RT.mastermix完成。使用特异性引物对PRA片段进行PCR扩增（图3-1），目的片段长度为933bp，核酸电泳结果显示所扩增片段大小与预期相符。图3-1PRA片段PCR扩增片段凝胶电泳Fig.3-1GelelectrophoresisofPRAfragmentamplifiedfragmentsbyPCR将扩增片段酶切后连入pCold-SUMO载体中，限制性内切酶SalI/XbaI酶切鉴定结果显示，酶切出的条带与预期大小一致（图3-2）说明重组质粒pCold-SUMO-PRA构建成功。 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究31图3-2pCold-SUMO-PRA质粒双酶切Fig.3-2ThedoubledigestionproductsofpCold-SUMO-PRA3.2.2重组蛋白表达和亲和层析纯化为去除重组蛋白SUMO-PRA上的SUMO标签，我们首先使用Ni亲和层析纯化rTEV蛋白酶，将超声后的rTEV蛋白酶菌体上清，沉淀，过Ni的穿流液，10~20mM咪唑洗脱杂蛋白穿流液，以及250mM咪唑洗脱目的蛋白同时用SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染胶脱色后如图3-3所示，rTEV蛋白酶经Ni纯化后，纯度达到95%以上，大小为55kDa。图3-3重组TEV蛋白酶Ni柱纯化SDS-PAGE分析Fig.3-3SDS-PAGEanalysisofrecombinantPRAproteinpurifiedusingHisTrapHPcolumn将超声后的PRA菌液上清，沉淀，挂Ni的穿流液，10~20mM咪唑洗杂蛋白流出液，以及250mM咪唑洗脱目的蛋白，rTEV蛋白酶酶切液和纯PRA蛋白等样品同时跑SDS-PAGE胶，经考马斯亮蓝染色，脱色后如图3-4所示，经过Ni柱纯化后，带SUMO标签的PRA蛋白条带比较单一，经rTEV酶切后，再反挂strep-tactin柱子去除SUMO标签，最终获得高纯度的PRA蛋白，其纯度达到90%以上。 32猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图3-4考马斯蓝染蛋白胶分析重组PRA蛋白纯化和用rTEV酶切除SUMO标签Fig.3-4CoomassieBluegelanalysisofrecombinantPRAproteinpurifiedandremovedSUMOtagwithrecombinantTobaccoEtchVirusProtease3.2.3PRA蛋白活性鉴定3.2.3.1ELISA和WB检测PRA蛋白表达将纯化的PRA蛋白以400ng包被ELISA板，以PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2作为一抗，以抗MYC标签的单克隆抗体作为阴性对照，以HRP标记的羊抗鼠的抗体作为二抗，鉴定结果如图3-5所示，重组表达的PRA保持良好的空间构象，可以被抗独特型抗体Mab2-5G2所识别。图3-5间接ELISA鉴定PRA蛋白与抗独特型抗体Mab2-5G2的结合Fig.3-5IdentifiactionofPRAproteinsreactingwithMab2-5G2usingELISAmethodNi柱纯化后SUMO-PRA，rTEV蛋白酶酶切和去除标签后的PRA，跑SDS-PAGE胶转PVDF膜后用Mab2-5G2检测，结果如图3-6，结果说明纯化后的PRA保持良好的生物学活性，即线性状态的PRA同样可以被Mab2-5G2识别。 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究33图3-6Westernblot鉴定PRA蛋白与Mab2-5G2的结合Fig.3-6WesternblotaynalysisofthePRAproteinsreactingwithMab2-5G23.2.4病毒阻断试验3.2.4.1PRA蛋白阻断PRRSV感染将纯化的PRA蛋白与PRRSVSD16预混合1h以后，感染MARC-145细胞1h，PCV-2Cap蛋白作为阴性对照，PBS洗掉未结合PRRSV，37oC放置24h，分别收取细胞上清和细胞，从转录水平和蛋白水平评价PRRSV感染，结果如图3-7所示：PRA蛋白处理PRRSV后可以显著降低PRRSV的感染，且表现出明显的剂量依赖关系，即伴随着PRA浓度加大，PRRSV感染随之下降，具体分析如下：图（3-7A）qPCR结果显示当PRA蛋白终浓度达到5µM时PRRSVN基因表达在转录水平与对照PCV2Cap组相比下降75%；图（3-7B）Westernbolt结果显示PRRSVN蛋白的表达量伴随着PRA蛋白浓度加大逐步降低，当PRA蛋白达到5µM时，检测不到PRRSVN蛋白表达；图（3-7C）绝对定量测定不同浓度的PRA蛋白处理PRRSV后，细胞培养基上清中子代病毒逐步减少，当PRA蛋白浓度达到5µM，PRRSV子代病毒量下降近15倍；图（3-7D）显示用PRA蛋白（5µM）处理PRRSV，检测不同时间点上清中病毒滴度，结果显示，伴随着时间往后推移病毒感染滴度逐步上升，但是PRA处理组的病毒滴度一直低于明显对照组。 34猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图3-7PRA阻断PRRSV感染在MARC-145细胞验证Fig.3-7theinhibitionassayofPRAproteininMARC-145为了进一步确定PRA蛋白是否在宿主细胞PAM上发挥作用，我们尝试了用PRA5µM分别处理PRRSV0.1MOI和1MOI两个剂量，接种到PAM细胞后，感染1h，PBS洗掉未结合PRRSV，24h后分别测定细胞内PRRSVN基因转录水平表达，结果如图3-8所示，对于原代PAM细胞来讲，PRA蛋白对PRRSV感染呈现剂量依赖，但是PRA对低浓度病毒感染（0.1MOI）效果更好。我们同时评价不同浓度的PRA处理PRRSV0.1MOI后PAM细胞上清的病毒滴度，如图3-9所示，PRA蛋白可以明显阻断PRRSV感染原代PAM细胞，当PRA蛋白浓度为5µM，病毒的滴度下降近4个数量级（p˂0.001）。图3-8在转录水平验证PRA阻断PRRSV感染Fig.3-8theinhibitionassayofPRAproteininmRNAlevel 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究35图3-9PAM细胞上清病毒滴度（0.1MOI）Fig.3-9thePRRSVtiterinPAMsculturesupernatant(0.1MOI)为了更直观观察到PRA蛋白在易感细胞MARC-145和PAM阻断PRRSV感染，我们借助间接免疫荧光技术检测病毒感染情况，用针对PRRSVN蛋白抗体6D10作为一抗，结果如图3-10所示，伴随着PRA蛋白浓度增大，红色二抗着色的细胞明显减少，提示PRA蛋白能够明显阻断PRRSV感染MARC-145和PAM细胞。图3-10免疫荧光验证PRA阻断PRRSV感染Fig.3-10Resultofanti-PRRSVeffectofPRAdetectedwithindirectimmunofluorescenceassay与此同时，在PRRSV易感细胞系PK-15CD163和CRL-2843CD163中测试PRA蛋白对PRRSV的阻断作用，结果如图3-11所示，无论是转录水平和蛋白水平，PRA蛋白明显阻断PRRSV感染，同样呈现PRA蛋白剂量依赖性，相比之下，PRA蛋白阻断病毒效果在PK-15CD163细胞上更明显。 36猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图3-11PRA阻断效果在PK-15CD163和CRL-2843CD163分析Fig.3-11theinhibitionofPRAproteinsinPK-15CD163和CRL-2843CD1633.2.4.2PRA蛋白的细胞毒性检测为了评估试验中所使用不同浓度的PRA蛋白是否对MARC-145，PAM，PK-15CD163和CRL-2843CD163细胞有细胞毒性，从而影响病毒复制，我们用CCK-8试剂盒分别测定不同浓度PRA蛋白对四种易感细胞活力的影响。结果如图3-12所示，不同浓度的PRA蛋白处理细胞后，与无蛋白处理对照组相比没有显著差异，说明PRA抑制PRRSV感染的工作浓度对上述四种细胞均没有明显的细胞毒性作用，同时，我们进一步在PAM和MARC-145细胞上加大PRA蛋白的浓度，测试该重组蛋白的半数细胞毒性所需浓度（CC50），如图3-13所示：MARC-145和PAM细胞伴随着PRA蛋白浓度加大，细胞活性逐步下降，两者达到半数致死量，PRA浓度约为50µM。 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究37图3-12CCK-8检测不同浓度的PRA蛋白对MARC-145、PAM、PK-15CD163和CRL-2843CD163细胞的细胞毒性作用Fig.3-12DeterminationofthecelltoxicityofPRAproteinwithCCK-8inMARC-145,PAM,PK-15CD163andCRL-2843CD163图3-13CCK-8检测PRA蛋白最大浓度对MARC-145和PAM细胞的细胞毒性作用Fig.3-13Cellulartoxicityofhigh-concentrationPRAwasexaminedinMARC-145andPAMcellsusingCCK-8kit3.2.4.3PRA对PRRSV不同毒株感染阻断分析为了验证PRA蛋白阻断PRRSV感染是否具有广谱性，本试验用PRA（5µM）蛋白分别与PRRSV-2（JXA1，GD-HD，VR-2385和CH-1a）或PRRSV-1（GZ11-G1和P073-3）0.1MOI混合1h，分别孵育MARC-145和PAM细胞，分别从mRNA水平，蛋白水平以及病毒滴度检测PRRSV感染量，结果如图3-14所示，无论是在MARC-145细胞还是原代PAM细胞上，PRA蛋白对这几株差异比较大的毒株均具有阻断作用，尤 38猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究其是对弱毒株VR-2385和CH-1a均有很好的阻断效果，但是对于强毒株来讲，PRA对GD-HD的抑制效果要优于JXA1。图3-14PRA蛋白对PRRSV-2型毒株阻断效果分析Fig.3-14theanalysisofPRAinhibitiontoPRRSV-2typestrains由于本实验室现有的6D10单抗和PRRSV阳性血清仅识别PRRSV-2毒株，因此PRA蛋白对于PRRSV-1毒株感染阻断效果只能借助定量PCR，结果如3-15所示，PRA（5µM）预处理GZ11-G1和P073-3分别感染PAM细胞，24h后测试PRRSVN基因转录水平和细胞上清中子代病毒数目，从试验结果同样可以看到PRA可以阻断PRRSV-1感染（图3-15）。图3-15PRA对PRRSVⅠ型毒株阻断效果分析Fig.3-15theanalysisofPRAinhibitiontoPRRSV-1typestrains 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究393.2.5病毒捕获试验体外用MARC-145细胞增殖的PRRSVSD16，将细胞培养上清离心后经由100kDa浓缩包浓缩后，将浓缩的病毒经由sepharose4FF层析柱分离后，结果如图3-16所示，PRRSV病毒经分子筛纯化过程中会出现两个峰，由于病毒粒子较大，出峰位置比较靠前，因此我们收取第一个峰，收集液进一步用100kDa蛋白浓缩管进行浓缩，0.22µm的滤膜过滤后，TCID7.87550测定浓缩后病毒滴度为7×10（plaque-formingunits,pfu）。图3-16PRRSVSD16经由Sepharose4FastFlow分离Fig.3-16PRRSVSD16wereseparatedbySepharose4FastFlow取25µL纯化的病毒液用12%SDS-PAGE蛋白胶分离，将病毒样品进行染色分析（考马斯亮蓝和银染），将另一块胶转PVDF膜后，PRRSV阳性血清检测病毒蛋白结果如下，如图3-17所示，可以明显检测PRRSVGP3（42kDa），GP4（31kDa），GP5（25kDa），M（18~19kDa）和N（15kDa）蛋白，说明我们已获得纯化的PRRSVSD16。图3-17PRRSV阳性血清检测病毒粒子Fig.3-17DetectionofPRRSVvironsusingPRRSVpositiveserum 40猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究将纯化PRRSV包被到ELISA板，5%脱脂奶封闭后，加入PRAhis蛋白和对照蛋白PCV2Caphis，鼠源抗His单克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗鼠作为二抗，结果如图3-18所示，PRA蛋白可以特异结合PRRSV病毒，PCV2Cap作为对照蛋白与PRRSV无结合，鼠抗PRRSVGP5多抗血清作为结合病毒粒子的阳性对照。图3-18病毒结合PRA蛋白的ELISA鉴定结果Fig.3-18ResultofELISAforbindingbetweenPRAandPRRSV同时，进一步对PRAhis蛋白进行两倍倍比稀释，ELISA结果发现PRA蛋白和PRRSV结合力度伴随着PRA蛋白浓度的降低逐步变弱，而对照蛋白基本保持不变，这说明PRA与PRRSV存在互作，结合力度伴随PRA蛋白浓度降低而减少（图3-19）。图3-19PRA按照两倍稀释结合PRRS病毒的ELISA鉴定结果Fig.3-19DilutionofPRAproteinforPRRSVbindingusingELISA另外，进行反向ELISA试验，即包被纯化PRAhis蛋白和Caphis蛋白，分别孵育纯化的PRRSV，PBST洗涤后，加入Trizol提取RNA，RT-PCR试验结果显示，PRAhis结合PRRSV，所以能扩增出PRRSVORF5基因，而对照蛋白Caphis的样品中却扩不到ORF5基因，说明Cap蛋白与PRRSV不结合（图3-20）。 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究41图3-20RT-PCR检测PRRSVORF5基因Fig.3-20RT-PCRusingprimersagainstPRRSVORF5为了进一步探究PRA蛋白是通过结合PRRSVGP5来实现结合PRRSV，将flag抗体偶联到溴化氢激活的4B层析柱上，从稳定转染的MARC-145-GP5flag细胞系裂解液，纯化得到可溶的GP5蛋白，甘氨酸（pH2.4）洗脱后，立即中和，跑12%SDS-PAGE转PVDF膜，用PRRSV康复血清作为识别GP5的抗体，结果如图3-21所示，在25kDa大小的位置有一个特异的蛋白条带与PRRSV康复血清反应，提示我们已从稳定表达GP5细胞系获得可溶的GP5蛋白。图3-21蛋白免疫印迹用PRRSV康复血清检测纯化GP5蛋白Fig.3-21WesternblotdetectingpurifiedGP5proteinusingPRRSVConvalescentserum同时将纯化好的PRAhis蛋白包被ELISA板子，加入纯化GP5flag蛋白，纯化的PRRS病毒作为阳性对照，正常MARC-145细胞裂解液作为阴性对照，ELISA试验结果显示，PRA蛋白可以结合GP5，提示PRA阻断PRRSV感染，是通过结合PRRSVGP5实现（图3-22）。 42猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图3-22酶联免疫吸附试验验证PRA蛋白结合GP5Fig.3-22ELISAdetectingthebindingbetweenPRAandGP5protein为了进一步探究PRA蛋白与PRRSVGP5之间直接互作，将融合myc标签PRA质粒转染到COS-7-GP5flag细胞系中48h，随后收取细胞裂解后，进行免疫共沉淀试验，分别用鼠源抗myc和兔源抗flag抗体进行检测，结果如图3-23，GP5flag可以特异将PRAmyc拉下来，提示GP5蛋白进入PRRSV易感细胞是结合MYH9的羧基端。图3-23Co-IP验证PRA蛋白结合GP5Fig.3-23Co-IPdetectingthebindingbetweenPRAandGP5protein为了进一步探究PRA和GP5的特异性结合，分别将PRAhis和Caphis结合到NI柱上，收取MAC-145-GP5flag细胞进行反复冻融和少量超声裂解，4oC高速离心后，将破碎上清分别孵育PRAhis和Caphis柱子4oC过夜，PBST反复洗涤3次，取少量PRAhis和Caphis柱分别加入2×loadingbuffer，100oC煮沸10min，离心后，取少量跑胶，转PVDF膜后，分别孵育鼠源抗his抗体，兔源抗flag抗体，结果如图3-24所示，体外试验PRA可以结合GP5蛋白，但是对照蛋白Cap却不能结合GP5蛋白。 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究43图3-24体外pull-down验证PRA蛋白结合GP5Fig.3-24pull-downassaytodetectthebindingbetweenPRAandGP5protein3.2.6PRA孵育病毒后减少宿主细胞MYH9往细胞膜上运行前期研究表明PRRSV在早期进入宿主细胞过程中MYH9由胞内往细胞膜上运动，尤其是5min和15min比较明显，为了评估PRA蛋白对病毒进入宿主细胞抑制作用是否与内源性MYH9运动有关，将PRRSVSD1650MOI和PRRSV50MOI+PRA（50µM）混合物（预先37oC放置1h），分别在4oC吸附细胞2h，弃掉病毒液，换成3%DMEM，37oC放置15min，4%多聚甲醛固定细胞，用PRRSV阳性血清和Mab2-5G2分别识别PRRS病毒和MYH9，图3-25结果显示，随着时间延长，PRRS病毒组MYH9表达量逐步上升，但是PRRSV用PRA蛋白预处理组，MYH9往细胞膜上运行明显减少。图3-25病毒内化过程中MYH9往PAM细胞膜迁移Fig.3-25PlasmamembranemovementofMYH9duringPRRSVinteranalizationinPAMs 44猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究同时，我们用PRRSV刺激PAM后，病毒内化15min时分别收取不同处理组细胞用MinuteTMPlasmaMembraneProteinIsolationKit提取膜蛋白，跑SDS-PAGE胶和免疫印迹，结果显示，宿主PAM细胞在PRRSV感染之前，MYH9细胞膜上表达量较少，随着病毒内化过程，MYH9表达量逐步上调，与单纯PRRSV组相比，PRA处理病毒组MYH9表达量明显减少，说明PRA结合PRRSV后，可以减少病毒内化（图3-26）。