猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究

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分类号：S852.65学校代码：10712UDC：579.62研究生学号：2015060181密级：公开2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究学科专业：预防兽医学研究方向：兽医免疫学研究生谢莎指导教师：张改平教授完成时间：2018年6月中国陕西杨凌 Classificationcode:S852.65Universitycode:10712UDC:579.62Postgraduatenumber:2015060181Confidentialitylevel:openDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018IDENTIFICATIONOFPATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNSANDRECOGNITIONMECHANISMOFPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSMajor:PreventiveVeterinaryMedicineResearchfield:VeterinaryImmunologyNameofPostgraduate:XieShaAdviser:Prof.Zhang,GaipingDateofsubmitted:June2018YanglingShaanxiChina 本研究由国家自然科学基金重大项目（31490601）；国家自然科学基金青年基金（31502043）提供资助。ThisworkwasfundedbythekeyprojectofNationalNaturalScienceFoundationofChina(Grantno.31490601)andtheNationalNaturalScienceFund(Grantno.31502043). 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》,如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：2018年6月1日导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博士研究生所呈交的博士学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名：时间：2018年6月1日 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。（保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：时间：2018年6月1日导师签名：时间：2018年6月1日 猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）作为一种猪病毒性传染病，其病原为PRRS病毒（PRRSvirus，PRRSV）。目前PRRS在全世界的猪场广泛流行传播，造成了巨大的经济损失。2006年，我国突然爆发了猪高热病，其临床症状主要为持续高热，迅速死亡，传染性非常强，发病率接近100%，同时引起妊娠母猪严重流产等繁殖障碍，对我国养猪业产生了巨大危害，该病病原随后被鉴定为高致病性PRRSV（highlypathogenicPRRSV，HP-PRRSV），该毒株是一种变异的PRRSV毒株。对于PRRSV的防控与净化目前还没有很好的方法，鉴于天然免疫在抗病毒过程中起着重要作用，因此需要进一步阐明其免疫机制，从而为该病的有效防控奠定基础。病毒感染宿主后，机体的模式识别受体（patternrecognitionreceptors，PRRs）会迅速识别病原相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs），激活下游信号通路从而诱导干扰素（interferon,IFN），以及下游干扰素诱导基因（interferon-stimulatedgenes，ISGs）的大量产生，进而起到抗病毒作用。由于PRRSV具有免疫抑制的特性，之前的研究主要围绕在PRRSV蛋白对固有免疫的抑制效应及其机制，关于PRRSV如何被机体识别，以及诱导IFN产生的机制研究较少。本论文针对此问题进行了研究，取得的主要结果如下：1、本研究首先采用RNA结合蛋白免疫沉淀及测序（RNA-BindingProteinImmunoprecipitationsequence，RIP-seq）等实验方法分析了PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcinealveolarmacrophage，PAM）过程中，PRRSV基因组被黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别的碱基序列，结果表明在PRRSV感染的PAM中，RIG-I和MDA5主要结合于PRRSV正链基因组的3’端非翻译区（3’untranslatedregions，3’UTR），同时RIG-I和MDA5的结合有U/C和U/G碱基序列特异性。2、PRRSV属于套式病毒目，其基因组和亚基因组都含有共同的5’和3’UTR区域，对病毒的复制至关重要，同时本研究前期RIP-seq结果已证明，PRRSV3’UTR区域对于免疫识别非常重要，因此我们进一步研究了PRRSV基因组5’和3’UTR与免疫识别之间的关系。结果表明，PRRSV基因组的5’和3’UTR能够刺激细胞产生IFN，并且位于PRRSV基因组3’UTR的假结结构能够作为一种新的PAMP被模式识别受体RIG-I和Toll样受体3（Tolllikereceptor3，TLR3）识别，从而强烈地诱导IFN及ISGs的产生。由于假结结构是RNA病毒末端两个茎环相互作用形成的三级结构，能作为分子开关调节病毒RNA合成以及病毒复制，本研究发现此假结结构还能作为PAMP诱导抗病 毒免疫应答，且将此假结结构相互作用破坏后其诱导IFN的能力显著降低。RNA-pull-down结果显示，RIG-I的调节区（regulationdomain，RD）和TLR3的腔内区（ectodomain，ECD）均能与PRRSV基因组3’UTR的假结结构RNA结合。在PAM中转染此假结结构能显著抑制PRRSV复制，表明该结构具有抗病毒能力。序列比对及二级结构预测显示，动脉炎病毒科其它成员在基因组3’UTR都含有假结结构，此结构在动脉炎病毒科中非常保守，且这些病毒基因组的假结结构都能有效诱导IFN产生。3、对猪源RIG-I的RD区（pRIG-I-RD）进行了表达和纯化，并采用凝胶过滤层析验证了pRIG-I-RD和PRRSV基因组3’UTR假结结构RNA的相互作用。同时本实验采用小角散射（Small-angleXrayscattering，SAXS）技术分析了PRRSV3’UTR假结结构RNA与pRIG-I-RD复合物在溶液中的状态，结果显示其为细长的大分子结构，可能含有多个区域，至少有两个中心。由于PRRSV基因组的5’末端带有帽子，其识别机制与之前报道的机制不同，因此本研究为深入研究RIG-I识别模式奠定了基础。综上所述，本研究鉴定了3’UTR的假结结构可以作为病原相关分子模式特异性激活RIG-I和TLR3介导抗病毒免疫应答，并且该模式在动脉炎病毒科中非常保守。结合以往研究，我们提出了一个PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN效应与PRRSV蛋白抑制IFN效应平衡的模型。在早期胞内体中，病毒基因组释放到细胞质内，基因组mRNA可以作为模板翻译复制转录酶蛋白（polyproteinprecursors1a，pp1a）（polyproteinprecursors1ab，pp1ab），经过切割后这些蛋白组装成复制转录复合体（replicationandtranscriptioncomplex，RTC），然后结合到PRRSV3’UTR区域起始负链RNA合成。在PRRSV复制过程中，PRRSV基因组3’UTR假结结构能够被模式识别受体RIG-I的RD区和TLR3的ECD区识别并激活核转录因子κB（NF-κB）或干扰素调节因子3（IRF3）产生IFN。病毒的蛋白例如非结构蛋白1/2/4/11（nonstructuralproteins1/2/4/11，NSP1/2/4/11）和结构蛋白N蛋白可以通过靶向IRF3或NF-κB从而干扰宿主的抗病毒应答。因此，PRRSV基因组3’UTR假结结构既能作为分子开关调节病毒RNA合成，同时可以影响天然免疫识别以及下游IFN产生。本研究为探索PRRSV免疫识别机制及发现RIG-I和MDA5新的识别特征奠定了重要研究基础。关键词：干扰素；假结；病原相关分子模式；猪繁殖与呼吸综合征病毒；模式识别受体 IDENTIFICATIONOFPATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNSANDRECOGNITIONMECHANISMOFPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUSABSTRACTPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isthemostcommonviraldiseaseinporkindustry.Itiscausedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV).Atpresent,PRRSiswidelyspreadinpigindustryaroundtheworld,causinghugeeconomiclosses.In2006,therewasasuddenoutbreakofswinefeverinChina,whichwascharacteristicofpersistenthighfever,rapiddeath,highlycontagious,andtheincidenceratewascloseto100%.Atthesametime,itcausedseriousmiscarriageandotherbreedingdisordersinpregnantsows.ThepathogenofthediseasewassubsequentlyidentifiedashighlypathogenicPRRSV(HP-PRRSV),whichisavariantPRRSVstrain.Untilnow,therehavebeennobettermethodsforthepreventionandcontrolofPRRSV.InnateimmunityplaysanimportantroleintheantiviralresponseanditisnecessarytofurtherstudytheimmunologicmechanismofPRRSV.Uponvirusinfection,thehostpatternrecognitionreceptors(PRRs)quicklyrecognizethepathogen-associatedmolecularpatterns(PAMPs)toactivatedownstreamsignals,inducinglargeproductionofinterferon(IFN)anddownstreaminterferon-stimulatedgenes(ISGs)torestrictvirusreplication.PreviousreportshaveplacedonhowPRRSVevadeshostimmunityduetotheimmunosuppressivecharacteristicofPRRSV.However,therearefewstudiesonthespecificmechanismofhowPRRSVisrecognizedandinducesIFNproduction.Thus,mythesisfocusesonthisandthemainresultsobtainedareasfollows:1.Inthisstudy,weanalyzethenucleotidesequencesrecognizedbyretinoicacid-induciblegeneI(RIG-I)andmelanomadifferentiationassociatedgene5(MDA5)viaRNA-bindingproteinimmunoprecipitationsequence(RIP-seq)inPRRSVinfectedporcinealveolarmacrophages(PAM).TheresultsdemonstratedthattheregionsofRIG-IandMDA5bindingcenteronthe3’untranslatedregions(3’UTR)regionofthePRRSVpositive-strandRNAgenomeandthebindingsequencesshowU/CandU/Gspecificity.2.PRRSVbelongstotheArteriviridaefamily,orderNidoviralesandthegenomeandsubgenomesharecommon5’and3’UTRregionswhichareessentialforviralreplication.TheRIP-seqresultsalsoindicatethatthePRRSV3’UTRregionisimportantforimmune recognition.Therefore,wefurtherstudiedtherelationshipbetweenPRRSVgenome5’or3’UTRandimmunerecognition.Here,wereportedthat5’and3’UTRofPRRSVgenomecouldinduceIFNs.Moreover,thepseudoknotregionresidinginthe3’UTRofPRRSVgenomesensedasanewPAMPbyRIG-IandTolllikereceptor(TLR3)andstronglyinducedtypeIIFNsandISGsinPAMs.ThepseudoknotstructureisatertiarystructureformedbytheinteractionoftwostemloopsattheendofRNAviruswhichcanbeusedasakeymoleculetoregulateviralRNAsynthesisandvirusreplication.Inthisstudy,weshowedthatitactedasPAMPtoinduceantiviralresponse.Theinteractionbetweenthetwostem-loopsinsidethepseudoknotstructurewassufficientforIFNinduction,sincedisruptionofthepseudoknotinteractionpowerfullydampenedtheIFNinduction.TheresultsofRNA-pulldownindicatedthatRIG-Iregulationdomain(RD)andTLR3ectodomain(ECD)boundtothepseudoknot.Furthermore,transfectionofthe3’UTRpseudoknottranscriptsinPAMsinhibitedPRRSVreplicationinvitro.ThesequencealignmentandRNAsecondarystructurepredictionrevealedthatthepseudoknotsequenceswereconservedindifferentarteriviruses.Importantly,thepredictedsimilarstructuresofotherarterivirusmembersalsodisplayedstrongIFNinductionactivities.3.pRIG-I-RDproteinwassuccessfullyexpressedandpurified,anditsinteractionwiththePRRSV3’UTRpseudoknotRNAwasidentifiedbygelfiltrationchromatography.Moreover,Small-angleXrayscattering(SAXS)wasusedtoanalyzethestatusofthecomplexofpRIG-I-RDandPRRSV3’UTRpseudoknotinsolution,theresultsshowedthatthecomplexwaselongatedmacromoleculesandmayhavemultiplelobesandatleasttwolargecenters.SincethePRRSV3’UTRpseudoknotRNAwascappedonthe5’end,therecognitionmechanismisdifferentfromthepreviouslyreportedrecognitionmechanism.Thisstudyprovidesnovelinsightsintoinnateimmunerecognitionduringvirusinfection.Together,inthisworkweidentifiedaninnaterecognitionmechanismbywhichPRRSV3’UTRpseudoknotregionservedasPAMPsofarterivirusesandactivatedinnateimmunesignalingtoproduceIFNsthatinhibitvirusreplication.Combiningwithpreviousresearch,weproposedamodelonthebalancebetweentheIFNstimulatoryeffectof3’UTRpseudoknotstructureandtheIFNinhibitoryeffectbytheviralproteins.Attheearlyendosome,followingthevirusuncoatinganddisassemblythevirusgenomeisexposedtocytoplasm.ThegenomicRNAservesasthemRNAforimmediatetranslationofthelargereplicasepolyproteins,pp1aandpp1ab.Aftercleavage,theseproteinsassembleintoareplicationandtranscriptioncomplex(RTC).TheRTCimmediatelybinds3’UTRtoinitiateminus-strandRNAsynthesis.Duringinfection,thepseudoknotofthegenomeisrecognizedbyRNAsensorsRIG-IthroughitsRDdomainandTLR3throughitsECDdomainresultinginIFNregulatoryfactor3(IRF3) ornuclearfactor-κB(NF-κB)activationandtriggeringIFNgenesexpression.TheIFNsactivateISGF3rapidlyinducingISGproductsthroughtheJAK/STATpathwaytorestrictinfection.Thegeneratedviralproteinssuchasnonstructuralproteins1/2/4/11(NSP1/2/4/11)andNproteininterferethehostantiviralresponsebytargetingsignalingpathways,suchasIRF3orNF-κB.Duringthisprocess,theconformationalchangeofthe3’endwhichactsasamolecularswitchtoregulatethetimingofviralsynthesismightaffectvirusrecognitionandsubsequentIFNresponse.Alltheseresultsprovidenovelinsightsintoinnateimmunerecognitionduringvirusinfection.KEYWORDS:pseudoknot,PRRSV,PRRs,PAMPandIFN 