《猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒感染猪肺泡巨噬细胞差异蛋白的筛选及验证》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
．為；奈ｖ＼．ｆｒ论文编号章攀ｒ，嫂妾：—．＂．Ｖ－－孚＼－呈；Ｊ為於中国农业科学燃弄．，＿議誦＾毒酱转畏．施；学位徐乂诗難旷韻；■■－／－．－：＞：：苗技＾藏蒙殖与呼吸综合征病毒强弱奉感染猪肺泡臣晚奢细胞差异蛋白的錄选验证部＇甚，【＾ｏ一ＳｃｒｅｅｎｉｎａｎｄＴｅｓｔｉｎｇｆ说ｆｅｒｅｎ材ａｌＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＰＡＭｓＩｎｆｅｃｔｅｄ／：ｇ＊＾ｗｉ化ＨｉｇｈｌｙＰａ化ｏｉｃａｎｄＡｔｅｎｕａｔｅｄＰＲＲＳＶｓ三＇ｇ畑＇＂ｒ－ｆｖ．择＿方＇■．＇：！？？ｔ．．＇－二．－ｒ．＇．；Ｗ．‘．：．＂户．三－＇．－’’．．亨－－巧户：＾＾二：呈呈；咕芒．＇巧．＇，＇：＇．－．－：‘＇／ＷＳ．；冷：：４．．ｒ；＇：爲终＿石／．皆氏癸心．：娜ｐ＇勺次－＾八－＾＇乂魏－－－六－．；：．：ｍ賴Ｖ．：＾心爲六＾等一－■■．．－’－‘＇＇，＂－辜已考申■■：：：乃茲．式Ｖ％＇為冷．雅巧气一京．＇軟．‘．＇－；野’馬气矜ｔｃ＼ｖ：：脊寡霉巧若’硕±研巧生：曲泽巧＾：蹇＞章＾冻；．這；養二．胃表童光志研巧员苗去：法瓦＇？＇巧：＼译指导教师！．＇＾：：；－．令产－：；＞三ＶＪ马：ｆｊ鸯若ｔｆ申请学位華别业：农学巧女頭舊讀璋讓研专：预防兽运学，拦－，、－？：导ｉ．其＇或．■；：寅―一巧方向：兽區微生称及其分子生伤学．％凑．＇？＇己单位：上海鲁医研狱ｆ劈；聲靠＾巧养；莫晏．．‘減福４：芯．．研宛生院ｉＶｉ：；；露喔Ａ，．－：■－．Ｖ，．Ｉｒ三＇‘■一，－－－亏－：ｎ．著泉Ｋ－户；■’－卢赏ＹＸ的话皆手觀；式－－聲病．节．＇’．：＇心冶妄，．三巧取；．廣；＇节．／Ｖ兰扛记皆！等－＂’＂’－＇．勺今Ｕ务户皆｝－六ｙ＼．如叫是扛Ｔ—某；早＇凌取：．Ｍｆ巧诗扣清；心．＇＇：＇‘；六勢请？？巧．致Ｋ培皆怒＾亩产ｙ藤；谭＾？＇‘謝６年化＂５月口．．．＂Ｖ＾非；－或；满豁獲：苗證．，导茜Ｆ，巧儀－．户．＇—＇＇：；；減普：声，實：泉寒巧．巧每节子＇＇－ｖ：；ｔｖ：ｖ．＾－／Ｐｒ／ｍ－ｍ：＾Ａｉｉ 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒感染猪肺泡巨噬细胞差异蛋白的筛选及验证ScreeningandTestingofDifferentialProteinsofPAMsInfectedwithHighlyPathogenicandAttenuatedPRRSVs硕士研究生：曲泽慧指导教师：童光志研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：上海兽医研究所研究生院2016年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationScreeningandTestingofDifferentialProteinsofPAMsInfectedwithHighlyPathogenicandAttenuatedPRRSVsM.S.Candidate：ZehuiQuSupervisor：Prof.GuangzhiTongMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2016 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒感染猪肺泡巨噬细胞差异蛋白的筛选及验证兽医微生物及其分子论文作者曲泽慧专业预防兽医学研究方向生物学指导教师童光志培养单位（研究所、中心）上海兽医研究所姓名职称单位专业签名评盲审////阅盲审////人盲审////答辩范红结教授南京农业大学预防兽医学主席周继勇教授南京农业大学微生物学华修国教授上海交通大学预防兽医学答丁铲研究员上海兽医研究所预防兽医学辩廖瑛研究员上海兽医研究所预防兽医学委员会议记录（秘书）顾惠明论文答辩时间地点2016年5月19日，上海兽医研究所 摘要猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSvirus,PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为特征的急性传染病。1987年，该病在美国首次报道。2006年，中国爆发高致病性PRRS，除了经典症状以外，以高致病率与高死亡率为主要特点。PRRSV为单股正链RNA病毒，属于套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属；基因组在核糖体移码框的作用下转录并翻译为pp1a与pp1ab两段多肽，并在其自身产生的水解酶的作用下，将这两条多肽链消化产生多于12种非结构蛋白，这些非结构蛋白会参与结构蛋白的合成，与此同时，产生的结构蛋白与非结构蛋白会一同协作，参与病毒感染宿主细胞的过程。PRRSV具有严格的细胞嗜性，在患猪体内病毒主要靶细胞是肺泡巨噬细胞（PAM）以及不同组织的单核巨噬细胞，不同毒力的毒株感染PAM效率有显著差异，导致这种差异的机制尚不清楚。本研究以高致病性PRRSVHuN4强毒株与其传代致弱的HuN4-F112弱毒株为参考毒株，构建重组EGFP-PRRSV强弱毒感染性克隆，感染和纯化PAM，进行定性蛋白质谱分析；同时以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行定量蛋白质谱分析，筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白，可揭示PRRSV不同毒力毒株感染细胞效率差异的分子基础，为PRRSV致病机制的研究提供理论依据。为了纯化和筛选与PRRSV相互作用的宿主细胞膜蛋白，本研究首先分别构建了含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组PRRSV强弱毒感染性克隆，作为指示病毒，为筛选及验证与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白提供技术支撑。以PRRSVHuN4感染性克隆以及其传代致弱毒株HuN4-F112感染性克隆为骨架，利用反向遗传操作技术，在其病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入egfp基因，并在外源基因3端下游插入该病毒的转录调控序列6（TRS6），构建重组病毒感染性分子克隆pHuN4-EGFP和pHuN4-F112-EGFP，并通过转染拯救出重组病毒。在MARC-145细胞中，将重组病毒连续传代，其外源egfp基因仍能够持续表达，表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒在病毒滴度、噬斑形态、生长能力等方面与亲本毒无明显差异。在获得具有能够持续表达绿色荧光蛋白的重组PRRSV强弱毒之后，将强弱毒重组病毒分别感染PAM，纯化PAM，提取细胞膜蛋白进行定性蛋白质谱分析，筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明，在分选流式仪的FITC通道中，可获得强弱重组病毒感染PAM而产生的绿色荧光信号，分选出重组病毒感染的PAM，获得了纯化的细胞膜蛋白，利用Shotgun方法进行了膜蛋白定性蛋白质谱分析，获得的蛋白信息进行GO注释，并按蛋白分类分析，筛选出强弱毒差异蛋白93个。对选择的5个相关蛋白进行标签融合和真核上调表达试验，发现ApolipoproteinM、JUP、ApolipoproteinA-IV和Kexintype9对强毒存在抑制作用，推测为抵御PRRSV感染的宿主蛋白；Clusterinisoformx1对强毒的感染存在上调作用，推测可能是PRRSV感染的宿主受体蛋白。以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行了定量蛋白质谱分析，筛选及验证了与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明，通过Label-free定量蛋白质组分析，获得差异蛋白95个，其中确定定位在膜上26个；通过WesternBlot验证了KDEL受体以及HistoneH3蛋白，发I 现与质谱结果中强弱毒组检测结果一致，证明了质谱的可靠性；通过Stringanalysis方法寻找强弱毒之间的差异感染机制，揭示了不同毒力PRRSV感染PAM的差异潜在信号通路。关键词：PRRSV，强弱毒株，重组病毒，PAM细胞，膜蛋白，质谱分析。II AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)hasremainedaleadingeconomicallysignificantviraldiseaseofswineworldwideforalmost28years,andwasfirstfoundin1987,USA.In2006,severallarge-scale,severeoutbreaksofhighlypathogenicPRRSV(HP-PRRSV)wasreportedinChina.PRRSVisamemberofthefamilyArteriviridae,togetherwithEquineArteritisVirus(EAV),SimianHemorrhagicFeverVirus(SHFV),andtheLactateDehydrogenase-elevatingVirusofMice(LDV).PRRSVisapositive-sense,single-strandedRNAvirus,throughaso-calledribosomalframeshiftmechanism,pp1aandpp1abaretranslatedandhydrolyzedintomorethan12Nsps,andthentheywillhelpproducethestructuralproteins,withwhichparticipatethevirusentry.PRRSVexhibitsahighlyrestrictedcelltropismbothinvivoandinvitro.PAMsarethemaintargetcellsofPRRSV.PRRSVhasalsobeenshowntoinfectMARC-145,whichisconsideredpermissivecelllinesforPRRSV.Theinfectioneffectbetweendifferentvirulentstrainschangesbadly,anditisstilllargelyunknown.HP-PRRSV(HuN4)anditsattenuatedPRRSV(HuN4-F112)wereusedasthebackboneforconstructingtherecominantpHP-EGFPandpA-EGFPinfectiousclone.ThemembraneproteinsofPAMwerepurifiedandperformedforShotgunMS.ThemembraneproteinsofparentalHP-PRRSVandAP-PRRSVinfectedPAMsweredetectedbyLabel-freeMS.TheresultshavegreatsignificanceforthestudyofPRRSV’spathogenesis.InordertoscreenthemembraneproteinsofPAMsinterplayedwiththePRRSV.Thereportgeneofenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)genewasinsertedbetweenORF1bandORF2aofthefulllengthinfectiouscloneofHP-PRRSVHuN4anditsattenuatedPRRSVvaccinestrainHuN4-F112bySOEPCR(designatedpHuN4-EGFPandpHuN4-F112-EGFP),andtherecombinantPRRSV(vHuN4-EGFPandvHuN4-F112-EGFP)expressingEGFPwasrescuedbytransfecting.Then,geneticallystabletestshowedthattheforeigngenewasstableforpassages.Moreover,theviraltiter,plaquemorphologyandthegrowthabilityoftherecombinantvirusweresimilartotheparentalvirus.AfterobtainingtherecombinantvHuN4-EGFPandvHuN4-F112-EGFP,wesortedthepositivecellsinfectedwiththiskindofrecombinantvirusbyFACSthroughdetectingthegreenfluorescencesignalandthenthemembraneproteinofsortedcellswasextractedandperformedforthefollowingShotgunMS,someproteinswerechosenandanalyzedforfurtheroverexpressioninMARC-145cells.ThentheMARC-145cellswereinfectedwithHP-PRRSVandAP-PRRSVagain.ThroughWesternBlotting,wecanobtainthepotentialinteractionsbetweenthetargetproteinsandtheHP-,AP-PRRSVrespectively,wefoundthattheApolipoproteinM,JUP,ApolipoproteinA-IVandKexintype9downregulatedthePRRSV,whileClusterinisoformx1upregulatedthePRRSV.Ontheotherhand,theHP-PRRSV(HuN4)andAP-PRRSV(HuN4-F112)wereusedforinfectingPAMandthemethodofLabel-freequantifiedMSwereconductedfordetectingwiththethepotentialdifferentialinfectionpathwayofHP-PRRSVandAP-PRRSV.95differentialproteinsweredetectedand26ofthemwerelocatedonthemembraneconfidently,andwegotKDELreceptorandHistoneH3toIII verifytheLabel-freeMSbyWB.SeveraldifferentpotentialpathwaysbetweenHP-PRRSV,AP-PRRSVwerefoundbyStringanalysis.Keywords:PRRSV,HP-PRRSV,PAM,Membraneprotein,Massspectrometry.IV 