图3-26病毒内化过程中MYH9往细胞膜迁移Fig.3-26PlasmamembranemovementofMYH9duringPRRSVinteranalization另外，我们评价了PRRSV感染早期(˂1h)，MYH9总蛋白水平变化，同时加入PRRSV与PRA混合物作为对照，免疫印迹结果发现，PRRSV感染宿主细胞早期MYH9总蛋白基本没有太大变化（图3-27）。图3-27病毒内化过程中MYH9总蛋白变化Fig.3-27TotalexpressionofMYH9duringPRRSVinteranalization3.2.7PRA预孵育PRRSV后减少病毒内化PRRSV入侵宿主细胞依赖网格蛋白介导的内吞，MYH9是调控网格蛋白介导内吞的关键因子，从上述激光共聚焦试验结果来看，PRA处理病毒后不影响PRRSV吸附宿主细胞，为了证实此推断，试验设计用PRA蛋白处理PRRSV后，4oC吸附细胞后，PBS洗除未吸附的PRRSV，收取细胞提取RNA，QPCR检测细胞表面吸附病毒量，结果显示PRA对PRRSV的吸附无影响（图3-28）。 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究45图3-28PRRSV吸附PAM细胞的评价Fig.3-28TheassayforPRRSVattachmentinPAMs为了探讨PRA蛋白是否影响PRRSVGP5与MYH9互作，从而减少PRRSV内化，试验设计用PRA蛋白处理PRRSV后，4oC吸附细胞后，转入37oC15min后，胰酶消化去除未进入的PRRSV，收取细胞PBS洗涤后，提取RNA，检测细胞内病毒进入量，结果如图3-29所示，与PRRSV对照组相比，经PRA蛋白处理组的PRRSV明显减少，说明PRA与PRRSVGP5结合，从而使PRRSVGP5与MYH9互作减少，最终导致PRRSV感染下降。图3-29PRA降低PRRSV内化入PAM细胞Fig.3-29PRAreduceinteranalizationofPRRSVinPAMs3.3讨论本试验通过截短表达PRRSV入侵依赖蛋白MYH9，通过Westernblot和ELISA初步锚定抗独特型抗体Mab2-5G2结合区域位于MYH9的羧基端（aa1651-1960），命名为PRA。用原核表达系统获得可溶重组PRA蛋白，深入测试该蛋白潜在的抗病毒活性，试验结果显示，与对照组PCV2Cap蛋白处理PRRSV相比，PRA处理组的PRRSV复制呈现明显下降且呈现剂量依赖的特征（图3-7），表明PRA具有显著阻断PRRSV复制的功能。 46猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究前期研究表明，PRRSV进入宿主细胞通过受体介导内吞，已报道受体因子包括硫酸肝素（HS），波形蛋白（vimentin），CD151，清道夫蛋白CD163，Sialoadhesin(CD169)和MYH9等(Lietal.2017)，前期研究表明体外表达可溶猪源CD163SRCR5-9和CD169N端第四个Ig-likedomains是PRRSV吸附和内化的主要区域，而且体外具有阻断PRRSV感染的作用(Chenetal.2014)，然而一些细胞系不存在Sn，当猪源CD163存在时依然能介导PRRSV入侵（图1-6），说明细胞中还有某些协同分子协助CD163介导PRRSV入侵。近期MYH9作为多种病毒入侵不可缺少的受体或者调控因子相继被报道，例如：单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）(Ariietal.2010)，血小板减少综合征病毒(SevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeVirus)(Sunetal.2014)和Epstein-Barrvirus(Xiongetal.2015)，与此同时Gao等报道MYH9可以与PRRSVGP5蛋白互作，是调控RRSV感染内化不可缺少的因子(Gaoetal.2016)，但是MYH9结合PRRSV囊膜蛋白GP5具体位置尚未知晓，同时重组表达该区域是否能够与PRRS病毒粒子结合，与此同时该区域能否阻断PRRSV感染，及其相关机制尚需要进一步探讨。基于第二章研究，初步鉴定Mab2-5G2与MYH9特异结合区域为羧基端aa1651-1960（PRA），为了探究重组表达PRA蛋白是否具有阻断PRRSV感染的能力，首先用大肠杆菌系统获得可溶PRA蛋白，同时在PRRSV易感细胞（MARC-145，PAM，PK-15CD163和CRL-2843CD163）上验证PRA蛋白阻断PRRSV感染，试验结果发现PRA阻断PRRSV感染呈现剂量依赖性。与此同时PRA对PRRSV-1型毒株（GZ11-G1和P073-3），PRRSV-2型毒株（SD16，VR-2385，VR-2332，JXA1和GD-HD）的复制均具有抑制作用，PRA对弱毒株CH-1a和经典株VR-2332的抑制率要明显高于其他株高致病性，PRRSVGD-HD的抑制效率与对SD16的抑制效率相当，然而对于JXA1抑制效果仅为50%，说明其具有广谱的抗病毒作用。但是PRA对PRRSV不同毒株存在不同程度的阻断，可能与不同毒株GP5序列存在很大差异。相关研究表明PRRSVGP5蛋白是所有结构蛋白中最不保守的一个蛋白，美洲与欧洲型毒株GP5氨基酸序列的同源性仅为52％～55％之间。由于模拟PRRSVGP5蛋白的抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9区域为羧基端的PRA，为了探讨PRA蛋白抑制PRRSV感染的机制，本试验首先纯化PRRS病毒，排除培养基以及血清成分非特异性结合，同时从稳定表达GP5的MARC-145-GP5flag细胞系中，纯化获得可溶的GP5蛋白，本研究将重组PRA蛋白包被到ELISA板上，分别孵育纯化的PRRSV和GP5蛋白，与对照蛋白PCV2Cap相比，酶联免疫吸附试验结果证明PRA蛋白具有结合PRRSV能力（图3-22），同时免疫共沉淀和体外互作试验均证明PRA具有结合PRRSVGP5的功能（图3-23和图3-24）。相关研究显示MYH9在介导宿主细胞网格蛋白途径内吞过程中起关键调节作用(Chandrasekaretal.2014)，为了深入探讨PRA蛋白处理PRRSV后，对宿主细胞内源性 第三章MYH9羧基端的可溶表达和病毒阻断研究47MYH9迁移和分布的影响，我们首先通过免疫荧光试验评价PRRSV早期进入过程中，宿主细胞內源MYH9往细胞膜上迁移，同时发现PRA处理PRRSV后，可以明显减少MYH9往PAM细胞膜上迁移（图3-25）。同时我们从蛋白水平评价细胞膜上MYH9表达的变化，结果发现MYH9在PRRSV进入宿主细胞早期15min时明显上调，PRA蛋白处理组的MYH9表达量明显下调（图3-26）。与此同时，进一步评价MYH9总蛋白水平变化过程，试验结果显示，PRRSV感染组和PRA处理组，MYH9总蛋白水平没有明显变化，说明PRRSV感染早期过程中，MYH9先由细胞内往细胞膜上运行，结合PRRSV后，部分MYH9由细胞膜返回细胞浆内。当用PRA蛋白处理PRRSV后，其并不影响病毒对易感细胞的吸附（图3-28），但是PRRSV+PRA复合物刺激宿主细胞后，MYH9往细胞膜上运行明显减少。为了进一步探讨阻断机制，相关研究表明MYH9在介导宿主细胞网格蛋白途径内吞中起关键作用，为此借助QPCR技术深入探讨PRA处理PRRSV后对病毒内化的影响，结果显示PRA处理PRRSV后，在内化15min后，PRA处理组宿主细胞内化PRRSV明显减少（图3-29）。3.4小结本试验将MYH9羧基端PRA克隆到原核表达载体，经诱导表达和Ni柱亲和层析纯化后，获得高纯度PRA可溶蛋白，在体外借助ELISA和Westernblot方法验证了重组PRA与Mab2-5G2结合活性，并且分别在PRRSV易感染细胞MARC-145，PK-15CD163，CRL-2843CD163以及原代PAM细胞上验证PRA蛋白阻断作用，试验结果显示PRA对PRRSV-1型毒株（GZ11-G1和P073-3）以及PRRSV-2型毒株（SD16，VR-2332，VR-2385，JXA1和GD-HD）结果证明均有较好的阻断效果。PRA结合PRRSVGP5蛋白，阻断PRRSVGP5与细胞內源MYH9互作，从而减少PRRSV内化，进而阻断病毒入侵易感细胞。 48猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定PRRSV感染宿主细胞具有严格地特异性(Zhangetal.2015)，其主要是由细胞表面病毒受体蛋白决定(Duetal.2017c;Shietal.2015)，其中，MYH9作为介导PRRSV入侵宿主细胞不可缺少的受体因子(Gaoetal.2016)，本章研究主要以下三个问题：第一，不同种属MYH9是否能够同样参与PRRSV感染靶细胞，第二，不同种属MYH9中可能存在与PRRSV结合的共同区域，该区域重组表达是否具有抗病毒作用？第三，针对该区域产生的多克隆抗体是否结合细胞表面的MYH9从而发挥“占位效应”阻断PRRSV感染？4.1材料与方法4.1.1细胞系、毒株、抗体试验用PK-15CD163细胞由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室构建保存，鼠源抗pCD163SRCR1-4多克隆抗体由本实验室制备留存，Bablc小鼠购自第四军医大学试验动物中心，原代PAM细胞取自于PRRSV阴性仔猪（6-8周龄），细胞系培养和所用PRRS毒株参照第三章3.1.1。4.1.2主要试剂NP40裂解液购自碧云天生物有限公司，4%多聚甲醛购于索莱宝生物科技公司，其余试剂参照第三章3.1.2。4.1.3主要仪器震荡乳化仪器购自北京鼎昊源科技有限公司，其余参照第三章3.1.3。4.1.4稳定表达pCD163的BHK-21和HEK-293T细胞系构建与鉴定将HEK-293T细胞铺入6孔板，24h后细胞汇合度达到80%，用Lip2000转染试剂将pTrip-CMV-CD163（2µg）、pMD2.G（1µg）和psPAX2（1µg）质粒共转染至HEK-293T细胞，转染6h后更换血清含量为3%的DMEM继续维持60h，收集包含慢病毒的细胞上清，分别感染BHK-21和HEK-293T，感染48h后，加入嘌呤霉素筛选细胞（最佳作用浓度为30µg/mL），筛选2周，将成团的细胞用胰酶消化成单个细胞，将细胞亚克隆到96孔板后，用含嘌呤霉素的DMEM培养基培养3周，最终获得新细胞系，冻存至液氮中备用。为了鉴定猪源CD163是否在PK-15，BHK-21和HEK-293T细胞系稳定中表达，分别收取经嘌呤霉素筛选的阳性细胞PK-15，BHK-21和HEK-293T后，加入Triozl裂解细胞，提取RNA，反转录成cDNA，用Q5高保真酶对pCD163扩增，引物序列如下（5’-3’）：pCD163-F：GCTCTAGAATGGTGCTACTTGAAG；pCD163-R：CGGGATCCTCATTGTACTTCAGAGTGG，PCR结束后，用1%核酸胶进行电泳鉴定。同时收取部分细胞，加入 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定49NP40裂解液冰上作用30min，12000g4oC，离心30min，收取裂解上清加入5×SDSloadingbuffer，沸水煮10min，用10%SDS-PAGE蛋白跑胶转PVDF膜，一抗为鼠源抗CD163SRCR1-4多抗血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为检测抗体，ECL发光检测目的蛋白条带。将构建成功的稳定表达CD163的BHK-21和HEK-293T细胞系命名为：BHK-21CD163和HEK-293TCD163。4.1.5PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163感染PRRSV评价将稳定表达pCD163受体的猪源，人源和鼠源细胞系PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163用HP-PRRSVSD16（1MOI）感染48h后，4%多聚甲醛取适量加入细胞细胞板，37oC静置15min后弃取固定液，PBS洗涤3次，0.25%TritonX-100透化10min，PBS洗涤5次后，用针对PRRSVN蛋白的抗体6D10作为一抗，37oC1h，PBST洗涤3遍，红色荧光染料标记羊抗鼠二抗孵育2h，借助荧光显微镜观察间接免疫荧光试验结果。4.1.6特异性siRNA敲低MYH9对PRRSV影响分别针对猪源、人源和鼠源的MYH9各设计3条特异性干扰siRNA引物，引物序列如下：○1针对猪源MYH9设计siRNA序列如下（5’-3’）：siRNA-707-F：GCAAGUUCAUCCGCAUCAATT；siRNA-707-R：UUGAUGCGGAUGAACUUGCTTsiRNA-1136-F：GCAUCAACGUGACCGAUUUTT；siRNA-1136-R：AAAUCGGUCACGUUGAUGCTTsiRNA-1721-F：CCGGCAAGGUGGAUUACAATT；siRNA-1721-R：UUGUAAUCCACCUUGCCGGTT.○2针对人源MYH9设计siRNA序列如下（5’-3’）：siRNA-2245-F：CGUGCGUGCUCAUGAUAAATT；siRNA-2245-R：UUUAUCAUGAGCACGCACGTTsiRNA-1044-F：GGACCUUCCACAUCUUCUATT；siRNA-1044-R：UAGAAGAUGUGGAAGGUCCTTsiRNA-3305-F：GAGGCAAUGAUCACUGACUTT；siRNA-3305-R：AGUCAGUGAUCAUUGCCUCTT.○3针对鼠源MYH9设计siRNA序列如下（5’-3’）：siRNA-913-F：GGUGCCAACAUUGAGACUUTT；siRNA-913-R：AAGUCUCAAUGUUGGCACCTTsiRNA-1200-F：CCUUCAGCUUGGCAACAUUTT；siRNA-1200-R：AAUGUUGCCAAGCUGAAGGTT 50猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究siRNA-1363-F：GCAGAAGGCGCAGACUAAATT；siRNA-1363-R：UUUAGUCUGCGCCUUCUGCTTNegativecontrol-F:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；Negativecontrol-R:ACGUGACACGUUCGGAGAATT.将特异性的siRNA分别按照说明书，加入适量无RNA酶水溶解，充分溶解后，分装冻存-80oC冰箱，分别取适量的siRNA与脂质体2000混合后，37oC作用25min，然后分别加入PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163细胞中，转染6h后换成10%FBSDMEM，培养48h后，收取细胞，提取RNA反转录后，用针对MYH9的定量引物，借助QPCR首先摸索有效siRNA序列，同时从50，100，150和200nM摸索有效浓度。按照先前摸索的浓度，分别将siRNA转染PRRSV易感细胞系PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD16312h后，用PRRSVSD16（1MOI）感染细胞36h，分别收取细胞，提取RNA后反转录成cDNA，用QPCR检测MYH9和PRRSVN基因表达量，内参基因为GAPDH；同时在病毒感染36h后，将收取的细胞裂解提取蛋白质，加入2×SDSloadingsamplebuffer，将样品用10%SDS-PAGE跑胶转膜后，分别用Mab2-5G2和6D10检测siRNA干扰后MYH9和PRRSVN蛋白变化，β-actin作为内参蛋白。引物序列如表4-1：表4-1引物序列Table4-1Primersequences基因名称上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）GenesnameForwardprimer(5′–3′)Reverseprimer(5′–3′)aMYH9GATGAGGAGTGCTGGTTTCCCTTCAGTTGCTTGGGCTTCTbMYH9ATACCGCTTCCTGTCCAATGTTTGCTCCTCTTCTGGGATGGAPDHCCTTCCGTGTCCCTACTGCCAACGACGCCTGCTTCACCACCTTCTNATGCCAAATAACAACGGCAAGCTCATGCTGAGGGTGATGCTGTGa为鼠源MYH9定量引物，b为猪源和人源MYH9通用定量引物a:theprimerofMYH9formousespecies，b:theprimerofMYH9forswineandhumanspecies4.1.7Blebbistatin阻断PRRSV感染Blebbistatin作为一种细胞通透性的非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制剂，抑制非肌肉肌球蛋白IIA运动活性(Duxburyetal.2004;Kovacsetal.2004)，将PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163细胞系分别用不同浓度的Blebbistatin处理30min，分别用PRRSVSD16（1MOI）和VR-2332（1MOI）感染1h，PBS洗涤后，换含有合适浓度的Blebbistatin10%FBSDMEM，继续培养48h后，75%乙醇固定细胞，一抗用抗PRRSVN蛋白的抗体6D10，二抗用红色染料标记抗鼠抗体，DAPI染细胞核，PBST洗涤后，Dako封玻片后置于4oC过夜，荧光显微镜观察PRRSV感染情况。4.1.8不同种属MYH9羧基端（PRA）对PRRSV感染的阻断作用4.1.8.1人源、鼠源和猴源PRA片段的扩增与质粒构建 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定51收集HEK-293T和BHK-21细胞，按照Trizol操作说明提取细胞总RNA，获得RNA后立即反转录为cDNA。反转录体系以及PCR反应体系参见步骤2.1.5。