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1猪繁殖与呼吸综合征病毒概述..................................................................................11.1.1PRRSV分子病原学特征......................................................................................11.1.2PRRSV基因组结构及其复制过程......................................................................11.1.3PRRSV编码的蛋白..............................................................................................51.1.4PRRSV的预防和控制..........................................................................................71.2宿主模式识别受体和病原相关分子模式概述.........................................................81.2.1核酸识别概述.......................................................................................................81.2.2宿主模式识别受体及其信号通路.......................................................................91.2.3病原相关分子模式.............................................................................................121.3PRRSV感染与宿主免疫应答..................................................................................161.3.1PRRSV诱导的适应性免疫特征........................................................................161.3.2PRRSV诱导的固有免疫特征............................................................................171.4本研究的目的与意义...............................................................................................19第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析.............................................212.1引言...........................................................................................................................212.2实验材料...................................................................................................................212.2.1细胞和病毒.........................................................................................................212.2.2试剂及耗材.........................................................................................................212.2.3主要仪器设备.....................................................................................................212.3实验方法...................................................................................................................222.3.1PAM的分离与培养............................................................................................222.3.2RIP-seq样品制备................................................................................................232.3.3二代测序文库构建及上机测序.........................................................................242.3.4生物信息学分析.................................................................................................252.4实验结果与分析.......................................................................................................272.4.1RIP测序RNA样品制备及质量检测结果........................................................272.4.2二代测序文库构建及上机测序.........................................................................292.4.3生物信息学分析.................................................................................................302.5讨论...........................................................................................................................382.6小结...........................................................................................................................39 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答..............................................................................................................................................403.1引言...........................................................................................................................403.2实验材料...................................................................................................................403.2.1细胞和病毒.........................................................................................................403.2.2试剂及耗材.........................................................................................................413.2.3主要仪器设备.....................................................................................................413.3实验方法...................................................................................................................413.3.1PAM的分离与培养............................................................................................413.3.2双荧光素酶报告实验检测病毒感染细胞中IFN-β启动子活性.....................413.3.3细胞样品RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR检测.........................423.3.4细胞上清中PRRSV的滴度测定.......................................................................443.3.5siRNA介导的基因沉默实验.............................................................................443.3.6WesternBlot检测蛋白表达水平.......................................................................453.3.7RNA制备及转染................................................................................................473.3.8RNA二级结构预测............................................................................................533.3.9真核表达载体构建.............................................................................................543.3.10RNA-pulldown实验..........................................................................................563.3.11统计学分析........................................................................................................583.4实验结果与分析.......................................................................................................583.4.1PRRSV感染诱导抗病毒免疫应答....................................................................583.4.2PRRSV诱导IFN与RIG-I、MDA5和TLR3相关.........................................613.4.3PRRSV基因组5’UTR和3’UTR能诱导IFN产生.......................................633.4.4PRRSV基因组3’UTR假结结构是诱导IFN的关键.....................................663.4.5PRRSV基因组3’UTR假结之间的相互作用是诱导IFN产生的关键.........683.4.6PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN与RIG-I和TLR3相关..............713.4.7PRRSV基因组3’UTR假结结构与RIG-I和TLR3相互作用......................723.4.8PRRSV基因组3’UTR假结结构能特异性抑制PRRSV感染.......................743.4.9病毒基因组3’UTR假结结构诱导IFN在动脉炎病毒科保守......................773.5讨论...........................................................................................................................793.6小结...........................................................................................................................81第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究................................824.1引言...........................................................................................................................824.2实验材料...................................................................................................................824.2.1试剂及耗材.........................................................................................................82 