目录第一章引言..........................................................11.1PRRSV病原学概述..................................................11.1.1病毒的基因组结构特征..........................................11.1.2病毒的编码的蛋白..............................................21.1.3PRRSV感染细胞机制............................................41.1.4PRRSV进入宿主细胞RIG-I信号通路..............................51.1.5PRRSV进入宿主细胞TLR3信号通路...............................61.1.6PRRSV进入宿主细胞NF-κB信号通路.............................71.2反向遗传操作技术..................................................71.2.1RNA病毒反向遗传学技术........................................81.2.2RNA病毒反向遗传学的研究进展..................................91.2.3PRRSV反向遗传学的研究进展....................................91.3分选流式细胞术....................................................91.3.1流式细胞术的原理.............................................101.3.2流式细胞术的研究进展.........................................101.4蛋白质组学概述...................................................101.4.1常用的蛋白质组学研究技术.....................................111.4.2Shotgun定性质谱的研究进展...................................121.4.3Label-free定量质谱的研究进展................................131.5研究目的和意义...................................................13第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建................142.1实验材料.........................................................142.1.1病毒株.......................................................142.1.2细胞.........................................................142.1.3主要试剂.....................................................142.1.4主要仪器设备.................................................152.1.5引物及设计...................................................15V 2.2实验方法.........................................................152.2.1重组病毒感染性克隆的构建.....................................152.2.2病毒拯救及纯化传代...........................................162.2.3重组病毒的PCR鉴定..........................................162.2.4重组病毒报告基因表达的鉴定...................................172.2.5重组病毒的间接免疫荧光的鉴定.................................172.2.6重组病毒的生物学特性鉴定.....................................172.3结果.............................................................182.3.1EGFP重组PRRSV的全长克隆的构建与感染性检测..................182.3.2重组病毒与亲本病毒结构蛋白表达分析结果.......................192.3.3重组病毒与亲本病毒的生物学特征分析结果.......................202.4讨论.............................................................22第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证....................233.1材料.............................................................233.1.1病毒株.......................................................233.1.2细胞.........................................................233.1.3主要试剂.....................................................233.1.4主要仪器设备.................................................243.2方法.............................................................243.2.1PAM细胞分离培养.............................................243.2.2Shotgun质谱分析重组病毒感染PAM细胞的制备...................243.2.3Label-free质谱分析亲本病毒感染PAM细胞的制备................253.2.4Shotgun定性质谱分析.........................................253.2.5Label-free定量质谱分析......................................263.2.6Shotgun质谱分析目的蛋白的过表达验证.........................283.2.7Label-free质谱分析目的蛋白WB验证...........................293.3结果.............................................................293.3.1PAM细胞的分离培养...........................................29VI 3.3.2重组病毒感染PAM细胞.........................................303.3.3绿色荧光信号检测.............................................313.3.4Shotgun定性质谱分析结果.....................................313.3.5Label-free定量质谱分析结果..................................333.3.6Shotgun质谱分析目的蛋白的过表达验证结果.....................373.3.7Label-free质谱分析目的蛋白的WB验证结果.....................373.4讨论.............................................................38第四章全文总结.......................................................45参考文献..............................................................46致谢..................................................................54作者简介..............................................................55VII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称PorcineReproductiveandRespiratoryPRRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒SyndromeVirusNNucleocapsid核衣壳ORFOpenReadingFrame开放阅读框FBSFetalBovineSerum胎牛血清BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液MOIMultiplicityofInfection感染复数TCID5050%TissueCultureInfectiveDose半数组织培养感染量hpiHoursPostInfection感染后小时数μLMicroliter微升mLMilliliter毫升μgMicrogram微克hHour小时minMinute分钟secSecond秒rpmRotationPerMinute转/分ntnucleotide,核苷酸bpBasePair碱基对kbKilobase千碱基pHPowerofHydrogen酸碱度DNADeoxyRibonucleotideAcid脱氧核糖核酸RNARibonucleicacid核糖核酸cDNAComplementaryDNA互补DNAPCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应IFAImmunofluorescenceassay免疫荧光试验PAMPorcineAlveolarMacrophage猪肺泡巨噬细胞IFNInterferon干扰素WBWesternBlotWestern印迹MSMassSpectrometry质谱技术MARC-145MonkeyEmbryonicKidneyepithelialcells145猴胚胎肾上皮细胞145VIII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1PRRSV病原学概述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV），为单股正链RNA病毒，属于套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。同一科属的病毒除PRRSV以外还有鼠乳糖脱氢酶增高征病毒（LDV）、马动脉炎病毒（EAV）以及猴出血热病毒（SHFV）(Benfieldetal.,1992)。1985年，美国首次出现PRRSV的相关报道(Keffaber,1989)。在中国，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的郭保清在1996年第一次分离。从临床症状来看，最为多见的是母猪严重的繁殖障碍（以流产，死胎，弱胎，木乃伊胎为特点）(Albina,1997;Bilodeauetal.,1991;Christianson,1992;Poletal.,1991)以及所有年龄猪以严重间质性肺炎为特点的呼吸困难(Albina,1997;Bilodeau,etal.,1991;Collinsetal.,1992;Halbur,etal.,1996;Rossowetal.,1994)。2006年，中国南方爆发高致病性猪蓝耳病，除了经典感染症状以外，以高死亡率为主要特点(Lietal.,2007;Tian,etal.,2007)。PRRSV，直径大约60nm。如图1.1所示，脂质双层膜上面是糖蛋白等病毒基因组编码的结构蛋白，该病毒的核心由呈螺旋的核衣壳组成，内部包裹着病毒核酸(Spilmanetal.,2009)。PRRSV十分脆弱，一般暴露于清洁剂或者温度，pH值不适宜的条件下都会导致病毒活性与感染力的丧失(Benfield,etal.,1992)。即便如此，如果条件适宜，PRRSV可以气溶胶的形式传播4.7km(Deeetal.,2009)。图1.1PRRSV的病毒学形态模型Fig.1.1ThevirologicmorphologyofthePRRSV无论在体内环境还是体外环境，PRRSV都具有严格的细胞嗜性。在体内，PRRSV主要侵染不同种类及不同组织的单核巨噬细胞细胞系，其中PRRSV对于猪的肺泡巨噬细胞（PAM）的侵袭最为典型(Beyer,etal.,2000;Duan,etal.,1997a;Halbur,etal.,1995;Halbur,etal.,1996)。有相关报道，PRRSV的RNA在自然感染状态下的细支气管上皮细胞，肺泡管的上皮样细胞，以及肺细胞中都有发现(Teifkeetal.,2001)。目前实验室里常用的传代细胞为MARC-145细胞。1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.1.1病毒的基因组结构特征PRRSV全长15Kb，在5端存在有帽子结构，并在3端存在一个PolyA结构。通过图1.2的方式，PRRSV基因组会在核糖体移码框的作用下转录并翻译为pp1a与pp1ab两段多肽，在其自身产生的水解酶的作用下，这两条多肽链消化为多于12种非结构蛋白，参与了后续结构蛋白合成，与此同时，产生的结构蛋白与非结构蛋白共同协作，参与病毒侵袭宿主细胞的过程。图1.2PRRSV基因组组成与复制翻译的过程Fig.1.2ThecompositonofPRRSVgenomeandreplication,translationprocess1.1.2病毒的编码的蛋白PRRSV的病毒蛋白主要分为两类，非结构蛋白和结构蛋白。非结构蛋白先于结构蛋白合成并参与病毒入侵机体以及结构蛋白合成，PRRSV非结构蛋白的特点与功能见表1.1，PRRSV的结构蛋白特点及功能见表1.2。2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言表1.1PRRSV的非结构蛋白特点与功能Table.1.1CharacterandfunctionofthePRRSVsNSP基因蛋白名称特点与功能ORF1aNSP1多功能调节蛋白，参与转录与修饰过程。具有蛋白水解活性以及干扰素抑制活性。NSP2最大的PRRSV病毒复制相关蛋白，是欧洲株与北美株PRRSV差别最大的区域，具有蛋白水解活性以及干扰素抑制活性。