根据NCBI的已提交的序列，涉及PRA特异的引物如下(5’-3’)：mousePRA-F:CGCGGATCCATGCGGGAGCTGGACGAmousePRA-R:CCCAAGCTTCTATTCAGCTGCCTTGGCAT；humanPRA-F:CGGGATCCATGCGCGAGCTGGATGAhumanPRA-R:CCCAAGCTTTTATTCGGCAGGTTTGGC；monkeyPRA-F:ACGCGTCGACATGCGCGAGCTGGATGAmonkeyPRA-R:GCTCTAGATTATTCGGCAGGTTTG将PCR产物回收，用SalI和XbaI酶切，连入pCold-SUMO载体中，挑选阳性克隆交由上海生工测序，测序正确后保存质粒备用。将构建成功的质粒命名为：pCold-SUMO-mousePRA，pCold-SUMO-humanPRA。4.1.8.2不同种属PRA和截短体的蛋白表达与纯化将pCold-SUMO-mousePRA，pCold-SUMO-humanPRA以及猪源PRA截短体质粒（详见4.1.11）分别转入BL21（DE3）感受态细胞中，涂到含氨苄和氯霉素抗性的固体LB平板，挑取单克隆后，及时冻存菌种，取菌种加入5mL液体LB中，37oC活化2~3h待菌液浓度OD600值达到0.8时，按照1:50比例扩大到1升LB中，待OD600值达到0.6~0.8，加入0.1MIPTG，将菌液转入15oC诱导16~18h，离心收菌后，弃掉上清，留沉淀，加入预冷的20mL裂解液（50mMTris，50mMNacl，1mMEDTA，1mMAEBSF，5%glycerol，pH7.5）重悬菌体，超声仪低温条件下破碎菌体，12000g4oC离心30min，将上清放冰上，0.22µm滤膜过滤后，准备过Ni柱纯化，最后用rTEV蛋白酶酶切去掉SUMO标签的流程参照第三章PRA纯化。4.1.9阻断PRRSV感染有效片段筛选4.1.9.1QPCR检测不同种属PRA及其截短片段抗病毒活性分别将不同种属（鼠源，人源）PRA蛋白，PRA截短片段（2.5µM）与PRRSVSD16（0.1MOI）混合，37oC放置1h后分别与MARC-145细胞孵育1h，之后用PBS洗涤3遍，换成3%DMEM维持24h，收取细胞后加入Trizol，提取RNA，用反转录酶M-MLV按照1µg反转录成cDNA，用针对PRRSVN基因的特异引物检测病毒含量的变化，GAPDH作为内参基因。4.1.9.2Westernblot评价PRRSV的感染情况将PRRSV易感细胞MARC-145和PAM分别铺入24孔板中，用PRRS病毒按照0.1MOI与不同种属的PRA或者截短体蛋白混合，37oC放置1h后感染细胞24h，分别收取细胞，加入NP40裂解液，冰上裂解30min，加入Cooktail，14000g离心10min，上清加入5×SDSloadingbuffer，沸水煮样品10min，跑12%SDS-PAGE，转PVDF膜，一 52猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究抗用抗PRRSVN蛋白抗体6D10，β-actin作为内参蛋白。二抗用辣根过氧化酶标记抗鼠二抗（1:5000），PBST洗涤3遍后，用ECL发光液显色。4.1.9.3病毒上清TCID50测定将MARC-145细胞铺于96孔细胞培养板，病毒液用DMEM作10倍稀释接种于单层细胞孔中（每个梯度8孔重复），置于37oC，5%CO2培养箱中培养，按照设定的时间点收取接毒后的细胞上清液，用MARC-145细胞测定细胞上清中的病毒滴度，参考Reed-Muench法计算TCID50，最后汇总数据用GraphPadPrism5软件绘制病毒生长曲线。4.1.10Blebbistatin与不同种属PRA蛋白细胞毒性检测将PRRSV易感细胞PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163细胞计数铺到96孔板，放置于37oC过夜，待细胞的汇合度至80%，分别加入不同浓度Blebbistatin（0µM，10µM，20µM，40µM和80µM），每个样品做4个重复，24h后，加入10µLCCK-8试剂，37oC作用2h，此过程要注意蒸发问题。在96孔板周围一圈加相同量的PBS，同时把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发，将细胞板放入酶标仪读数，所用波长为OD450。将PRRSV易感细胞MARC-145细胞计数铺到96孔板，放置于37oC过夜，待细胞的汇合度至80%，分别加入不同种属PRA蛋白（0.5µM，1µM，2.5µM，5µM和10µM），每个样品做重复4个孔，24h后，加入10µLCCK-8试剂，操作参考上述步骤。4.1.11MYH9结合PRRSV最小区域确定基于前期试验证实不同种属PRA（猪源、鼠源和人源）均具有阻断PRRSV感染效果，我们推测不同种属的PRA区域可能存在一个相同的区域结合PRRSV，为了鉴定该区域，首先通过序列比对，发现不同种属PRA区域主要差异在C端，为此对猪源PRA区域进行截短表达（如图4-20），同时在PRRSV易感细胞上结合病毒阻断试验对有效区域进行筛选，逐步查找结合PRRSV的共同区域，PRA截短片段引物如表4-2所示。其△1676-1791中，MYH9区域需要通过OverlapPCR拼接获得，如图4-18所示，先分别扩展出片段一MYH91651-1676和片段二MYH91791-1960，然后通过片段一的上游引物F：5’ATGTCGACATGCGGGAGCTGGAGGACAC3’，和片段二的下游引物R：5’ATTCTAGATTATTCGGCAGGTTT3’扩增获得。另外，MYH9(1651-1676)片段较小，由上海吉尔生物有限公司直接合成。表4-2引物序列Table4-2Primersequences基因名称上游引物（5’-3’）下游引物（5’-3’）GenesnameForwardprimer(5′–3′)Reverseprimer(5ever)MYH9(1651-1960)ACGCGTCGACATGCGGGAGCTGGAGATTCTAGATTATTCGGCAGGTTTMYH9(1716-1960)CGGGATCCATGGGCAAAGGGGCGATTCTAGATTATTCGGCAGGTTTMYH9(1761-1960)ATGGATCCATGCAGATCAATACCGACAAGGATTCTAGATTATTCGGCAGGTTTMYH9(1786-1960)ATCCATGCAGAACAAGGAGCTCATTCTAGATTATTCGGCAGGTTT 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定53MYH9(1811-1960)ATGGATCCATGGCCCTCGAGGCCAAGATTCTAGATTATTCGGCAGGTTTMYH9(1861-1960)ATGGATCCATGTACAAGGACCAGGCGATGTATTCTAGATTATTCGGCAGGTTTATTCTMYH9(1676-1810)CGACAAAAGCATGGAGGCCGAGATAGAGGCGATGGAGGCCTTATTCTAGATMYH9(1651-1716)ATGTCGACATGCGGGAGCTGGAGGACACTTGCCGCTGCTGTTGGCAAMYH9(1651-1785)ATGTCGACATGCGGGAGCTGGAGGACACATTCTAGAGCGCTCCAGCTGTTGMYH9(1651-1810)ATGTCGACATGCGGGAGCTGGAGGACACCTATTCTAGAGGCGATGGAGGCCTTAACGMYH9△1676-1791CCTGCAGCTTGACCAGCTTCTTCTCGTTAGAAGAAGCTGGTCAAGCTGCAGGAGMYH9(1676-1791)ATGTCGACATGAAAAGCATGGAGGCCGAATTCTAGACTTGAGCTCCTTGTTCTGGC4.1.12MYH91676-1791结合PRRSV验证将纯化后PRRSV包被到ELISA板，具体操作参照第三章3.1.12，用5%脱脂奶封闭后，加入MYH91676-1791蛋白，和对照蛋白PCV2Cap，鼠抗MYH91676-1791多克隆抗体或者鼠抗His抗体作为一抗，HRP标记羊抗鼠作为二抗，TMB显色。4.1.13MYH91676-1791鼠源多抗血清制备准备10只6~8周龄左右的Bablc雌鼠，将纯化好的MYH91676-1791蛋白与佐剂按照1:1体积混合，低温条件震荡乳化，乳化条件为：震荡幅度1500转，工作时间60s，间歇时间15s，温度设置在20oC，循环9次，总共震荡6次，待乳化完毕，取一滴混合物滴在冷水中，20min不扩散即为乳化合格，第1次用弗氏完全佐剂，免疫原每只鼠100µg，大腿皮下或者后肢脚掌免疫；第2次用弗氏不完全佐剂，免疫原剂量为50µg/只；第3次用弗氏不完全佐剂，剂量为50µg/只。注意两次免疫间隔为2周，切记每次免疫前尾根部采血留存，第三次免疫后14天，捕杀小鼠收集的多抗血清冻存于-80oC备用。4.1.14MYH91676-1791多抗血清阻断PRRSV感染的研究为了验证鼠源多克隆抗体的有效性，首先，体外试验将重组蛋白MYH91676-1791400ng包被ELISA板子，放置4oC过夜，将收取的鼠源血清分别按照10倍倍比稀释，分别孵育蛋白，二抗用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，显色过程参照第三章ELISA操作；aa1676-1791△1676-1791同时，我们将重组蛋白SUMO-MYH9和SUMO-MYH9同时跑12%SDS-PAGE，转PVDF膜后，用MYH91676-1791多抗反应孵育过夜，二抗用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体，ECL发光显色，验证多克隆抗体的特异性。其次，在MARC-145，PAM以及重组细胞系PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163细胞上分别验证针对MYH91676-1791多抗对天然MYH9的识别，简言之，分别将上述五种细胞系分别按照1×104个/孔铺入24孔细胞板24h后，用4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤3次，用MYH91676-1791多抗血清孵育，用CY3红色标记羊抗鼠二抗作为检测抗体，最后荧光显微镜观察记录照片。鉴于目前对PRRSV研究主要用MARC-145和PAM作为靶细胞，将MYH91676-1791不同稀释度多抗血清预处理MARC-145和PAM细胞1h，以免疫前鼠阴性血清作为对照，37oC孵育1h后，分别感染PRRSVSD16（0.1MOI），PBS洗涤3遍后，将3%DMEM+ 54猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究一定量的多抗血清同时加入培养皿培养24h，收取细胞后，分别提取RNA，从转录水平评价PRRSVN基因表达情况，借助IFA在蛋白水平检测PRRSVN蛋白表达情况，从而评价MYH91676-1791多克隆抗体对PRRSV感染的影响。4.2试验结果4.2.1MYH9在PK-15，BHK-21和HEK-293T细胞的表达鉴定分别收取PK-15，HEK-293T和BHK-21细胞，加入2×sampleloadingbuffer充分裂解细胞，煮样后跑10%SDS-PAGE分析，转膜后用Mab2-5G2检测不同细胞系（猪源，人源和鼠源）內源性MYH9表达情况，结果如图4-1所示，Mab2-5G2可以特异结合不同种属细胞系MYH9蛋白分子，其大小为230kDa，同时说明这几株不同种属的细胞系均表达MYH9蛋白。图4-1免疫印迹检测内源性MYH9在PK-15，HEK-293T和BHK-21表达Fig.4-1DetectionofMYH9expressioninPK-15,HEK-293TandBHK-21usingWesternblot4.2.2稳定表达猪源CD163细胞系构建和鉴定将包装好表达pCD163的慢病毒上清，分别感染HEK-293T和BHK-21细胞，48h后分别用嘌呤霉素筛选，经亚克隆培养，同时将实验室之前王向鹏博士构建的PK-15CD163细胞系复苏后，分别收取PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163细胞提取RNA，借助QPCR检测稳定转染细胞系中pCD163基因表达，结果如图4-2A所示：重组细胞系在转录水平均可检测到pCD163基因的表达，大小为3333bp。我们进一步在蛋白水平检测pCD163表达，免疫印迹结果如图4-2B所示，稳定转染pCD163的细胞系中均能检测到一条约130kDa大小的条带，而对照父母代细胞PK-15，HEK-293T和BHK-21均检测不到pCD163表达。上述试验结果显示无论在转录和蛋白水平，重组细胞系PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163细胞均可以检测到pCD163表达，说明不同种属（人、猪、鼠）稳定表达pCD163细胞系构建成功。 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定55图4-2在转录和蛋白水平检测pCD163基因表达Fig.4-2DetectionofpCD163geneexpressionfrommRNAandproteinlevel4.2.3重组表达pCD163的细胞系感染情况为了明确PRRSV感染稳定表达pCD163的人源，猪源和鼠源细胞系情况，将HP-PRRSVSD16（1MOI）分别感染PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163，48h后用间接免疫荧光检测重组细胞系中PRRSV感染情况，针对PRRSVN蛋白单抗6D10作为一抗，结果如图4-3所示，PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163均可感染PRRSVSD16，但是其父母代细胞PK-15，HEK-293T和BHK-21均检测不到病毒。图4-3间接免疫荧光评价外源表达pCD163细胞系感染PRRSVFig.4-3DetectionofPRRSVinfectionincellllinesexpressingpCD163byIFA4.2.4特异性siRNA敲低MYH9致使易感细胞系的PRRSV感染量下降首先，我们通过QPCR技术分别在PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163细胞系上探讨针对MYH9的siRNA有效性和有效作用浓度，如图4-4所示，针对猪源PK-15CD163细胞系的MYH9设计3条干扰siRNA中，最有效的为siRNA1136，其有效浓度为100nM；针对人源HEK-293TCD163MYH9设计3条干扰siRNA中，siRNA2445敲低MYH9效果最佳，其有效作用浓度为100nM；针对鼠源BHK-21CD163MYH9的干扰RNA为siRNA913，其有效作用浓度为150nM。 56猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图4-4在转录水平检测筛选针对不同种属MYH9的特异性siRNA有效性Fig.4-4thevaliditycheckofsiRNAtargetingdifferentspeciesMYH9inmRNAlevel为了检测MYH9敲低表达后，是否影响PRRSV的感染，先将siRNA分别转染易感细胞PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD16312h，然后用PRRSVSD161MOI感染细胞48h，最后用QPCR分别定量MYH9和PRRSVNmRNA的变化，结果如图4-5所示，siRNA敲低MYH9后，PRRSVN基因的表达明显下降，两者之间变化有正相关性，说明MYH9参与调控PRRSV感染；同时，我们在蛋白水平检测MYH9敲低后，PRRSV感染的变化，结果如图4-6显示，与阴性对照siRNA处理组对比，特异性针对MYH9的干扰RNA处理组，MYH9的表达量明显下降，同时伴随着PRRSV感染下降，即N蛋白条带变弱。 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定57图4-5QPCR评估敲低PK-15CD163，BHK-21CD163andHEK-293TCD163细胞系中MYH9后PRRSV感染情况Fig.4-5thePRRSVinfectionofPK-15CD163，BHK-21CD163andHEK-293TCD163wereevalutedwithMYH9knockdownbyQPCR图4-6免疫印迹评估敲低PK-15CD163，BHK-21CD163andHEK-293TCD163细胞系中MYH9后PRRSV感染情况Fig.4-6thePRRSVinfectionofPK-15CD163,BHK-21CD163andHEK-293TCD163wereevalutedwithMYH9knockdowninproteinlevel4.2.5Blebbistatin处理易感细胞系导致PRRSV感染下降Blebbistatin作为一种细胞渗透性抑制剂，主要靶向于非肌球蛋白NMHCII-A（MYH9）ATPase，该药物可以抑制卵裂沟的收缩而不干扰有丝分裂，或者收缩环集合，快速可逆地抑制脊椎动物细胞气泡，以及细胞迁移和细胞分裂，为了探究不同种属MYH9是否参与PRRSV的感染，我们首先利用CCK-8测定Blebbistatin对PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163细胞的毒性，结果如图4-7所示，Blebbistatin浓度在80µM时对细胞系略显毒性，基于细胞毒性试验，选用不同剂量的Blebbistatin分别预先处理PRRSV易感细胞系PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163，分别评测HP-PRRSVSD16和经典毒株VR-2332感染情况，间接免疫荧光结果发现，伴随着Blebbistatin的浓度加大，PRRSV的红色荧光明显减少，这说明无论是PRRSV强毒株SD16还是经典毒株VR-2332在PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163细胞中感染情况均明显下降（图4-8），上述研究结果说明来自不同种属的MYH9均具有介导PRRSV感染的能力。 58猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图4-7CCK-8试剂盒测定Blebbistatin细胞毒性Fig.4-7ThecytotoxicityassayofBlebbistatinweredeterminedbyCCK-8kit图4-8间接免疫荧光评价Blebbistatin抑制PRRSV活性Fig.4-8theanti-PRRSVactivityofBlebbistatinweredeterminedbyIFA 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定594.2.6人源和鼠源PRA基因组片段的扩增与质粒构建提取HEK-293T和BHK-21细胞总RNA，利用PrimeScript™RT.mastermix进行反转录合成cDNA，特异性引物PCR扩增得到了人源和鼠源PRA（aa1651-1960）片段（图4-9），其长度均为933bp，核酸电泳结果显示所扩增片段与设计大小相符。图4-9凝胶电泳分析人源和鼠源PRA片段PCR扩增Fig.4-9GelelectrophoresisofhumanPRAandmousePRAfragmentamplifiedfragmentsbyPCR将扩增的人源和鼠源PRA片段连入pCold-SUMO载体中，使用限制性内切酶SalI/XbaI对重组质粒进行酶切（图4-10），酶切鉴定结果表明人源和鼠源PRA基因已成功克隆到pCold-SUMO载体上，载体大小为4779bp，目的片段大小为933bp，与预期结果保持一致。说明质粒pCold-SUMO-humanPRA和pCold-SUMO-mousePRA构建成功。图4-10pCold-SUMO-humanPRA和mousePRA质粒酶切鉴定凝胶电泳图Fig.4-10GelelectrophoresisofthedigestionproductsofpCold-SUMO-humanPRAormousePRA4.2.7不同种属PRA蛋白重组表达及纯化参考第三章猪源PRA的表达纯化步骤，将人源和鼠源PRA菌液超声后的上清经过Ni亲和层析柱，用20mM咪唑洗脱液去除杂蛋白，最后用含250mM咪唑的BufferA洗脱目的蛋白，加入rTEV蛋白酶酶过夜，利用strep-tactin去除SUMO标签，跑12% 60猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究SDS-PAGE胶，考马斯亮蓝染色2h（图4-11），脱色液过夜脱色，我们发现重组表达的人源PRA和鼠源PRA蛋白已经顺利获得。图4-11人源和鼠源PRA蛋白纯化和用rTEV酶切除SUMO标签Fig.4-11humanPRAormousePRAproteinpurifiedandremovedsumotagwithrecombinantTobaccoEtchVirusProtease4.2.8不同种属PRA预处理PRRSVSD16导致易感细胞系的病毒感染下降为了探究不同种属PRA是否可以阻断PRRSV感染？首先在MARC-145和PAM细胞上分别测试不同种属PRA的细胞毒性，结果如图4-12所示，当PRA蛋白终浓度达到10µM时，对细胞略微有些细胞毒性。图4-12CCK-8检测人源和鼠源PRA蛋白不同浓度对MARC-145和PAM细胞的细胞毒性作用Fig.4-12CellulartoxicityofdifferentconcentrationPRAwasexaminedinMARC-145andPAMcellsusingCCK-8kit然后将人源PRA蛋白按照不同剂量分别与PRRSVSD16（0.1MOI）预混合1h，PCV-2Cap蛋白作为阴性对照，然后与MARC-145和PAM细胞分别作用1h，用PBS洗掉未结合PRRSV，感染24h后，分别从转录水平和蛋白水平评价PRRSV感染，如 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定61图4-13和4-14所示：人源PRA可以显著地阻断PRRSVSD16感染，具体呈现为伴随着人源PRA蛋白浓度加大，PRRSVN蛋白在转录水平下降90%以上，同时蛋白水平几乎检测不到。图4-13人源PRA阻断PRRSV感染MARC-145Fig.4-13humanPRAproteinblocksPRRSVinfectioninMARC-145cells图4-14人源PRA阻断PRRSV感染PAMFig.4-14humanPRAproteinblockPRRSVinfectioninPAMcells鼠源PRA蛋白预先处理PRRSVSD16后，分别感染MARC-145和PAM，病毒感染24h后，按照上述方法评价其阻断作用，如图4-15和4-16所示，鼠源PRA导致PRRSV在MARC-145和PAM细胞上感染明显下降，尤其是当鼠源PRA浓度达到5µM时，病毒复制在蛋白水平下降90%以上。 62猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图4-15鼠源PRA降低PRRSV感染MARC-145Fig.4-15MousePRAproteinreducePRRSVinfectioninMARC-145cells图4-16鼠源PRA阻断PRRSV感染PAMFig.4-16MousePRAproteinsuppressPRRSVinfectioninPAMcells4.2.9不同种属MYH9结合PRRSV最小区域确定基于上述研究，不同种属MYH9均可参与PRRSV的感染靶细胞，同样重组表达可溶的不同种属（猪，鼠和人）MYH9羧基端（PRA）蛋白均具有阻断PRRSV感染能力，同时我们前期研究在MARC-145细胞中用siRNA干扰MYH9时，PRRSV感染明显下降(Gaoetal.2016)，综合分析上述试验结果我们得出推断：MYH9是PRRSV感染过程必不可缺少的因子，同时推测不同种属MYH9的羧基端可能存在一个关键区域，其可结合PRRSVGP5蛋白或者其“内影像”在病毒进入易感细胞时发挥重要作用，同时鉴于猴源细胞MARC-145为PRRSV易感细胞，我们克隆构建猴源MYH9的羧基端PRA（1651-1960）到pCold-SUMO载体（重组质粒构建不再赘余），参照上述猪源PRA表达的方法获得猴源PRA蛋白（图4-17），分子量大小约40kDa。 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定63图4-17猴源PRA蛋白纯化和用rTEV酶切除SUMO标签Fig.4-17monkeyPRAproteinpurifiedandremovedsumotagwithRecombinantTobaccoEtchVirusProtease首先验证第一个假设：是否不同种属MYH9（猪源，人源，鼠源和猴源）PRA区段（aa1651-1960）均结合Mab2-5G2？免疫印迹结果显示，针对PRRSVGP5的抗独特型抗体Mab2-5G2与不同种属MYH9的羧基端PRA区域结合（图4-18），Mab2-5G2具有模拟PRRSVGP5蛋白的功能，而且重组表达不同种属的PRA区域均具有阻断PRRSV感染的能力，进一步推测在不同种属MYH9的羧基端可能存在一个共同区域参与PRRSV进入过程与GP5蛋白发生相互作用。图4-18不同种属MYH9羧基端PRA与Mab2-5G2结合Fig.4-18thebindingofMab2-5G2withC-terminalofMYH9othersspeciesPRA为了进一步探寻该区域结合PRRSV的最小区域，我们首先比对猪源，猴源，人源和鼠源PRA的蛋白序列，结果如图4-19所示，不同种属PRA蛋白序列存在很多差异，相同区域主要集中在MYH9的第1660-1791个氨基酸之间，且主要差异区位于后半段即羧基(C)端。 64猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图4-19人源，鼠源，猪源和猴源PRA蛋白序列比对Fig.4-19theaminoacidsequencealignmentofdifferentspeciesC-terminalofPRAproteins考虑到不同种属MYH9均可参与PRRSV感染靶细胞，且不同种属MYH9的羧基端PRA区域均具有阻断PRRSV感染作用，基于上述试验结果产生如下推断：不同种属的MYH9可能存在相同的区域可与PRRSV结合，从而阻断其感染易感细胞。为了证实第二个推断，我们以猪源PRA为例，对其进行逐步截短表达，同时结合阻断试验对该区域进行筛选。PRA截短示意图如图4-20所示，参考上述重组质粒pCold-SUMO-PRA构建方法，将不同PRA截短片段构建到pCold-SUMO载体上，对菌液PCR阳性的质粒进行双酶切，结果如图4-21所示，切出的条带与预期相一致，说明载体构建成功。然后将构建成功的不同截短体质粒分别转到BL21大肠杆菌中，诱导表达纯化严格按照第三章PRA表达纯化条件，最后，将纯化的PRA不同截短体重组蛋白同时跑SDS-PAGE胶，图4-22显示，所有截短体已成功表达，蛋白大小与预期设计保持一致。 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定65图4-20猪源MYH9羧基端PRA截短表达构建图Fig.4-20SchematicdiagramofC-terminaltruncationmutantsofswineMYH9图4-21MYH9羧基端PRA截短片段重组质粒酶切鉴定Fig.4-21DoubledigestanalysisofC-terminaltruncationmutantsofswineMYH9 66猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图4-22猪源MYH9羧基端（PRA）截短片段蛋白胶分析Fig.4-22SDS-PAGEgelanalysisofC-terminalofswineMYH9(PRA)andtruncationmutants为了筛选PRA片段中对PRRSV感染有效阻断作用的区域，分别测试重组PRA不同区域蛋白（终浓度2.5µM）预处理PRRSVSD16，感染MARC-145细胞，24h后，首先在转录水平检测病毒感染情况。结果如图4-23所示，与对照组PCV2Cap蛋白处理PRRSV组感染情况相比，凡是包含MYH9的第1676-1791氨基酸区域的重组蛋白（MYH91651-1960，MYH91717-1960，MYH91761-1960，MYH91786-1960，MYH91676-1791，MYH91651-1676，MYH91651-1716，MYH91651-1785和MYH91651-1810）对PRRSVSD16感染均具有显著阻断作用，重组表达的MYH91676-1791发挥主要的抗PRRS病毒作用，仔细比对分析不同种属MYH9此区域的蛋白序列发现，该区域氨基酸序列基本一致，基于此试验推测该区域可能是MYH9结合PRRSVGP5介导内化关键区域。图4-23转录水平检测MYH9羧基端（PRA）及截短体阻断PRRSV筛选Fig.4-23anti-PRRSVanalysisofC-terminaltruncationmutantsofMYH9(PRA)inmRNAlevel 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定67同时，借助免疫印迹试验在蛋白水平评估MYH9(1651-1960)PRA的不同截短片段对PRRSV感染的阻断效果。第一次初筛，PRA被分为两部分：氨基端的MYH91651-1716和羧基端MYH91714-1960分别表达纯化重组蛋白截短蛋白处理PRRSV感染MARC-145细胞，PCV2Cap作为对照蛋白，结果如图4-24A所示，MYH91651-1716和MYH91714-1960同样浓度（2.5µM）对于PRRSVSD16感染均具有阻断作用，而且在同样蛋白作用浓度时，重组表达MYH91651-1716阻断病毒感染效果更佳，但是MYH91714-1960仍然有阻断作用；第二次筛选，将MYH91714-1960这一部分进行逐步往PRA的羧基端进行缩短，重组表达这些截短体后继续测试其阻断PRRSV功能，如图4-24B所示，从PRRSVN蛋白的表达量来看，初步确定从MYH9的氨基酸第1810至1960即MYH91810-1960，对PRRSV感染没有阻断作用，说明PRA片段中对PRRS病毒有阻断作用的区域查找，需要在第1651至第1810氨基酸之间探索；第三次筛选，从MYH9的第1810氨基酸往氨基端方向缩短，截短表达重组截短突变体后，同时测试其对病毒的阻断作用，如图4-24C所示，重组表达的MYH91676-1810具有较好的病毒阻断作用。比较不同种属（猪，鼠，人和猴源）MYH9的羧基端（aa1651-1960）氨基酸序列（图4-19），发现不同种属的MYH9从第1676-1791氨基端序列基本相似（除了鼠源MYH9第1733氨基酸和猪源MYH9第1748氨基酸）；第四次筛选，设计表达MYH91676-1791和对照蛋白（删除1676-1791氨基酸表△1676-1791达的蛋白即MYH9），继续尝试验证我们的推断，试验结果图4-24D所示，1676-1791△1676-1791MYH9蛋白对PRRS病毒阻断有效，而MYH9基本无阻断作用，而且该区域在转录水平和蛋白水平对病毒的阻断作用基本一致，本结果提示MYH91676-1791是发挥病毒阻断作用的关键区域。图4-24蛋白水平检测MYH9羧基端（PRA）及截短体阻断PRRSV筛选Fig.4-24anti-PRRSVanalysisofC-terminaltruncationmutantsofMYH9(PRA)inproteinlevel为了进一步证实我们关于MYH91676-1791结合病毒的假设，通过ELISA试验来验证，如图4-25所示，重组MYH91676-1791可以捕获PRRSV，而对照蛋白Cap蛋白不与病毒结 68猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究合，此结果提示，aa1676-1791可能是MYH9介导PRRSV入侵的区域。图4-25ELISA试验验证MYH91676-1791结合PRRSVFig.4-25AnalysisthebindingbetweenMYH91676-1791andPRRSV4.2.10MYH91676-1791多克隆抗体抑制PRRSV感染基于上述研究MYH9分子在PRRSV内化过程中发挥作用，大量的MYH9会迁移到细胞膜上，科学推测如果MYH91676-1791是结合PRRSV的关键区域，那么用针对该区域的抗体预处理易感细胞时，是否会一定程度阻断PRRSV感染。为此首先制备针对MYH91676-1791的鼠源多克隆抗体，其制备期约两个月，第三次免疫后，第十二天采集小鼠血清验证此多抗的特异性。首先将SUMO-MYH91676-1791用SDS-PAGE蛋白胶，转PVDF膜后，用制备的多抗孵育检测，免疫印迹结果如图4-26A所示，在35kDa和45kDa之间有一条特异性条带，这说明制备的针对MYH91676-1791的鼠源多克隆抗体是有效的；然后将MYH91676-1791和对照蛋白MYH91811-1960按照400ng/孔，同时包被ELISA板，将上述制备的多抗血清做10倍倍比稀释作为一抗孵育，加入酶标二抗后显色，结果如图4-26B所示，MYH91676-1791片段结合鼠源多抗的数值在不同稀释度均高于对照片段MYH91811-1960，这说明鼠源多抗可以特异与MYH91676-1791蛋白结合，与对照蛋白MYH91811-1960不反应。 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定69图4-26免疫印迹和间接ELISA方法检测MYH91676-1791多抗血清特异性Fig.4-26AnalysisofMYH91676-1791polyclonalantibodybindingbyWesternblotandELISA为了测试针对MYH91676-1791多克隆血清是否具有识别不同种属MYH9的活性，间接免疫荧光试验结果如图4-27所示，该多抗可识别MARC-145和PAM细胞上的MYH9蛋白，同时亦能识别PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163细胞中的MYH9。图4-27间接免疫荧光显示MYH91676-1791多抗血清识别不同种属MYH9（200×）Fig.4-27AnalysisofMYH91676-1791polyclonalantibodybindingthedifferentMYH9speciesbyIFA(200×) 70猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究为了进一步测试MYH91676-1791多克隆血清是否具有阻断PRRSV感染的作用，将多抗按照一定稀释度分别预先孵育易感细胞系MARC-145和PAM，再用PRRSVSD160.1MOI分别感染24h后，收取细胞借助QPCR技术在转录水平评价PRRSVN基因的表达，结果如图4-28所示，该血清可阻断PRRSV感染，同时伴随着该血清稀释度降低其阻断PRRSVSD16的能力逐步下降，从转录水平来看，多抗血清稀释度为1:20效果最佳。为了更直观观察该多抗的阻断效果，我们选用最有效的血清稀释度（1:20）借助IFA试验来评价病毒感染情况，图4-29所示，与阴性血清比较，PRRSV感染PAM和MARC-145细胞能力明显下降。这提示该抗体可提前结合MYH91676-1791区域后形成“占位效应”，从而降低病毒感染。图4-28荧光定量PCR检测MYH91676-1791多抗血清阻断病毒感染PAM和MARC-145Fig.4-28theanti-PRRSVeffectofMYH91676-1791polyclonalantibodyinPAMandMARC-145weredetectedbyQPCR图4-29间接免疫荧光观察MYH91676-1791多抗血清阻断PRRSV感染（200×）Fig.4-29theanti-PRRSVeffectofMYH91676-1791polyclonalantibodywereobservedbyIFA(200×) 第四章MYH9介导PRRSV进入易感细胞关键区域的鉴定714.3讨论猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染宿主细胞具有严格特异性，主要感染肺泡巨噬细胞和单核巨噬细胞(Zhangetal.2015)，该特性主要是由细胞表面的相关受体蛋白决定，目前为止，研究最热的受体因子主要包括CD163，MYH9和CD169（Sn）。前期研究表明，不同种属CD163（人源、猴源、狗源和鼠源）转染BHK-21，PK032495和NLFK细胞系，均能介导PRRSV感染(Calvertetal.2007)，同样HansJ.Nauwynck等研究报道不同种属CD169均具有介导PRRSV感染的能力(VanBreedametal.2013)。基于前期研究，MYH9作为介导PRRSV内化的重要因子之一能与PRRSVGP5结合，同时许多不同种属细胞系稳定转染pCD163后，即使细胞系上不存在Sn，这些细胞系均可以被PRRSV所感染，同时前期研究发现敲出猪体Sn并不影响PRRSV的感染，这说明Sn并非PRRSV的感染过程中所必需的(Pratheretal.2013)，细胞内可能存在另外辅助因子（co-factor）参与病毒进入。