4.2.2主要仪器设备.....................................................................................................824.3实验方法...................................................................................................................824.3.1pRIG-I-RD表达载体的构建..............................................................................834.3.2pRIG-I-RD蛋白表达..........................................................................................834.3.3pRIG-I-RD蛋白纯化..........................................................................................844.3.4体外转录制备PRRSV3’UTR假结结构RNA...............................................864.3.5凝胶过滤层析分析PRRSV3’UTR假结结构与pRIG-I-RD结合................864.3.6pRIG-I-RD结晶条件的筛选与优化..................................................................864.3.7SAXS数据收集与解析......................................................................................874.4实验结果与分析.......................................................................................................874.4.1pRIG-I-RD蛋白表达纯化..................................................................................884.4.2凝胶过滤层析分析RNA与pRIG-I-RD结合..................................................894.4.3pRIG-I-RD与pRIG-I-RD-RNA复合物结晶条件的筛选与优化....................904.4.4pRIG-I-RD-RNA小角散射数据收集及结构分析............................................914.5讨论...........................................................................................................................934.6小结...........................................................................................................................94全文总结..................................................................................................................................95参考文献..................................................................................................................................97创新点................................................................................................................................108缩略语及中英文对照............................................................................................................109致谢................................................................................................................................111作者简介................................................................................................................................113 第一章文献综述1第一章文献综述1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒概述PRRS作为一种猪病毒性传染病，在1987年于美国部分区域首次出现并报道，两年后欧洲地区也迅速爆发此病，随后在全世界的猪场形成广泛流行传播趋势，造成了巨大的经济损失。引发PRRS的病原为PRRSV，该病典型的临床症状为妊娠母猪严重繁殖障碍，仔猪呼吸功能受损等。荷兰科学家在PRRS爆发后于1991年成功分离到PRRSV欧洲型毒株，即Lelystadvirus，不久后美国学者分离到了在美国流行的美洲型毒株即VR2332(Collinsetal.1992)。PRRS在我国的流行开始于1995年底，第二年郭宝清分离到PRRSV，并确定其属于美洲型毒株(Zhouetal.2010)。2006年，在我国爆发了“猪无名高热”，其临床症状主要为持续高热，且迅速死亡，传染性非常强，发病率接近100%，该病病原为HP-PRRSV，是一种变异的PRRSV毒株(Tianetal.2007)。对于PRRS的防控与净化是世界养猪行业的重要课题，防治PRRS任重而道远。1.1.1PRRSV分子病原学特征PRRSV作为单股正链RNA病毒属于套式病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒属（Arteriviridaefamily）中的动脉炎病毒科（Arterivirus）。根据基因组序列分析及其血清学特征，目前将PRRSV毒株主要分为两种基因型，即Ⅰ型（欧洲型）和Ⅱ型（美洲型）(Mengetal.1995)。两种基因型的毒株所引发的PRRS临床症状相近，但其基因组序列相似度仅50-60%(Nelsenetal.1999)。PRRSV其遗传物质RNA不分节段，在电镜下PRRSV颗粒呈现直径约为40-65nm的卵圆或光滑球形，内部含有核衣壳。病毒颗粒表面虽有个别突起但大多数平滑如图1-1(Dokland2010;Spilmanetal.2009)。PRRSV颗粒在外界环境中不稳定，如温度升高到56℃约45分钟可完全失活；当pH值小于6.5或者大于7.5时，PRRSV亦可迅速失活。1.1.2PRRSV基因组结构及其复制过程PRRSV基因组5’端含有甲基化帽子结构（5’cap），其3’端存在多聚腺苷酸（poly(A)）尾巴结构，全长15.4Kb。如图1-2所示，在基因组末端为5’UTR和3’UTR，中间为病毒的编码区编码结构蛋白以及非结构蛋白，目前发现至少11个开放阅读框（OpenReadingFrame,ORF）即ORF1a/1a-(TF)/1b/2a/2b/3/4/5a/5/6/7。其中基因组5’端包含最大的开放阅读框即ORF1a/1b占整个基因组3/4，主要编码两个大的复制聚合酶蛋白前体，即pp1a和pp1ab。其中pp1ab是由ORF1a和ORF1b交叉区域的-1型核糖体移码框信号介导的(Snijderetal.1998)，如图1-2所示，目前，一个-2型核糖体移码框信号介导的ORF1a’-(TF)的翻译被发现，其编码蛋白为覆盖NSP2并延伸到-2型核糖体移码框信号位置的蛋白（NSP2TF）(Lietal.2014a)。 2猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图1-1PRRSV颗粒在电子显微镜下的形态（引自(Doklandetal.,2010)）Fig.1-1ElectronmicroscopydescriptionofPRRSVvirions(citedfrom(Doklandetal.,2010))如图1-2所示，在PRRSV复制和翻译过程中，由ORF2-7基因组序列产生6个亚基因组RNA，所有的亚基因组RNA含有共同的3’UTR区域，同时其5’端含有共同的前导序列来源于PRRSV基因组的5’UTR部分区域，且该区域含有重要的转录调控序列，这些具有共同5’端和3’端的亚基因组RNA是由病毒的非连续型复制方式产生的(Sawickietal.2007)，其编码PRRSV的结构蛋白GP2/3/4/5、M蛋白和N蛋白。在合成亚基因组RNA的过程中首先要以PRRSV基因组为模板合成负链亚基因组RNA（minussubgenomicRNA，（-）sgRNA），在负链亚基因组RNA的3’末端区域含有一个与正链基因组RNA上的TRS互补的反向前导序列，在产生亚基因组过程中，此序列在延伸过程中非连续移动与正链基因组的TRS序列互补，从而形成不同的负链亚基因组RNA(Snijderetal.2013)。PRRSV基因组RNA3’UTR末端发卡结构是病毒RNA合成所必需的，并且两个发卡结构的环状区域相互作用形成假结结构(Beerensetal.2007b)，此假结结构在动脉炎病毒科病毒中非常保守，作为分子开关调节负链RNA合成。此外，PRRSV3’UTR发卡结构的环状区域能与PRRSVN基因区域相互作用形成“吻环”（kissinginteraction），此结构是PRRSVRNA复制所必需的(Verheijeetal.2002)。PRRSV复制过程非常复杂，在PRRSV的生存周期中主要包括吸附，内吞，基因组释放，复制，组装和释放病毒粒子这些重要过程(Lunneyetal.2016)。PRRSV颗粒吸附于易感细胞表面主要依赖于对细胞表面糖胺聚糖的结合，随后PRRSV迅速与唾液酸黏附素（CD169）结合从而依赖网格蛋白介导的内吞作用进入细胞(VanBreedametal.2010)。病毒进入细胞后首先与早期胞内体进行膜融合进入早期胞内体阶段，随后在清道夫受体（CD163）的介导下进行脱衣壳PRRSV基因组释放入细胞质中。PRRSV暴露于细胞质中其正链RNA即可翻译病毒的非结构蛋白，位于PRRSV基因组上游的开放阅读框ORF1a和ORF1b依赖于核糖体的-1型移码框信号转录翻译出pp1a和pp1ab两个 第一章文献综述3多聚复制聚合酶蛋白前体(Meulenbergetal.1993)。这两个多聚复制聚合酶蛋白前体会被特定的蛋白酶裂解从而产生至少14个具有不同结构和功能的NSPs。由ORF1a开放阅读框编码的非结构蛋白主要包括6个蛋白即NSP1α/1β/2/3/4/5，而由ORF1b开放阅读框编码的非结构蛋白主要包括4个蛋白即NSP9-12。将pp1a和pp1ab进行加工的蛋白酶主要位于NSP1α、NSP1β、NSP2和NSP4上(Deaetal.2000;Snijderetal.1998)。PRRSVRTC的形成依赖于这些非结构蛋白的正确翻译及组装，组装成功的RTC围绕在内质网附近，进一步进行基因组的复制和病毒颗粒的组装，包括亚基因组的合成及翻译，产生6条编码不同结构蛋白的亚基因组，在亚基因组的序列两端存在共同的非编码区5’和3’长度分别为190-220nt和150nt，其对亚基因组的翻译过程至关重要，亚基因组进一步合成病毒颗粒组装所需的结构蛋白(deVriesetal.1990;Kroeseetal.2008)。图1-2PRRSV基因组主要结构示意图（引自(Kappesetal.,2015)）Fig.1-2ThegenomeorganizationofPRRSV(citedfrom(Kappesetal.,2015))如图1-2所示，病毒亚基因组合成6条sgRNA分别翻译成8个组成PRRSV颗粒的结构蛋白，分别由ORF1b下游的ORF2a、ORF2b和ORF3-6所编码，作为核衣壳的组成成分N蛋白由ORF7所编码(Snijderetal.1999)。后期研究发现在开放阅读框ORF5中存在一个小的开放阅读框ORF5a，其编码的蛋白被命名为GP5a(Firthetal.2011;Johnsonetal.2011)。病毒进入细胞后从早期胞内体阶段进入晚期胞内体阶段，在早期胞内体阶段病毒基因组释放入细胞质中进行病毒基因组的复制及病毒颗粒的组装，作为紧密包裹PRRSV遗传物质的N蛋白其与PRRSV基因组RNA结合后形成核衣壳，此核衣壳复合物形成后于内质网或高尔基体进行加工形成出芽小泡与由亚基因组指导合成的结构蛋白进一步组装从而形成完整的病毒颗粒(Tijmsetal.2002;Zevenhoven-Dobbeetal.2004)。如图1-3所示，组装好的病毒颗粒主要分布在内质网和高尔基体附近膜腔中，利用宿主的胞吐作用病毒颗粒随之释放于细胞外从而继续传播(Deaetal.1995)。 4猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图1-3PRRSV生命周期（引自(Lunneyetal.,2016)）Fig.1-3ThelifecycleofPRRSV(citedfrom(Lunneyetal.,2016)) 第一章文献综述51.1.3PRRSV编码的蛋白1.1.3.1PRRSV编码的非结构蛋白（NSP）PRRSV进入细胞后首先合成ORF1a/1b编码的非结构蛋白，其对于PRRSV复制蛋白酶复合体的形成以及翻译后加工有重要作用，复制蛋白酶体复合物加工过程包含一个复杂的蛋白水解级联反应，是由PRRSVORF1a所编码的的蛋白酶介导的。在复制聚合酶蛋白前体pp1a和pp1ab切割期间或之后，PRRSV的非结构蛋白组装成一个膜相关酶复合体从而调控病毒复制及转录，据推测ORF1a编码三种跨膜蛋白（nsp2、nsp3和nsp5），将病毒RNA合成过程锚定到修饰过细胞内膜上，从而使PRRSV复制及转录过程顺利进行(Snijderetal.2013)。PRRSVNSP1α/β是PRRSV非结构蛋白中由ORF1a编码NSP1裂解的两个蛋白酶NSP1α、NSP1β，已被鉴定具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性，同时含有锌指结构域（zincfinger,ZF）。NSP1由于自身的酶活性可以介导多聚蛋白的切割，同时NSP1α可以进入细胞核影响宿主细胞转录和翻译(Kroeseetal.2008)。最近研究表明PRRSVNSP1α/β通过不同途径都具有拮抗宿主天然免疫的功能(Wangetal.2013)。PRRSVNSP2也是由ORF1a编码，其功能非常重要，在PRRSV的高致病性毒株与低致病性毒株进行比较发现其NSP2蛋白处有30个氨基酸缺失，是PRRSV区分强弱毒株的重要指标，同时其本身具有半胱氨酸蛋白酶结构域，NSP2利用其自身酶活性将其与NSP3进行切割，并且NSP2对于宿主细胞蛋白例如ISG15有去除泛素化的作用，从而逃逸宿主免疫应答(vanKasterenetal.2012)。PRRSV基因组NSP2区域依赖于-2型核糖体移码框信号编码NSP2TF及NSP2蛋白(Lietal.2014a)。研究表明，其抗原表面有B细胞表位，能被宿主细胞识别启动宿主抗病毒免疫(Lietal.2010)。PRRSVNSP4是重要的非结构蛋白，其3C样蛋白酶活性对于病毒整个基因组非结构蛋白的剪切至关重要，研究表明其可以切割NSP1α/β使这两个木瓜蛋白酶释放，NSP1β/2/3之间的切割也依赖于NSP4进行加工(Ziebuhretal.2000)。同时，利用结构生物学方法成功解析的NSP4结构证实其C端含有特异的α/β延伸可能与其参与蛋白的修饰加工有关，NSP4结构含有一个糜样蛋白酶又名胰凝乳蛋白酶三联体结构（S-H-D）是3C样丝氨酸蛋白酶典型特征(Tianetal.2009)。PRRSVNSP5-6、NSP7α/β和NSP8功能目前还不清楚，有待进一步研究。根据前期研究结果分析NSP5-6是转膜蛋白，在病毒膜蛋白修饰中可能有重要作用。NSP7α/β功能不确定，但是其在PRRSV进化中非常保守，可用于PRRSV检测，同时目前利用核磁共振方法成功解析了NSP7α的结构，并证明其与NSP9存在相互作用，因此NSP7α/β有可能参与到PRRSV的复制和转录过程中(Chenetal.2017)。PRRSVNSP9在动脉炎病毒科病毒的复制和转录过程中至关重要，其具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RNAdependentRNApolymerase,RdRp)，对马动脉炎病毒（equine 6猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究arteritisvirus，EAV）的RdRp进行功能分析发现其依赖于RNA模板可以准确合成病毒复制转录所需的基因组及亚基因组RNA(Beerensetal.2007a;Fangetal.2010)。PRRSVNSP10已被鉴定的功能是解旋酶活性，NSP10在基因组复制和亚基因组RNA合成中起到重要作用。同时研究表明其N端存在锌指结构域，该结构域具有ATP酶活性，可以与病毒的RNA结合并解旋病毒RNA双链结构，从而继续合成下游RNA。Li等报道，NSP9/10影响PRRSV的毒力(Lietal.2014b)。PRRSVNSP11在套式病毒目中非常保守且功能类似，其主要具有内切核糖核酸酶（NendoU）活性，其对病毒RNA的切割具有尿嘧啶核糖核苷酸特异性(Fangetal.2010)。同时，有研究报道NSP11通过抑制NF-κB和IRF3启动子从而拮抗干扰素(Sunetal.2014)。PRRSVNSP12目前被证明不含有甲基化修饰酶功能，但其可能与非结构蛋白NSP11存在相互作用从而对病毒基因组进行修饰(Lehmannetal.2015)。1.1.3.2PRRSV编码的结构蛋白（SP）PRRSV编码的结构蛋白主要有GP2a/2b/3/4/5/5a、M蛋白和N蛋白。这些结构蛋白的合成都依赖于病毒的6条亚基因组RNA。如图1-4所示，其中小糖蛋白GP2a、GP3和GP4由PRRSVORF2-3编码，非糖蛋白离子通道蛋白即E蛋白由ORF2b所编码，E蛋白可以使病毒进行脱衣壳从而更容易侵染细胞，其在胞内体上使病毒与胞内体进行膜融合，产生离子通道，从而使病毒内的pH值降低，启动低pH依赖的膜融合(Leeetal.2006;Wuetal.2001)。PRRSVGP5是病毒主要的糖蛋白，其可以和M蛋白形成二聚体，对于病毒侵染非常重要(Snijderetal.2003)，目前新发现了GP5a蛋白，其功能有待探索(Firthetal.2011)。作为重要的结构蛋白N蛋白，其与病毒核酸结合形成核衣壳保护病毒的基因组，同时其可以进入细胞核与核内转录因子相互作用从而发挥抑制天然免疫的作用(Sagongetal.2011)。 第一章文献综述7图1-4PRRSV膜蛋白相互作用（引自(Daseta1．，2010)）Fig.1-4ThePRRSVenvelopeproteincomplexofPRRSV(citedfrom(Daseta1．，2010))关于病毒颗粒的组装，目前认为最主要的蛋白是GP5、M和N蛋白，这三个蛋白协同作用从而使病毒正确组装。有研究报道GP2a/3/4和E蛋白是病毒感染相关蛋白，虽然其不是病毒形成的重要蛋白，但是也会参与病毒组装，这四个蛋白在病毒组装中形成一个复合物，表达在病毒表面，缺一不可。