NSP3具有蛋白酶水解活性，其中NSP4具有干扰素抑制活性。NSP4NSP5NSP6NSP7NSP8ORF1bNSP9参与病毒转录与复制，其中NSP9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性（RDRP），NSP10并且具有ATP酶活性，NSP10具有解旋酶活性，NSP11具有干扰素抑制活性。NSP11NSP123 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言表1.2PRRSV的结构蛋白特点与功能Table.1.2CharacterandfunctionofthePRRSVsstructuralproteins基因蛋白名称特点与功能ORF2aGP2a较小，包含两个高度保守的N端糖基化位点，对于病毒的感染至关重要，能够被病毒粒子包含作为一个多聚体的复合物，是一种病毒吸附蛋白。ORF2bE较小，非糖基化的，十八烷基化的结构蛋白，对于病毒的感染至关重要，能够与病毒粒子形成多聚体，拥有通道样的特点，可能起病毒囊膜上孔蛋白的作用。ORF3GP3较小，最容易突变的PRRSV蛋白之一，被7个N端的低聚糖高度糖基化，膜的拓扑结构在不同的毒株之间存在特异性。具有很好的抗原性并且可能参与病毒的中和作用，影响病毒的感染力，能够和病毒粒子形成多聚体。ORF4GP4拥有四个N端糖基化位点，是高度糖基化的蛋白，与病毒的感染力有关，并且是与病毒粒子形成多聚体的关键蛋白，能够调节多聚蛋白与病毒的小糖基化蛋白以及GP5的相互作用，病毒吸附蛋白，可能与病毒的中和作用相关。ORF5GP5主要的结构蛋白与跨膜蛋白，含有多个N端糖基化位点，连同GP3是PRRS最容易突变的结构蛋白，参与病毒中和作用，与M蛋白共价结合并对于病毒装配以及吸附蛋白十分重要，参与病毒进入宿主细胞以及引起的后续细胞凋亡。ORF5aGP5a可能与病毒的复制与毒力有关。ORF6M主要的糖基化结构蛋白，是基因组最为保守的部分，对于病毒的组装与生长过程起到关键作用，与GP5组成异二聚体，与病毒的感染力息息相关。ORF7N主要的非糖基化，以及磷酸化蛋白，具有高度的免疫原性并且能够作为特异性的病毒检测抗体，用于诊断疾病，通过共价键以及非共价键相互作用形成同二聚体组成病毒核衣壳蛋白，能够定位于细胞核和核仁，并与细胞转录因子相互作用。1.1.3病毒感染细胞机制PRRSV在感染宿主细胞时，最先经历的即为病毒感染进入宿主细胞的过程，如图1.3所示。首次关于PRRSV如何进入细胞的报道出现在1996年(KreutzandAckermann,1996)。由于PRRSV的病毒囊膜不会直接和细胞膜融合，推测PRRSV最有可能通过受体调节的内吞作用来进入宿主细胞。这一假设在1998年得到了验证(Duanetal.,1998)。之后，又有一些包括与病毒结合相关的肝素盐，与结合和中和都有关的唾液酸粘附素（Sn），以及波动蛋白等病毒的受体被逐一发现(DelputteandNauwynck,2004;Delputteetal.,2007a;Delputteetal.,2007b;Delputteetal.,2002)，但是仍有很多的致病因子仍然未知。最近有相关报道CD163可能是PRRSV受体(Calvertetal.,2007;Pattonetal.,2009;VanGorpetal.,2008)，之后发现巨噬细胞对于PRRS的敏感性与CD163的表达量有关(Lopez-Fuertes4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言etal.,2000)。表达唾液酸粘附素和CD163的non-permissive细胞对PRRSV更加敏感，并且比仅表达CD163的细胞多产生10-100倍的病毒粒子(VanGorp,etal.,2008)。在之后相关的报道中，通过免疫共沉淀技术（Co-IP）实验，发现了GP2a，GP4与CD163存在相互作用，猜测GP4参与调节内部糖蛋白的作用，GP2a作为病毒附着蛋白负责调节与CD163相互作用，从而影响病毒感染宿主细胞(Dasetal.,2010)。PRRSV3UTR的RNA结合蛋白，CD151(Shanmukhappaetal.,2007)是穿膜超家族的成员(Fitteretal.,1999;Hasegawaetal.,1998;Sincocketal.,1999)，是PRRSV体外感染必不可少的(Shanmukhappa,etal.,2007)。值得一提的是有相关报道CD163与Sn并不是影响PRRSV其严格的宿主嗜性的原因，PRRSV病毒感染表达其相应CD163和SN（Siglec-1/CD169）的传代细胞，结果均发生了PRRSV的感染(Calvert,etal.,2007;VanBreedametal.,2013)。PRRSV侵入机体，随后会引起一系列的机体免疫反应，病毒主要通过以下途径对机体造成损伤。图1.3病毒感染进入宿主细胞的过程Fig.1.3Theprocessofvirusinfectionandentry5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.1.4PRRSV进入宿主细胞RIG-I信号通路视黄酸诱导基因I（RIG-I），包含一个C端的DExD/Hbox-RNA解旋酶以及两个N端的半胱天冬酶补充结构域（CARDS），RIG-I通过这两个结构来诱导产生I型IFN，只有RNA分子能够有效的被解旋酶识别并且解旋。因此，RIG-I解旋酶结构域像是一个开关一样，能够调控CARDS的开关(GantierandWilliams,2007)，从而控制CARDS发挥作用。如果因外界刺激导致CARDS结构域构象发生改变，另一个CARDS的IFN-β刺激因子-1（IPS-1）就能够补充并作为一个适配器参与CARD-CARD作用。这种作用对于双链RNA诱导的NF-κB，IRF3以及IRF7的活化十分重要(BowieandUnterholzner,2008)。当PRRSV感染宿主细胞以后，其能够阻碍IRF3，IRF7的磷酸化，并抑制IPS-1以及TLR3（见图1.4），从而抑制IFN的产生，抑制免疫应答(MusicandGagnon,2010)。图1.4PRRSV进入宿主细胞RIG-I信号通路Fig.1.4PRRSV’sentryintothehostcellviaRIG-I6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.1.5PRRSV进入宿主细胞TLR3信号通路TLR3负责调节对poly（I:C）以及双链RNA的应答(Karikoetal.,2004;Okahiraetal.,2005)。当机体受到外界刺激之后，TLR3的TOLL/IL-1（TIR）受体结构域结合刺激来源，并诱导产生TIR结构域衔接蛋白（TRIF），它能够直接活化许多转录因子，包括NF-κB，干扰素调节因子（IRF）-3，以及活化蛋白（AP）-1(Vercammenetal.,2008)。当PRRSV感染宿主以后，病毒会通过一系列方式来抑制TLR3和IRF7的活性，PRRSV的Nsp2还会抑制IRF3的磷酸化，从而抑制IFN的产生(Chaungetal.,2010;Milleretal.,2009;Sangetal.,2008a;Sangetal.,2008b)，见图1.5。图1.5PRRSV进入宿主细胞的TLR3信号通路Fig.1.5PRRSV’sentryintothehostcellviaTLR-3pathway1.1.6PRRSV进入宿主细胞NF-κB信号通路核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）是一种控制DNA转录的蛋白复合体。这条信号通路能够通过一系列相互作用，从而产生IFN并引起机体的炎症反应，在机体抗病毒过程中起到重要作用。NF-κB以异二聚体的形式存在于细胞质中，由两个亚基（p65和p50）以及一个核定位信号（NLS）共同组成。当细胞处于静息状态，NF-κB可与其抑制物IκBα结合；当受到外界刺激时，如图1.6所示，通过TAK（转移生长因子β活化激酶）结合蛋白2（TAB2）和TAB3识别泛素化连接酶TRAF6，并泛素化RIP1，导致TAK1的活化，磷酸化IκKα和IκKβ。活化后的激酶会磷酸化IκBα，使其处于激活状态，随后磷酸化的IκBα通过泛素化作用被降解，在细胞核中释放NF-κB；同时TAK-1也能够活化MAPK（分裂素活化的蛋白激酶），c-JunN末端激酶，p38，以及细胞外信号调节激酶，引导AP-1家族的磷酸化和活化，进而引导IFN-β的转录。PRRSV感染后，病毒蛋白可起到抑制NF-κB的作7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言用，目前已知病毒的Nsp1α可抑制IκBα的磷酸化，Nsp2则可抑制磷酸化的IκBα的泛素化降解，Nsp1会抑制CBP的活性，并抵抗NF-κB的抗病毒作用，从而抑制IFN的产生。有趣的是，PRRSV病毒蛋白在一定条件下，可促进NF-κB，如N蛋白可上调NF-κB，从而引起机体严重的炎症反应(UnterholznerandBowie,2008;Vercammen,etal.,2008)。图1.6PRRSV感染宿主细胞NF-κB信号通路所发生的变化Fig.1.6PRRSV’sentryintothehostcellviaTLR-3pathway1.2反向遗传操作技术反向遗传学是指从已知的基因序列水平上，使用相关技术，在序列上进行突变从而导致表型改变的技术。1.2.1RNA病毒反向遗传学技术PRRSV的病毒基因组主要由单股正链RNA构成，其本身就具有感染的能力。所以只需要体外合成病毒的cDNA，并将其构建到具有强启动活性启动子的载体上，从而进行体外转录，合成病毒基因组的RNA，然后将获得的病毒基因组RNA进行转染宿主细胞，进而拯救出活病毒。除此之外，也可以通过将病毒的全长cDNA构建到真核表达载体中，获得具有病毒基因组cDNA的质粒，通过转染的方法将质粒转移到宿主细胞，并转录成为具有感染能力的病毒RNA。8 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.2.1.1通过体外转录实现的反向遗传技术通过体外转录实现的反向遗传技术依赖于目的载体上的强启动子，RNA聚合酶转录系统才能够充分发挥作用，保证体外转录的产量与完整性，产生具有感染能力的病毒基因组RNA。目前广泛使用的启动子有T7，T3，SP6等，这些启动子都具有很强的启动子活性。1.2.1.2通过体内转录实现的反向遗传技术将携带目的cDNA的强启动子表达载体质粒直接在宿主细胞中进行转染，转录，并产生具感染性的子代基因组，从而包装为完整的病毒颗粒。与体外转录的反向遗传方法相比，该方法具有一定的优越性，cDNA水平更加稳定。所以，在体内进行转录比在体外进行转录更加稳定。不依赖亲本病毒直接获得具有感染性的病毒基因组，适用于进行反向遗传操作后丧失复制能力的突变病毒研究。1.2.2RNA病毒反向遗传学的研究进展1.2.2.1在正链RNA病毒研究中的应用对于正链RNA病毒来说，该技术是较先应用，同时也是研究较为广泛的，例如烟草花叶病毒（TMV）、登革病毒等的感染性克隆反向遗传学系统已经非常成熟，具有较广泛的应用。例如，VanGennipHG等为了提高CSFV突变病毒的感染能力，构建表达了T7RNA聚合酶（SK6，T7）的稳定猪肾细胞系，并将病毒cDNA直接转染细胞。拯救的病毒滴度比体外转录方法转染原代细胞的病毒滴度高200倍，即使体内转录的方法获得的病毒，也要高20倍。利用反向遗传技术获得的SK6，T7细胞系，可以作为回收CSFV的突变体的一种工具，从而获得大量的突变病毒。1.2.2.2在负链RNA病毒研究中的应用相对于正链RNA病毒，负链RNA病毒反向遗传技术的发展较为滞后，主要因为其基因组是负链RNA，本身并没有感染宿主细胞的能力，需要亲本病毒的相关功能蛋白，才能使其复制产生正链RNA，并进行后续的病毒包装过程。针对上述问题，主要有两种解决方案，其一是在体外合成病毒基因组，核蛋白以及聚合蛋白，混合成核糖核酸蛋白复合物（RNP），并辅助病毒复制以及表达包装成为病毒粒子；第二种方法，分别构建能够表达RNA复制相关蛋白的载体以及能够表达T7RNA聚合酶的痘病毒载体，并将病毒基因组共转染细胞，也可以得到具有感染性的病毒。1.2.3PRRSV反向遗传学的研究进展通过对PRRSV于cDNA水平进行突变，可以获得理想的病毒模型，有助于更好的研究病毒基因组上各部分的作用。PRRSV病毒基因组中存在一些非必需区，如ORF1b与ORF2a之间(Peietal.,9 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言2009)、非结构蛋白Nsp2的高变区(Fangetal.,2008;Kimetal.,2007)以及N蛋白基因的3末端(Wangetal.,2013)。利用反向遗传操作技术，在其基因组ORF1b和ORF2a之间插入其他病毒免疫原性蛋白，为PRRSV多价疫苗的研究提供思路。1.3分选流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry，FCM）能够从单个细胞或粒子水平出发，进行定量分析或进行分选，可以同时在大量的细胞样本中，准确的获得单个细胞信息，与传统的相关技术对比，流式细胞术具有很高的效率与准确性，现已成为一种较为先进的单个细胞分选手段。1.3.1流式细胞术的原理在一定压力下，将样品输入流动室中，与此同时，在高压下将用于流式细胞术的缓冲液从鞘液管喷出，调整鞘液管入口方向并使之与待测样品的输出管中流出的液流形成一定的角度，使得输出的鞘液能够正好包含待检测液中的细胞，并一同流动形成连续的液滴，流经流式细胞仪的样品检测区域。流式细胞仪的光源输出通常采用激光。以不同的方向照射样品时，由于被染色的样品在一定波长的激光照射下会被激发出信号。发出的信号通常会被水平方向的光电二极管以及垂直方向的光电倍增管分别接收。水平方向信号用来反应样品细胞或者颗粒的体积；垂直方向检测到的信号，可经过双色性反射镜以及带通滤光片，最终产生多个波长的信号，用来反应细胞或颗粒的表面颗粒度。分选流式细胞仪是通过分离鞘液中单个细胞而实现目的细胞分选的。可以通过在其喷口上超高频电晶体的高速振动，将流经液流断裂，并分离样品中的单个细胞。通过对分离出单个细胞进行带电处理，并通过高压使带有正负电荷的样品细胞进行分选。1.3.2流式细胞术的研究进展流式细胞技术可检测细胞的理化及生物学特性，包括细胞的大小，DNA含量，以及细胞表面抗原表达等方面的快速多参数定量分析与分选。随着荧光染料及单克隆抗体的技术进步，也为流式细胞术带来了更广泛的应用，使其逐渐成为医学以及生物学研究的重要工具。在临床免疫学方面，流式细胞术可对主要免疫细胞如T细胞，B细胞和NK细胞等淋巴细胞进行分选，进而对机体的免疫功能进行评价。在血液学方面，可对白血病进行免疫学分型，帮助我们了解白血细胞所属细胞系列以及其分化的程度，这对于白血病的诊断、治疗方案选择、预后判断以及发病机制等研究都有重要意义。在肿瘤学方面，流式细胞术通过对宿主细胞DNA及细胞周期进行分析，可对患者进行免疫功能相关检查，对于恶性淋巴瘤、脑肿瘤、皮肤肿瘤、骨肿瘤、妇科肿瘤等多种肿瘤的早期诊断有重要意义。10 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言流式细胞仪在神经生物学、细胞遗传学、细胞生物学、分子生物学、微生物学、植物学和海洋生物学等学科领域得到了越来越多的应用。