基于以上研究，我们分析这些细胞共同特点都存在猪源CD163和MYH9，这就提示MYH9可能是其中之一辅助因子，同时有三个科学问题提出：第一，不同种属MYH9是否能够同样参与PRRSV进入？第二，若如推测所想，那么在不同种属MYH9中可能存在与PRRSVGP5结合的共同区域，重组表达该区域是否具有抗病毒作用？第三，针对该区域产生的多克隆抗体是否结合细胞表面的MYH9从而形成“占位效应”阻断PRRSV感染？为了回答上述科学问题，本试验分别构建PRRSV易感的表达猪源CD163的猪源，人源和鼠源细胞系，首先用Mab2-5G2作为识别抗体借助免疫印迹的方法证实内源性MYH9在PK-15，BHK-21和HEK-293T细胞中表达，然后分别用特异性siRNA敲低MYH9，以及用特异性抑制剂Blebbistatin分别处理即PK-15CD163，BHK-21CD163和HEK-293TCD163细胞系，结果证实敲低和抑制MYH9的活性后，PRRSV感染重组细胞的能力明显下降，说明不同种属MYH9均具有参与PRRSV感染能力。鉴于抗独特型抗体Mab2-5G2可以与不同种属MYH9的羧基端结合，考虑到Mab2-5G2具有模拟PRRSVGP5结合MYH9的羧基端PRA区域，且重组表达该区域具有较好的阻断效果（详见第三章研究内容），为了探究其他源的PRA是否具有阻断PRRSV的感染活性，同时重组表达不同种属MYH9的羧基端PRA（aa1651-1960），分别测试不同种属PRA对SD16的阻断作用，结果发现其对PRRSV感染均具有阻断作用，通过序列分析不同种属PRA和截短表达该区域重组蛋白，借助阻断试验进一步筛选获得结合PRRSV的关键区域大致位于第1676-1791氨基酸，不同种属MYH9在此区域氨基酸基本保持一致，且重组表达MYH91676-1791保留较好的抗病毒活性，同时用针对MYH91676-1791多克隆抗体处理易感细胞MARC-145或者PAM后，再感染PRRSV，结果发现该多抗体可以结合易感细胞表面MYH9，从而形成占位效应，对易感细胞呈现显著保护作用，本研究进一步丰富了我们对MYH9在PRRS病毒进入易感细胞过程中的认识。 72猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究4.4小结本试验成功构建稳定表达pCD163的人源，鼠源和猪源细胞系（HEK-293TCD163，BHK-21CD163和PK-15CD163），以新构建细胞系为研究对象，通过特异性siRNA或者抑制剂Blebbistatin干扰MYH9均不同程度减少PRRSV感染；同时重组表达不同种属MYH9的羧基端PRA（aa1651-1960）对PRRSV感染均具有阻断作用，说明不同种属MYH9均可参与病毒复制。通过分析不同种属PRA蛋白序列和逐步截短表达PRA，并借助阻断试验进一步确定结合PRRSVGP5的关键区域位于aa1676-1791，重组表达的MYH91676-1791保留着较强的抗病毒活性，且针对该区域制备的鼠源多抗血清可以抑制PRRSV感染。本研究证明MYH9作为介导PRRSV感染过程中必需的细胞因子，同时为下一步抗病毒多肽药物筛选的开发提供坚实的理论基础。 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测73第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测前期研究发现，针对甲型肝炎病毒的抗独特型抗体KF94，可以显著阻断其感染宿主细胞(Kiyoharaetal.2009)，针对普马拉病毒的抗独特型抗体(anti-idlC9和anti-id4G2)可以明显抑制病毒感染宿主细胞(Lundkvistetal.1993)，基于上述研究，抗独特型抗体Mab2-5G2与PRRSV囊膜蛋白GP5互为“内影象”，本章研究探讨Mab2-5G2是否可以阻断PRRSV感染宿主细胞，进一步揭示其阻断PRRSV感染的机制，同时利用结构生物学方法预测Mab2-5G2与MYH9的结合位点，并对该位点进行功能验证，发现这几个位点可能参与PRRSV感染。5.1材料与方法5.1.1毒株、细胞系和菌株参照第三章3.1.1。5.1.2主要试剂硫酸铵和甘氨酸购自sigma，其余参照第三章3.1.2，MYH9几个小多肽片段由上海吉尔生化有限公司合成。5.1.3主要仪器圆二色谱仪CD（circulardichroism）购自英国应用光物理公司，其余仪器参照第三章3.1.3。5.1.4Mab2-5G2抗体制备和Fab序列测定将Mab2-5G2的杂交瘤细胞按照1×106个/只，腹腔注射Bablc小鼠，大约一个周左右，小鼠的腹部会逐步变大，左手固定小鼠，将其腹部往下，酒精棉球消毒后，右手用10mL注射器采集腹水，4oC，12000g离心20min，收集上清，用PBS按1:1稀释腹水，逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，4oC搅拌4h后，12000g高速离心后小心除去上清，将沉淀用PBS重新溶解，加入到10kDa透析袋中，用预冷PBS透析过夜，将透析的腹水直接缓慢结合ProteinG，待结合完毕后，用10倍柱体积的PBS冲洗ProteinG，去除非特异蛋白的结合，最后用甘氨酸（pH2.4）洗脱抗体，用pH11的磷酸盐缓冲液中和抗体到pH7.5，收取少量的抗体样品跑SDS-PAGE分析。抗体Mab2-5G2序列测定交由金唯智生物科技有限公司完成，具体序列详见附录2。5.1.5病毒阻断功能验证将原代PAM细胞按照6×105个/孔铺入24孔板，将纯化的Mab2-5G2按照一定浓度（0µM，0.3125µM，0.625µM和1.25µM）预孵育PAM细胞15min，将PRRSVSD16 74猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究按照0.1MOI接入细胞中37oC1h，去掉上清后，PBS洗涤3次，换成3%FBSDMEM，继续培养24h后，收取细胞对PRRSVN基因定量和蛋白分析，以评价病毒感染情况（Mab2-5G2对PAM细胞毒性试验测定详见5.1.12）。为了评价PRA突变体对PRRSV的阻断作用，分别取5µM纯化好的PRA突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670，在37oC与PRRSVSD16（0.1MOI）预孵育1h，然后分别感染MARC-145和PAM细胞，37oC1h，用PBS洗涤除去未结合的病毒粒子，换成3%FBSDMEM，感染24h后，收取细胞培养上清和细胞，借助QPCR和Westernblot技术分别从转录水平，蛋白水平以及上清中子代病毒拷贝数来评价病毒感染情况（PRA突变体细胞毒性试验测定详见5.1.12）。5.1.6PRA兔源多克隆抗体血清制备准备2只雌性新西兰大白兔，将纯化好的猪源PRA蛋白与佐剂按照1:1体积混合，低温条件震荡乳化，乳化条件为：震荡幅度1500转，工作时间60s，间歇时间15s，温度设置在20oC，循环9次，总共震荡10次，待乳化完毕，取一滴混合物滴在冷水中，20min不扩散即为乳化合格。第1次用弗氏完全佐剂，每只兔子用免疫原500µg，背部皮下免疫；第2次用弗氏不完全佐剂，免疫原剂量为300µg/只；第3次用弗氏不完全佐剂，剂量为300µg/只。注意两次免疫间隔为2周，切记每次免疫前耳源静脉采血留存，第三次免疫后14天，捕杀兔子收集的多抗血清冻存备用。5.1.7病毒捕获试验为了验证PRA突变体蛋白（PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670）与PRRSV的结合活性，将上述纯化好的PRRSV病毒（7×107.875p.f.u）100µL包被到96孔ELISA板子上，具体操作详见3.1.12，简述如下:分别结合等量（1µg）的PRA突变体蛋白，一抗用兔抗PRA的多克隆抗体，二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的抗体，TMB显色后，酶标仪读取OD450值，借助GraphPadPrism5软件分析汇总数据。5.1.8间接免疫荧光试验首先将细胞用爬片铺入24孔板中，将PAM按照5×105个/孔铺入细胞板，待细胞贴壁以后，加入PRRSV（50MOI），4oC吸附2h，转到37oC放置15min，用4%多聚甲醛固定后，PBST洗三遍，0.25%tritonX-100透化10min，注意仅作病毒吸附的对照组，细胞不做透化，用Mab2-5G2和PRRSV阳性血清作为一抗，罗丹明标记的红色鼠源单克隆抗体或者FITC标记的绿色羊抗猪的单克隆抗体作为二抗，用DAPI染细胞核后，用激光共聚焦显微镜观察。5.1.9PRA截短体和突变体的表达纯化将PRA区域分为两部分：氨基端66氨基酸（MYH91651-1714）和羧基端246氨基酸（MYH91716-1960），其引物设计详见第四章，以猪源PRA为模板，通过BamHI和HindIII 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测75酶切位点分别连入pCold-SUMO质粒，将重组质粒送上海生工测序。同时根据分子对接（docking）结果找到Mab2-5G2与PRA结合位点，分别在结合位点处对PRA进行丙氨酸突变，主要包含PRA1683（E1683），PRA1679（K1679），PRA1673（E1673），PRA1670（I1670）和PRA1683,1679,1673,1670（四个位点同时突变成丙氨酸），所需引物如下表5-1所示。由江苏金伟智生物公司完成氨基酸突变和测序工作。将测序正确的质粒分别转化BL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆菌落加入LB培养基，37oC摇至OD600值到0.6后，加入IPTG，进行诱导表达，具体表达纯化步骤参照第二章。收取洗脱的目的蛋白，用12%蛋白胶分析。表5-1PRA突变体构建引物Table5-1PrimersequencesofPRAmutants引物名称引物序列PrimersnamesPrimerSequence(5’-3’)PRA1670-ForwardGCACAGGCCAAGGCAAACGAGAAGAAGCTGAAAAGCATGGAGGCCPRA1670-ReverseCTTCTTCTCGTTTGCCTTGGCCTGTGCCAGGATCTCCTCGCGGGAPRA1673-ForwardAAGGAGAACGAGGCAAAGCTGAAAAGCATGGAGGCCGAGATGATCPRA1673-ReverseGCTTTTCAGCTTTGCCTCGTTCTCCTTGGCCTGTGCCAGGATCTCPRA1679-ForwardCTGAAAAGCATGGCAGCCGAGATGATCCAGCTGCAGGAGGAGCTGPRA1679-ReverseGATCATCTCGGCTGCCATGCTTTTCAGCTTCTTCTCGTTCTCCTTPRA1683-ForwardGAGGCCGAGATGGCACAGCTGCAGGAGGAGCTGGCCGCCGCCGAPRA1683-ReverseCTCCTGCAGCTGTGCCATCTCGGCCTCCATGCTTTTCAGCTTCTT5.1.10间接免疫酶联吸附试验将纯化好的PRA截短体蛋白（MYH91651-1714）和（MYH91716-1960），以及PRA的五个突变体蛋白（PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670），按照200ng/孔包被至ELISA板中，4oC过夜，5%脱脂奶粉封闭过夜，PBST洗3次，每次10min，加入Mab2-5G2按照1:1000稀释，加入ELISA板子，室温作用1h，PBST洗3次，将HPR标记羊抗鼠抗体作为二抗，25oC，放置2h，PBST洗涤3次；加入TMD显色液后，室温避光10min，最后加入3M硫酸终止，酶标仪读取OD450值。5.1.11免疫印迹试验将纯化好的PRA截短体蛋白Sumo-MYH91651-1714和Sumo-MYH91716-1960，以及PRA突变体蛋白（PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670）分别用12%SDS-PAGE分析，同时借助Westernblot试验分析其与Mab2-5G2的结合。Westernblot主要步骤参照3.1.9.2，转PVDF膜后，一抗孵育Mab2-5G2，二抗用HPR标记羊抗鼠抗体。Dot-blot试验，将合成的多肽MF1，MF2，MF3，MF4，MF5和MF6分别用PBS溶解后，浓度为2mg/mL，分别吸取5µg滴到硝酸纤维素膜（NC）上，待NC膜自然 76猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究风干后，同时用5%脱脂奶粉封闭2h，Mab2-5G2作为检测抗体37oC，孵育2h，二抗用HPR标记羊抗鼠抗体。5.1.12细胞毒性试验将PRRSV易感细胞MARC-145和原代PAM细胞计数后铺到96孔板，过夜培养，加入不同浓度（0.5µM，1µM，2.5µM和5µM）PRA突变体蛋白或者（0，0.3125µM，0.625µM，1.25µM，2.5µM，5µM和6.126µM）Mab2-5G2，每个样品做五个重复孔，具体操作参考3.1.10。收集数据后用GraphPadPrism5软件分析结果。5.1.13圆二色谱仪分析PRA结构将PRA蛋白分别溶解到不同盐浓度NaCl（0.1，0.25，0.5和1）mol/L的磷酸盐缓冲液中，pH值为7.5，约500μL，PRA蛋白的终浓度为50μM，同时将PRA蛋白质溶解到同一盐浓度（0.25）mol/L磷酸盐溶液中，用一定的磷酸调节不同酸碱度（pH4.5，6，7和8），在圆二色谱仪(Chirascan)180～260nm波长下扫描，并测定PRA的二级结构在不同溶液中的变化，分别判断不同盐浓度和酸碱度，对PRA二级结构稳定性的影响。5.2试验结果5.2.1Mab2-5G2抗体纯化及其序列确定收集小鼠抗体腹水，将其经过饱和硫酸铵沉淀除杂后，直接经过ProteinG亲和层析纯化，用甘氨酸洗脱后中和至pH7.5，取少量完整的lgG加入5×loadingbuffer进行SDS-PAGE分析，如图5-1所示，纯化后的Mab2-5G2纯度较高，而且考马斯亮蓝染色结果显示，主要包括抗体的重链（55kDa）和轻链（25kDa），将纯化好的Mab2-5G2浓缩后冻存到-80oC备用。图5-1纯化Mab2-5G2蛋白胶分析Fig.5-1PurifiedMab2-5G2wereanalyedbySDS-PAGE5.2.2Mab2-5G2阻断PRRSVSD16感染PAM前期研究显示，Mab2-5G2具有模拟PRRSVGP5的功能，可以结合宿主细胞膜上的MYH9，我们推测Mab2-5G2可作为PRRSV进入易感细胞的竞争阻断剂，其可以与 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测77PRRSVGP5竞争结合MYH9，从而降低病毒感染。为了证实我们的推测，首先测试不同浓度Mab2-5G2对PAM细胞毒性，如图5-2所示，Mab2-5G2终浓度达到6.125µM时，毒性仍然较小；基于细胞毒性试验，将不同浓度Mab2-5G2预先结合PAM细胞15min，再感染PRRSVSD16（0.1MOI）24h后，结果如图显示，与对照抗体相比，无论是RNA水平（图5-3A）还是蛋白水平（图5-3B），Mab2-5G2均可以降低PRRSVSD16感染，而且伴随着抗体浓度加大，其阻断病毒感染能力逐步增强。图5-2CCK-8检测Mab2-5G2对PAM细胞的细胞毒性作用Fig.5-2CellulartoxicityofMab2-5G2wasexaminedinPAMcellsusingCCK-8kit图5-3Mab2-5G2在转录水平(A)和蛋白水平(B)降低PRRSVSD16感染Fig.5-3Mab2-5G2reducePRRSVSD16infectioninmRNAlevelandProteinlevel同时分别收取病毒感染24h后细胞上清，测定不同浓度Mab2-5G2对病毒滴度的影响，结果如图5-4A所示，随着抗体浓度加大，细胞上清子代病毒也随着下降；另外，同一浓度的Mab2-5G2（1.25µM）处理的PAM细胞，接毒后不同时间点的细胞上清中病毒滴度均显著低于PBS处理组。 78猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图5-4细胞上清检测Mab2-5G2对PRRSV阻断Fig.5-4theblockingeffectofMab2-5G2weredeterminedbyTCID50fromcellsupernatant为了探究Mab2-5G2是否对PRRSV其他毒株（JXA1，CH-1a，GD-HD，VR-2332和VR-2385）均具有阻断效果，分别先用Mab2-5G2（1.25µM）预先结合PAM细胞15min，将几株病毒0.1MOI分别感染PAM细胞24h，分别收取细胞借助QPCR和Westernblot方法评价病毒感染。结果如图5-5所示，与PBS对照处理组相比，Mab2-5G2可显著阻断PRRSVJXA1，CH-1a，GD-HD，VR-2332和VR-2385毒株感染PAM细胞，而且与对照组相比具有显著性差异。值得注意的是，PRRSVVR-2332与CH-1a可能在PAM细胞中增殖较少，导致蛋白水平检测不到病毒N蛋白的条带。同时收取细胞上清，测定细胞上清的TCID50（图5-6），结果发现Mab2-5G2均导致其他毒株子代病毒减少。图5-5Mab2-5G2显示广谱抑制PRRSV其他毒株感染Fig.5-5Mab2-5G2demonstratedbroad-spectruminhibitionofPRRSVotherisolates 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测79图5-6上清子代病毒滴度确定Mab2-5G2在PAM细胞对PRRSV其他毒株抑制Fig.5-6theprogenyvirusfromsupernatantsfromPAMsinfectedwithPRRSVotherstrainsthathadbeenpreincubatedwithMab2-5G2weretitratedandmeasuredbyTCID505.2.3Mab2-5G2结合MYH9区域查找为了证实Mab2-5G2与MYH9之间确实互相结合，首先将PRRSVSD16（50MOI）加入PAM细胞经4oC吸附2h后，转至37oC15min，固定细胞后做IFA，结果显示，当病毒内化入胞时，细胞中的MYH9由胞浆往细胞膜上迁移，并且Mab2-5G2可以在空间构象上特异识别PAM细胞膜表面的MYH9（图5-7A）；将PAM细胞裂解液与纯化好的PRA同时用12%SDS-PAGE胶分离，通过免疫印迹技术在线性状态上证实Mab2-5G2结合MYH9的羧基端PRA区域（图5-7B）；为了进一步查找抗体Mab2-5G2结合区域，PRA区域被分成两部分即MYH91651-1716（N端66氨基酸）和MYH91714-1960（C端246氨基酸）（图5-7C），其蛋白分别与Mab2-5G2抗体的结合结果显示，SUMO-MYH91651-1716可以被抗体Mab2-5G2识别，而SUMO-MYH91714-1960与Mab2-5G2不结合（图5-7D）；进一步将重组蛋白SUMO-MYH91651-1716和SUMO-MYH91714-1960标签切掉，将纯化后MYH91651-1716和MYH91714-1960包被ELISA板，将Mab2-5G2按照10倍倍比稀释，分别加入蛋白样品孔中，HEV239蛋白和PRA蛋白分别做为阴性对照和阳性对照，结果显示，MYH91651-1716可以明显结合Mab2-5G2，而MYH91714-1960蛋白和阴性对照蛋白HEV239与Mab2-5G2均未见结合（图5-7E）。 80猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图5-7Mab2-5G2结合MYH9区域的鉴定Fig.5-7theidentificationofMYH9forbindingMab2-5G2为了进一步查找Mab2-5G2结合MYH9的氨基酸，将MYH91651-1716（即MF1）片段进一步截短，设计如图5-8所示，将MF1截短成五个片段（MF2，MF3，MF4，MF5和MF6），分别合成多肽，用PBS溶解后，分别5µg吸取滴到硝酸纤维素膜（NC）上，待NC膜自然风干后，同时用Mab2-5G2作为检测抗体，Dot-blot试验结果显示，片段MF5（aa1668-1696）是结合Mab2-5G2的主要区域，而对照片段未见结合（图5-9）。图5-8MYH91651-1716区域多肽示意图Fig.5-8theschematicillustrationfortruncationpeptideofMYH91651-1716图5-9dot-blot鉴定Mab2-5G2结合MF5Fig.5-9thebindingdomainofMYH9forMab2-5G2wereidentifiedbydot-blot 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测815.2.4预测Mab2-5G2Fab与PRA结合位点5.2.4.1同源建模预测抗体Fab的结构将抗体Mab2-5G2的高变区域VL和VH序列分别输入Vbase2软件（http://www.vbase2.org/vbdnaplot.php），分析获得抗体相关序列数据（图5-10），抗体高变区(VL和VH)包含的互补决定区已标注出来，上面为核苷酸（红色），下边为对应氨基酸（蓝色）。图5-10Mab2-5G2Fab包含（VL和VH区域）的核苷酸以及推到氨基酸序列Fig.5-10NucleotideanddeducedaminoacidsequenceofbothVLregionandVHregionoftheFabgenefragmentforMab2-5G2将已测定的抗体Fab序列（详见附件）输入SWISSModel(https://www.swissmodel.expasy.org)网站，同源建模获得Fab原子结构模型，如图5-11A所示，同时将抗体的互补决定区（CDR）展示到图片上，为了方便观察抗体高变区结构，同时将抗体旋转90°（图5-11B）。 82猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图5-11同源建模获得抗体Mab2-5G2Fab结构Fig.5-11HomologousmodelingofMab2-5G2Fab5.2.4.2同源建模预测MYH9的结构前期研究报道称，MYH9的形态为“六聚体”主要包含两条重链，两条调节轻链RLCs和两条必需轻链ELCs组成，其中两条重链相互缠绕形成螺旋杆状(Fangetal.2010b;Newell-Litwaetal.2015)。将纯化好的PRA蛋白分别稀释到不同的pH和不同盐浓度磷酸溶液中，蛋白终浓度为50µM，借助圆二色谱仪测定PRA的二级结构，试验结果如图5-12所示：曲线在靠近192nm处有一正的谱带，在208nm和222nm处表现出两个负的特征肩峰谱带，这个结果提示PRA在不同pH和盐浓度下，都保持为α-螺旋结构。图5-12圆二色谱仪测定溶液中PRA的二级结构.（A）在不同盐浓度，（B）在不同pH状态Fig.5-12theproteinsecondarystructureweredeterminedbyCD.(A)differetsaltconcentration,(B)differentpHbuffer鉴于上述圆二色谱仪数值，我们进一步将猪源MYH9羧基端PRA序列输入SWISSModel（https://www.swissmodel.expasy.org）网站，同源建模获得结构模型（如图5-13），该模型构象与前期研究一致，主要是两条α-螺旋铰链。 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测83图5-13PRA区域同源建模结构Fig.5-13HomologousmodelingofthePRAprotein5.2.4.3分子对接Docking预测Mab2-5G2Fab与PRA结合位点将同源建模获得抗体Mab2-5G2Fab和MYH9原子模型在DiscoveryStudioClient2.5软件打开，使用ZDOCKProtocols将Fab可变区与MYH9进行分子对接，获得对接最优结果（图5-14），结果显示两者结合位点位于MYH9的羧基端E1670，K1673，E1679和I1683。结合位点展示如图5-14。图5-14Mab2-5G2Fab与PRA分子对接Fig.5-14thedockingdatabetweenMab2-5G2FabandPRA5.2.5PRA结合位点突变功能验证5.2.5.1PRA突变体表达纯化将Mab2-5G2与PRA的结合位点E1670，K1673，E1679和I1683分别突变为丙氨酸，构建突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670，构建到原核表达载体pCold-SUMO上，诱导表达后，经过Ni亲和层析柱纯化，咪唑洗脱后，收少量样品，用rTEV蛋白酶切除SUMO标签，留取少量样品跑SDS-PAGE胶，试验结果如图5-15所示，PRA五个突变均已获得可溶表达，且纯度较高。 84猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图5-15PRA突变体表达纯化SDS-PAGE胶分析Fig.5-15thePRAmutantwereanalyedwithSDS-PAGEgel5.2.5.2PRA突变体与Mab2-5G2结合活性检测为了验证重组PRA突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670与抗体Mab2-5G2结合情况，分别从空间构象和线性化两个方面着手。首先，通过ELISA方法从空间构象层面，验证PRA突变体与抗体的结合，ELISA结果显示PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670等与抗体Mab2-5G2结合的活力与野生型PRA相比显著下降（图5-16）。图5-16酶联免疫吸附法检测PRA突变体与Mab2-5G2结合Fig.5-16thebindingdetectionofPRAmutantandMab2-5G2usingELISA其次，将PRA与PRA五个突变体用12%SDS-PAGE胶分离并转PVDF膜，在线性层面验证突变体与Mab2-5G2结合，结果如图5-17所示，当PRA单突变1670E→A，或者1673K→A，Mab2-5G2依然可以结合此蛋白，但是当PRA单突变1679E→A，1683K→A或者同时突变以上四个位点即PRA1683，1679，1673和1670，其蛋白与Mab2-5G2完全不结合。 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测85图5-17免疫印迹方法检测PRA突变体与Mab2-5G2结合Fig.5-17thebindingdetectionofPRAmutantandMab2-5G2usingwesternblot5.2.5.3PRA突变体阻断PRRSV感染活性检测基于第三章的研究重组表达PRA能够结合PRRSV，致使宿主细胞内MYH9往细胞膜上迁移减少，从而显著减少病毒的内化。为了进一步探究Mab2-5G2与PRA结合位点是否是病毒进入易感细胞所需要的位点？我们推断重组表达的PRA突变体结合病毒的能力有所改变，为了验证该假设，首先制备兔源PRA多克隆抗体，并且借助ELISA和蛋白免疫印迹试验测试该抗体的特异性，如图5-18A所示，与免疫前阴性血清相比，免疫后的兔血清对于PRA蛋白结合的最大稀释度为1:204800；蛋白免疫印迹结果显示图5-18B，几个突变体均可结合PRA多克隆抗体；ELISA数据显示，当PRA及其突变体分别按照1µg包被ELISA板时，兔源PRA多抗以1:5000稀释度孵育，PRA及其突变体与抗体Mab2-5G2结合OD450数值均在1左右，没有显著差异（图5-18C），说明PRA几个点突变体均结合PRA多抗。图5-18ELISA和免疫印迹检测兔源多抗PRA结合及其突变体Fig.5-18thebindingdetectionofPRAandPRAmutantwithployclonalantibodyofPRAusingELISAandwesternblot 86猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究为了进一步证实上述假设，将纯化的PRRSV100µL包被到ELISA板中，分别孵育PRA及其突变体1µg，用PRA兔源多抗作为一抗，TMD显色结果表明PRA突变体结合PRRSV能力显著低于PRA，有趣的是重组PRA1683,1679,1673,1670蛋白结合病毒的能力高于其单个氨基酸位点突变，可能与其空间构象改变有关（图5-19）。图5-19间接ELISA测试PRA及其突变体结合PRRSV能力测试Fig.5-19thebindingdetectionofPRAandPRAmutantforPRRSVusingELISA鉴于将PRA与Mab2-5G2结合位点突变后，导致其结合病毒能力下降，进一步推测PRA突变体可能降低其自身抗PRRSV能力，为了验证该设想，首先分别测试PRA突变体对易感细胞是否有毒性，将PRA突变体分别按照不同稀释度，加入MARC-145和PAM细胞，24h后，加入CCK-8，结果如图5-20A所示：PRA突变体作用浓度达到10µM时，对易感细胞MARC-145仍然没有明显地细胞毒性。将野生型PRA和PRA突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670（5µM）分别与PRRSVSD16（0.1MOI）于37oC预处理1h，再感染MARC-14524h，收取细胞，分别从转录和蛋白水平评价PRA不同突变体处理组病毒感染量，结果如图5-20B所示，在转录水平，与PRA处理组相比，PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670等突变体显著降低对PRRSV感染的抑制作用；同时蛋白水平结果显示（图5-20C），PRA1683，PRA1679，PRA1673和PRA1670突变体阻断PRRSV能力明显下降。然而同时突变四个位点的突变体PRA1683,1679,1673,1670其抑制病毒效果明显高于单个位点突变体，与PRA蛋白处理组相比未发现明显差异；绝对定量检测各个PRA突变体处理的细胞培养上清中子代病毒的数量，结果显示PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670突变体处理组的病毒拷贝数显著高于PRA处理组（图5-20D）。 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测87图5-20在MARC-145细胞上PRA突变体蛋白降低对病毒抑制作用Fig.5-20PRAmutantsreducePRRSVinhibitioninMARC-145鉴于PAM为PRRSV的宿主靶细胞，PRA突变体对于病毒抑制变化需要进一步在PAM细胞上验证，分别将野生型PRA和PRA突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670（5µM）分别与PRRSVSD16（0.1MOI）于37oC预处理1h，再感染感染PAM细胞24h，然后分别从转录水平、蛋白水平和上清子代病毒滴度三方面评价病毒的感染。结果发现，在PAM细胞上，PRA几个突变体阻断病毒感染能力明显低于野生型PRA，其阻断PRRSV感染趋势与MRAC-145细胞系上结果基本保持一致（图5-21）。值得我们注意的是，PRA四个位点全突变时，其阻断PRRSV感染能力要低于单点突变，提示PRA同时突变多个点可能改变其天然结构。 88猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究图5-21在PAM细胞上PRA突变体蛋白降低对病毒抑制作用Fig.5-21PRAmutantsreducePRRSVinhibitioninPAM5.3讨论自从1974年，Jerne提出“免疫调控网络学说”(Jerne1974)，该理论被广泛地应用到科学研究和临床实践中，主要包括寻找生物受体相关研究(Marascoetal.1982)；抗独特型抗体疫苗研发(Gaultonetal.1986;Gelletal.1985;Lodeetal.2013)；抗肿瘤研究(Gajdosik2014;SanchesJdeetal.2016)；自身免疫病机制研究(Hampe2012;Menshikovetal.2015)以及诊断试剂开发研究应用(Lemaireetal.2014;Richardsonetal.2013)。前期相关研究PRRSV感染宿主后，会刺激猪体产生针对PRRSVGP5和M蛋白的抗独特型抗体（aAb2s），其中主要两种aAb2s非常值得注意，一种aAb2s在猪体感染21天出现，35天达到峰值有助于猪体清除PRRSV，而另一种aAb2s在感染49天出现，在77天达到峰值反而加重猪体的PRRS病毒载量，其提示抗独特型抗体(Ab2s)可以在PRRSV感染猪体发挥着重要地调控作用（(Jiangetal.2003;Zhouetal.2004)。抗独特型抗体主要分为Ab2α，Ab2β，Ab2γ和Ab2ε四种亚型，其中Ab2β具有在结构和功能上模拟原始抗原的内影像作用(Kennedyetal.1983;Marascoetal.1982;Segeetal.1978)，在一定程度上可以替代原始抗原，因此其被广泛地应用于基础免疫学和疾病防治研究，尤其对于病毒研究来讲，筛选病毒受体作为抗独特型抗体一个重要应用已被广泛应用(Coetal.1985;Gaoetal.2016;Hanhametal.1993)，相关研究报道，一些针对病 第五章Mab2-5G2竞争结合MYH9阻断PRRSV感染及其位点预测89毒糖蛋白的抗独特型抗体可以阻断病毒感染宿主细胞(Lundkvistetal.1993;Tanakaetal.1986)。我们实验室前期制备产生一株针对PRRSVGP5的抗独特型抗体Mab2-5G2，其不仅可以抑制GP5抗体与GP5蛋白的结合，而且该抗体从PRRSV易感细胞PAM和MARC-145中拉到一个重要的受体因子蛋白MYH9，同时利用免疫共沉淀方法证实PRRSV囊膜糖基化GP5蛋白与MYH9互作(Gaoetal.2016;Zhouetal.2008)，这些研究提示Mab2-5G2具有模拟GP5蛋白功能。前期研究显示PRRSV感染宿主细胞早期，MYH9由胞浆往细胞膜上运行结合病毒GP5蛋白介导病毒内化，基于前期研究，我们首先推测Mab2-5G2可能作为PRRSV的一个竞争抑制剂，降低PRRSVGP5对宿主细胞MYH9的结合，试验结果显示Mab2-5G2可以明显降低PRRSV对宿主细胞的感染（图5-3，5-4和5-5）。为了从结构生物学揭示MYH9介导PRRSV入侵机制，PRRSVGP5作为三次跨膜的糖蛋白，鉴于目前获得可溶的GP5蛋白和解析其结构难度很大，本试验主要尝试借助一些结构生物学软件预测GP5的“内影象”Mab2-5G2与MYH9结合位点，同时进一步验证这些结合位点在PRRSV感染过程中的作用。本研究首先在原代PAM细胞上(即天然状态)确定Mab2-5G2可以识别MYH9（图5-7A），同时在体外截短表达全长MYH9，借助真核表达和蛋白免疫印迹方法，逐步确定抗独特型抗体Mab2-5G2结合大致区域位于MYH9的羧基端PRA区域（aa1651-1960）（图5-7B），为了进一步查找与Mab2-5G2结合的区域，将PRA区域分为氨基端66氨基酸（1651-1716）和羧基端（1714-1960），经大肠杆菌表达，通过蛋白免疫印迹和ELISA方法进一步查找Mab2-5G2结合区域缩小至PRAaa1651-1716（图5-7C和5-7D）。通过多肽合成，借助dot-blot进一步筛选到与抗体Mab2-5G2结合区域位于aa1668-1696（图5-9）。将Mab2-5G2杂交瘤细胞送测序后，收集抗体Mab2-5G2Fab序列信息和PRA分别输入SWISSModel软件，分别进行同源建模，获得相应的空间结构，鉴于前期研究表明MYH9的形态由两条调节轻链，两条必需轻链和两条重链相互缠绕形成螺旋杆状组成(Chenetal.2003;Fangetal.2010b)，为了进一步验证可溶表达MYH9羧基端(PRA)形态，借助圆二色谱仪，根据测定结果显示重组表达PRA主要为α-螺旋，进而借助DiscoveryStudioClient2.5软件将Fab与分子PRA进行对接（Docking），预测两者结合位点位于E1670，K1673，E1679和I1683（图5-14），为了验证预测位点是否参与抗独特型抗体Mab2-5G2结合，分别设计引物构建几个PRA突变体即几个氨基酸分别突变为丙氨酸或者四个位点同时突变为丙氨酸，重组表达纯化获得五个突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670后，分别验证其结合Mab2-5G2活力，ELISA结果显示，PRA突变上述几个位点后，均不与抗体Mab2-5G2反应，说明野生型PRA突变后在空间结构不与抗体结合，我们进一步用蛋白免疫印迹方法验证两者互作，结果显示当PRA单突变1670E或者1673K时，抗体Mab2-5G2依然可以结合，该数据提示线性状态下的PRA的E1679和I1683与抗体Mab2-5G2结合发挥作用。 90猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究前期研究表明重组PRA可以结合PRRSVGP5蛋白发挥阻断病毒感染，为了验证与抗体Mab2-5G2结合位点突变是否影响病毒复制，我们分别测试PRA突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670与PRRSV的结合力，分析试验数据发现同浓度的PRA突变体与PRRSV结合力均有所下降（图5-19），突变体阻断PRRSV试验结果PRA单突变以上几个位点后，其阻断PRRSV感染能力明显下降，有趣的是当PRA同时突变以上四个位点时，其阻断PRRSV感染能力反而低于PRA单个位点突变，而且病毒捕获试验显示PRA突变体结合PRRSV的能力较PRA明显下降(图5-20和5-21)，可能四个位点同时突变时，造成PRA的空间结构发生改变。综合上述几部分研究发现这些位点都分布在介导PRRSV入侵关键区域MYH91676-1791附近，提示1670E，1673K，1679E和1683I可能是MYH9介导PRRSV入侵易感细胞的位点。5.4小结本试验首先证实Mab2-5G2可以竞争结合宿主细胞表面的MYH9，从而减少PRRSV感染，利用ELISA和Westernblot方法逐步筛选抗独特型抗体Mab2-5G2结合MYH9最小区域，同时借助通过同源建模和分子对接预测两者结合位点位于PRA区域的1670E，1673K，1679E和1683I，分别将这几个位点突变为中性丙氨酸，重组表达PRA几个突变体PRA1683，PRA1679，PRA1673，PRA1670和PRA1683,1679,1673,1670，其处理PRRSV后，与野生型PRA对照组相比，发现突变体组病毒感染宿主细胞能力下降，提示几个位点可能是MYH9介导PRRSV进入宿主细胞的结合位点。 全文总结91全文总结一、鉴定出针对PRRSVGP5蛋白的抗独特型抗体Mab2-5G2与宿主细胞蛋白MYH9结合区域，利用原核表达系统获得此区域可溶性蛋白，探讨其抗PRRSV的活性并揭示抗病毒机制，为后期研制新型的抗病毒药物提供科学的理论依据和试验数据支撑。1.通过比对人、鼠、猴MYH9的序列，设计间并引物，扩增出猪源MYH9全长基因序列，利用Westernblot和间接ELISA初步确定MYH9与Mab2-5G2结合的区域位于羧基端第1651至1960氨基酸。2.表达获得MYH9羧基端区域的重组蛋白（PRA），该蛋白具有良好的可溶性、纯度高、而且可以广谱的阻断多种PRRSV-1和PRRSV-2毒株的感染。3.证实PRA阻断PRRSV感染机制主要通过与PRRSVGP5结合，影响宿主细胞内源性MYH9的重排，从而降低PRRSV的内化过程。二、构建稳定转染猪CD163的不同种属细胞系，通过siRNA干扰和Blebbistatin抑制MYH9功能，验证是否不同种属MYH9均可介导PRRSV感染；通过病毒阻断试验测试不同种属PRA对病毒的抑制作用，比对猪、鼠、人、猴MYH9羧基端序列，通过对PRA的截短表达与抗病毒筛选，鉴定MYH9介导PRRSV进入的关键区域，同时测试针对该区域的多克隆抗体对病毒复制的影响，本研究进一步证实MYH9作为PRRSV进入易感细胞的重要因子。1.成功构建PRRSV易感细胞系PK-15CD163，HEK-293TCD163和BHK-21CD163，证实不同种属MYH9均可介导PRRSV感染。2.验证了不同种属的PRA均可阻断PRRSV的感染，鉴定出与PRRSV结合的关键区域为aa1676-1791。3.证实针对MYH91676-1791的鼠源多克隆抗体可以阻断PRRSV感染MARC-145和PAM。三、本研究首先在原代PAM细胞上测试Mab2-5G2是否对PRRSV感染具有竞争阻断作用，通过逐步截短表达PRA区域和多肽合成，借助ELISA和Westernblot方法逐步查找Mab2-5G2与MYH9结合区域，利用同源建模方法和分子对接获得Mab2-5G2与PRA结合的位点，通过构建PRA突变体以及一系列的功能试验验证结合位点的准确度，试验结果提示这些位点可能是MYH9介导PRRSV入侵宿主细胞的重要位点。1.证实Mab2-5G2对PRRSV感染PAM细胞具有明显地阻断作用，而对多种PRRSV毒株均有效。2.通过逐步截短表达PRA区域，借助ELISA，Westernblot和Dot-blot试验逐步查找Mab2-5G2结合MYH9最小区位于aa1668-1696。3.通过同源建模获得抗体Fab和PRA的空间结构，通过分子对接软件预测Mab2-5G2 92猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究与MYH9的羧基端结合位点为E1670，K1673，E1679和I1683。4.构建重组表达PRA突变体（PRA1670，PRA1673，PRA1679，PRA1683和PRA1670,1673,1679,1683），相关功能试验证实，E1670，K1673，E1679和I1683可能是PRRSV囊膜蛋白GP5结合MYH9入侵易感细胞的结合位点。 本研究创新点和研究展望93本研究创新点和研究展望创新点：1.本研究首次利用PRRSV抗独特型抗体Mab2-5G2从MYH9全基因组上筛选到结合PRRSVGP5的片段PRA，初步测试重组PRA蛋白抗病毒活性同时深入探究该区域抗病毒机制。2.首次证明不同种属MYH9均具有介导PRRSV感染的功能；同时鉴定出MYH9介导病毒内化的关键区域位于aa1676-1791。3．首次Mab2-5G2与MYH9的结合区域aa1668-1696，和PRRSVGP5与MYH9结合区段MYH91676-1791存在部分重合，并且通过同源建模和分子对接的方法，预测抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9结合位点E1670，K1673，E1679和I1683，初步验证这些位点可能是MYH9介导PRRSV入侵位点。未来研究展望：1.表达PRRSVGP5蛋白或者纯化PRRSV病毒粒子与MYH9aa1676-1791复合后，借助冷冻电镜解析其结构，进一步揭示PRRSV入侵的机制。2.借助结构生物学解析MYH9与PRRSVGP5互作位点，设计靶向药物，开发新的抗PRRS病毒药。 94猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究参考文献An,T.Q.,Tian,Z.J.,He,Y.X.,Xiao,Y.,Jiang,Y.F.,Peng,J.M.,Zhou,Y.J.,Liu,D.,Tong,G.Z.2010.PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusattachmentismediatedbytheN-terminaldomainofthesialoadhesinreceptor.VetMicrobiol,143(2-4):371-378.Arii,J.,Goto,H.,Suenaga,T.,Oyama,M.,Kozuka-Hata,H.,Imai,T.,Minowa,A.,Akashi,H.,Arase,H.,Kawaoka,Y.etal.2010.Non-musclemyosinIIAisafunctionalentryreceptorforherpessimplexvirus-1.Nature,467(7317):859-862.Bassaganya-Riera,J.,Thacker,B.J.,Yu,S.,Strait,E.,Wannemuehler,M.J.,Thacker,E.L.2004.ImpactofimmunizationswithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusonlymphoproliferativerecallresponsesofCD8+Tcells.ViralImmunol,17(1):25-37.Binjawadagi,B.,Dwivedi,V.,Manickam,C.,Ouyang,K.,Torrelles,J.B.,Renukaradhya,G.J.2014a.Aninnovativeapproachtoinducecross-protectiveimmunityagainstporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinthelungsofpigsthroughadjuvantednanotechnology-basedvaccination.IntJNanomedicine,91519-91535.Binjawadagi,B.,Dwivedi,V.,Manickam,C.,Ouyang,K.,Wu,Y.,Lee,L.J.,Torrelles,J.B.,Renukaradhya,G.J.2014b.Adjuvantedpoly(lactic-co-glycolic)acidnanoparticle-entrappedinactivatedporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvaccineelicitscross-protectiveimmuneresponseinpigs.IntJNanomedicine,9679-9694.Bohua,L.,Ming,S.,Lu,Y.,Xiaoyu,D.,Baochun,L.,Fenqin,S.,Li,Z.,Xizhao,C.2016.Purificationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirususingultrafiltrationandliquidchromatography.JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,1017-1018:182-186.Burkard,C.,Lillico,S.G.,Reid,E.,Jackson,B.,Mileham,A.J.,Ait-Ali,T.,Whitelaw,C.B.,Archibald,A.L.2017.PrecisionengineeringforPRRSVresistanceinpigs:MacrophagesfromgenomeeditedpigslackingCD163SRCR5domainarefullyresistanttobothPRRSVgenotypeswhilemaintainingbiologicalfunction.PLoSPathog,13(2):e1006206.Cain,H.,Kraus,B.,Krauspe,R.,Osborn,M.,Weber,K.1983.Vimentinfilamentsinperitonealmacrophagesatvariousstagesofdifferentiationandwithalteredfunction.VirchowsArchBCellPatholInclMolPathol,42(1):65-81.Calvert,J.G.,Slade,D.E.,Shields,S.L.,Jolie,R.,Mannan,R.M.,Ankenbauer,R.G.,Welch,S.K.2007.CD163expressionconferssusceptibilitytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses.JVirol,81(14):7371-7379.Chandrasekar,I.,Goeckeler,Z.M.,Turney,S.G.,Wang,P.,Wysolmerski,R.B.,Adelstein,R.S.,Bridgman,P.C.2014.NonmusclemyosinIIisacriticalregulatorofclathrin-mediatedendocytosis.Traffic,15(4):418-432.Charerntantanakul,W.2012.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvaccines:Immunogenicity,efficacyandsafetyaspects.WorldJVirol,1(1):23-30. 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附录107附录SwineMYH9ORIGIN:ATGGCACAGCAAGCTGCCGATAAGTATCTCTATGTGGATAAAAACTTCATCAATAACCCGCTGGCCCAGGCCGACTGGGCTGCCAAGAAGCTGGTATGGGTGCCTTCCGACAAGAGTGGCTTTGAGCCCGCCAGCCTCAAGGAGGAGGTGGGCGAGGAGGCCATCGTGGAGCTGGTGGAGAATGGGAAGAAGGTGAAGGTGAACAAGGATGACATCCAGAAGATGAACCCGCCCAAGTTCTCCAAGGTGGAGGACATGGCCGAGCTCACTTGCCTCAACGAAGCTTCAGTGCTGCACAACCTCAAGGAGCGCTACTACTCAGGGCTCATCTATACCTACTCAGGCCTGTTCTGTGTGGTCATCAATCCATATAAGAACCTGCCCATCTACTCGGAAGAGATCGTGGAAATGTACAAGGGCAAGAAGAGGCATGAGATGCCACCGCACATCTACGCCATCACGGACACCGCCTACAGGAGCATGATGCAAGACCGAGAGGACCAGTCCATTTTGTGCACGGGTGAGTCTGGAGCCGGCAAGACTGAGAACACCAAGAAAGTCATTCAGTACCTGGCTCACGTGGCCTCTTCACACAAGAGCAAGAAGGACCAGGGCGAGCTGGAGCGGCAGCTGCTGCAGGCCAACCCCATCCTGGAGGCCTTCGGCAACGCCAAGACCGTGAAGAACGACAACTCCTCACGCTTCGGCAAGTTCATCCGCATCAACTTTGATGTCAACGGCTACATCGTTGGAGCCAACATTGAGACCTATCTCCTGGAGAAATCCCGTGCCATCCGCCAGGCCAAGGAGGAGCGGACCTTCCATATCTTCTACTACCTGCTGTCTGGGGCTGGGGAGCACCTCAAGACTGATCTCCTGCTGGAGCCGTACAACAAATACCGCTTCCTGTCCAACGGGCATGTCACCATCCCCGGGCAGCAGGACAAGGACATGTTCCAGGAGACCATGGAGGCCATGCGGATCATGGGCATCCCCGAGGAGGAGCAGATGGGCTTGCTGCGGGTCATCTCGGGGGTCCTCCAGCTGGGCAACATCGTCTTCAAGAAGGAGCGTAACACCGACCAGGCGTCCATGCCCGACAACACGGCGGCCCAAAAAGTGTCCCACCTCTTGGGCATCAACGTGACCGATTTCACCAGAGGCATCCTCACCCCGCGCATCAAGGTGGGACGGGATTACGTGCAGAAGGCGCAGACGAAGGAGCAGGCTGACTTTGCCATCGAGGCCTTGGCCAAGGCCACCTACGAGCGCATGTTCCGCTGGCTGGTCCTGCGCATCAACAAGGCTCTGGACAAGACCAAGAGGCAGGGCGCCTCGTTCATCGGCATCCTGGACATCGCCGGCTTCGAGATCTTCGATCTGAACTCCTTCGAGCAGCTCTGCATCAACTACACCAACGAGAAGCTGCAGCAGCTCTTCAACCACACGATGTTCATCCTGGAGCAGGAGGAGTACCAGCGCGAGGGCATCGAGTGGAACTTCATCGACTTCGGCCTCGACCTGCAGCCCTGCATCGACCTCATCGAGAAGCCAGCAGGCCCCCCTGGCATCCTGGCCCTGCTGGACGAGGAGTGCTGGTTCCCCAAAGCCACGGACAAGAGCTTCGTGGAGAAGGTGATGCAGGAGCAGGGCACCCACCCCAAGTTCCAGAAGCCCAAGCAGCTGAAGGACAAAGCTGATTTCTGCATCATCCACTATGCCGGCAAGGTGGATTACAAAGCGGACGAGTGGCTGATGAAGAACATGGACCCGCTAAACGACAACATCGCCACGCTGCTGCACCAGTCCTCCGACAAGTTCGTCTCGGAGCTGTGGAAGGATGTGGACCGCATCATTGGCCTGGACCAGGTGGCCGGCATGTCGGAGA 108猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究CGGCGCTGCCCGGTGCCTTCAAGACGCGCAAGGGCATGTTCCGAACCGTGGGGCAGCTGTACAAGGAGCAGCTGGCCAAGCTGATGGCCACACTGAGAAACACCAACCCCAACTTCGTCCGCTGCATCATCCCCAACCACGAGAAGAAGGCTGGCAAGCTGGACCCCCACCTGGTGCTGGACCAGCTGCGCTGTAACGGCGTCCTGGAGGGCATCCGGATCTGCCGCCAGGGCTTCCCCAACCGCGTGGTCTTCCAGGAGTTCCGGCAAAGATACGAGATCCTGACACCGAATTCCATCCCCAAGGGCTTCATGGACGGGAAGCAGGCGTGTGTCCTCATGATCAAAGCCCTGGAGCTCGACAGCAACCTGTACCGCATCGGCCAGAGCAAGGTCTTCTTCCGGGCGGGCGTGCTGGCCCACCTGGAGGAGGAGCGGGACCTGAAGATCACGGACGTCATCATCGGCTTCCAGGCCTGCTGCAGGGGCTACCTGGCCAGGAAGGCCTTTGCCAAGCGGCAGCAGCAGCTGACGGCCATGAAGGTCCTGCAGAGGAACTGCGCCGCCTACCTCAAGCTGCGCAACTGGCAGTGGTGGCGGCTCTTCACCAAGGTTAAGCCACTGCTGCAGGTGAGCCGGCAGGAGGAGGAGATGATGGCCAAGGAGGAGGAGCTGGTGAAGGTGCGGGAGAAGCAGTTGGCTGCGGAGAACAGGCTCACAGAGATGGAGACCCTCCAGTCACAGCTTATGGCTGAGAAGTTGCAGCTGCAGGAGCAGCTCCAGGCAGAGACAGAGCTGTGTGCCGAGGCCGAGGAGCTCCGGGCCCGCCTGACGGCCAAGAAGCAGGAGCTGGAGGAGATCTGCCATGACCTGGAGGCCAGGGTAGAGGAGGAGGAGGAGCGCTGCCAGCACCTGCAGGCCGAGAAGAAGAAAATGCAGCAAAATATTCAGGAACTGGAGGAGCAGCTGGAGGAGGAGGAGAGCGCCCGGCAGAAGCTGCAGCTGGAGAAGGTGACCACCGAAGCCAAGCTGAAGAAGCTGGAGGAGGACCAGATCATCATGGAGGACCAGAACTGCAAGCTGGCCAAGGAGAAGAAGCTGCTGGAAGACCGGATAGCTGAGTTCACCACCAACCTCATGGAAGAGGAGGAGAAATCCAAGAGCCTCGCCAAGCTCAAGAACAAGCACGAGGCGATGATCACCGACTTGGAGGAGCGCCTGCGGAGAGAGGAGAAGCAGCGTCAGGAGCTAGAGAAGACCCGCCGGAAGCTGGAGGGAGACTCCACGGACCTCAGCGACCAGATCGCCGAGCTGCAGGCTCAGATCGCCGAGCTCAAGATGCAGCTGGCCAAGAAGGAGGAGGAGCTCCAGGCTGCCCTGGCCAGAGTGGAAGAAGAAGCCGCCCAGAAGAACATGGCCCTAAAGAAGATCCGGGAGCTGGAATCTCAGATTTCTGAGCTCCAGGAAGACCTGGAGTCTGAGCGTGCTGCTAGGAATAAAGCTGAGAAGCAGAAACGGGACCTCGGGGAAGAGCTGGAGGCCCTGAAAACAGAGTTGGAGGACACTCTGGATTCCACGGCTGCCCAGCAGGAGCTCAGGTCCAAACGGGAACAGGAAGTGAACATCCTGAAGAAGACCCTTGAGGAGGAGGCCAAGACCCACGAGGCGCAGATCCAGGAGATGAGACAGAAGCACTCGCAGGCCGTGGAGGAGCTGGCAGAGCAGCTGGAGCAGACGAAGCGGGTGAAAGCCAACCTGGAAAAGGCCAAGCAGACCCTGGAGAATGAGCGAGGGGAGCTGGCCAATGAGGTGAAGGTGCTGCTGCAGGGCAAGGGGGACTCCGAGCACAAGCGGAAGAAGGTGGAGGCGCAGCTGCAGGAGATGCAGGTGAAGGTCACCGAGGGAGAGCGCGTGCGCACGGAGCTGGCCGACAAGGTCTCCAAGCTGCAGGTGGAGCTGGACAACGTGACAGGTCTCCTCACCCAGTCGGACAGCAAGTCCAGCAAGCTCTCCAAGGACTTCTCCGCTCTGGAGTCCCAGCTGCAGGACACGCAGGAGCTGCTGCAAGAGGAGAACCGGCAGAAGCTGAGCCTGAGCACGAAGCTGAAGCAGGTGGAGGATGAGAAGAACTCCTTCAAGGAGCAGCTGGAGGAGGAGGAGGAGGCCAAGCGGAA 附录109CCTCGAGAAGCAGATCGCCACCCTCCATGCCCAGGTGACCGACATGAGGAAAAAGATGGAGGATGGCGTGGGGTGCCTGGAGCTGGCCGAGGAGGCCAAGAGGAAGCTCCAGAAGGACCTGGAGGGGCTGGGCCAGCGCTTCGAGGAGAAAGTGGCCGCCTACGACAAGCTGGAGAAGACCAAGACGCGGCTGCAGCAGGAGCTGGACGACCTGCTCGTGGACCTGGACCACCAGCGGCAGAGCGTCTCCAACCTGGAGAAGAAGCAGAAGAAGTTCGACCAGCTCCTGGCCGAGGAGAAGACCATCTCCGCCAAGTACGCGGAGGAGCGCGACCGGGCGGAGGCCGAGGCCCGGGAGAAGGAGACCAAGGCGCTGTCCGTGGCGCGGGCGCTGGAGGAGGCCATGGAGCAGAAGGCGGAGCTGGAGCGGCTCAACAAGCAGTTCCGCACGGAGATGGAGGACCTCATGAGCTCCAAGGACGACGTCGGCAAGAGCGTGCACGAGCTGGAGAAGTCCAAGCGGGCTCTGGAGCAGCAGGTGGAGGAGATGAAGACCCAGCTGGAGGAGCTGGAGGACGAGCTGCAGGCCACCGAGGACGCCAAGCTGCGGCTGGAGGTGAACCTGCAGGCCATGAAGGCCCAGTTCGAGCGGGACCTGCAGGGCCGCGACGAGCAGAGCGAGGAGAAGAAGAAGCAGCTGGTCAGACAGGTGCGGGAAATGGAGGCCGAGCTGGAGGACGAGCGGAAGCAGCGCTCGATGGCTGTGGCCGCTCGGAAGAAGCTGGAGATGGACCTGAAGGACCTGGAGGCCCACATCGACTCAGCCAACAAGAACCGGGACGAAGCCATCAAGCAGCTGCGGAAGCTGCAGGCTCAGATGAAGGACTACATGCGGGAGCTGGAGGACACGCGTGCCTCCCGCGAGGAGATCCTGGCACAGGCCAAGGAGAACGAGAAGAAGCTGAAAAGCATGGAGGCCGAGATGATCCAGCTGCAGGAGGAGCTGGCCGCCGCCGAGCGTGCGAAGCGCCAGGCCCAGCAGGAGCGGGACGAGCTGGCGGACGAGATTGCCAACAGCAGCGGCAAAGGGGCGCTGGCGTTGGAGGAGAAACGGCGCCTGGAGGCCCGCATTGCGCAGCTGGAGGAGGAGCTGGAGGAGGAGCAGGGCAACACAGAGCTGGTGAACGACAGGCTGAAGAAGGCGAACCTGCAGATCGACCAGATCAATACCGACCTGAACCTGGAGCGCAGCCACGCCCAGAAGAACGAGAACGCACGGCAACAGCTGGAGCGCCAGAACAAGGAGCTCAAGGTCAAGCTGCAGGAGATGGAAGGCACCGTCAAGTCCAAGTACAAGGCCTCCATCGCCGCCCTCGAGGCCAAGATCGCGCAGCTGGAGGAGCAGCTGGACAACGAGACCAAGGAGCGCCAGGCAGCCTGCAAGCAGGTGCGTCGGGCCGAGAAGAAGCTGAAGGACGTGTTGCTGCAGGTGGATGATGAGCGGAGGAACGCGGAGCAGTACAAGGACCAGGCGGACAAGGCGTCCACCCGCCTGAAGCAGCTCAAGCGGCAGCTGGAGGAGGCCGAGGAGGAGGCCCAGCGGGCCAACGCCTCCCGCCGGAAGCTGCAGCGCGAGCTCGAAGATGCCACGGAGACCGCCGATGCCATGAACCGTGAGGTCAGCTCCCTCAAGAACAAGCTCAGGCGTGGGGACCTGCCGTTTGTCGTGCCGCGCCGAATGGGCCGGAAAGGTGCCGGCGACTGCTCAGACGAGGAGGTGGACGGCAAAGCCGACGGGGCTGAGGCCAAACCTGCCGAATAA. 110猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究Mab2-5G2VL-CL:GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGAATGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTTTTATGCAACAAGCTTGGCCGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTMab2-5G2VH-CH:GTGCAGCTGCAGGAGTCTGGTCCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAGCTACAGTGGTAACACTCGCTATAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCGATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATCGGGTTTCTATAGGTACGACGGCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTG 中英文对照缩略词表111中英文对照缩略词表英文缩写英文全称中文全称MabMonoclonalantibody单克隆抗体TEVtobaccoetchvirus烟草蚀纹病毒ADEAntibody-dependentenhancement抗体依赖增强作用CapCapsidprotein衣壳蛋白MOIMultiplicityofinfection感染复数TCID50Tissuecultureinfectiousdose-50半数组织感染剂量CPECytopathiceffect细胞病变效应IFAImmunofluorescenceassay间接免疫荧光检测WBWesternblot免疫印迹PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附法ODOpticaldensity光密度SDSSodiumdodecyIsulfate十二烷基硫酸钠NMHCIINonmusclemyosinheavychainII非肌肉肌球蛋白II型重链DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚Hhour小时minminute分钟sseconds秒钟FBSFetalbovineserum胎牛血清DMEMDulbecco’sModifiedEagle’sMedium达尔伯克改良伊格尔培养液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应ECLElectro-chemi-luminescence电化学发光PK-15Porcinekidney15cell猪肾细胞BHK-21BabyHamsterSyrianKidney乳仓鼠肾细胞HEK-293Thumanemborynickidney人源胚胎肾细胞PRRSPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征PCV2PorcinecircovirusType2猪圆环病毒2型HSV-1Herpessimplexvirus单纯疱疹病毒I型SFTSVSeverefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus血小板减少综合症病毒EBVEpstein–Barrvirus巴尔病毒PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯膜μg,mg,gMicrogram,milligram,gram微克，毫克，克SCFVsingle-chainantibodyfragment单链抗体CDRcomplementarity－determiningregions互补决定簇RLCsregulatorylightchains调节轻链ELCsessentiallightchains必需轻链 112猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究致谢时光荏苒，岁月如梭。四年的博士生活即将结束，在这里，我真诚的感谢那些曾经在学习、科研和生活中给予我无私指导和帮助的老师和同学们。首先，诚挚的感谢我的导师周恩民教授。无论是在科研中，还是在生活上，周老师都给予了我莫大的关怀和帮助，尤其是恩师在学术上的指导和教诲是我的科研和论文顺利完成的基础和保障。周老师严谨求实的治学态度，渊博的学识，对前沿科研问题敏锐的洞察力，与时俱进的科学思想，高昂的工作热情和锲而不舍、百折不挠的坚韧毅力，对科学研究那份执着追求，都深深影响着我，当学生的试验进入困境时，您如同慈父，几句温馨话，一个鼓励的眼神，足以支撑学生度过难关，同时特别感谢我的师母陈晓萍老师，您如一位慈母关心学生的成长，纳诲于严父慈母，在此向恩师和师母致以深深的谢意，祝福你们身体健康，生活快乐，幸福美满。特别感谢河南农业大学的张改平院士，感谢河南省农业科学院的乔松林研究员，侄玉宝研究员，李睿老师，刘云超老师，陈鑫鑫老师在河南学习一年来，感谢各位老师和马红芳师姐，陈静师姐，师弟孙彦刚，王林建等对我试验的帮助，同时深深的感谢复旦大学丁澦副教授，丁老师对我无私的指导和试验材料支持，让学生感动，深深的祝福丁老师一切顺利。感谢西北农林科技大学理学院陶虎教授，杨彦涛老师和周晓娜老师，感谢中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王靖飞研究员和郭莹莹副研究员，几位老师深厚的专业知识和崇高的师德，令学生钦佩，谢谢老师们在蛋白表达和结构生物学研究方面对我谆谆教诲和辛勤培养，传授给我丰富的结构生物学专业知识和扎实的实验技能，这些都为我科学研究的顺利进行保驾护航，并将成为我一生的宝贵财富，深深感谢刘春国老师，魏丽丽老师，孙振钊师兄，王世达师兄，王慧敏师妹，师弟史智宾对我是试验帮助和支持，兽研电镜组是非常温馨的家。深深的感谢本课题组的南雨辰副教授、赵钦副教授、武春燕副教授对于我科研论文发表的指导和帮助，谢谢课题组的穆杨老师，孙亚妮老师，杜涛峰老师，郭文平老师，对我试验的支持，特别感谢我们的高级实验师陈国霞老师，实验室在您的管理下整洁有序，为我们提供了良好的学习和科研工作环境。在此祝福老师们身体健康，笑口常开！深深感谢课题组已毕业的王刚师兄，高继明师兄，王向鹏师兄，张冲师兄，吕军华师兄，黄柏成师兄，刘红亮师兄，孔宁师兄，李治军师兄，刘宁宁师姐，李琼毅师姐，于颖师姐，李慧霞师姐在具体实验方面给予我悉心的指导和帮助。感谢课题组同一届的王鑫杰，张昂克，姬鹏超，梁超，党露以及苏运芳博士等给予我的帮助。感谢师弟孙伟尧，胡启帆，真诚谢谢你们在实验上的鼎力相助，试验顺利完成离不开你们的辛勤付出，感谢师弟：张贝贝，侯高鹏，张茂东，罗雪刚，刘迎琦，丁培阳，师妹薛碧云，王立珍， 致谢113范梦男，谢莎，史云鹏，王雪婷，共同营造了一个温馨和睦的课题组大家庭，为我博士生活留下了很多幸福时刻。深深感谢论文评阅专家对本论文的悉心审阅和指正。深深感谢学位论文答辩委员会的各位老师能在百忙之中参加我的博士学位论文答辩。衷心感谢我的父母、爱妻王彤彤博士以及朋友们，是他们无微不至的关怀和爱护，不断的勉励和教诲，支持着我完成博士学位。最后再次衷心感谢所有关心和帮助过我的老师、同学及亲朋好友，祝你们身体健康、万事如意！李亮亮2018年10月 114猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体Mab2-5G2与MYH9蛋白互作的研究作者简介李亮亮，男，汉族，中共党员，山东平度人。2011年毕业于青岛农业大学动物科技学院动物医学专业，获得农学学士学位。同年考入西北农林科技大学的动物医学院预防兽医专业，攻读硕士学位，师从穆杨副教授，2014年6月获得农学硕士学位。同年保送西北农林科技大学预防兽医学专业，攻读博士学位，师从周恩民教授，博士期间主要从事猪繁殖与呼吸综合征病毒抗独特型抗体与受体蛋白研究，研究PRRSV进入机制和筛选抗病毒药物。研究生学习期间发表或参与发表的学术论文如下：1.LiL,XueB,SunW,GuG,HouG,ZhangL,WuC,ZhaoQ,ZhangY,ZhangG,HiscoxJA,NanY,ZhouEM*.RecombinantMYH9ProteinC-TerminalDomainBlocksPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusInternalizationbyDirectInteractionwithViralGlycoprotein5.AntiviralRes.2018Aug;156:10-20.doi:10.1016/j.antiviral.2018.06.001.Epub2018Jun4.2.LiL,WuC,HouG,XueB,XieS,ZhaoQ,NanY,ZhangG,ZhouEM*.Generationofmurinemacrophage-derivedcelllinesexpressingporcineCD163thatsupportporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection.BMCBiotechnol.2017Nov9;17(1):77.doi:10.1186/s12896-017-0399-5.3.MuY,LiL,ZhangB,HuangB,GaoJ,WangX,WangC,XiaoS,ZhaoQ,SunY,ZhangG,HiscoxJA,ZhouEM*Glycoprotein5ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainSD16inhibitsviralreplicationandcausesG2/Mcellcyclearrest,butdoesnotinducecellularapoptosisinMarc-145cells.Virology.2015Oct;484:136-45.doi:10.1016/j.virol.2015.05.019.Epub2015Jun194.LiZ,WangG,WangY,ZhangC,WangX,HuangB,LiQ,LiL,XueB,DingP,SyedSF,WangC,CaiX,ZhouEM.RescueandevaluationofarecombinantPRRSVexpressingporcineInterleukin-4.VirolJ.2015Nov14;12:185.doi:10.1186/s12985-015-0380-7.5.LiZ,WangG,WangY,ZhangC,HuangB,LiQ,LiL,XueB,DingP,CaiX,WangC,ZhouEM.ImmuneresponsesofpigsimmunizedwitharecombinantporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusexpressingporcineGM-CSF.VetImmunolImmunopathol.2015Nov15;168(1-2):40-8.doi:10.1016/j.vetimm.2015.08.003.Epub2015Aug146.李亮亮，张雪梅，汤小龙，周恩民，穆杨*，猪繁殖与呼吸综合征核酸疫苗研究进展，动物医学进展，2014，35（3）：87-91.
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