另外这个多元复合物中糖蛋白GP2a和GP4可以与病毒受体CD163相互作用，对于病毒入侵至关重要(Dasetal.2010)。作为病毒重要的表面膜蛋白，GP5和M蛋白作为外源物质对于宿主免疫反应有强烈的刺激作用，因此可以用于亚单位疫苗的开发(Pirzadehetal.1998)。同时，研究发现GP3、GP4分别与GP5进行串联表达后，其对于宿主细胞的免疫刺激效应显著增强，GP3、GP4虽然是小的糖基化蛋白但是其可以与GP5协同作用从而增强机体的抗病毒免疫应答(Jiangetal.2008)。1.1.4PRRSV的预防和控制PRRSV在临床上引起严重的经济损失，因此自此病出现以来，关于PRRSV疫苗的探索就没有停止过，常规的疫苗类型分为将PRRSV灭活的灭活疫苗和将PRRSV致弱的弱毒疫苗，临床试验表明PRRSV灭活疫苗对动物并不能起到很好的保护作用，因此目前规模化猪场使用的主要为弱毒疫苗。在早期疫苗研究中，由于同属动脉炎病毒的EAV与乳酸脱氨酶增高病毒（lactatedehydrogenase-elevatingvirus,LDV）其灭活疫苗可以产生中和抗体，对动物有较好的保护作用，因此科学家首先尝试研制PRRSV灭活疫 8猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究苗(Chenetal.1999;Hammondetal.1997)。同时对感染猪血清学分析及PRRSV含量分析发现中和抗体可以清除病毒(Labarqueetal.2003)，然而商品化灭活疫苗在临床使用未能检测到高水平的中和抗体产生，究其原因可能是PRRSV诱导产生的中和抗体可能造成抗体依赖性增强作用及IFN-γ的延迟反应所致(Pirasetal.2005)。灭活疫苗与弱毒疫苗相比有明显安全优势，然而其对于PRRSV保护效果不好，因此需要开发特异性激活机体抗病毒免疫反应的新型疫苗。PRRSV弱毒苗在临床使用中能够更有效的防控PRRSV感染，当PRRSV感染猪时能有效激活机体细胞和体液免疫反应，使猪临床症状减轻，其体内病毒含量显著下降同时各脏器损伤减轻。然而弱毒苗最大的问题是它的安全性，大规模免疫弱毒苗容易在体内与野毒进行重组，从而促进病毒的变异，加大防控难度，因此在使用弱毒苗时要按正规操作，防止散毒。PRRSV感染后传播速度非常快，整群动物有可能都被传染，且目前没有良好的药物对其进行治疗，会造成重大的经济损失，同时PRRSV很难清除，因此难以防控。在PRRSV防控过程中，最重要的是对猪场环境进行控制，阻断病毒的传播途径，同时做好定期消毒免疫工作。猪场在引进种猪的时候，要进行严格的检疫，防止其携带PRRSV。一旦有猪感染PRRSV，应对发病猪进行处理并隔离易感动物，同时对环境进行彻底消毒。在防控PRRSV过程中，疫苗扮演着重要角色，虽然临床上灭活苗的效果不理想但是对猪群进行PRRSV免疫对于防控PRRS仍然很重要。合理的免疫程序对于防控PRRS很重要，因此需要对猪场兽医进行标准培训，同时制定严格有效的免疫程序。1.2宿主模式识别受体和病原相关分子模式概述宿主天然免疫系统的抗病毒免疫应答，依赖于一系列模式识别受体对外来病原相关分子模式的识别，其中包括一些专门识别核酸的受体对病毒核酸的特异性识别。在脊椎动物中，对外源核酸的有效识别对于宿主启动抗病毒免疫应答非常重要，当模式识别受体受到刺激后诱发抗病毒免疫应答，包括产生大量Ⅰ型IFN和ISGs，进而编码一些具有自限性抗病毒效应的分子，从而有效地抵御病毒入侵。1.2.1核酸识别概述对于外源核酸的识别，脊椎动物和非脊椎动物机制差别很大。大多数非脊椎动物，例如昆虫、植物和线虫，主要依赖RNA干扰（RNAi）来抵御外源病原入侵，在脊椎动物中，有研究表明在某些细胞类型中宿主可以通过RNAi降解病毒的基因组(Svoboda2014)，然而一些报道显示在脊椎动物中小RNA介导的RNAi和Ⅰ型干扰素控制的抗病毒免疫之间是竞争关系不是协同关系(Seoetal.2013)，因此RNAi在脊椎动物抗病毒免疫中似乎并未起到重要作用，而Ⅰ型干扰素控制的抗病毒免疫对于脊椎动物抵御病毒起到关键作用。在脊椎动物Ⅰ型干扰素控制的抗病毒免疫中，宿主识别自己和非己基于三种重要原则：首先是核酸配体的有效性，基于它的局部浓度，被内源性核酸酶降解比例以 第一章文献综述9及自身逃逸的程度。然后是核酸配体所在的位置，例如在细胞膜外，溶酶体区或者在细胞浆内。最后是核酸配体的结构，例如序列、构象或者化学修饰（图1-5）。在脊椎动物中，很多情况下，这三种原则的组合促成了宿主对外源核酸的有效识别，从而激活模式识别受体通过下游信号级联反应产生Ⅰ型干扰素以及ISGs，引发天然免疫应答有效抵御病毒入侵。图1-5识别非己核酸的基本原则（引自(SchleeandHartmann,2016)）Fig.1-5Therecognizedprinciplesofselfversusnon-selfnucleicacids(citedfrom(SchleeandHartmann,2016))1.2.2宿主模式识别受体及其信号通路宿主核酸识别受体分为两种类型，一种类型是具有直接抗病毒作用的核酸识别受体，这一类受体需要Ⅰ型干扰素或模式识别受体信号将其激活，例如双链RNA激活的蛋白激酶R（PKR又名eIF2AK2）和作用于RNA1的腺苷脱氨酶（ADAR1）。此类核酸识别受体识别外源核酸的生物化学特性，它们的主要功能不是通过诱导转录因子和细胞因子触发天然免疫应答，而是直接作用在病毒RNA上（例如抑制翻译或对其进行化学修饰或降解它们的靶标RNA）。另一种类型是模式识别受体，包括位于胞内体上的Toll样受体（Tolllikereceptors，TLR）家族以及位于细胞质内的RIG-I样受体（RIG-I-likereceptors，RLR）家族和NOD样受体（NOD-likereceptors,NLRs）家族。其中RNA识别受体包括TLR家族的TLR3/7/8；RLR家族的RIG-I又名DDX58和MDA5又名IFIH1；NLR家族。DNA识别受体，例如非黑色素瘤2（AIM2）和环磷鸟苷腺苷合成酶（cGAS）。这些模式识别受体直接或间接的激活转录因子，包括NF-κB和IRF3从而上调抗病毒效应蛋白、趋化因子和细胞因子，因此模式识别受体介导的抗病毒免疫应答是由IFN和ISGs控制的。近期研究表明，这两种类型的核酸识别受体存在交叉，例如，RIG-I可以作为一个效应分子直接作用于病毒RNA(Satoetal.2015;Weberetal.2015)，PKR的翻译抑制效应据报道可以抑制NF‑κB信号(McAllisteretal.2012)，经第二类核酸受体修饰或剪切的RNA可以破坏或生成被PRRs识别的特定RNA结构。两种类型的核酸识别受 10猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究体相互作用从而有效抵御病毒入侵，在此过程中模式识别受体起关键性作用，RNA识别受体和DNA识别受体分别识别不同的PAMPs从而抵御外源病原的入侵。1.2.2.1RNA识别受体之前研究表明，跨膜的TLRs例如TLR3、TLR7和TLR8是在胞内体上识别RNA的(Alexopoulouetal.2001;Dieboldetal.2004;Heiletal.2004;Hornungetal.2005)，然而TLR3也可以在一些细胞表面识别RNA，如纤维母细胞和肿瘤细胞系(Matsumotoetal.2003)（图1-6）。在细胞浆内，RLRs家族的RNA解旋酶RIG-I和MDA5含有细胞凋亡酶招募结构域（CARD）(Yoneyamaetal.2004)，当RIG-I和MDA5识别RNA后通过线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS又名CARDIF、IPS1和VISA）和IRF3诱发Ⅰ型干扰素产生(Wuetal.2014)，同时RIG-I具有信号功能可以作为直接的抗病毒蛋白结合病毒的基因组RNA干扰病毒聚合酶功能(Satoetal.2015;Weberetal.2015)。除了干扰素的产生，RIG-I激活的MAVS可以通过某些途径诱导细胞凋亡，例如招募和激活细胞凋亡酶8（casepase8）(ElMaadidietal.2014)；依赖IRF3–IRF7的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）上调和细胞凋亡前体蛋白p53上调介导的细胞凋亡（PUMA又名BBC3）和NOXA(又名PMAIP1)；通过下调抗凋亡基因BCL2、BIRC3和PRKCE；通过直接激活前凋亡基因BCL‑2相关X蛋白（BAX）(Beschetal.2009;Glasetal.2013;Kumaretal.2015)。更重要的是，MAVS会涉及到激活NOD-、LRR-和NLRP3炎症小体，因此会促进诱发白介素1β（IL‑1β）依赖的炎症因子应答(Franchietal.2014;Parketal.2013;Poecketal.2010;Pothlichetetal.2013;Subramanianetal.2013)。另一个胞浆RIG-I家族解旋酶是LGP2又名DHX58，它缺少CARD结构域并通过抑制RIG-I和促进MDA5对免疫应答进行微调(Ahmadetal.2015;Schlee2013b)，尽管LGP2可以识别RNA，但是与之相关的功能还有待研究。目前在RNA病毒感染过程中，TLRs、RIG-I和MDA5所识别的RNA不同，然而最终都会产生干扰素及其它细胞因子从而起到抗病毒作用。 第一章文献综述11图1-6RNA识别受体（引自((BowieandUnterholzner,2008)）Fig.1-6RNAreceptor(citedfrom(BowieandUnterholzner,2008))1.2.2.2DNA识别受体TLR9对于识别胞内溶酶体区的DNA起到重要作用并且可以引发浆细胞样树突状细胞诱导Ⅰ型干扰素(Hemmietal.2000)，促进髓样分化因子（MYD88）激活B细胞分裂且与IRF7信号通路相关。与胞内溶酶体区的DNA不同，通常出现在细胞质中的DNA预示着非己或“危险”DNA，DNA识别受体会对其进行识别激活抗病毒免疫反应。通过研究DNA识别受体及机制表明其可以促进炎症反应并且诱导Ⅰ型干扰素产生（图1-7）。目前，cGAS是最被广泛接受的DNA受体，然而其它成员在特定的组织中会对cGAS信号通路产生影响。目前广泛接受的观点是干扰素基因线粒体接头蛋白刺激因子（STING又名MITA，ERIS和MPYS）是DNA识别受体的下游分子并且对于IRF3依赖的信号激活起到重要作用（图1-7）(Ishikawaetal.2009;Zhongetal.2008)。结构生物学分析和体外的激活实验表明双链DNA可以直接激活cGAS的酶活性(Civriletal.2013;Gaoetal.2013a;Katoetal.2013;Kranzuschetal.2013;Lietal.2013;Zhangetal.2014)，在体内，DNA识别受体cGAS对于识别双链DNA基因组病毒例如单纯疱疹病毒（HSV）、痘病毒、逆转录病毒和腺病毒起到关键作用。 12猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图1-7DNA识别受体（引自(SchleeandHartmann,2016)）Fig.1-7DNAreceptor(citedfrom(SchleeandHartmann,2016))1.2.3病原相关分子模式1.2.3.1RNA相关PAMPs与RNA识别相关的基序通常具有一些相似的特征比如二级结构、RNA修饰或者RNA序列。值得注意的是，同样的结构或者修饰特征通常可以被进化上不相关的受体识别，暗示了模式识别受体的趋于一致性的进化。（1）RNA二级结构特征在细胞质内一些长的双链RNA通常是DNA或者RNA病毒复制的标志，它并不存在于未感染的宿主细胞中(Weberetal.2006)。聚肌胞苷酸（poly(I:C)）与双链RNA类似可以结合并激活RNA识别受体PKR、OAS1、TLR3、MDA5和RIG-I，因此poly(I:C)和它的衍生物通常被用作工具来鉴定和分析双链RNA的识别特征(Alexopoulouetal.2001;Gitlinetal.2006;Goubauetal.2014;Katoetal.2008;Katoetal.2006b)。TLR3介导的NF-κB激活需要35-39bp的双链RNA(Leonardetal.2008)，但是鼠源的TLR3可以识别更小的双链RNA，包括不能被人源的TLR3识别的siRNAs(Kleinmanetal.2012;Weberetal.2012)，因此用鼠源模型进行基于siRNA治疗方法的评估是存在问题的。同时，长的双链或单链RNA片段含有凸起茎环结构都可能作为配体被TLR3识别(Tatematsuetal.2013)。细胞质内的解旋酶MDA5可以被长的双链RNA激活（>300bp）例如poly(I:C)，但是对于其所能识别的最小双链RNA片段目前尚未研究清楚(Gitlinetal.2006;Katoet 第一章文献综述13al.2008;Katoetal.2006b)。目前MDA5所识别的双链RNA模型基本是MDA5用长的双链RNA作为信号平台再招募MDA5分子呈头尾相对排列从而暴露出招募结构域，暴露的招募结构域再募集和激活下游的接头分子MAVS(Wuetal.2013)。最近研究表明，ADAR1的RNA修饰活性（A到I的转换）对于抑制MDA5识别内源性双链RNA至关重要(Liddicoatetal.2015;Pestaletal.2015)。考虑到目前ADAR1修饰的内源性双链RNA长度还未确定，暗示MDA5除了识别长的双链RNA外，也识别其它类型的配体。一些研究表明，MDA5的激活与病毒复制过程中RNA构象改变存在相关性，在单股负链RNA病毒感染过程中尽管没有长的双链RNA存在，MDA5对于其识别同样起到重要作用(Schlee2013a)。研究发现MDA5可以结合副黏病毒的mRNA并被激活，其V蛋白结合并抑制MDA5而不是RIG-I(Childsetal.2007)。此外，对体内发卡RNA分析表明MDA5在流感病毒天然免疫中发挥重要作用(Benitezetal.2015)。这些结果表明，单股负链RNA病毒，虽然不能产生双链RNA，但是仍然可以被MDA5识别并且还可以有效地干扰MDA5的功能，因此可以大致推断，MDA5不仅可以识别双链RNA，同时也能识别短的碱基配对的单链RNA二级结构。有研究报道，poly(I:C)小于300bp的短片段和大于200bp的双链RNA都可以激活RIG-I，采用不依赖于5’修饰的方式(Binderetal.2011;Katoetal.2008)，然而这些发现与RIG-I识别呼肠孤病毒基因组的长片段双链RNA依赖于5’端的双磷酸修饰研究是有冲突的(Goubauetal.2014)，因此RIG-I具体识别机制还有待进一步研究。（2）外源RNA的序列依赖性特征一些RNA识别受体是有序列偏爱性的（图1-8）。研究表明，RIG-I和MDA5对于富含AU的长病毒转录片段具有特殊的偏爱性(Rungeetal.2014;Saitoetal.2008)。TLR7和TLR8更容易被多聚尿嘧啶（polyU）和富含鸟苷酸尿嘧啶（GU-rich）的序列激活(Heiletal.2004;Hornungetal.2005;Judgeetal.2005)。由于与脊椎动物相比病原微生物RNA中含有多聚尿嘧啶或富含鸟苷酸尿嘧啶的序列频率是比较低的，目前还未研究清楚这些基序是如何被区分为己和非己的。（3）外源RNA的5’端修饰特征RIG-I可以识别病毒5’端三个磷酸基团的钝性末端双链RNA(Fazelietal.2006;Hornungetal.2006;Schleeetal.2009;Velaetal.2012)（图1-8）。目前采用化学合成或转录酶合成高度纯化的5’端三个磷酸基团的双链RNA对RIG-I识别的最小片段进行研究，表明其识别的最小双链RNA长度18-19bp(Marqetal.2010;Schleeetal.2009)，结构生物学分析证实了RIG-I可以识别5’三个磷酸基团RNA(Civriletal.2011;Jiangetal.2011;Kowalinskietal.2011;Luoetal.2011;Wangetal.2010)。但是，另一项研究表明，更短片段10bp长度的5’三磷酸基团RNA形成一个发卡结构RNA同样可以被RIG-I识别(Kohlwayetal.2013)，但是，此类RNA可以形成异源双链聚体从而形成最小长度18-19bp（图1-8）。 14猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图1-8RNA识别配体（引自(SchleeandHartmann,2016)）Fig.1-8RNAligand(citedfrom(SchleeandHartmann,2016))在细胞质内早期5’三磷酸RNA存在表明可能有病毒感染(Hornungetal.2006)或外源细菌入侵(Abdullahetal.2012;Hagmannetal.2013;Monroeetal.2009)。RNA聚合酶的生物合成是基于3’到5’方向，因此在5’端会存在一个游离的三磷酸，内源性的宿主RNA是在细胞核内合成的，并且要进行转录后加工例如碱基修饰、剪切和5’加帽，从而在RNA被转运出细胞核时去除了5’端的三磷酸基团。相反，在很多病毒复制过程中都会形成一个5’三磷酸基团的钝性末端双链RNA，导致被细胞质内的RNA识别受体所识别。然而一些单股负链RNA病毒例如流感病毒，将它的单链RNA结合到核蛋白上在基因组加工时形成一个钝性末端的柄状结构减少其双链RNA的暴露频率(Schlee2013a)，这种部分互补的末端序列是病毒基因组RNA末端的两个保守的单链RNA复制起始位点形成的，它们被相同的RNA聚合酶所支配，但是柄状结构仍然可以被RNA识别受体RIG-I识别(Liuetal.2015)。特定的负链RNA病毒例如仙台病毒和水泡性口炎病毒，它们的RNA是和核蛋白分开的，因此没有双链RNA中间体和柄状结构(Weberetal.2006)，然而，RIG-I仍然可以识别错误复制过程（缺陷干扰RNA基因组）产生的碱基互补配对的“流产RNA”(Strahleetal.2006)，除了5’三磷酸基团末端，RIG-I也识别5’双磷酸末端双链RNA，但比5’三磷酸基团末端亲和性略低，5’双磷酸末端是特定病毒例如呼吸道肠道病毒的特定 第一章文献综述15分子结构(Goubauetal.2014)。值得注意的是，去除poly（I:C）游离的5’双磷酸，反而更利于poly（I:C）被RIG-I的识别(Goubauetal.2014)，因此，poly（I:C）不是一个简单的双链RNA模拟物，还含有其它不含有5’双磷酸基序的成分。RIG-I能识别5’端三磷酸和双磷酸RNA的特点使得它与TLR3和MDA5相比可以识别更短片段的双链RNA分子(Hornungetal.2006;Schleeetal.2009)。