1.4蛋白质组学概述自从1990年开始，以美国为首在世界范围内开始了人类基因组计划，生物体的全基因组序列逐渐被揭示，2002年3月，多个国家和地区同时公布了人类基因组图谱及初步分析结果。当人们完成人类全部基因序列测序后，发现这也只能解决遗传信息库问题，根本无法完整系统地阐明基因功能，这让科学家们将视线转移到了基因表达蛋白质。蛋白质是生命存在以及运动的物质基础，对于细胞的增殖、分化、衰老以及凋亡等重大生命活动有重要的意义。在机体中，重要的生命活动都是由许多蛋白共同发挥作用，所以针对蛋白质群体的研究，才能更有效的解读遗传信息。蛋白质组，即个体所表达的全套蛋白质。在公布人类基因组序列草图的同时，发表了关于蛋白质组学概念及展望的报道(Abbott,2001;Fields,2001;Kahn,1995;Swinbanks,1995)。蛋白质组学能够将生物个体的全套蛋白质全部展示出来，在不同时间与空间条件下，采用大规模、高通量、高灵敏度的技术手段从宏观角度研究个体基因组所表达的所有蛋白质，并绘制出较为完整的表达谱和功能谱，揭示生命本质。蛋白质组学能够涵盖几乎所有个体有关的重要生命现象，如体内能量转换、信号传导、发育、代谢、神经活动等都与蛋白质存在联系，因而蛋白质组学技术对于生命科学相关研究有巨大推动作用。蛋白质组学能够从组学角度研究药物及其相关靶点等(Rifaietal.,2006)，已成为一种十分重要的技术，日益受到普遍关注。1.4.1常用的蛋白质组学研究技术蛋白质组学分析方法，分成蛋白质的分离与鉴定两大部分，除此之外，分离出的蛋白还要配合各种显色手段以及分析软件等。现在蛋白的分离手段主要通过蛋白质不同的理化性质，通过双向凝胶电泳或者二维以及多维液相色谱进行分离。1.4.1.1双向电泳（2-DimensionalGelElectrophoresis，2-DE）双向电泳（2-DE）是一种能够大规模分离蛋白质的技术，可以将数千种蛋白质同时分开与展示。20世纪70年代中期，首次提出双向凝胶电泳。所谓双向凝胶电泳，即通过两次不同方向的电泳，将不同蛋白组分分离开来。第一向电泳为等电聚焦（IEF）电泳，因为不同的蛋白具有不同的等电点性质；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），是将蛋白按照分子量不同的性质进行分离。分离方法主要分为垂直电泳和水平电泳，这两种方法在分离效果以及分离效率等方面均差异不大，但是因为技术原因，具有重复性差以及上样量小等缺点。固相PH梯度是一种80年代中期出现的新技术，这种技术能够缩短凝胶时间，稳定梯度，并避免阴极漂移，从而克服了2-DE上样量小以及重复性不好11 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的缺点(陈伟，游向荣,2006)，但仍然具有检测丰度较低、检测敏感性较差以及对操作要求较高的缺点。样品中不同蛋白组分得到分离后，分离蛋白的着色对于整个质谱试验尤为重要。着色不好不但影响蛋白质的分离效率，并且影响蛋白质的质谱鉴定结果。蛋白质的染色方法主要包括有机试剂染色法、银染法、荧光染色法及同位素显色法等(刘小林,2007)。通过2-DE分离的蛋白，要通过染色对分离出的蛋白斑点进行检测。银染和考马斯亮蓝染色是目前最为常见的染色方法，具有检测灵敏性较高的特点，但这两种方法都要进行脱色，因为不进行脱色可能会影响后续质谱分析的结果。在质谱之后，还要通过阴性对照来去除凝胶图谱的纹理和背景，以有利于获得准确蛋白信息。1.4.1.2液相色谱技术溶于流动相的蛋白在流经固定相时，会发生排阻、离子吸引、吸附、分配、亲和等一系列作用，不同蛋白与固相作用的大小、强弱不同，不同蛋白组分就会分先后从固定相中流出，进而起到分离的作用。经典液相色谱法是指在常温、常压下通过玻璃管柱，利用液位差将液相输送通过固相，但是这种方法效率较低。60年代后期提出了高效液相色谱法，伴随气相色谱理论的产生，这种方法迅速发展起来。与经典液相色谱相比，使用小而均匀的填料颗粒替代流动相，具有较高的分离效率。由于小颗粒会造成分离口的高阻力，所以需要应用高压来推动分离过程。1.4.1.3质谱技术（MassSpectrometry，MS）质谱技术主要将不同离子按照其不同的质荷比进行分离和定量，具有较高的灵敏性、准确性，而且较为容易实现自动化。实现样品的离子化过程，对于质谱过程至关重要。ESI-MS技术，是将进样毛细管置于有高压电场中，样品流出时通过电场以及辅助气流氮气的作用下会形成带电的微液滴，对雾状的微液滴进行加热，伴随溶剂蒸发，微液滴直径不断缩小，当表面电荷密度达到一定限度时，微液滴会发成爆裂，产生带电的子液滴。当液滴变得足够小时，表面电荷形成的电场足够强，就能够使样品离子化，最终获得从液滴中解析出来的样品分子，并进行下游质谱检测，可测定多肽相对分子质量以及序列，但分析速度较慢。MALDI-TOF-MS是基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱，主要利用基质（alfa-cyanomatrix以及DHB），在从激光的脉冲中获得能量后，使被测样品分子分离成单分子状态。这种方法的检测灵敏性非常高，并且检测速度较快，一般用于肽质量指纹图谱，并且能够用于检测目的样品的肽序列。目前，蛋白质组中最常用的胶上鉴定技术，样品更适合为较简单的肽混合物，但这种方法最适合于测量肽段的分子质量，而非肽序列。上述质谱分析，在样品分子被电离时，都会保留样品完整性，避免产生碎片。如今，质谱已成为蛋白研究中最重要的鉴定技术。通过肽指纹技术能够获得样品中多肽的精确分子量(曾嵘，夏其昌,2002;胡志远，贺福初,1999)。12 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言如果PMF不能鉴定出该蛋白质，还可以进一步采用串联质谱，获得离子化的样品多肽，利用惰性气体与之碰撞，导致肽键断裂，形成一系列N端离子系列，以及C端碎片离子系列，对这些离子系列进行分析就可以获得整个肽段序列。1.4.2Shotgun定性质谱的研究进展Shotgun（鸟枪法）LC-MS质谱是一种高效、高兼容、高自动化的检测方法。将样品消化酶解成肽段混合物后，利用高效液相色谱分离肽段，然后再导入高分辨率质谱仪，进行样品质量分析，也可以选择某些肽段进行再次破碎，再通过检索软件根据再次破碎获得的二级质谱信息进行查库，可以帮助获得肽段更加准确的信息。1.4.3Label-free定量质谱的研究进展如何从大规模质谱数据中提取蛋白质表达水平相关信息，一直是研究者们关注的热点。对于样品进行定量，有助于获得更加准确以及重要的蛋白信息。基于标记的定量方法存在一定局限性，如数据分析软件要求过于特殊、同位素标记试剂过于昂贵、样品制备的过程复杂等。近年来，发现蛋白质的丰度与质谱数据一级谱图肽段峰强度或者二级谱图数目呈现一定相关性，推动了无标记定量质谱方法（Label-freequantitationMS）的发展，帮助科研工作者在单次实验中，可以获得更多蛋白数据，Label-free质谱通常分成两类，其一，是基于一级谱图母离子强度，如谱图峰面积、谱图峰高、谱图峰容量等；其二，是基于肽段匹配的二级谱图数目，称为谱图计数法。1.5研究目的和意义猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种母猪严重繁殖障碍以及所有年龄猪呼吸困难为特征的急性传染病。2006年，中国南方爆发高致病性猪蓝耳病，除了经典症状以外，以高致病率与高死亡率为主要特点。PRRSV具有严格的细胞嗜性，在患猪体内病毒主要侵染不同种类及不同组织的单核巨噬细胞细胞系，但以猪的肺泡巨噬细胞（PAM）的侵袭最为典型，且不同毒力的毒株感染效率存在差异，其感染细胞差异机制尚不明确。本研究以高致病性PRRSVHuN4及其传代致弱的HuN4-F112为参考，构建重组EGFP-PRRSV强弱毒感染性克隆，感染和纯化PAM，进行定性蛋白质谱分析；同时以其亲本强弱毒感染宿主PAM提取细胞膜蛋白进行定量蛋白质谱分析，筛选及验证与病毒相互作用的PAM细胞膜差异蛋白，为PRRSV致病机制的研究奠定基础。13 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起的猪繁殖及呼吸障碍性传染病。1985年，美国首次报道了该病(Keffaber,1989)。国内于1996年由郭宝清首次分离到该病的病原PRRSV，该病仍然受到国内外的广泛关注，特别是在2006年，在我国南方一些地区爆发的高致病性PRRS（HP-PRRS）(Tian,etal.,2007)，给国内的养猪业造成了重大的经济损失。PRRSV属于单股正链RNA病毒，基因组约为15,000nt。该病毒基因组中存在一些非必需区，如ORF1b与ORF2a之间(Pei,etal.,2009)、非结构蛋白Nsp2的高变区以及N蛋白基因的3末端(Fang,etal.,2008;Kim,etal.,2007;Wang,etal.,2013)。目前，国内主要应用致弱的PRRSV疫苗进行防控。本研究在高致病性PRRSV（HP-PRRSV）毒株HuN4(Tong,etal.,2007)感染性克隆（pHuN4）以及其细胞致弱毒株感染性克隆（pHuN4-F112）(Zhangetal.,2011)的基础上，利用反向遗传操作技术，在强弱毒PRRSV感染性克隆基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白的增强型蛋白egfp基因，构建重组病毒感染性克隆pHuN4-EGFP以及pHuN4-F112-EGFP，并通过转染拯救重组病毒，以获得重组EGFP的PRRSV强弱毒株感染性克隆，作为指示病毒，感染和纯化PAM细胞，为筛选及验证与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白提供技术支撑。2.1实验材料2.1.1病毒株高致病性蓝耳病病毒HuN4毒株，以及其细胞传代致弱病毒HuN4-F112毒株；高致病性PRRSVHuN4感染性克隆（pHuN4）以及其细胞致弱病毒感染性克隆（pHuN4-F112），均由。2.1.2细胞猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）由中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室（以下简称本实验室）保存。2.1.3主要试剂限制性内切酶以及T4连接酶购自NEB；pfuIIDNA高保真聚合酶，购自Strategene公司；转染试剂DMRIE-C，OPTI-MEM培养基，2×MEM培养基，羊抗鼠IgG绿色以及红色荧光二抗购自Invitrogen公司；反转录酶，购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒，购自Omega公司。14 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建2.1.4主要仪器设备细胞间超净台，恒温CO2细胞培养箱，购自Thermo公司；梯度PCR仪，购自ABI公司；恒温培养摇床，购自江苏太仓公司；快速变温水浴锅，购自GE公司；水平电泳仪，购自上海康达公司；荧光倒置显微镜，购自Olympas公司；水平高速离心机，购自Eppendorf公司。2.1.5引物及设计表2.1引物设计Table.2.1Primersforconstructingrecombinantviruses名称序列位置EGFP-R4/R55-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-313070-13090EGFP-F1/F3/F55-TCATACATCCGAGTTCCTGTT-311559-11579EGFP-R15-GGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTTCAATTCAGGCCTAAAGTT-311963-11980-1-30EGFP-F25-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-311953-11990-1-22EGFP-R2/R35-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-314245-14284700-720EGFP-F45-GGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3686-72014245-14271F-SEQ5-TTTGAATCGGATACAGCGTATC-311805-11826R-SEQ5-CCAAACAAAATGGCCAAAAATAT-312078-121002.2实验方法2.2.1重组病毒感染性克隆的构建根据HuN4-F112序列（EF635006）和egfp基因序列（NC025025）合成引物（表2.1）。通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）的方法在pHuN4-F112的ORF1b和ORF2a之间插入EGFP基因及TRS6序列（位于egfp基因下游），并将扩增的片段回收，经AscI/EcoRV双酶切，egfp克隆于pHuN4-F112中，构建感染性克隆pHuN4-F112-EGFP（图2.1）。之后再对pHuN4进行AscI/EcoRV双酶切并回收，将之前扩增的片段克隆到酶切处理过的pHuN4上从而获得感染性克隆pHuN4-EGFP。15 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建图2.1重组EGFP的强弱毒PRRSV感染性克隆构建方法Fig.2.1TheconstructionmethodofHP-PRRSVandAP-PRRSVrecombainantinfectiousclones2.2.2病毒拯救及纯化传代待六孔板的MARC-145细胞长到密度大约为80%时，分别用强弱毒重组PRRSV及其亲本病毒体外转录RNA转染MARC-145细胞，在37℃温箱中培养72h后，观察细胞病变，并收集细胞上清，记为第一代病毒（P1）。然后将P1代病毒接毒MARC-145细胞。当出现80%的细胞病变时，收集细胞上清，作为第二代病毒（P2）。将1：103稀释的P2病毒，再次接毒细胞，病变80%时收集病毒上清，记为第三代（P3），同样方法连续传代，并从第6代开始，进行空斑纯化，将弱毒重组病毒一直传代至第20代，为防止强毒重组病毒因传代而毒性致弱，在获得拯救后传代到第5代（P5），不进行空斑纯化。待空斑出现之后，用1mL枪头将出现空斑位置的胶吸入，接种于1mL的DMEM中，混合均匀后，接种于新鲜的MARC-145细胞单层，每天观察CPE。2.2.3重组病毒的PCR鉴定选取P1、P5、P10、P15和P20代次的vHuN4-F112-EGFP（vA-EGFP，vAP-EGFP）以及P1至P5代的强毒vHuN4-EGFP（vH-EGFP，vHP-EGFP）病毒上清提取病毒RNA，并进行反转录，得到相应的cDNA，利用引物（F-SEQ与R-SEQ见表2.1）针对突变区域进行PCR扩增，胶回收纯化后进行测序，并将重组毒序列与其亲本毒序列做比对，观察相应区域外源序列是否插入成功。16 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建2.2.4重组病毒报告基因表达的鉴定重组病毒感染MARC-145细胞后60h，收取病毒培养上清，用PBS洗涤细胞单层两次，在每孔中再加入500μLPBS，置于荧光显微镜下观察，拍摄荧光照片。对于感染细胞进行不同时间点的荧光观察实验。