1.2.3.2DNA相关PAMPs对cGAS-STING-IRF3信号通路和AIM2炎性信号通路进行功能性分析，发现其对于DNA的识别是长度依赖性而不是序列依赖性的(Ablasseretal.2009;Civriletal.2013;Gaoetal.2013b;Jinetal.2012;Kranzuschetal.2013)。对于cGAS-STING-IRF3信号通路，在鼠骨髓瘤细胞中最小的DNA识别长度是25bp，在人的骨髓瘤细胞中是40-60bp(Ablasseretal.2009;Herzneretal.2015;Unterholzneretal.2010)。然而，在小鼠巨噬细胞中AIM2不能被ISD序列（45mer双链DNA）激活并且在人骨髓瘤细胞中观察到的最短DNA长度是50-80bp(Hornungetal.2009;Jinetal.2012)。出乎意料的是，逆转录病毒的单链DNA茎环结构和逆转录病毒的元件例如来源于HIV的单链DNA反转录产物虽然长度小于40bp但是都有可能激活cGAS(Herzneretal.2015;Jakobsenetal.2013)。图1-9DNA识别配体（引自(SchleeandHartmann,2016)）Fig.1-9DNAligand(citedfrom(SchleeandHartmann,2016))TLR9在溶酶体区域倾向于识别未甲基化的CpG双核苷酸，与细菌DNA相比未甲基化的CpG双核苷酸在真核生物自身DNA中很少出现(Cochetal.2009;Hartmannetal. 16猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究2000;Hemmietal.2000;Kriegetal.1995)。TLR9和cGAS可以识别DNA-RNA杂交双链(Mankanetal.2014;Rigbyetal.2014)，但是具体的DNA-RNA识别的生物学特征还需要进一步研究（图1-9）。1.3PRRSV感染与宿主免疫应答病毒感染细胞后，宿主启动天然免疫及适应性免疫应答从而有效清除病毒。宿主的适应性免疫系统包括体液免疫和细胞免疫，通过产生抗体或效应T细胞来抑制病毒复制或扩散。同时，宿主的天然免疫作为第一道防线在抗病毒免疫中发挥不可或缺的作用，宿主的PRRs被激活产生一系列信号级联反应，从而抵御病毒入侵。之前研究表明，在病毒感染过程中，RLRs介导的信号通路通过细胞类型和ATP酶依赖的方式对病毒诱导的抗病毒免疫起关键作用。为了有效清除病毒，RLRs需要激活下游信号分子从而产生干扰素、调节T细胞活化、粒细胞分化、调节巨噬细胞吞噬作用以及细胞凋亡来保护宿主细胞不受病毒侵染。例如A型流感病毒（IAV）柄状结构（panhandlestructure）能直接激活RIG-I从而诱导IFN产生(Liuetal.2015)、乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）前基因组RNA的5’ε区域能与RIG-I直接相互作用被RIG-I特异性识别刺激宿主细胞产生Ⅲ型干扰素起到抗病毒作用(Satoetal.2015)、刚果出血热病毒（Crimean-Congohemorrhagicfevervirus，CCHFV）基因组RNA能被RIG-I识别激活天然免疫应答(Spengleretal.2015)以及丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）3’UTR区域多聚尿嘧啶基序能被RIG-I特异性识别产生IFN及ISGs从而抑制HCV复制(Saitoetal.2008)。TLRs作为Ⅰ型跨膜蛋白在天然免疫中发挥重要作用，TLR3能识别呼吸道肠道病毒来源的dsRNA激活NF-κB或IRF3诱导IFN从而起到抗病毒作用(Alexopoulouetal.2001)。1.3.1PRRSV诱导的适应性免疫特征PRRSV感染猪后，由于病毒表面位于GP5上具有中和活性的表位被遮盖，因此机体针对GP5产生中和抗体较晚，同时GP5“诱骗”抗原表位含甘露聚糖，对于诱导病毒中和抗体产生起到抑制作用，因此在PRRSV感染初期猪体内产生中和抗体水平很低，非常不利于对病毒的清除(Faabergetal.2006)。病毒感染细胞后宿主启动细胞免疫，经典途径是利用CD4或CD8细胞介导的T细胞免疫，机体一旦受到外源刺激，树突状细胞会对抗原进行加工和递呈，从而将信号传递给B细胞进而传递给T细胞，刺激产生记忆性T细胞。T细胞免疫对于宿主清除病原体至关重要，能否有效启动T细胞免疫对于机体具有重要意义。而PRRSV的典型临床症状为持续性感染，究其原因可能与其未能有效启动T细胞免疫相关，当PRRSV感染后，其外周血淋巴细胞中CD4阳性T细胞水平显著下降，直到2周后才能恢复(Shimizuetal.1996)，对于CD8阳性T细胞则在PRRSV感染一个月后才能检测到(Kawashimaetal.1999)。分析感染PRRSV的猪组织，其胸腺组织细胞中不仅能检测到CD4阳性T细 第一章文献综述17胞，同时也能检测到CD8阳性T细胞，而在重度感染的肺部几乎检不到特异性CD4阳性T细胞仅CD8阳性T细胞增殖(Gomez-Lagunaetal.2009)。对于猪感染PRRSV后T细胞免疫应答及巨噬细胞招募能力的评价主要是分析感染不同时间在宿主细胞体内的炎症因子反应主要检测IFN-γ的含量。此外，分析感染PRRSV的猪胸腺组织，发现其T细胞免疫反应呈现一过性，且其病毒特异性T细胞的丰度与组织中的病毒含量无关(Xiaoetal.2004)。研究报道，PRRSV引起的持续性感染并不是由于白介素10所介导的免疫抑制引起的，并且PRRSV并未引发强烈的IFN-γ免疫反应尤其是在未成年仔猪体内(Klingeetal.2009)。PRRSV诱导的免疫应答与PRRSV基因的变异性无关即与PRRSV毒株没有明显关联(Ferrarietal.2013)。此外，关于细胞毒性T细胞（CTL）对于PRRSV感染过程的影响，目前研究表明CTL可能与机体组织清除感染PRRSV的细胞有关，PRRSV感染猪2周后可以检测到CD3阳性CD8高表达的CTL增殖，然而直到49天仍没有发现具有活性的CTL存在(Costersetal.2009)。临床上感染PRRSV的病例中，急性病例CTL早期出现既没有加重病情也不影响接受治疗的猪清除病毒(Lohseetal.2004)。1.3.2PRRSV诱导的固有免疫特征在天然免疫系统中宿主PRRs对PAMPs的识别在宿主抗病毒免疫中至关重要，在此过程中产生的细胞因子例如干扰素，在抗病毒免疫中起到重要作用。目前对于PRRSV的PRRs研究还不是特别深入，有研究表明干扰素可以显著抑制PRRSV感染(Albinaetal.1998;Brockmeieretal.2009)。目前，有研究报道将TLR3的TIR结构域去掉或使用siRNA将TLR3沉默，都能促进PRRSV的感染，同时在Marc145细胞上过表达TLR3能显著抑制PRRSV的复制。在PRRSV感染早期，仔猪肺脏TLR3mRNA表达水平显著增高。在PAMs中，将TLR3沉默后IFN-βmRNA表达水平显著降低同时明显促进PRRSV感染，用dsRNA处理PAM激活TLR3增加IFN表达量也可以显著抑制PRRSV复制。因此可以推断TLR3在PRRSV感染中起到重要作用，PRRSV能被TLR3识别从而激活抗病毒信号，拮抗病毒感染(Sangetal.2008)。此外，有研究报道在未成熟的DC细胞中，PRRSV感染早期TLR3/7/8显著下调，感染24h后细胞内TLR3/7/8表达量回升，而之后TLR7的表达量又开始持续下降(Wangetal.2014)，因此TLR3/7/8在病毒感染过程中起到重要的调控作用。PRRSV感染后，在气管支气管淋巴结TLR3/4/7表达量显著上调(Migueletal.2010)，进一步证明TLRs信号通路在PRRSV抗病毒免疫中的重要作用。另有研究表明，PRRSV感染后能激活TLR4信号通路从而产生白介素1β等炎症因子形成炎症小体(Bietal.2014)，导致神经损伤等(Chenetal.2014)。PRRSV通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞后暴露基因组RNA从而激活RIG-I信号通路，但是目前PRRSV基因组RNA与RIG-I之间精确的作用机制还不清楚(Zhouetal.2012)。PRRSV感染后会长期存在难以清除，其逃逸宿主免疫应答机制非常复杂。PRRSV 18猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究通过抑制RIG-I信号通路从而抑制IFN-α/β的表达(Luoetal.2008)，已报道的拮抗宿主天然免疫的PRRSV蛋白有非结构蛋白NSP1-2、NSP4以及NSP11，结构蛋白有N蛋白，不同病毒蛋白抑制干扰素信号通路机制不同(Kimetal.2010)。PRRSV的非结构蛋白NSP11和NSP1β可以抑制IRF-3的启动子活性(Beuraetal.2010)，NSP1α可以影响转录因子NF-κB的核转位，NSP2能将干扰素诱导基因ISG15去泛素化，从而下调IFN的产生(Frias-Stahelietal.2007)。PRRSV对干扰素下游信号通路同样具有抑制作用，被IFN-α预处理的PRRSV感染的Marc145细胞，其JAK-STAT通路下游核转录因子ISGF3的入核受到抑制(Pateletal.2010)。PRRSV的非结构蛋白NSP11具有核糖核酸内切酶活性，有研究报道NSP11的核糖核酸内切酶活性抑制IFN-β启动子活性，同时NSP11可以抑制MAVS活性，阻碍信号转导，而MAVS不仅在干扰素产生中很重要其同样在细胞凋亡中扮演重要角色，因此PRRSV通过NSP11既可以拮抗干扰素又能影响细胞凋亡通路，从而逃逸宿主免疫应答(Leietal.2009;Wysockietal.2012)。PRRSV的N蛋白能使IκB降解，从而激活NF-κB调控基因转录表达，然而N蛋白对IκB降解具有剂量依赖性，且N蛋白的核定位信号（NLS）及N蛋白的同源二聚化都能调控NF-κB激活(Sagongetal.2011)（图1-10） 第一章文献综述19图1-10PRRSV与固有免疫（引自(Sunetal.2012)）Fig.1-10InterplaybetweenPRRSVandinnnateimmunity(citedfrom(Sunetal.,2012)1.4本研究的目的与意义PRRS作为一种重要的病毒性传染病，在全世界的猪场广泛流行，引起巨大的经济损失(Pejsaketal.1997)。然而对于PRRS的防控与净化目前还没有较好的方法，因此需要进一步研究PRRSV免疫机制从而对其有效防治。之前研究表明，无论是在体内还是体外，IFN对PRRSV有显著抑制作用(Albinaetal.1998;Brockmeieretal.2009)，且不同毒株产生的IFN不同(Leeetal.2004)，因此，研究PRRSV感染过程中天然免疫应答尤其是IFN产生机制非常重要，本研究针对PRRSV感染后，机体产生IFN的机制进行了深入探讨。病毒感染过程中，宿主PRRs会迅速识别PAMPs从而激活下游信号通路，刺激机体产生IFN和ISGs，起到抗病毒作用，在此过程中，PRRs对PAMPs的识别起到至关重要的作用。有研究报道，PRRSV能激活RIG-I和TLR3信号通路起到抗病毒作用(Sangetal.2008;Zhouetal.2012)，然而关于PRRSV如何与PRRs结合而被识别，以及PRRSV 20猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究PAMPs具体特征的研究甚少，因此本课题将深入研究细胞对PRRSV的识别机制以及PRRSVPAMPs的具体特征及功能，为阐明PRRSV识别机制以及IFN产生机制奠定坚实基础。 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析21第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析2.1引言病毒感染宿主细胞后，机体的PRRs能够识别PAMPs进而激活下游信号通路分泌大量IFN，并刺激下游的ISGs大量产生。目前已鉴定的PRRs有很多种，与RNA病毒识别相关的PRRs主要有RLRs、TLRs和NLRs。在这些PRRs中，TLRs和RLRs在RNA病毒来源的PAMPs的识别中起到至关重要的作用。PRRSV感染后能够被宿主的PRRs识别，并诱导机体产生IFNs，然而关于宿主PRRs识别PRRSV的研究甚少。由于PRRSV属于套式病毒目成员，其复制机制非常复杂，PRRSV在细胞内存在基因组及亚基因组RNA，因此研究其宿主PRRs对病毒的识别比较困难。RIP-seq技术基于高通量测序技术，能将目的蛋白与RNA同时沉淀并经分离纯化得到与目的蛋白特异性结合的RNA，通过高通量测序分析得到RNA序列。因此本研究采用RIP-seq技术分析了模式识别受体RIG-I和MDA5结合的PRRSV基因组序列，得到了RIG-I和MDA5识别的PRRSV序列信息，通过与PRRSV的基因组序列进行比对分析，得到RIG-I和MDA5识别的关键区域，进而对其序列和结构特性进行分析，从而鉴定PRRSV感染后模式识别受体的识别特征。2.2实验材料2.2.1细胞和病毒Marc-145细胞（非洲绿猴肾细胞）购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），使用含10%灭活胎牛血清（FBS）并于4℃保存的DMEM培养基进行培养。从4-6周龄健康仔猪肺脏中分离得到PAM并于液氮中保存待用。使用含10%热灭活的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基培养PAM。PRRSV低致病型毒株BJ-4（GenBank登录号：AF331831）由中国农业大学杨汉春教授馈赠。2.2.2试剂及耗材TM细胞培养基DMEM、RPMI-1640、胎牛血清FBS（GIBCO,Invitrogen公司）；胰®蛋白酶（索莱宝公司）；TRIzolReagent（ThermoFisherScientific）；反转录试剂盒（TaKaRa公司）；SYBRGreen（Roche公司）；青霉素和链霉素（HyClone公司）；超敏化学发光液（CST公司）；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride，PVDF）（Millipore公司）；细胞培养板（Coring公司）；RT-PCR八连管（AppliedBiosystem公司）；RIPKit（Merk公司）；兔抗RIG-I抗体（D33H10）、兔抗Actin抗体（13E5）和兔抗MDA5抗体（D74E4）（CST公司）；抗GFP单抗（Abcam）；氯仿、甲醇、甘氨酸、琼脂糖、酵母提取物、TEMED、异丙醇和氯化钙等其他常规试剂均为国产分析纯。2.2.3主要仪器设备 22猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究实时荧光定量PCR仪（7500FastReal-TimePCRsystem，AppliedBiosystem公司）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；超纯水仪（Millipore公司）；超低温冰箱（SANYOMDF-U53V）；核酸电泳仪（北京六一，DYY-8C）；琼脂糖水平电泳槽（北京六一DYCP-31BN）；蛋白电泳仪（Bio-Rad公司）；蛋白转印仪（Bio-Rad公司）；生物安全柜、CO2细胞培养箱（ThermoFisherscientific公司）；荧光倒置显微镜（Leica公司）。2.3实验方法2.3.1PAM的分离与培养2.3.1.1肺脏的分离（1）准备组织分离所需器械（剪刀、止血钳、镊子、棉线和手术刀）和耗材（烧杯和离心管）等，经高压灭菌后待用。将4-6周龄仔猪按照0.1-0.2mL/kg剂量注射麻醉剂，待仔猪完全麻醉后采用前腔动脉放血方法将仔猪处死。（2）将处死后的仔猪转移至手术台，剖开胸腔及颈部，露出肺脏和气管。（3）从喉结处开始用手术刀将气管与食管及其他组织剥离，在喉结下部用棉线将气管结扎，然后沿着气管继续剥离肺脏，在此过程中避免损伤肺脏。待肺脏完全剥离后，从胸腔中取出肺脏，放入盛有含双抗的无菌PBS的烧杯中，将肺脏表面清洗干净。2.3.1.2PAM的收集和培养（1）将清洗过的肺脏转移到生物安全柜中，放于灭菌的锡箔纸上。用灭菌的剪刀剪断棉线下部的气管，用酒精棉球清洗气管周围。向气管中灌入含有双抗的无菌HBSS缓冲液（Hank’sBalancedSaltSolution），对左右肺进行灌洗，同时轻轻拍打肺部使肺泡巨噬细胞脱落。收集灌洗后的HBSS，2000g离心15min。弃掉上清，用含双抗的无菌HBSS重悬细胞再次离心，洗涤两遍。（2）10%FBSRPMI-1640将细胞重悬后，进行细胞计数并冻存。（3）实验前将冻存的PAM迅速取出，按所需的细胞浓度铺板，使用含10%FBS的RPMI-1640培养基培养细胞。 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析232.3.2RIP-seq样品制备样品制备流程如下：图2-1RIP-seq样品制备流程Fig.2-1TheworkflowofRIP-seq2.3.2.1准备感染PRRSV的细胞裂解液7复苏PAM，用1.0×10个细胞铺设100mm细胞培养皿，于37℃培养24h。接种PRRSVBJ-4毒株（MOI=1），12h后收集细胞。准备RIP裂解液（含有蛋白酶抑制剂（Cocktail）及RNA酶抑制剂），置于冰上待用。将接毒后的细胞用PBS轻轻洗2次，然后加10ml预冷的PBS将PAM用细胞刮刮下来并转移到离心管中，4℃1500g离心5min，将上清弃掉。用准备好的RIP裂解液重悬细胞，彻底混匀后冰上静置10min使细胞彻底裂解，然后按照每管200μl进行分装后冻于-80℃。2.3.2.2准备磁珠将磁珠颠倒混匀后每管50μl分装于无RNase的离心管中，分别加入500μlRIP洗液涡旋混匀。将离心管置于磁力架上，将上清弃掉，重复洗涤一次。每管加入100μlRIP洗液后分别加入5μgRIG-I、MDA5及对照GFP抗体，室温翻转孵育30min。将离心管置于磁力架上使磁珠吸附到一侧，弃掉上清，加入500μlRIP洗液涡旋混匀。重复一次 24猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究后，加入500μlRIP洗液重悬磁珠后置于冰上待用。2.3.2.3RNA结合蛋白免疫沉淀各取900μlRIP免疫沉淀缓冲液，分别加入35μl0.5MEDTA和5μlRNase抑制剂。将孵育抗体的磁珠置于磁力架上充分吸附磁珠后，将上清弃掉，用900μlRIP免疫沉淀缓冲液重悬磁珠。将保存于-80℃的细胞裂解液迅速溶解，并将此细胞裂解液于4℃14000g离心20min，取100μl上清加入孵育抗体的免疫磁珠中，终体积1ml，同时取出10μlRIP细胞裂解液标记为“input”用于检测。