将重组病毒感染MARC-145细胞，无需更换培养基，直接于感染后24h、48h、60h、72h、84h、108h、120h取细胞培养板在荧光显微镜下观察，拍摄荧光照片。2.2.5重组病毒的间接免疫荧光的鉴定将P20的vHuN4-F112-EGFP病毒以及P5代的vHuN4-EGFP感染MARC-145细胞48h后，弃掉培养基，PBS清洗一次后，用冰甲醇固定20min，然后用5%BSA（PBS溶液）室温封闭30min，使用PRRSVN蛋白单抗（SR30A，RuralTechnolog，LTD）37℃孵育2h，孵育后用PBS清洗5次，再加入羊抗鼠的红色荧光二抗，37℃在避光环境下孵育1h，然后用PBS清洗5遍后，在发绿色荧光的倒置荧光显微镜下避光观察结果。2.2.6重组病毒的生物学特性鉴定2.2.6.1遗传稳定性分析将P5、P10、P15、P20代的vHuN4-F112-EGFP以及P2、P3、P4、P5代的vHuN4-EGFP病毒培养上清抽提RNA，分别进行反转录并PCR扩增相应区域，胶回收纯化后送测序，以检测外源基因的完整性以及插入位点上下游区域的遗传稳定性。并对以上病毒进行N蛋白的间接免疫荧光，通过观察荧光对EGFP重组病毒的遗传稳定性进行评估。2.2.6.2空斑形态学分析选取P5重组强弱毒PRRSV及其亲本病毒PRRSV进行1：105稀释后，1mL每孔接毒MARC-145细胞，37℃孵育1h后，去掉培养基，5mL每孔加入含1%的琼脂糖，2%FBS的MEM培养基。待到凝固后，于37℃培养箱倒置，每天观察，待出现空斑后，使用4%的甲醛溶液固定1h后，去掉凝胶并使用5%结晶紫溶液染色。2.2.6.3多步生长曲线比较在培养有MARC-145的六孔板中，以moi=0.01分别接毒vHuN4-EGFP以及vHuN4-F112-EGFP，以及亲本病毒，并于6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h以及120h分别收毒200μL并补加200μL的2%FBSMEM培养基。将收好的病毒按照Reed-Muench法进行病毒滴度测定（TCID50）(Pizzi,1950)。17 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建2.3结果2.3.1EGFP重组PRRSV的全长克隆的构建与感染性检测以PRRSV全长感染性克隆pHuN4以及pHuN4-F112为骨架，在其ORF1b的终止密码子和ORF2a的起始密码子之间通过SOE-PCR的方法插入egfp基因以及TRS6。将构建好的感染性克隆进行EcoRV，AscI双酶切（如图2.2），可以看出pHuN4-EGFP以及pHuN4-F112-EGFP出现大小约为1,000bp的条带，说明egfp基因成功插入。之后将突变体克隆及亲本全长克隆进行线性化体外转录，并转染MARC-145细胞，在转染24h后收集上清传代于新鲜的MARC-145细胞，成功拯救出病毒，如图2.3。每天相隔一段时间观察CPE及荧光情况，结果见图2.4，嵌合重组病毒及亲本病毒都能够产生CPE，并且嵌合重组病毒在荧光倒置镜下发出明显的绿色荧光，从图中可见随着时间的推移，荧光由少到多，又逐渐消失，大约在60hpi至72hpi之间达到顶峰，这说明嵌合病毒在并未改变其与亲本病毒相似的宿主细胞感染能力的基础上，并且可以自发出稳定的绿色荧光。1234561000bp图2.2重组PRRSV感染性克隆克隆的EcoRV/AscI双酶切鉴定图谱1,4:15,000Marker;2:pHuN4-F112;3:pHuN4-F112-EGFP;5:pHuN4;6:pHuN4-EGFP.Fig.2.2DoubledigestionpatternsofrecombinantPRRSVinfectiousclonesbyEcoRV/AscI1,4:15,000Marker;2:pHuN4-F112;3:pHuN4-F112-EGFP;5:pHuN4;6:pHuN4-EGFP.18 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建图2.3重组egfp强弱毒PRRSV全长cDNA克隆的拯救（20X）Fig.2.3TherescueofPRRSVfulllengthcDNAclonesrecombinatedwithegfp(20X)图2.4重组病毒感染后不同时间点的EGFP荧光检测结果上图为pHuN4-F112-EGFP,下图为pHuN4-EGFPFig.2.4EGFPfluorescenceobservationfordifferenttimepointsofrecombinantvirusesvHuN4-F112-EGFP（Up）andvHuN4-EGFPinfection（Down）19 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建2.3.2重组病毒与亲本病毒结构蛋白表达分析结果将等量（moi=0.01），相同代次重组PRRSV以及亲本PRRSV，分别感染新鲜MARC-145，感染48h后，使用2.2.5中所描述的方法，采用间接免疫荧光来检测核衣壳蛋白（N）的表达。N蛋白是PRRSV在感染宿主细胞后，比较保守的，并且表达比较稳定的蛋白之一。由图2.5可见，重组病毒与其对应亲本病毒接毒孔中均能产生数量大致相同抗N蛋白的特异性荧光，并且荧光数目相近，说明重组病毒和亲本病毒具有相似的感染能力，并且重组病毒并未因为外源基因的插入导致其丧失原有的病毒学特征。图2.5重组病毒及其亲本病毒的抗N蛋白IFA检测结果（20×）Fig.2.5IFAdetection(Anti-N)oftherecombinantvirusesandtheirparentalviruses(20×)2.3.3重组病毒与亲本病毒生物学特征分析结果同时对重组病毒与亲本病毒（vHuN4-F112-EGFP与HuN4-F112选取P20病毒，vHuN4-EGFP与HuN4选取P5病毒）进行空斑形态学比较（图2.6），结果表明这些重组病毒在空斑形态、数目上均与亲本病毒无显著差异。绘制出的多步生长曲线结果（见图2.7），可以看出重组病毒及其亲本病毒在生长特性上无明显差异，证明了重组病毒与其亲本病毒在病毒学水平差异不显著。上述结果从生物学20 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建水平验证了重组病毒并未因插入外源基因而与亲本病毒产生显著差异，也验证了重组病毒作为指示病毒用于PRRSV相关研究的可行性。图2.6重组病毒与其亲本病毒的空斑形态学比较Fig.2.6Plaquemorphologycomparisonbetweentherecombinantandparentalviruses图2.7重组病毒与亲本病毒的多步生长曲线比较Fig.2.7Themulti-stepgrowthcurvesoftherecombinantvirusescomparedwiththeirparentalviruses21 中国农业科学院硕士学位论文第二章重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建2.4讨论为建立一种自发光的猪繁殖与呼吸综合征指示病毒，本研究在高致病性PRRSV感染性克隆pHuN4以及其细胞致弱毒株感染性克隆pHuN4-F112的基础上，通过SOE-PCR的方法在其基因组ORF1b和ORF2a之间插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，并在外源基因3端下游插入该病毒的转录调控序列6（TRS6），构建PRRSV-EGFP感染性克隆。将其体外转录制备的病毒RNA转染MARC-145细胞后，拯救获得了表达EGFP的重组病毒vHuN4-F112-EGFP以及vHuN4-EGFP。将vHuN4-F112-EGFP在MARC-145细胞中进行连续传代至20代，vHuN4-EGFP传代至第5代，其外源gfp基因仍能够持续表达，表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。与亲本病毒相比，重组病毒在病毒滴度、空斑形态等方面差异不显著；病毒生长曲线的结果显示，重组病毒具有良好的增殖能力。本研究结果表明，在PRRSV的ORF1b和ORF2a基因区中插入外源基因并未影响该病毒体外复制。本试验采用的重组病毒构建方法与Yoo采用的方法相比(Pei,etal.,2009)，免去了外源酶切位点的插入，提高了病毒的稳定性。选择在ORF1b与ORF2a之间插入外源基因是因为这两个ORF之间只存在一个碱基的间隔，并且不存在重叠基因，更有利于外源基因的插入。另一方面，选择PRRSV的TRS中最短的TRS6作为其独立转录组的转录调控因子，是由于TRS6序列所形成的二级结构较为简单，更有利于病毒的拯救与传代。此前，有一些非必需基因区，如PRRSV的nsp2的高变区或者N蛋白基因的3末端区(Fang,etal.,2008;Kim,etal.,2007;Wang,etal.,2013)，在插入外源基因后都会出现重组病毒不稳定的问题。本试验利用反向遗传操作技术，在强弱毒PRRSV感染性克隆基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白的增强型蛋白egfp基因，构建重组病毒感染性克隆pHuN4-EGFP以及pHuN4-F112-EGFP，并通过转染拯救重组病毒，获得了重组EGFP的PRRSV强弱毒株感染性克隆，作为指示病毒，为筛选及验证与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白提供技术支撑。22 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证高致病性PRRSV（HP-PRRSV）具有高致病力以及高死亡率的特点，发病率和死亡率可达100%。HP-PRRSV会引起病猪严重的临床症状，如持续高热超过（41℃），突然发病，突然死亡等，对中国养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV具有严格的细胞嗜性，在患猪体内病毒主要侵染不同种类及不同组织的单核巨噬细胞细胞系，但以猪的肺泡巨噬细胞（PAM）的侵袭最为典型，且不同毒力的毒株感染效率存在差异，其感染细胞差异机制尚不明确(Beyer,etal.,2000;Duan,etal.,1997a;Halbur,etal.,1995;Halbur,etal.,1996)。PRRSV也能够在体外感染猴胚胎肾上皮细胞系MA-104以及其衍生细胞系MARC-145以及CL-2621细胞系(Duan,etal.,1997a,b)，病毒主要通过受体调节的内吞作用进入靶细胞(JollyandSattentau,2013)，而PRRSV感染PAM的可能机制也在之前的报道中有所描述(Nauwyncketal.,1999)，相关受体在PRRSV感染宿主细胞之时，发挥了非常重要的作用。本研究以高致病性PRRSVHuN4强毒株与其传代致弱的HuN4-F112弱毒株为参考毒株，在构建重组EGFP-PRRSV强弱毒感染性克隆的基础上，获得了指示病毒，感染和纯化PAM，进行定性蛋白质谱分析；同时以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行定量蛋白质谱分析，筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白，可揭示PRRSV不同毒力毒株感染细胞效率差异的分子基础，为PRRSV致病机制的研究提供理论依据，也可为高致病PRRSV的防控奠定基础。3.1材料3.1.1病毒株HP-PRRSV毒株，HuN4、vHuN4-EGFP（105TCID50/mL）以及AP-PRRSV毒株，HuN4-F112、vHuN4-F112-EGFP（105TCID50/mL），均由中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室制备并保存。3.1.2细胞猴胚胎肾上皮细胞（MARC-145）由。经检测圆环病毒（PCV2），经典猪瘟（CSFV）以及PRRSV抗原抗体阴性的15日龄小猪，由本实验室饲养，依据伦理进行处死制备PAM细胞，保存备用。3.1.3主要试剂RPMI-1640培养基，FBS胎牛血清，RIPA裂解液，SDSPAGE蛋白Ruler以及Lipo3000转染试剂购自Invitrogen公司；MEM培养基，购自Sigma公司；TRUE-RefAnti-β-actin抗体购自诺唯赞公司；Anti-GFP抗体购自Abcam公司；抗鼠与抗兔二抗购自Proteintech公司；蛋白SDSPAGE蛋白上样缓冲液购自碧云天公司。23 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证3.1.4主要仪器设备Q-extractive质谱仪，购自Thermo公司；色谱柱0.15mm*150mm（RP-C18）购自Column技术公司；Zorbax300SB-C18peptidetraps液相色谱柱，购自Agilent公司；FACSARIAIII分选流式细胞仪，购自BD公司。3.2方法3.2.1PAM细胞分离培养将小猪处死后，取出肺脏，用含有1%双抗的PBS清洗一次以后，再次加入1%双抗的PBS，反复揉搓肺脏。收集灌洗液，l,000rpm离心后用含抗生素的PBS重悬，清洗两次后，用含有1%双抗、10%FBS的RPMI-1640培养基重悬。在10cm培养皿中，于5%CO237℃培养24h，分离培养的PAM细胞备用。3.2.2Shotgun质谱分析重组病毒感染PAM细胞的制备取PAM细胞进行培养，在PAM细胞贴壁超过95%时，使用PBS清洗一次去除培养皿中的死细胞或者没有贴壁的细胞。选取之前清洗过的三个平皿PAM感染1moivHuN4-EGFP病毒上清5mL，三个平皿感染1moivHuN4-F112-EGFP的病毒上清5mL，另外三个平皿则使用5mLDMEM培养基孵育，作为对照组。分别孵育1h以后去除上清并使用PBS洗一次，然后使用含有1%双抗、2%FBS的RPMI-1640培养基在温箱中培养24h，在镜下观察感染重组病毒的PAM，并使用抗PRRSVN蛋白抗体进行IFA并用荧光显微镜观察特异性荧光。将贴壁的PAM去除培养基后，用PBS清洗一次，使用2mL0.25%胰酶消化5min，然后用移液枪轻轻将细胞吹下并收集。通过FACS将收集的PAM细胞进行纯化。收集PAM细胞，1,000rpm离心后清洗两次，用含有EDTA的流式MACS液重悬并用40μm的滤网去除粘连细胞，收集于流式管中。在流式细胞仪FITC通道中检测荧光信号并进行分选，分别收集感染重组PRRSV的PAM细胞于含有DMEM的离心管中。将收集的感染重组PRRSV的PAM细胞1,000rpm离心5min，然后按照说明，使用ProteoExTractTransmembraneProteinExtractionKit进行膜蛋白提取。首先使用加过蛋白酶抑制剂的提取Buffer2A溶液重悬细胞，在4℃环境轻柔晃动孵育10min，孵育后1,000xg4℃离心5min，小心去除上清后将样品使用0.2mL含有蛋白酶抑制剂的提取Buffer2B重悬。在室温下轻柔晃动并孵育45min，并16,000xg4℃离心15min。最后将上清收集纯化的感染重组PRRSV的PAM细胞膜样品保存于-80℃冰箱。取纯化的样品，室温溶化后，用于FASP（Filteraidedproteomepreparation）酶解。样品加入10倍体积的丙酮沉淀，7,500xg离心15min，干燥后加入200μL100mM碳酸氢铵溶解。在溶液中加入二硫苏糖醇（DTT）并调整终浓度为10mM，煮沸5min。