混合好的样品于4℃翻转孵育过夜，然后使用磁力架将离心管中的磁珠吸附到一侧，弃掉上清。每管加入500μlRIP洗液充分重悬，置于磁力架上弃上清，重复5次。2.3.2.4纯化免疫沉淀的RNA每个样品用150μl蛋白酶K缓冲液（含15μl10%SDS和18μl10mg/ml蛋白酶K）重悬，将样品置于55℃水浴锅中孵育30min，不断混匀使蛋白充分消化，然后将样品置于磁力架上，取出上清即为含有目的片段的混合液，然后向此混合液中，加入250μlRIP洗液。向离心管中加入400μl酚氯仿异戊醇，混匀后室温14000g离心15min。小心吸取上层水相300μl，转入新的离心管并加入400μl氯仿，充分混匀，14000g离心15min。小心吸取上层水相300μl转入新的离心管中，每管加入50μl盐溶液I，15μl盐溶液II，5μl沉淀增强剂并加入850μl无水乙醇，置于-80℃沉淀过夜。4℃14000g离心10min弃上清，用80%乙醇洗涤两次，4℃14000g离心15min，将乙醇弃掉，风干沉淀，最终用10-20μl无RNase水重悬并保存至-80℃待用。2.3.3二代测序文库构建及上机测序文库制备流程如下：将上述实验得到的与GFP、RIG-I和MDA5结合的mRNA打断成短片段，并反转录合成cDNA，试剂盒纯化后末端修复，并连接测序接头，然后选择大小合适的片段进 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析25行扩增分别建立GFP、RIG-I和MDA5文库。构建好的文库用安捷伦2100仪器进行质检，文库质检试剂盒为DNA1000DNAassayKit，GFP、RIG-I和MDA5文库质检达到TM标准后，将三个样品同时用IlluminaHiseq2500仪器对每一个文库进行测序。2.3.4生物信息学分析测序数据的生物信息学分析流程如下：2.3.4.1原始测序数据将原始图像数据转化为序列数据，即rawdata/reads，存储为FASTQ格式，此数据TM包括测序的序列及测序质量。质量值范围为2-41。表2-1为IlluminaHiSeq2500测序错误率与质量关系表。TM表2-1.IlluminaHiSeq2000测序错误率与测序质量值简明对应关系TMTable.2-1IlluminaHiSeq2000thecorrelationbetweensequencingerrorrateandsequencingquality.测序错误率测序质量对应字符1%20T0.1%30^0.01%40h为更直观分析测序数据的碱基质量，分析其碱基质量分布图，如图2-2所示，图中上方蓝色的多少及深浅代表数据质量好坏，蓝色条不仅深而且多代表数据质量好。 26猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图2-2碱基质量值分布图Fig.2-2Thedistributiondiagramofnucleotidebasequalityvalues2.3.4.2碱基组成与质量分析为了直观地看数据质量情况，分析过滤前后数据碱基组成分布及质量图，四种碱基以及未知碱基（N）的分布如图2-3所示。横坐标为所测碱基的位置，纵坐标为所有Reads在该测序位置（如第一个测序碱基）A，T，C，G，N碱基分别占的百分比。不同碱基用不同颜色表示（见右上角图注）。其中AT配对，CG配对。两两配对的碱基含量应该相等，红绿和蓝黑两条线分别在同一直线上为最佳。各样品碱基组成情况如图2-5所示。图2-5中，A、T、C、G各代表每个位置碱基的比例。N表示未被检到碱基的比例。mean表示平均测序质量，Q20代表测序错误率低于1%的碱基比例图中配对的碱基（AT或GC）其含量应该是相等的，AT和GC两条线若在一条直线上表示数据质量好。 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析27图2-3碱基含量分布图Fig.2-3Thedistributiondiagramofnucleotidebasedistribution2.3.4.3测序数据质控为得到高质量的数据，要对原始数据进行质量检测与控制。对下机的reads进行严格的过滤，用于后续分析。过滤时将含有接头、含有未测到碱基比例高于10%和低质量的数据依次去掉。2.3.4.4测序数据过滤信息统计经过上面的步骤对样品测序数据进行过滤后，分别统计每个样品过滤前后的碱基质量和GC含量。2.3.4.5比对参考基因组将进行严格过滤后的高质量数据称为HQcleandata，将GFP、RIG-I和MDA5的HQcleandata分别与PRRSVBJ-4基因组进行比对，得到reads在PRRSVBJ-4基因组上的对应信息，以及PRRSVBJ-4基因组上每个位点的测序深度信息。病毒的参考基因组的GenBank登录号为AF331831，比对软件为：tophat。2.3.4.6比对结果可视化将每个样品的reads比对病毒参考基因组的结果用IGV软件进行可视化展示。2.4实验结果与分析2.4.1RIP测序RNA样品制备及质量检测结果为研究RIG-I和MDA5结合的PRRSV基因组序列，本研究将针对内源性RIG-I和MDA5的抗体与磁珠孵育后，分别与病毒感染的细胞裂解液进行孵育，从而得到与其结 28猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究合的RNA然后进行深度测序。本实验中用于感染PAM的PRRSV毒株为PRRSVBJ-4（Genbank登录号为AF331831），在免疫沉淀实验中采用抗GFP抗体（GFP蛋白在细胞裂解样品中不存在）作为阴性对照。免疫沉淀得到的RNA样品送广州基迪奥生物科技有限公司进行后续测序。经检测，测序的RNA样品完整性较高（表2-2）。表2-2RIP测序RNA样品检测结果Table.2-2RIPsequenceRNAsamplesquality浓度体积总量序样品样品OD260/OD260/28S/1（pg/（μl（ngRIN号名称编号2802308Sμl）））R20761GFP51231.21.60.50.02.022R20762GFP16230.41.00.50.01.523R20763MDA595232.21.50.50.02.224R20764MDA5109232.51.60.50.02.725R20765RIG-I9952322.91.70.50.34.226R20766RIG-I203234.70.60.30.02.427注：RIN：RNAIntergrityNumber，RNA完整性指数。 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析29样品检测图谱如图2-4，6个样品均无核糖体RNA污染，RIP实验RNA样品质量良好，可以用于后续测序及分析。图2-4RIP实验RNA样品检测结果峰图Fig.2-4TheresultsofRIPRNAsamplespectrumdetections2.4.2二代测序文库构建及上机测序2.4.2.1文库构建RNA样品检测合格后，加入片段化试剂将RNA打断成短片段，以打断后的片段为模板，合成cDNA做末端修复并选择片段大小及PCR扩增，采用安捷伦2100仪器对构建好的GFP、RIG-I和MDA5文库进行质检。 30猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究2.4.2.2上机测序TM将GFP、RIG-I和MDA5三个文库的样品，用IlluminaHiseq2500仪器同时进行测序。2.4.3生物信息学分析对GFP、RIG-I和MDA5三个样品的原始测序数据进行生物信息学分析，流程如下：原始测序数据的处理及质量控制；病毒基因组比对；Reads结合峰分析。2.4.3.1原始测序数据的处理将GFP、RIG-I和MDA5三个样品的原始图像数据转化为序列数据。根据表2-1测序错误率与质量关系表，本实验中GFP、RIG-I和MDA5三个样品原始数据的碱基质量值都很高，表明测序准确率高。2.4.3.2原始测序数据的碱基组成与质量分析为了直观地看数据质量情况，分析过滤前后数据碱基组成分布及质量图GFP、RIG-I和MDA5三个样品碱基组成及质量情况如图2-5所示，过滤后的碱基组成分布图，AT或GC的含量基本是相等的，同时AT和GC两条线大致在一条直线上，N曲线即未测到的碱基非常低且Q20接近100%表明数据质量良好。 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析31图2-5样品过滤前后碱基组成分布图Fig.2-5Thedistributionofbasesbeforeandaftersamplefiltration2.4.3.3测序数据质控对GFP、RIG-I和MDA5三个样品的reads进行严格过滤，得到cleanreads。三个样品原始数据依次将含有接头、含有未测到碱基比例高于10%和低质量的数据去掉，从而得到高质量数据。 32猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究2.4.3.4测序数据过滤前后信息统计经过上面的步骤对GFP、RIG-I和MDA5样品测序数据进行过滤后，分别统计每个样品过滤前后的碱基质量和GC含量。对过滤前后数据评估后与参考序列比对，统计结果显示3个文库即GFP、RIG-I和MDA5样品的Q30base（错误率小于0.1%）都大于94.49%，说明测序碱基错误率低（表2-3）。将各个文库的测序原始数据按照质控原则去除含接头的数据、含未检到碱基比例大于10%的数据同时去除低质量数据最后过滤得到高质量的数据其Q30base都大于95%，说明测序数据质量准确率高。表2-3测序数据过滤前后信息统计Table.2-3InformationStatisticsofrawdatabeforeandafterfilter过滤前过滤后样品HQCleanQ20Q30GCQ20Q30GC名称CleanData(bp)(%)(%)(%)(%)(%)(%)Data(bp)RIG-I2055020697.97%95.50%55.12%2047099698.18%95.79%55.12%MDA52017968997.38%94.49%52.83%2000240597.89%95.19%52.83%GFP2023515597.53%94.93%55.38%2002706598.21%95.82%55.35%2.4.3.5比对参考基因组获得GFP、RIG-I和MDA5样品的HQcleandata后，将过滤后数据分别与病毒参考基因组（GenBank登录号为AF331831）进行比对，得到这三个样品在病毒基因组上匹配的具体位置，以及比对到病毒基因组上的数据比例（表2-4）。表2-4HQcleandata比对病毒统计表Table.2-4InformationStatisticsofHQcleandatamappedtovirusgenomesequence样品名称reads数量比对的reads数量GFP2002706573290（0.37%）RIG-I2000240536778（0.18%）MDA52047099681964（0.40%）2.4.3.6比对结果可视化我们将GFP、RIG-I和MDA5样品过滤后数据比对到参考基因组（GenBank登录号为AF331831），获得的结果即MappedData。将此结果用IGV软件进行可视化展示，进行结合峰鉴定，确定病毒结合峰基因元件，使用基因组组装文件（GenBank登录号：AF331831）作为参考进行序列比对及后续分析从图2-6IGV可视化展示结果可以发现GFP、RIG-I和MDA5样品在病毒基因组的14900bp-15400bp处reads的覆盖是有区别的。 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析33图2-6测序样品比对病毒基因组可视化结果Fig.2-6ThevisualizationsofthethreesamplesmappedtovirusgenomeIGV可视化展示放大14900bp-15400bp处reads的具体覆盖差异（图2-7），此IGV可视化结果显示在PRRSV基因组14900bp-15400bp处即PRRSV3’UTR处RIG-I、MDA5测序样品与GFP对照样品存在明显匹配差异，初步推测，两个目标蛋白RIG-I、MDA5结合区域在上述区域。图2-7测序样品比对病毒基因组放大后可视化结果Fig.2-7Theamplificationvisualizationsofthethreesamplesmappedtovirusgenome2.4.3.7结合峰基因元件分布对图2-6的结合峰鉴定图进行分布统计，表2-2显示RIG-I样品的病毒结合区域分布结果。Start-End，有reads覆盖的病毒基因组区域；Total_depth，每个区域总覆盖深度；ave_depth，每个区域平均覆盖深度；CDS，每个区域的基因元件；Seq，每个区域的基因序列。对GFP、RIG-I和MDA5样品都做此病毒结合区域分布统计表以备后续分析使用。表2-2HQcleandata比对病毒统计表Table.2-2InformationStatisticsofHQcleandatamappedtovirusgenomesequenceStartEndTotal_depthave_depthCDSSeq1500144684289.3685’UTR-ORF1aTATG…GCTG5011000146255292.51ORF1aAGCT…CTGC10011500137363274.726ORF1aTGGT…ATTG15012000117976235.952ORF1aTGGT…GACC………………1500115500287588315.396ORF7-3’UTRAAGG…AATT 34猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究2.4.3.8RIG-I和MDA5结合序列RIP-seq深度测序分析将RIG-I和MDA5免疫沉淀实验得到的RNA序列比对到PRRSVBJ-4的基因组上，这些序列的相对表达丰度在RIG-I、MDA5和GFP免疫沉淀实验中进行比较。如图2-8，图2-9，图2-10所示，对RIG-I，MDA5结合序列分析结果显示RIG-I和MDA5在PRRSVBJ-4基因组有相似的结合区域。RIG-I和MDA5都主要结合于PRRSV基因组的3’末端区域。之前研究表明，此区域对于病毒的复制和转录过程起到非常重要的作用(Beerensetal.2007b)，RIP-seq的结果显示RIG-I和MDA5都在此区域有特异性结合因此PRRSV3’末端区域对于免疫识别也非常重要，其具体机制需要进一步分析。图2-8RIG-I免疫沉淀RNA与对照免疫沉淀RNA比对病毒基因组结果Fig.2-8RIG-I-associatedsequencesincomparisontothecontrolmappedtotheviralgenome图2-9MDA5免疫沉淀RNA与对照免疫沉淀RNA比对病毒基因组结果Fig.2-9MDA5-associatedsequencesincomparisontothecontrolmappedtotheviralgenome 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析35图2-10RIG-I和MDA5免疫沉淀RNA与对照免疫沉淀RNA共同比对病毒基因组结果Fig.2-10OverlayofRIG-I-associatedandMDA5-associatedsequencesincomparisontothecontrolmappedtotheviralgenome2.4.3.9RIG-I和MDA5结合序列链特异性分析基于病毒基因序列的链特异性，本实验在进行二代测序时，将接头特定地连接到基因组的5’和3’末端，因此在深度测序分析中可以使链特异性信息保存下来。在蛋白免疫沉淀过程中，链特异性信息表现出非常大的差异。如图2-11所示，对RIG-I结合序列进行链特异性分析，显示RIG-I结合序列主要集中在PRRSV的正链。如图2-12所示，对MDA5结合序列进行链特异性分析，MDA5结合的RNA同样主要富集在PRRSV的正链。图2-11RIG-I免疫沉淀RNA比对病毒基因组链特异性分析结果Fig.2-11Strandseparationofsequencinglibrariesinto(+)or(-)PRRSVRNAofRIG-Iassociatedsequencesincomparisontothecontrolmappedtotheviralgenome(+)RNAisshownplus,(-)RNAis 36猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究shownminus.图2-12MDA5免疫沉淀RNA比对病毒基因组链特异性分析结果Fig.2-12Strandseparationofsequencinglibrariesinto(+)or(-)PRRSVRNAofMDA5associatedsequencesincomparisontothecontrolmappedtotheviralgenome(+)RNAisshownplus,(-)RNAisshownminus.2.4.3.10heatscatter富集关联分析为阐明被RIG-I和MDA5免疫沉淀富集的RNA序列的具体特征，本实验对图2-8，图2-9，图2-10结合峰的结果进行不同碱基两两组合AU、AG、AC、UC、UG和CG，分别进行heatcatter的富集关联分析，获得六种碱基组合和表达量的关联性结果。以病毒基因组序列为模板，采用201bp作为滑窗，5bp为步长(Rungeetal.2014)，计算每个窗口平均覆盖深度以及不同碱基组合在基因组上的百分比，采用Peason相关系数分析覆盖深度和不同碱基组合的相关性，得到图2-13，图2-14的结果。图2-13是RIG-I结合PRRSV基因组序列与6种碱基组合富集关联性结果，图2-14是的MDA5结合PRRSV基因组序列与6种碱基组合富集关联性结果。cor>0代表正相关，cor<0代表负相关。Depth：平均测序覆盖深度，AUcontent：是A和U碱基在病毒基因组上的百分比。根据6种碱基组合富集关联分析结果显示，RIG-I和MDA5结合的PRRSVRNA分子更倾向于结合U/C及U/G碱基组合。 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析37图2-13RIG-I免疫沉淀RNA碱基特性分析结果Fig.2-13NucleotidebasefeatureanalysisofsequencinglibrariesintoRRSVRNAofRIG-Iassociatedsequencesincomparisontothecontrolmappedtotheviralgenome 38猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图2-14MDA5免疫沉淀RNA碱基特性分析结果Fig.2-14NucleotidebasefeatureanalysisofsequencinglibrariesintoPRRSVRNAofMDA5associatedsequencesincomparisontothecontrolmappedtotheviralgenome2.5讨论对模式识别受体RLR家族（RIG-I、MDA5和LGP2）RNA配体具体特征的研究，目前还不是特别完善。之前研究RNA分子的具体特征，通常采用NorthernBlot或实时荧光定量PCR，这些方法所得到的结果容易受到引物选择以及探针标记的影响。与传统方法相比RIP-Seq分析方法是基于高通量测序技术，其测序的广泛性及准确性都有很好的保证，此技术已被广泛应用于多种生命科学相关实验中(Baumetal.2010;Rungeetal.2014;SanchezDavidetal.2016)。本研究采用RIP-Seq分析方法，通过收集PRRSV感染 第二章利用RIP-seq对PRRSVPAMPs进行初步鉴定分析39PAM细胞裂解液，用RIG-I和MDA5特异性抗体免疫沉淀RIG-I和MDA5结合的RNA，同时采用之前报道过的GFP抗体作为阴性对照(Baumetal.2010)，将免疫沉淀得到的RNA进行深度测序，从而分析PRRSV感染PAM后与RIG-I和MDA5结合的RNA序列。本研究进一步分析了PRRSV感染PAM后，RIG-I和MDA5识别的RNA在PRRSV基因组上主要的分布区域，如图2-9、图2-10所示，RIG-I和MDA5结合的RNA主要匹配于PRRSV正链基因组的3’末端区域。之前研究结果表明，PRRSV的3’UTR区域对于病毒的复制有至关重要的作用(Yinetal.2013)，本研究基于RIP-seq技术发现PRRSV的3’UTR区域对于RLR家族免疫识别同样非常重要，因此本研究对于丰富PRRSV的复制与免疫识别机制有重要意义。进一步研究发现，RIG-I和MDA5识别的RNA序列主要集中于PRRSV的正链基因组，如图2-11、图2-12所示。PRRSV的正链基因组对于病毒的入侵至关重要，在PRRSV复制和转录过程中，以PRRSV正链基因组为模板进行负链RNA的合成及病毒蛋白的转录翻译，因此我们推测，在PRRSV的生命周期中PRRSV的正链基因组暴露于细胞质而被胞浆的RLR家族模式识别受体识别，启动抗病毒天然免疫应答。为进一步研究RIG-I和MDA5识别的PRRSVRNA具体的序列与结构特征，本研究对RIG-I和MDA5识别的PRRSVRNA序列的AU、AC、AG、UC、UG和GC碱基成分相关性进行了分析（如图2-13、图2-14所示），分析结果表明，无论是RIG-I还是MDA5其识别的PRRSVRNA序列，更倾向于结合U/C及U/G碱基组合，具有U/C及U/G碱基偏爱性。之前研究表明，RIG-I具有poly-U/UC碱基偏爱性，与本实验研究结果一致(Saitoetal.2008)。由于RIP-seq对于抗体要求非常高，而本实验中由于RIG-I和MDA5没有亲和力非常强的抗体，因此虽然我们尝试了很多次，但是最终所得到的RNA量并不是特别理想，因此RIP-seq的结果需要进行多次重复以得到稳定结果。通过上述研究，采用RIP-seq技术，我们初步分析了PRRSV感染PAM过程中，RIG-I和MDA5识别结合的PRRSV基因组的成分，为进一步阐明PRRSV的识别机制奠定了基础。2.6小结病毒感染机体后，病毒的基因组首先被宿主的PRRs识别，刺激机体产生天然免疫反应，从而达到抗病毒的作用在目前已被鉴定的模式识别受体中，RIG-I和MDA5作为RLR家族的重要成员，在天然免疫识别中起着重要的作用。然而在PRRSV感染过程中，与RIG-I和MDA5作用的病毒RNA成分还不清楚，本研究结果表明，PRRSV感染PAM的过程中，RIG-I和MDA5主要结合于PRRSV正链基因组的3’UTR区域，且结合序列具有U/C及U/G碱基偏爱性。本研究为探索PRRSV识别机制及发现新的RIG-I和MDA5配体奠定了基础。 40猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答3.1引言病毒入侵细胞后，病毒的核酸可以被宿主的PRRs识别，从而激发抗病毒免疫应答。研究表明RIG-I可以识别5’三磷酸修饰的RNA，同时可以识别5’二磷酸或单磷酸修饰的RNA(Goubauetal.2014;Hornungetal.2006;Spengleretal.2015)，但是关于5’加帽修饰的RNA研究较少。PRRSV是5’加帽的病毒，因此研究其识别机制对于阐明PRRSV识别机制及RIG-I等模式识别受体的新识别模式具有重要意义。PRRSV在体内长期存在难以清除，然而其免疫逃逸的机制还不清楚。天然免疫反应作为宿主抵御病毒入侵的第一道防线，在抗病毒过程中起着重要的作用，然而关于PRRSV如何被机体识别而激活天然免疫反应的机制研究甚少，本论文针对此问题进行了研究。本研究中我们讨论了在PRRSV感染过程中主要诱导的干扰素类型，以及PRRSV感染过程中与之相关的模式识别受体，分析了PRRSV宿主模式识别受体及病原相关分子模式相互作用机制。之前研究表明，PRRSV基因组3’UTR区假结结构对于调节病毒RNA合成及复制至关重要，本研究利用体外转录方法着重探讨了其对于干扰素产生的影响。同时利用突变的方法分析了此假结结构的完整性对于干扰素产生的影响，进一步分析了其对于病毒复制的影响。由于该假结结构在动脉炎病毒科中非常保守，本研究同时分析了EAV的假结结构对于干扰素产生的影响，因此本研究对于阐明动脉炎病毒科病毒的识别机制具有重要意义。3.2实验材料3.2.1细胞和病毒猪肺泡巨噬细胞传代细胞系CRL2843，由本实验室保存。猪肺泡巨噬细胞传代细胞系CRL2843-CD163，是由猪肺泡巨噬细胞传代细胞系CRL2843转染猪CD163基因后，进一步筛选得到表达猪CD163的稳定细胞系，该细胞系具有感染PRRSV的能力。PAM是通过标准方法从4-6周龄健康仔猪肺脏中分离并保存于液氮中待用。CRL2843细胞系、CRL2843-CD163细胞系及原代PAM，均使用含10%FBS含青链霉素的RPMI-1640培养基进行培养。PRRSV高致病性毒株HN07-1（GenBank登录号：KX766378.1），是由本实验室于2007年由PRRS发病猪体内分离得到。PRRSV毒株在Marc-145细胞上进行增殖并测定病毒滴度，于-80℃保存。紫外灭活（Ultraviolet-inactivated,UV-inactivated）的PRRSV采用紫外灯下照射2h，使病毒灭活。热灭活的PRRSV采用65℃水浴锅灭活30分钟得到。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答413.2.2试剂及耗材TM细胞培养基DMEM、RPMI-1640、胎牛血清FBS（GIBCO,Invitrogen公司）；TRIzol®Reagent（ThermoFisherScientific公司）；氯仿、异丙醇和无水乙醇等其他常规试剂均为国产分析纯；反转录试剂盒（TaKaRa公司）；SYBRGreenKit（Roche公司）；鼠抗Flag（M2）（Sigma-Aldrich公司）；兔抗RIG-I抗体（D33H10）、兔抗Actin（13E5）、兔抗MDA5（D74E4）（CST公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠或抗兔IgG（JacksonImmunoResearch公司）；Poly(I:C)（Sigma-Aldrich公司）；RNA转染试剂TransMessenger（Qiagen公司）；双荧光报告试剂盒（Promega公司）。3.2.3主要仪器设备蛋白质转印仪（Bio-Rad公司）；蛋白电泳仪（Bio-Rad公司）；CO2细胞培养箱（ThermoFisherscientific公司）；倒置荧光显微镜（Leica公司）；实时荧光定量PCR仪（7500FastReal-TimePCRsystem，AppliedBiosystem公司）；超纯水仪（Millipore公司）；超低温冰箱（SANYO公司）；核酸电泳仪（北京六一公司）；琼脂糖水平电泳槽（北京六一公司）。3.3实验方法3.3.1PAM的分离与培养按照2.3.1步骤进行。3.3.2双荧光素酶报告实验检测病毒感染细胞中IFN-β启动子活性CRL2843-CD163或Marc145细胞同时转染1μgpGL4.17-IFN-β-Luc和100ngpRL-TK（内源性对照海肾荧光素酶报告质粒），24h后感染PRRSV或转染1μg全长3’UTR或截短的3’UTR片段（1-151、50-88或50-151），同时转染1μgpoly(I:C)作为阳性对照。转染RNA参照TransMessenger转染试剂（Qiagen公司）操作说明书进行。细胞接毒24h或转染RNA片段6、12或24h后，使用Promega公司的双荧光报告检测试剂盒对细胞的两种荧光素酶活性进行检测，具体操作流程如下：（1）待检测细胞用PBS洗2遍后，置于冰上待裂解。（2）配制1×PassiveLysisBuffer(PLB)裂解液，加入细胞中室温孵育10-20min，使细胞充分裂解。（3）将LuciferaseAssaySubstrate干粉溶于LuciferaseAssayBufferⅡ，待用或分装后避光冻存。®®（4）使用Stop&Glo缓冲液稀释50×Stop&GloSubstrate，待用或分装冻存。（5）将裂解好的细胞收集到EP管中，取40μl到化学发光检测板，每孔同时加入100μlLARⅡ试剂，放入全波长酶标仪中检测萤火虫荧光素酶活性。收集数据后，加入®100μlStop&GloReagent与海肾荧光素酶反应，再次使用全波长酶标仪进行检测，收 42猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究集数据待分析。3.3.3细胞样品RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR检测3.3.3.1Trizol试剂裂解细胞进行总RNA提取按照Trizol试剂使用说明书对CRL2843-CD163及PAM的总RNA进行提取，具体过程如下：（1）经过实验处理过的细胞用PBS洗2次去除培养基，同时加入1mlTrizol充分震荡对细胞进行裂解，室温静置10min。（2）加入200μl氯仿，混匀后室温静置5min，4℃12000g离心15min，离心后样品分为明显的三层，其中总RNA在上层水相，中间白色层为DNA，下层为蛋白质。（3）小心吸取上层水相放入新的无RNaseEP管中，同时加入500ul异丙醇充分混匀对RNA进行沉淀，室温静置10min。然后，4℃12000g离心10min，管底可见白色沉淀。（4）弃上清，加入1ml75%乙醇，对RNA进行洗涤，7500g离心5min。（5）将75%乙醇倒掉，风干RNA15min，加入20μlDEPC水将RNA充分溶解，用分光光度计仪器对RNA浓度进行测定，于-80℃冻存备用。3.3.3.2总RNA反转录使用反转录试剂盒对RNA进行反转录，反转录过程中RNA使用量为1μg，反应体系如下表所示:表3-1RNA反转录体系Table.3-1ReactionMixtureofReverseTranscription试剂加入量5×PrimeScriptRTMasterMix4μlRTrtRTMasterMixRNaseFreedH（forRealTime2Oupto20μlTotalRNA1μg反应条件为：37℃20min，85℃5s，反转录完成后-20℃保存。3.3.3.3实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测（1）实时荧光定量PCR引物如表3-2所示。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答43表3-2qRT-PCR反应所需引物序列Table.3-2SequencesofprimersusedforqRT-PCR基因名称上游引物（5’→3’）下游引物（5’→3’）IFN-βTGCAACCACCACAATTCCCTGAGAATGCCGAAGATCTGGCCTCCTGCACCAGTTCTAIFN-αTGCATGACACAGGCTTCCACAAATGGTAGCTCTGGGAAACIFN-γACTTCTCTTCCGCTTTCTTAGGTGIFN-λ1GGTGCTGGCGACTGTGATGGATTGGAACTGGCCCATGTGAAAGCGGACAAGTCGAAATCCACTTCATTTCCATAGTCTTPKRGGCTGAGAGCTGCAGCGAGACTTCCOASTGCTTGACAAGGCGGATGATTCAGAGGTGAGAAGGCTGGISG56GCTTCCTGCAAGTGTCCTTCTAGGAAGGTCTATGAGGGTCAGMX1GGCGTGGGAATCAGTCATGATCTDDX58TATGTGCTCCTACTGGTTGTAGTTGAATAGCAAAAAAGAC(RIG-I)GGAAAAACCTCTTCTGGTTACCGATGTCTTCTCCCTTACTCCTGATTCATTTMDA5GGCCCATTGAGAATCTATCCCTGTGAGGTTTGTCTGCTTTAGTCCTLR3AGCAAAAAAACTCTGCCCTGTGATGTGAATCGCTGTCAAGTGCTTGTTLR7CAGTCPRRSVAAACCAGTCCAGAGGCAAGGCAAACTAAACTCCACAGTGTORF7GAACCTTCCGTGTCCCTACTGCCGAPDHGACGCCTGCTTCACCACCTTCTAAC（2）实时荧光定量PCR检测基因的表达首先将cDNA稀释，充分混匀备用。qRT-PCR反应体系如下：表3-3qRT-PCR反应体系Table.3-3ReactionMixtureofqRT-PCR试剂加入量2×FastStartUniversalSYBRGreenMaster10μl上游引物（10μM）0.6μlGreenMasterRTrtRTMasterMix下游引物（10μM）（forRealTime0.6μlcDNA2μlRNaseFreedH2O6.8μl（3）实时荧光定量PCR反应程序预变性：95℃10min。 44猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究PCR扩增：95℃15s，60℃60s，扩增40个循环。生成溶解曲线：95℃15s，60℃60s，95℃15s。使用AppliedBiosystem公司7500FastReal-TimePCRsystem仪器进行反应和数据分析。（4）绝对定量为检测PRRSV的拷贝数，使用绝对定量方法对样品进行检测。首先将ORF7全长372bp基因构建到pMD19T载体上，经测序验证序列正确后，作为标准质粒对PRRSV样品进行定量，反应体系与程序同上。3.3.4细胞上清中PRRSV的滴度测定5（1）首先培养Marc145细胞，进行细胞计数，按1×10个细胞／ml密度铺96孔板，待细胞80%密度时接毒。（2）首先使用无血清DMEM对待测样品进行10倍梯度稀释，每次稀释至少10个梯度。（3）弃去培养基，使用PBS洗两遍以排除残留血清对于病毒的影响。以每孔100μl的量将稀释的病毒接种细胞，每个稀释梯度做8个重复，同时留两列作为阴性对照。细胞接毒后置于37℃培养箱中孵育1h，使病毒充分吸附并进入细胞。（4）弃掉上清并洗细胞，然后加入含2%FBS的DMEM培养基，置于37℃，5%CO2培养箱连续培养5-7d。（5）每天对细胞进行观察，记录细胞病变情况。（6）待细胞病变数稳定后计算TCID50，计算方法采用Kaebe法，公式为lgTCID50=L-D(S-0.5)。L表示最高稀释度取对数，D表示稀释度对数差，S表示细胞病变阳性孔比率之和。具体计算实例如表3-4。表3-4计算TCID50公式Table.3-4CalculationofTCID50病毒稀释倍数阳性孔阳性孔比率-18108/8=1-21088/8=1-31088/8=1-48108/8=110-566/8=0.75-61022/8=0.2510--571000/8=010-800/8=03.3.5siRNA介导的基因沉默实验 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答453.3.5.1siRNA序列设计与合成siRNA序列如表3-5所示，所有siRNA序列由上海吉玛公司合成，同时合成siRNA（siNC）作为阴性对照。合成的siRNA干粉用DEPC水进行溶解，终浓度为20μM。表3-5siRNA序列Table.3-5ThesequenceofsiRNA靶基因siRNA序列（5’→3’）DDX58(RIG-I)GCAGGUUAUUCUGGACUUUTTMDA5CCUCAGAUAUUGGGACUAATTTLR3GCUUAAGUGUGAUUGGUAATTTLR7CCUUGGACCUAAGUAGAAATT3.3.5.2转染siRNA准备所需的siRNA置于冰上待用，siRNA转染试剂为RNAiMAX。转染试剂与siRNA的具体比例需要经过实验优化达到最佳，一般使用siRNA终浓度20nM,转染试剂2μl，具体实验步骤如下：（1）铺设细胞板，待细胞密度约80%时进行siRNA转染实验。（2）转染试剂用100μl无血清1640进行稀释。（3）靶基因siRNA同样用无血清1640进行稀释。（4）以上两者混合均匀，室温孵育10min。（5）孵育完成后，轻轻滴入待转染细胞。（6）4-6h后换为新鲜的10%FBSRPMI1640培养基。（7）siRNA处理细胞24h后，以MOI=1的毒量进行接毒。（8）病毒感染后24h或36h，收集细胞样品，细胞上清用于病毒滴度测定，细胞用于总RNA提取，使用实时荧光定量PCR或WesternBlot方法检测siRNA对靶基因的干扰效率。3.3.6WesternBlot检测蛋白表达水平（1）蛋白样品收集：弃掉培养基，用预冷的PBS将残留的培养基洗掉，再加入预冷的PBS，使用细胞刮将细胞轻轻刮下。将刮下来的细胞小心吹打并收集到1.5mlEP管中，使用低温冷冻离心机4℃2000g离心5min。用预冷的PBS再次洗涤一次，将PBS上清弃除干净。（2）裂解细胞：将蛋白酶抑制剂PMSF及磷酸酶抑制剂NaF加入到PierceIPlysis6buffer中，作为细胞裂解液。按一定比例（10个细胞加入100μl细胞裂解液）加入细胞 46猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究裂解液，将细胞充分重悬混匀后置于冰上进行裂解，至少30min。4℃12000g离心20min，收集上清即为蛋白样品。取少量样品用于蛋白浓度测定，剩余样品进行分装并保存于-80℃。（3）蛋白含量测定：根据thermoscientific公司的BCA试剂盒使用说明书对蛋白样品进行含量测定。首先使用PBS对BSA标准品进行梯度稀释，待测样品稀释10倍进行测定。按照50:1的比例将1倍体积的试剂A加入到50倍体积的试剂B中，充分混匀至工作液变为均匀透明的绿色。