待溶液冷却至室温后，加入40μLUA缓冲液24 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证（8MUrea，150mMTrisHClpH8.0）并混匀，加入吲哚-3-乙酸（IAA）至终浓度为50mM，避光15min。加入2μg胰酶，37℃处理16-18h。用C18脱盐柱（3M）脱盐，用于进行Shotgun质谱分析。3.2.3Label-free质谱分析亲本病毒感染PAM细胞的制备取PAM细胞进行培养，在PAM细胞贴壁超过95%时，使用PBS清洗一次去除培养皿中的死细胞或者没有贴壁的细胞。选取之前清洗过的三个平皿PAM感染1moi亲本病毒强毒HuN4株上清5mL，三个平皿感染1moi亲本病毒弱HuN4-F112株的上清5mL，另外三个平皿则使用5mLDMEM培养基孵育，作为对照组。分别孵育1h以后去除上清并使用PBS洗一次，然后使用含有2%FBS的RPMI-1640培养基在温箱中培养24h，并在镜下观察感染病毒的PAM，并使用抗PRRSVN蛋白抗体进行IFA，荧光显微镜观察特异性荧光。将贴壁的PAM去除培养基后，用PBS清洗一次，使用2mL0.25%胰酶消化5min，然后用移液枪轻轻将细胞吹下并收集。直接收集消化好的PAM并使用PBS清洗两次后备用。取备用样品加入1mL丙酮沉淀，12,000rpm离心10min，沉淀挥干后加入150μLSDT缓冲液（4%SDS，1mMDTT，150mMTrisHClpH8.0），沸水浴5min，离心取上清，取约15μLSDSPAGE电泳检测，合格后备用。取50μL备用样品，加入二硫苏糖醇至终浓度为100mM，沸水浴5min，将溶液冷却至室温，用于Label-free质谱FASP酶解。加入200μLUA缓冲液（8MUrea，150mMTrisHClpH8.0）并混匀，将溶液转入10kd超滤离心管，14,000xg离心15min。加入200μLUA缓冲液14,000xg再次离心15min，并弃掉废液。加入100μL吲哚-3-乙酸（50mMIAAinUA），600rpm振荡1min，在室温下避光处理30min，然后再次14,000xg离心10min。然后加入100μLUA缓冲液，14,000xg离心10min并重复两次。加入100μL100mMNH4HCO3，14,000xg离心10min重复2次。然后加入40μlTrypsin缓冲液（4μLTrypsinin40μLNH4HCO3），600rpm振荡1min，37℃水浴16-18h。换新收集管，离心14,000xg10min后，收集滤液并使用OD280进行肽段定量，合格后用于后续Label-free质谱分析。3.2.4Shotgun定性质谱分析3.2.4.1Shotgun质谱配制0.1%甲酸水溶液为液相A液，配制0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）为液相B液。在色谱柱（0.15mm*150mm，RP-C18，ColumnTechnologyInc）中加入95%的A液进行色谱柱的平衡。将需要进行Shotgun质谱分析的样品上样到液相色谱柱（Zorbax300SB-C18peptidetraps，AgilentTechnologies，Wilmington，DE），并对样品中的蛋白样品进行色谱分离。从实验开始到第50min，将B液线性梯度从4%调整到50%；从第50min到第54min，将B液线性梯度从50%调整到100%；从第54min到60min，将B液的线性梯度维持在100%。25 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证3.2.4.2ESI质谱鉴定待分析样品经液相色谱脱盐及分离后，使用QExactive质谱仪（ThermoFisher）对分离好的蛋白样品进行质谱分析。检测方式为检测正离子，并按照每次全扫描（fullscan）后采集10个碎片图谱（MS2scan）的方法来采集多肽和多肽碎片的质荷比。3.2.4.3ESI质谱数据分析将获得的质荷比信息文件使用ProteomeDiscoverer1.4（Thermo）提交至Mascot2.2服务器，并进行查库从而获得蛋白质的相关信息。相关参数如下：Enzyme=Trypsin、Missedcleavage=2、Fixedmodification：Carbamidomethyl（C），Variablemodification：Oxidation（M）。查库所用本地化Uniprot数据库：uniprot_Sus_scrofa_34349_20150317.REVERSED.fasta（下载日期20150317，序列34349条）。设置肽段容差（Peptidestolerance）为20ppm；MS/MS容差为0.1Da，结果过滤参数为FDR≤0.01。3.2.5Label-free定量质谱分析3.2.5.1酶解产物的LCMS/MS分析取2μL样品上样到色谱仪，并进行LCMS/MS分析。采用纳升流速HPLC液相系统（EASY-nLC1000）进行分离。配制0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈浓度为2%）记作A液，配制0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈浓度为84%）记作B液。使用100%A液对色谱柱（ThermoEASYcolumnSC200150μm*100mm，RP-C18）进行平衡。上样样品到色谱柱（ThermoEASYcolumnSC001traps150μm*20mm，RP-C18，Thermo），再经色谱柱分离，设置流速为300nL/min。从实验开始至105min，B液线性梯度从0%调整45%；从第105min至第110min，B液线性梯度从45%调整100%；从第110min至第120min，将B液线性梯度维持在100%。酶解后的样品经毛细管高效液相色谱分离后，使用Q-Exactive质谱仪（ThermoFinnigan）将样品进行质谱分析。分析时长共120min，采取检测正离子的检测方式，母离子扫描范围为300至1,800m/z，并通过设置以下参数来对多肽和多肽碎片的质荷比信息进行收集：MS1在m/z为200时分辨率为70,000，AGCtarget：3e6，一级MaximumIT：10ms，Numberofscanranges：1，Dynamicexclusion：40.0s；每次全扫描（fullscan）后采集10个碎片图谱，二级在M/Z200时分辨率为17,500，MS/MSActivationType：HCD，Isolationwindow：2m/z，Microscans：1，二级MaximumIT：60ms，Normalizedcollisionenergy：30eV，Underfillratio：0.1%。26 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证3.2.5.2Maxquant的非标记分析将样品重复三次上样质谱分析，并将获得的LCMS/MS结果信息文件，导入Maxquant软件（版本号1.3.0.5）进行数据库检索，并进行LFQ非标定量分析。搜索使用的本地化数据库为uniprot_Sus_scrofa_34253_20141227.fasta（蛋白质序列34253条，下载日期20141227）。主要参数如下：Mainsearchppm:6Missedcleavage:2MS/MStoleranceppm:20De-Isotopic:TRUEEnzyme:TrypsinDatabase:uniprot_Sus_scrofa_34253_20141227.fastaFixedmodification:Carbamidomethyl(C)Variablemodification:Oxidation(M),Acetyl(ProteinN-term)Decoydatabasepattern:reverseLablefreequantification(LFQ):TRUELFQminratiocount:1Matchbetweenruns:2minPeptideFDR:0.01ProteinFDR:0.013.2.5.3Perseus的统计学和生物信息学分析使用Perseussoftware（er.1.3.0.5）进行定量分析，主要流程见图3.1。鉴定蛋白的GO注释以及功能分类使用Blast2GOver.V2.6.2进行分析，公用数据库b2g_aug12（www.Blast2go.com）。分子过程分析以及亚细胞定位由DAVIDFunctionalAnnotationToolsuite（https://david.ncifcrf.gov/）进行分析。蛋白质相互作用分析由Stringanalysis进行分析（string-db.org/）。27 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证图3.1非标记定量蛋白质质谱Maxquant方法流程Fig.3.1TheMaxquantmethodprotocoloflabel-freequantitativeMS3.2.6Shotgun质谱目的蛋白过表达验证在Genewiz公司合成目的蛋白的核酸序列，并将合成的片段克隆到pCAGGS（Addgene公司）载体上。如图3.2方法构建表达载体。通过SOEPCR的方法在目的片段的5以及3端分别插入EcoRI以及KpnI酶切位点序列，并在3端目的片段终止密码子之前插入标签序列。图3.2pCAGGS融合表达载体的构建Fig.3.2ConstructionofpCAGGSfusionexpressionvectors培养MARC-145细胞，当细胞生长到70%左右，使用Lipo3000转染试剂对构建好的目的蛋白表达载体进行转染，转染24h后，对转染目的蛋白后的细胞分别以moi=0.1接毒vHuN4-EGFP以及28 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证vHuN4-F112-EGFP。选择过表达目的蛋白进行WB，将感染36小时后的PAM细胞培养皿中弃掉病毒上清后，在冰上使用RIPA细胞裂解液对细胞进行裂解，并收取裂解后细胞，离心收上清，加入蛋白上样缓冲液。之后进行SDS-PAGE以及转膜试验。转膜后，使用TBST溶液溶解并配制为3%BSA，0.01%明胶的封闭液，封闭半小时后，将NC膜于Anti-GFP以及Anti-β-Actin抗体中孵育过夜，用TBST清洗5次后，孵育二抗1h，TBST清洗5次后，使用显色液孵育5分钟，并进行曝光显色。在吉玛公司合成CLU基因的SiRNA，并转染MARC145细胞，转染36h以moi=0.3感染vHuN4-EGFP，24h后通过流式细胞仪检测FITC信号从而检测感染效率，并通过荧光定量方法检测干扰效率。3.2.7Label-free质谱分析目的蛋白WB验证HistoneH3对于转录调节DNA修复机制，DNA复制以及染色体的稳定性具有重要作用，参加机体抵御病毒入侵过程，在检测蛋白中，强毒组相比于弱毒组蛋白表达量显著降低，这可能与HP-PRRSV的免疫抑制机制相关；KDEL受体蛋白是一种跨膜蛋白，主要维持ER-高尔基体的转运以及蛋白转运功能。为了验证质谱定量的可靠性，从Label-free质谱分析获得的膜蛋白中选择HistoneH3和KDEL受体两个目的蛋白，按照同3.2.6的方法，使用Anti-HistoneH3、Anti-KDEL受体以及Anti-β-Actin抗体进行WB验证，从而验证质谱定量的可靠性。3.3结果3.3.1PAM细胞的分离培养将小猪处死后，取出肺脏，成功分离获得了PAM细胞，如镜下观察，见图3.3。图3.3镜下观察到的分离成功的PAM细胞（20X）Fig.3.3TheobservationoftheseparatedPAM(20X)29 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证3.3.2重组病毒感染PAM细胞vHuN4-EGFP以及vHuN4-F112-EGFP重组病毒分别感染PAM细胞，24h后，在镜下进行直接荧光观察。结果如图3.4。图3.4感染重组PRRSV的PAM镜下直接观察结果左图为vHuN4-EGFP感染后的PAM细胞。中间图为vHuN4-F112-EGFP感染后的PAM细胞（20X）Fig.3.4ThedirectobservationofinfectedPAMwithrecombinantPRRSVLeftfigureisthevHuN4-EGFPinfectedPAM,middlefigureisthevHuN4-F112-EGFPinfectedPAM(20X)通过Anti-PRRSVN蛋白的抗体对感染重组病毒的PAM进行IFA试验，如图3.5，证明重组病毒成功感染PAM细胞。图3.5感染重组PRRSV的Anti-NIFA实验结果（20X）Fig.3.5Anti-NIFNresultsofRecombinantPRRSVinfection(20X)30 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证3.3.3绿色荧光信号检测在流式细胞仪中通过检测FITC通道中的EGFP信号，对感染PRRSV重组病毒的PAM细胞进行分选，分选获得的细胞如图3.6。图3.6感染PRRSV重组强弱毒的PAM细胞FACS流式分选结果图中红色圆圈即为获得的纯化细胞Fig.3.6ThepurificationofPAMsinfectedwithvHuN4-EGFPandvHuN4-F112-EGFPbythemethodofFACSThepurifiedcellsareintheredcircle3.3.4Shotgun定性质谱分析结果利用Shotgun定性质谱技术，对制备并保存的感染vHuN4-EGFP以及vHuN4-F112-EGFP重组病毒获得的分选纯化PAM细胞差异蛋白进行分析，检测到的差异蛋白进行GO注释，分别对强弱毒检测组检测到的差异蛋白从分子转运活性、蛋白结合核转录因子活性、结合能力等方面进行蛋白分子功能注释分类，结果如图3.7。成功获得了与猪繁殖与呼吸综合征强弱毒株相互作用的PAM细胞膜差异蛋白信息，而且多数蛋白具有结合能力或者酶活性。31 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证图3.7与猪繁殖与呼吸综合征强弱毒株相互作用PAM细胞膜差异蛋白GO分子功能注释左图为弱毒组差异蛋白，右图为强毒组差异蛋白Fig.3.7GoannotationofmoleculefunctionofHP-PRRSVandAP-PRRSVgroup.LeftisthedifferentialproteinsofAP-PRRSVgroup,andrightisthediiferentialproteinsofHP-PRRSVgroup.在进行功能GO注释以后，按照其分子功能，体内参与的相关过程以及细胞定位等多方面因素综合分析数据，对相关差异蛋白进行整理与分析获得了进一步研究所需差异蛋白93个。进一步分析，获得了JUP、Clusterinisoformx1、Kexintype9、ApolipoproteinM和ApolipoproteinA-IV差异蛋白5个，见表3.1。表3.1强弱毒差异蛋白信息GO注释及功能分析结果Table.3.1GOannotationandfunctionanalysisofHP-PRRSVandAP-PRRSV英文名称中文名称功能JUP班珠蛋白桥粒的重要组成部件Clusterinisoformx1丛生蛋白细胞保护功能的伴侣蛋白结合RNA结合载脂蛋白Kexintype9受体抑制活性ApolipoproteinM载脂蛋白M载脂活性ApolipoproteinA-IV载脂蛋白A432 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证3.3.5Label-free定量质谱分析结果ABCDEFGHIJKLM图3.8Label-free质谱检测到的蛋白热图Fig.3.8ThehotmapofLabel-freeMSdetectedproteins利用Label-free定量质谱技术，对制备并保存的感染亲本病毒HuN4以及HuN4-F112毒株获得的PAM细胞差异蛋白进行分析，通过液相色谱分离后并进行质谱检测（LCMS/MS），本次实验共鉴定肽段数22,179个，蛋白质数2,849个。将所有检测的蛋白进行热图总结，如图3.8所示，从绿色到黑色再到红色的分布，表示着各组检测蛋白丰度与对照组三次上样的检测到目的蛋白丰度的平均值之间的比值。从热图结果可以得到以下结论：三次上样实验的均一性很好，颜色在强毒组（H-virus-1，2，3）、弱毒组（A-virus-1，2，3）以及对照组（Con-1，2，3）三次检测的蛋白丰度均很平均；只有一小部分蛋白是没有发生变化的（见F排黑色部分），其他部分相比于对照组，强毒组以及弱毒组表现出明显下调（A排至D排）以及上调（I排至M排）。33 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证对检测到的差异蛋白进行t-test检验（bothside），当PValue<0.01为显著性差异，结果见表3.2。表3.2Label-free定量质谱差异蛋白检测统计Table.3.2StatisticofLabel-freequantifiedMSdetecteddifferentialproteins样品量变差异*“有无”差异*A-VirusvsCon19590H-VirusvsCon256158H-VirusvsA-Virus5243*注：量变差异：该蛋白在两组间差异符合P<0.01,ratio>2或<0.5；“有无”差异：该蛋白在一组组内3次重复均检测到，而在另一组内3次重复中均未检测到。为了获得检测的差异蛋白在各个实验组份中的分布情况，绘制维恩图（Vennmap），如图3.9。图3.9HP-PRRSV组，AP-PRRSV组以及Control组检测蛋白的Venn分布图Fig.3.9VenndistributionmapofdetectedproteinsintheHP-PRRSV，AP-PRRSVandControlgrouprespectively如图3.9可知，实验中绝大多数蛋白都是三个组别当中共同检测到的，但每个小组中都有单独表达的蛋白。为了研究强弱毒之间感染PAM细胞的差异感染机制，所以重点集中在AP-PRRSV组与HP-PRRSV组之间差异的蛋白质。通过Label-free定量蛋白质谱分析，共计获得与亲本PRRSV强弱毒株相互作用的差异蛋白95个。对获得的差异蛋白进行GO注释，如图3.10所示。检测到的定位在细胞质膜表面的强弱毒组差异蛋白26个。34 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证图3.10Label-free蛋白质谱差异蛋白GO注释分析A为蛋白分布注释，B为参与细胞过程注释，C为分子功能注释Fig.3.10GOannotationofdifferentialLabel-freeMSdetectedproteinsA,thelocationannotation;B,theprocessannotation;C,thefunctionannotation对Label-free质谱三次技术重复结果进行Pearson相关性分析，见散点图3.11，横坐标和纵坐标分别标记强度值的对数值，相关性R值可达97%，可见技术重复相关性较好。图3.11Label-free质谱相关性分析Fig.3.11RelativityanalysisofLabel-freeMS为了进一步研究强弱毒感染PAM的差异机制，本实验使用StringNetwork的方法去尝试阐明Label-free质谱分析中亲本强弱毒差异蛋白的表达情况。选取了PRRSV在感染宿主细胞时主要的受体CD163（Q2VL90）、肝素硫酸盐（Q29411）、CD151（F1RYZ1）、非肌肉肌球蛋白重链IIA（F1SKJ1）、唾液酸粘附素（A7LCJ3）以及波动蛋白（P02543）(Calvert,etal.,2007;DelputteandNauwynck,2004;Jusaetal.,1997;Kimetal.,2006;Shanmukhappa,etal.,2007;Zhouetal.,2008)进行Stringanalysis分析，以揭示检测到的差异蛋白与病毒入侵的关系。Stringanalysis分析结果如图3.12，结果显示CD16335 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证（WC1）、非肌肉球蛋白重链IIA（MYH9）以及波动蛋白（P02543）与检测到的差异蛋白之间，预测存在相互作用，见图3.13，并且存在着潜在的差异感染信号通路。图3.12PRRSV受体蛋白与强弱毒PRRSV差异蛋白Stringanalysis分析结果Fig.3.12ThestringanalysisofHP-PRRSVandAP-PRRSVgroupswiththeknownPRRSVreceptorinvolved图3.13强弱毒潜在的感染PAM差异蛋白信号通路Fig.3.13ThepotentialinfectionpathwayofHP-PRRSVandAP-PRRSVRAP2A，MINK1，以及GNAS是RAS信号通路的调节蛋白，RAP2A以及MINK1只在HP-PRRSV组别中检测到，GNAS只在AP-PRRSV组别中检测到，最近有报道证明RAS信号通路能够通过下调IFN-JAK-STAT通路来降低丙肝病毒（HCV）的复制能力(Zhangetal.,2012)。36 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证干扰素调节因子（interferonregulatoryfactor3），IRF3在依赖于I型IFN的免疫应答过程中是一种重要的调节因子，试验结果表明IRF3在AP-PRRSV感染组的表达量比HP-PRRSV的表达量高出10倍以上，推测可能存在能够引起IRF3差异表达并引起PRRSV免疫逃逸的机制。3.3.6Shotgun质谱分析目的蛋白的过表达验证结果对Shotgun定性质谱结果进行分析，获得了JUP、Clusterinisoformx1、Kexintype9、ApolipoproteinM和ApolipoproteinA-IV差异蛋白5个，在MARC-145上进行过表达，感染重组EGFP强弱毒PRRSV后，采用Anti-GFP单抗进行WB验证，研究这些蛋白的过表达是否可以引起病毒感染量的变化。结果表明：ApolipoproteinM、ApolipoproteinA-IV、JUP对强毒存在抑制作用、推测为抵御PRRSV感染的宿主蛋白，Clusterinisoformx1对强毒的感染存在上调作用，推测可能是PRRSV感染的宿主受体蛋白，并通过RNA干扰实验验证了其上调作用，见图3.14。图3.14目的蛋白对病毒感染能力影响Fig.3.14InfluenceofthesortedproteinstothePRRSVinfectiveactivity3.3.7Label-free质谱分析目的蛋白WB验证结果通过WB试验验证了Label-free质谱分析PAM细胞膜蛋白结果中KDEL受体和HistoneH3的表达量，结果见图3.15，在检测数据中的定量结果显示KDEL受体的表达量vHuN4-F112/vHuN4的比值为2，HistoneH3的vHuN4-F112/vHuN4比值为5，这与质谱检测结果一致。图3.15质谱定量结果WB验证Fig.3.15WBverificationofquantitativemassspectrometry37 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证3.4讨论1998年，首次提出PRRSV的一种大小为210kDa的受体蛋白(Duan,etal.,1998)，并于2003年证实其为唾液酸粘附素(Vanderheijdenetal.,2003)。2012年，研究发现I型PRRSV以及唾液酸粘附素之间的相互作用会对肺泡巨噬细胞的吞噬作用造成抑制(DeBaereetal.,2012)。CD163是一种长为130kDa的蛋白，开始被认为是一种红细胞受体，并可以起到调节作用(VandenHeuveletal.,1999)。图3.1所示，目前报道中，唾液酸粘附素以及CD163是PRRSV感染宿主细胞最主要的两种受体蛋白。除了以上两种重要蛋白，还有许多PRRSV入侵相关重要的受体蛋白，如表3.3。目前有报道表明，至少有六种分子已经被证实为PRRSV的受体，包括肝素硫酸盐（Heparansulphate，HS），波动蛋白（Vimetin）、CD151、CD163（ScavengerReceptorforhemoglobincomplex）、唾液酸粘附素（Siglec-1，CD169）以及DC-SIGN（Dendriticcell-specificintercellularadhesionmolecule-3-grabbingnon-integrin和CD209(Calvert,etal.,2007;Duan,etal.,1998;Huangetal.,2009;Jusa,etal.,1997;Kim,etal.,2006;Shanmukhappa,etal.,2007)。这些受体分子中，关于唾液酸粘附素以及CD163相关研究最多，如图3.16。从这些实验可知，CD163与Sn是PRRSV感染PAM过程中尤为重要的两个受体。其中CD163起到了关键性作用。如图3.17，图中阐述了CD163为主介导的病毒入侵过程。图3.16目前报道的PRRSV感染的CD163以及Sn受体蛋白(ZhangandYoo,2015)Fig.3.16ThereportedexperimentontheSnandCD163duringPRRSVinfection(ZhangandYoo,2015)38 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证图3.17CD163介导的PRRSV入侵过程Fig.3.17CD163inducedPRRSVintrusion在病毒感染宿主细胞时，首先病毒的GP2与GP4蛋白与宿主细胞细胞膜表面的CD163受体结合，之后在CD163的协助下，PRRSV会通过被细胞膜所形成的囊泡包裹进入细胞中，随后PRRSV的囊膜会和囊泡融合，继而在细胞质中释放出病毒的核衣壳蛋白以及核酸。从蛋白质组学角度阐明病毒与其宿主细胞之间的相互作用是十分重要的。因为很难盲目的直接从大量的宿主细胞蛋白中直接选择某种蛋白进行相关研究。近几年来，蛋白质组学技术得到了迅速发展。基于液相色谱分离技术的蛋白质组学技术都具有很好的准确性以及灵敏性，并且都已经在病毒宿主相互作用方面得到了广泛的应用。其中，基于液相色谱串联质谱（LCMS/MS）的Shotgun定性蛋白质谱方法以及label-free定量蛋白质谱(Zhengetal.,2011)方法逐渐成为了同时检测大量蛋白的重要方法。39 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证表3.3有报道的PRRSV主要潜在受体介绍Table3.3IntroductionofthereportedPRRSVreceptor受体大小结构特点表达分布功能参考文献CD163130kDa由九个富含半胱单核巨噬细胞家族，在质膜以及粘附受体，红细胞生成；(VandenHeuvel,etal.,1999)；氨酸结构域的清细胞外区域大量存在清除无细胞的血红蛋白，血红(Kristiansenetal.,2001;Madsenetal.,道夫受体蛋白结合珠蛋白受体；2004)；(Nielsenetal.,2010;Philippidis炎症相关；etal.,2004)；(Sanchezetal.,1999)巨噬细胞分化标志；(Caietal.,2015;CrockerandGordon,先天性免疫传感；1986;Fabrieketal.,2009;Fraserand病毒受体Gordon,1994;Sanchez-Torresetal.,2003;VanGorp,etal.,2008)唾液酸粘210KDa在细胞外含有17受组织巨噬细胞严格调节与控羊红细胞受体，红细胞生成，(CrockerandGordon,1986;Crockeret附素个Ig样的重复结制，在质膜以及胞外大量存在免疫效应调节；al.,1997;Delputte,etal.,2007b;Fraser构域，并且包含一唾液酸结合受体；andGordon,1994;Heikemaetal.,2010;个小的胞质尾巴炎症相关；Jiangetal.,2006;Jonesetal.,2003;结构启动摄取唾液酸抗原Monteiroetal.,2005;Nathetal.,1995;Rempeletal.,2008;Zouetal.,2011)CD15128kDa存在于细胞的表主要存在于红系细胞，相比于成细胞信号，细胞激活，动力作(Fitter,etal.,1999;Robertsetal.,1995;面，具有四个疏水熟的红细胞，在红细胞前体细胞用，癌细胞入侵以及血小板聚Sincock,etal.,1999)结构域表达量更高；在许多组织中，大集多数存在于细胞质以及质膜上肝素硫酸10-70kDa线性多糖，具有两几乎全部哺乳动物细胞全部表血凝，血管生成，肿瘤转移以(Bernfieldetal.,1999;Lopesetal.,2006;盐个或者三个侧链达，在细胞以及胞内大量存在及损伤修复，细胞粘附、迁徙、Tumovaetal.,2000)形成整个多糖增殖、分化以及信号转导；病毒入侵正向调节，受体信号复合体波动蛋白54kDa在中心具有一个存在于间充质细胞，大多表达于细胞骨架成分，维持细胞完整(Ogrodniketal.,2014;Sarriaetal.,α-螺旋结构-卷曲细胞骨架，胞质，细胞外区域以性，稳定细胞骨架连接，控制1992)螺旋二聚体的单及过氧化物酶体蛋白的转运体DC-SIGN46kDaN端具有跨膜结主要表达于巨噬细胞以及树突粘附素受体，病毒受体，启始(denDunnenetal.,2009;Geijtenbeeket（CD209）构域，在C端具状细胞，大多表达于质膜以及先天性免疫al.,2000;Khooetal.,2008)有外源凝集素糖胞外区域识别域40 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证通过纯化感染病毒的细胞，提取膜蛋白并进行Shotgun蛋白质谱，或者不纯化细胞直接提取膜蛋白并进行Label-free蛋白质谱，可以获得准确可靠的差异膜蛋白信息，这对我们对于强弱毒感染PAM的差异机制研究有着非常大的帮助。本实验通过过表达目的蛋白进而研究相关蛋白与病毒之间的相互作用，从而确定这些目的蛋白与病毒之间存在抑制作用或者在病毒感染时起到感染受体相关作用，并且通过Label-free定量蛋白质谱获得潜在的强弱毒差异感染途径，为未来揭示PRRSV感染机制奠定基础。病毒入侵宿主细胞时，病毒蛋白与细胞膜表面的受体蛋白结合过程是尤为重要的，因为这些与膜蛋白之间的相互作用情况会直接影响病毒感染宿主细胞的能力，所以我们把这次强弱毒之间差异表达的膜蛋白单独列出来并做详细的研究，希望为以后的PRRSV感染受体研究，抑或宿主细胞抗PRRSV感染研究奠定基础。我们将检测到的确定定位在细胞膜表面的差异膜蛋白数据进行总结与功能注释，并绘制热图与Kmeans聚类分析如图3.18，从而更好的理解这些差异膜蛋白的功能以及所参与的生物学过程。图3.18强弱毒PRRSV的差异表达膜蛋白丰度热图Fig.3.18ThehotmapofdifferentiallyexpressedmembraneproteinsfromtheHP-PRRSVandAP-PRRSVgroups通过查询UniProt数据库，我们共获得了26个确定定位在膜上的强弱度组别中差异表达的膜蛋白。如热图中（蛋白以UniProt登录号表示），F1S0A2（0.406，这个数值为在强毒组以及弱毒组检测41 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证到的蛋白平均丰度之间的比值），P36887（2.053），I3LJL8（2.554），I7KJP5（0.483），E7EAX3（2.862），F1SNF8（2.550），F2Z5N4（0.136），F1RRB7（0.184），A9X3T3（0.493），I3L9Z5（0.419），以及F1SIE7（0.390）在强毒组以及弱毒组都较高丰度表达。相比于HP-PRRSV感染的PAMs，AP-PRRSV组中F1S0A2（0.406）表达相对较高，它具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性，并参与蛋白质折叠以及蛋白质肽基-脯氨酰基异构，这种蛋白能够促进蛋白的折叠，在强毒PRRSV感染宿主细胞时，可能有助于减少IFN等免疫相关蛋白的产生。F2Z5N4（0.136）主要作用为结合ATP控制的5-羟基激酶活性的激酶，需要在mRNA切割和siRNA装载到RNA诱导的沉默复合物参与下介导RNA干扰和破坏。因此，在HP-PRRSV感染的细胞降低表达可能有助于衰减siRNA的作用。F1RRB7（0.184）主要作用为氧化酶以及转移酶的作用。A9X3T3（0.493）功能为与脂肪酰基辅酶A的结合并具有异构酶活性。I3L9Z5（0.419）是一种蛋白酪氨酸磷酸酶活性的调节蛋白，可以负调节许多炎症反应的信号通路，HP-PRRSV感染的PAM降低了这种蛋白的表达，可能引起更加严重的炎性反应。E7EAX3（2.862）（干扰素诱导的跨膜蛋白3），这种蛋白能够应对生物刺激，在弱毒组中检测到的这些膜蛋白之中表达量是最高。对于人类的相关研究有报道，这种蛋白质可以帮助负调节多种病毒的入侵宿主细胞能力，如A型流感，SARS冠状病毒（SARS-CoV），马尔堡病毒（MARV），埃博拉病毒（EBOV），登革热病毒（DV），西尼罗病毒（WNV），I型人免疫缺陷病毒（HIV），水泡性口炎病毒（VSV），它可以抑制流感病毒的血凝素蛋白-介导的病毒入侵，GP1、GP2介导的MARV和EBOV，S蛋白介导的SARS冠状病毒的病毒进入以及G蛋白介导的VSV病毒入侵，因而对于内涵体的V-ATP酶的结构稳定性和功能至关重要。建立与内涵体的V-ATP酶的相互作用，这对网格蛋白（Clathrin）的正确定位至关重要，同时也需要在V-ATP酶的帮助下，降低在吞噬内涵体的pH值，从而提供低pH的环境来抵抗病毒的入侵(Brassetal.,2009)，在病毒感染组的高表达证明其也会对PRRSV的感染起到抑制作用，在强毒组的低表达可能和强毒PRRSV的免疫抑制有关。P36887（PRKACA）（2.053）主要具有激酶以及ATP结合活性，除此之外还具有其他很多功能。I3LJL8（2.554）能够促进双链RNA的结合并且激活B细胞受体信号通路以及TLR3信号通路，上调产生IL-17，促进促炎性细胞因子的产生。F1SNF8（2.549）具有促进拉布脒基核苷酸交换因子活性，促进蛋白转运，上调GTP酶的能力。这些膜蛋白在HP-PRRSV以及AP-PRRSV组中都有检测到，并且多数都与免疫应答有关。这些蛋白的差异表达也许与宿主细胞因感染不同毒力PRRSV所处的不同免疫状态有关，这对以后更好的阐述机体的抗PRRSV机制奠定基础。“有无差异”的组别，也许能够揭示更多的关于不同毒力PRRSV感染PAM后的不同机制相关信息。强毒组检测到，而弱毒组没有检测到的（vAP-/vHP+）:Q06AU2具有GTP/GDP结合活性，并且具有特异性的蛋白结构域结合活性，能够降低细胞的迁徙能力，并参与GTP分解代谢过程，肌动蛋白细胞骨架重组，蛋白磷酸化，Rap蛋白信号转导，包内蛋白定位，JNK级联，树突形态，蛋白酪氨酸激酶活性，以及血小板聚集，并参与调节下游Ras通路。F2Z5K9是一种组蛋白样蛋白，主要功能为促进DNA和染色质结合，具有蛋白异二聚体的活性，并参与聚合酶启动子的调节，染色质沉默，核小体装配，凝血，基因表达，DNA甲基化，应激反应，以及调节基因沉默。此外，它也许可以帮助PRRSV沉默免疫相关的基因，从而促进免疫逃逸。F1RMZ0能够结合生长受体，参与蛋白C末端42 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证结合和多聚（A）RNA结合，并能调节受体内化，参与小脑浦肯野细胞的分化，细胞质mRNA加工的相关组装，压力颗粒装配，多细胞生物生长的负调节，神经元的分化形态，一些细胞和神经肌肉的动态平衡，并可能导致TNF-α和TGF-β2的异常表达，从而引起免疫抑制。P26234（Vinculin）能够结合聚糖，肌动蛋白，具有结构分子活性，beta-连环蛋白的结合，alpha-连环蛋白（catenin）的结合，以及连环蛋白的结合，参与上皮细胞的结构维持，血小板脱粒，细胞及亚细胞组分的移动，肌肉收缩，细胞-基质粘附，板状伪足组成，负向调节细胞迁移，粘着连接装配，蛋白在细胞表面的定位，心尖结合（Apicaljunction）的组装，血小板聚集，以及上皮细胞-细胞粘连。它具有Q06AU2相类似的功能，并且我们发现HP-PRRSV能够引起细胞迁移的负向调节并且也许和PRRSV感染宿主细胞后的变化有关。F1SUF6具有氨基乙酰tRNA的编辑活性，异亮氨酸-tRNA的连接酶活性，并且具有连接ATP的功能，参与成骨细胞分化，异亮氨酸-tRNA的氨酰化，调节翻译的保真性，这些可能与参与免疫应答有关。在弱毒组检测到，但在强毒组没有检测到的组别：I3LUE7具有补体成分C5a受体活性以及C5a过敏毒素受体活性，参与中性粒细胞趋化（neutrophilchemotaxis），肽聚糖应答，C补体C5a信号通路，通过RNA聚合酶II启动子进行的mRNA转录，上皮细胞增殖的正调控，革兰氏阳性菌的防御性应答，以及ERK1/2的级联的正调控。F1RMY4具有ARFGTP酶激活物活性并能结合锌离子，并参与ARFGTP酶活性的正调控。F1SGC8在RNA聚合酶功能二核心启动子近侧区序列特异性DNA结合，RNA聚合酶II远端增强序列特异性DNA结合，及核小体DNA的结合，参与神经视网膜发育，神经系统的发育，ATP依赖的染色质重塑，以及组蛋白H4和H2A的乙酰化。F1RRK2与蛋白质C末端结合，具有RapGTP酶激活物活性，并参与细胞骨架的组织，参与细胞粘附，细胞增殖，细胞生长的负调节，RapGTP酶活的正调控，细胞内信号转导，脱水状态下的细胞应答，并参与细胞周期的负调控。通过对纯化后的感染PRRSV的PAM细胞进行Shotgun质谱分析，筛选检测蛋白，经过体外过表达实验，发现Jup，Kexintype9，ApolipoproteinM，ApolipoproteinA-IV均对PRRSV存在一定程度的抑制，Clusterinisoformx1对PRRSV强毒存在明显上调，这说明ClusterinIsoformx1可能是强毒PRRSV感染PAM时潜在的受体蛋白，并通过RNA干扰实验验证了其上调作用。在亲本病毒感染宿主细胞时，高致病性PRRSV以及低致病性PRRSV之间存在明显的差异。但目前关于病毒入侵以及出芽机制的研究还不能够足以说明强弱度之间为何有这样的差异。我们尝试通过LC-MS的方法进行Label-free定量蛋白质谱来分别确定HP-PRRSV以及AP-PRRSV感染后的PAM上的膜差异蛋白。共获得22,179个肽段以及2849个蛋白，其中95个是强弱度组别中差异表达的。这95个是强弱毒差异蛋白，其中26个是确定定位在细胞膜上的，这可为以后PRRSV感染受体以及相关蛋白功能，信号通路等研究奠定基础。有报道，非肌肌球蛋白IIA重链分子（MYH9）为一种PRRSV重要的受体蛋白，但就此展开的相关研究较少。本试验结果表明，MYH9分别与AP-PRRSV以及HP-PRRSV中的两种差异蛋白存在相互作用（VCL以及ACTL6A）。VCL蛋白为肌动蛋白丝（F-肌动蛋白）结合蛋白，是一种负责细胞基质粘附以及细胞间相互粘附作用的蛋白，E-钙粘蛋白复合物，负责调节细胞表面的钙粘蛋白的表达，并在维持细胞形态分布以及促进肌动蛋白、泛素蛋白连接酶等方面发挥重要作用(LeClaincheetal.,2010)。ACTL6A（DNA核小体的拓扑结构改变蛋白）主要参与43 中国农业科学院硕士学位论文第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证染色质的结合与转录共激活因子相关机体活动(Doyonetal.,2004)。上述结果，能够帮助我们阐明PRRSV独特的入侵机制。44 中国农业科学院硕士学位论文第四章全文总结第四章全文总结1．成功构建pHuN4-EGFP与pHuN4-F112-EGFP感染性克隆，获得重组EGFP的强弱毒PRRSV，通过噬斑试验、IFA以及生长能力试验，证明其与亲本毒相比无明显差异。2．通过FACS流式分选技术，成功纯化了重组EGFP的PRRSV强毒或弱毒感染的PAM细胞。3．对重组病毒强弱毒株感染宿主PAM细胞膜蛋白进行了Shotgun定性蛋白质谱分析，获得差异表达蛋白93个，真核过表达试验发现ApolipoproteinM、ApolipoproteinA-IV、JUP对强毒存在抑制作用，Clusterinisoformx1对强毒的感染存在上调作用，并通过RNA干扰实验验证了其上调作用。4．对亲本强弱毒株感染宿主PAM细胞膜蛋白进行了定量蛋白质谱分析，获得差异蛋白95个，其中确定定位在膜上26个；通过WB对质谱结果可靠性进行了验证；通过Stringanalysis方法寻找强弱毒之间的差异感染机制，揭示了不同毒力PRRSV感染PAM差异的潜在信号通路。45 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中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时光飞逝，一转眼间，那个曾经怀揣梦想刚刚进入实验室的我，经历三年硕士生活的丰富与磨练，已经变得更加成熟与优秀。回想起硕士期间三年，心中充满无限感激与留念。感谢上海兽医研究所提供给我的良好实验氛围与优秀的学术平台，使我能够获得如此巨大的进步。谨向我的导师，童光志研究员致以最诚挚的感谢！童老师对于学术的追求与热爱深深的感染了我。感谢童老师从开题的课题选择到中期的辛劳照顾再到硕士毕业期间的细心指导。我会在今后的学习科研以及工作等方面，认真进取，并争取获得优异的成绩来报答恩师的教导之情。感谢周艳君老师，对我的硕士期间的教诲，周老师的学术态度真的深深的感染了我，也是周老师，让我体会到作为一名科学工作者，该有的严谨与细致，也要感谢周老师平时对我学习生活中的热心照顾。我还要特别感谢我的指导老师，高飞老师。高老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以细心的关怀，是我今后科研道路的良好榜样以及学习楷模。在此谨向高老师致以最诚挚的感谢。还要感谢黄勤峰老师，李国新老师，单同领老师，于海老师，童武老师，唐老师等等等等。我还要特别感谢我的师兄师姐。感谢郑旭晨师姐对我的细心的指导，每次我有疑问跑去问她，总能得到完美的答案。感谢刘飞师姐对我的关心照顾，记得在我刚到实验室时，就不顾实验繁忙，帮我找宿舍。感谢梁超师姐的监督帮助，让我克服实验以及学业上的疑虑。感谢李丽薇师姐，在我遇到困难是总是能够第一个站出来给予我帮助，并经常能送给大家好玩的小礼物，还有做的那么好吃的胡辣汤，为大家营造完美的学习氛围。还要感谢王康师兄，孔宁师兄，刘欢师兄，叶超师兄，姜一峰师兄，李林师兄，夏天奇师兄，杨莘师兄，虞凌雪师姐，郭亦菲师兄，潘溪师姐，汪秀慧师姐，等等等等。我还要特别感谢我的同学们。田青，顾峰，他们在我北京上课时就是室友，平时互相监督鼓励，互相关心照顾，来到所里以后，还经常一起打球，一起学习。谢春，王鑫和于之清，我们经常在一起玩耍，并且中午一起去吃饭，一起聊课题，搞学术。还要感谢杨德强和武吉强，王涛在我硕士期间的陪伴。还要感谢曹艳云，宫晓倩，孟琼，吴勇光，阮宝杨等等等等。另外，我必须感谢我的父母。是我的父母给了我一切，如果没有我的父母的辛勤劳动，与养育之恩，就不会有我的今天。我要在今后的学习工作等方面继续努力，以报答父母的养育之恩。54 中国农业科学院硕士学位论文作者简介作者简介曲泽慧，男，生于1990年8月，黑龙江省哈尔滨市人，硕士研究生。学习经历：2013.9-2016.6：中国农业科学院上海兽医研究所预防兽医学专业硕士2009.9-2013.6：东北农业大学动物医学学院动物医学专业本科硕士期间发表文章：1.曲泽慧，高飞，李丽薇，姜一峰，虞凌雪，周艳君，郑海红，童光志*.猪繁殖与呼吸综合征重组病毒非必须基因区的鉴定。中国预防兽医学报，2015,37（4）：246-249。2.Yi-fengJiang，Tian-qiXia，Yan-junZhou，Ling-xueYu，ShenYang，Qin-fengHuang，Li-weiLi，FeiGao，Ze-huiQu，WuTong，Guang-zhiTong*.Characterizationofthreeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolatesfromasingleswinefarmbearingstronghomologytoavaccinestrain.VeterinaryMicrobiology,2015,179:242-249.3.ZehuiQu,FeiGao,LiweiLi,YifengJiang,LingxueYu,QinfengHuang,ShenYang,YanjunZhou,HaoZheng,GuoxinLi,WuTong,GuangzhiTong*.LabelfreequantitativeproteomicanalysisforofdifferentiallyexpressedmembraneProteinsofPAMsinfectedwithhighlypathogenicPRRSVanditsattenuatedstrain.JournalofProteomics,2016,revision专利情况：1.童光志，高飞，姜一峰，曲泽慧，周艳君，李国新，虞凌雪，李丽薇，杨莘，郑浩，童武，夏天奇.表达猪瘟病毒E2蛋白重组PRRS病毒基因工程疫苗的构建方法和应用.2014年，申请号：201410801939，公开号：104561092A.2.高飞，童光志，周艳君，姜一峰，曲泽慧，李丽薇，虞凌雪，郑浩.表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的构建方法及应用.2015年，申请号：201510069182.公开号：1046945661A.55
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