将等体积不同浓度的BSA标准品与待测样品同时加入到96孔板中，并加入200μl工作液，置于37℃静置孵育30min。待样品反应完全，温度降到室温后，使用562nm波长进行激发并测定吸光度，保存数据。分析数据时将已知浓度的BSA标准品与吸光度值做标准曲线，然后根据待测样品的吸光度值计算其蛋白浓度。（4）样品变性处理：根据蛋白含量，取适量蛋白加入上样缓冲液，煮沸5min，然后进行SDS-PAGE检测或置于4℃保存。（5）配制SDS-PAGE凝胶：采用标准配方如表3-6，3-7所示，首先配制分离胶待其凝固后配制浓缩胶，丙烯酰胺浓度分别为12%和5%。表3-6SDS-PAGE分离胶配方Table.3-6Thecompositionof12%separationgel试剂名称加入量ddH203.3ml30%丙烯酰胺4.0ml1.5MTris-HCl(pH8.8)2.5ml10%APS0.1ml10%SDS0.1mlTEMED4μl总体积10ml分离胶配制完成后，置于室温凝固30min，待其完全凝固后配制浓缩胶。表3-7SDS-PAGE浓缩胶配方Table.3-7Thecompositionof5%stackinggel试剂名称加入量ddH201.4ml30%丙烯酰胺0.33ml1.5MTris-HCl(pH8.8)0.25ml10%APS0.02ml10%SDS0.02ml 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答47试剂名称加入量TEMED2μl总体积2ml浓缩胶配制完成后，将10孔或15孔梳子轻轻插入，室温静置20min，待彻底凝固可用于SDS-PAGE电泳。（6）SDS-PAGE电泳：根据说明书配制SDS-PAGE电泳缓冲液，组装蛋白胶后用上样针将准备好的蛋白样品上样，小心加入以防样品弥散，每孔蛋白含量一致。在200V电压恒定条件下进行蛋白电泳，至溴酚蓝接近底部停止电泳。（7）转膜：根据说明书配制转膜缓冲液，同时准备甲醇，滤纸，PVDF膜等。将与凝胶大小相近的PVDF膜浸泡于甲醇中30s进行激活，激活后将PVDF膜取出浸泡于转膜缓冲液中。在转膜板上依次放滤纸、PVDF膜、蛋白胶和滤纸，PVDF膜靠近正极且与凝胶之间不要存在气泡，采用100V电压恒定条件进行转膜。（8）封闭：转膜结束后，将PVDF膜小心取出并放入新鲜配制的封闭液中，置于翻转摇床室温孵育1h。（9）孵育一抗：用5%脱脂奶粉分别稀释鼠源actin单抗（1:1000）、兔源RIG-I单抗（1:1000）、兔源MDA5单抗（1:1000）和鼠源Flag单抗（1:1000）。PVDF膜封闭完成后，根据相应蛋白大小，将PVDF膜进行裁剪，然后放入对应的抗体中，置于翻转摇床室温孵育2h。（10）洗膜：一抗孵育结束后，弃除抗体孵育液，加入PBST置于旋转摇床上洗膜，每次清洗15min，共洗4次。（11）孵育二抗：用5%脱脂奶粉稀释HRP标记的羊抗鼠（1:5000）或羊抗兔（1:5000）二抗，将PVDF膜置于二抗孵育液中，置于翻转摇床室温孵育1h。（12）洗膜：二抗孵育结束后，弃除抗体孵育液，加入PBST置于旋转摇床上洗膜，每次10min，共3次。（13）显色：将1:1配制的增强型化学发光显色液滴于PVDF膜上室温孵育1min，将PVDF膜置于凝胶成像扫描仪调整合适的曝光时间进行显色。3.3.7RNA制备及转染3.3.7.1体外转录制备RNA（1）制备3pRNA：根据MEGAshortscript（Ambion）说明书，首先合成3pRNA的DNA模板（含有T7启动子序列），合成序列如表3-10所示。将合成的两条互补DNA在PCR仪上梯度降温进行退火合成双链DNA，以此退火后的双链DNA为模板根据操作说明体外转录合成单链RNA，反应体系如表3-8所示，反应条件为37℃4h。 48猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究表3-8体外转录体系Table.3-8Thereactionsystemofinvitrotranscription试剂名称加入量T7EnzymeMix2μlT710×ReactionBuffer2μlNTPs(75mM)8μlTemplateDNA8μl总体积20μl（2）制备加帽RNA：根据mMESSAGEmMACHINE（Ambion）说明书，先合成含有T7启动子序列的DNA模板，合成序列如表3-10所示。将合成的两条互补DNA在PCR仪上梯度降温进行退火合成双链DNA，以此双链DNA为模板体外转录合成加帽的单链RNA，反应体系如表3-9所示，反应条件为37℃4h。表3-9加帽体外转录体系Table.3-9ThereactionsystemofinvitrocappedRNAtranscription试剂名称加入量T7EnzymeMix2μlT710×ReactionBuffer2μl2×NTP/CAP10μlTemplateDNA6μl总体积20μl（3）纯化：向体外转录体系中加入2μlTURBODNase，37℃水浴15min，将模板DNA充分消化。依据SephadexG-25quickspincolums（Roche）操作说明书，进一步对RNA进行纯化，最终纯化得到的RNA溶于RNase-free水中，然后用Nanodrop2000c（ThermoScientific）对RNA浓度进行测定，分装冻存于-80℃。3.3.7.2RNA转染使用TransMessenger转染试剂对体外转录的RNA进行细胞转染实验，具体步骤如下：（1）准备状态良好的待转染细胞，细胞密度约80%即可进行实验。（2）稀释RNA：将2μl增强试剂加入到100μlEC-R缓冲液中混匀，同时加入1μgRNA，涡旋震荡混匀10s。注意加入EnhancerR必须在RNA之前。（3）室温孵育5min后，瞬离。（4）向反应液中加入4μlTransMessengerRNA转染试剂，用移液枪吹打混匀5次或涡旋震荡混匀10s。（5）室温孵育10min使转染试剂与RNA充分混合。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答49（6）转染混合液加入细胞之前，用PBS对细胞清洗一次。（7）向转染混合液中加入900μl无抗无血清培养基，用移液枪吹打混匀2次，然后滴加到细胞上。（8）于37℃培养箱孵育3h。（9）将培养基更换为含血清及抗生素的新鲜培养基继续培养，根据实验需要在特定时间点收取细胞。表3-10体外转录模板DNA序列Table.3-10DNAoligonucleotidesofPRRSVRNAand3pRNAforinvitrotranscription.目的基因引物（5’-3’）Sense:TAATACGACTCACTATAGGGAAACTAAAAGGGAGAAGTGAAAGTG3pRNAAntisense:CACTTTCACTTCTCCCTTTTAGTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGTTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTTAContRNAAntisense:ATAACCAGGACAAATTGGAGGACAGGAGGTTGGTGAGTGATTGGAGGTTGGGGACTGCGAACTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGTGGGCTGGCATTCTTGAGGBJ-43’UTRCATCTCAGTGTTTGAATTGGAAGAATGTGT1-49Antisense:ACACATTCTTCCAATTCAAACACTGAGATGCCTCAAGAATGCCAGCCCACCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACTGATTGABJ-43’UTRCATTGTGCCTCTAAGTCACC50-88Antisense:GGTGACTTAGAGGCACAATGTCAATCAGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGTATTCAATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTGAGATTTAATTGGCGAGAACCATGCGGCCGBJ-43’UTRAAATT89-151Antisense:AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAATTAAATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATACCCTATAGTGAGTCGTATTA 50猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究目的基因引物（5’-3’）Sense:TAATACGACTCACTATAGGGTGGGCTGGCATTCTTGAGGCATCTCAGTGTTTGAATTGGAAGAATGTGTGGTGAATGGBJ-43’UTRCACTGATTGACATTGTGCCTCTAAGTCACC1-88Antisense:GGTGACTTAGAGGCACAATGTCAATCAGTGCCATTCACCACACATTCTTCCAATTCAAACACTGAGATGCCTCAAGAATGCCAGCCCACCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACTGATTGACATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTGAGATTTAATTGGCGAGAACCATGCGGCCGABJ-43’UTRAATTpseudoknotAntisense:AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAATTAAATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCACAATGTCAATCAGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACTGATTGACACTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTAAAGTTTAATTGGCGAGAACCATGCGGCCGTHN07-13’AATTUTRAntisense:pseudoknotAATTACGGCCGCATGGTTCTCGCCAATTAAACTTTACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCACAGTGTCAATCAGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACTTAATTGCATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTGAGATTGATTGAGCGAGAACCATGCGGCCGBJ-43’UTRAAATTpseudoknotAntisense:SW12AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCTCAATCAATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCACAATGCAATTAAGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:BJ-43’UTRTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACTGATTGApseudoknotCATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTSW2GTGGGGGTGAGATTGATTGAGCGAGAACCATGCGGCCGAAATT 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答51目的基因引物（5’-3’）Antisense:AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCTCAATCAATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCACAATGTCAATCAGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACTTAATTGCATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTGAGATTTAATTGGCGAGAACCATGCGGCCGABJ-43’UTRAATTpseudoknotAntisense:SW1AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAATTAAATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCACAATGCAATTAAGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACAGTTAGTCATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTGAGATGTTAATTGCGAGAACCATGCGGCCGABJ-43’UTRAATTpseudoknotAntisense:OR12AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCAATTAACATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCACAATGACTAACTGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACTGATTGACATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTGTGGGGGTGAGATTAATTTGGCGAGAACCATGCGGCCGABJ-43’UTRAATTpseudoknotAntisense:OR2AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAAATTAATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCACAATGTCAATCAGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGGGTGAATGGCACAGTTAGTCATTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGACCGTBJ-43’UTRGTGGGGGTGAGATTTAATTGGCGAGAACCATGCGGCCGApseudoknotAATTOR1Antisense:AATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAATTAAATCTCACCCCCACACGGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACTTAGAGGCAC 52猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究目的基因引物（5’-3’）AATGACTAACTGTGCCATTCACCCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCGCCTCCAGCAGGGCCGTAAGACGTGGATATTCTCCTGTGTGGCGTCATGTTGAAGTAEAVGTTATTAGCCACCCAGGAACCpseudoknotAntisense:GGTTCCTGGGTGGCTAATAACTACTTCAACATGACGCCACACAGGAGAATATCCACGTCTTACGGCCCTGCTGGAGGCGCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCTGGCGAAGGTCACCTCCTCCACCTAGGCCAGACACTGATTATATGGTTCATATGGGTSHFVAATTACCTTCCCTAGGCTAAGGACTAACTGGTATATACpseudoknotAntisense:GTATATACCAGTTAGTCCTTAGCCTAGGGAAGGTAATTACCCATATGAACCATATAATCAGTGTCTGGCCTAGGTGGAGGAGGTGACCTTCGCCAGCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCTGCTTAAGAGTTACAATGTAAGTCATGTCAGTCAGATGCAGCGACTCAGCCTTTTGTLDVAATTAATTGCGATTTGGCTGGGCCGGAATTpseudoknotAntisense:AATTCCGGCCCAGCCAAATCGCAATTAATTACAAAAGGCTGAGTCGCTGCATCTGACTGACATGACTTACATTGTAACTCTTAAGCAGCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCGCCTCACGACGGGCCGTAAGACGTGGATATTCTCCTGTGTGGCGTCATGTTGAAGTAEAVGTTATTAGCCACCCAGGAACCpseudoknotAntisense:OR4GGTTCCTGGGTGGCTAATAACTACTTCAACATGACGCCACACAGGAGAATATCCACGTCTTACGGCCCGTCGTGAGGCGCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCGCCTCCAGCAGGGCCGTAAGACGTGGATATTCTCCTGTGTGGCGTCAGTTGTAAGTAEAVGTTATTAGCCACCCAGGAACCpseudoknotAntisense:OR5GGTTCCTGGGTGGCTAATAACTACTTACAACTGACGCCACACAGGAGAATATCCACGTCTTACGGCCCTGCTGGAGGCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答53目的基因引物（5’-3’）Sense:TAATACGACTCACTATAGGGCGCCTCACGACGGGCCGTAAGACGTGGATATTCTCCTGTGTGGCGTCAGTTGTAAGTAEAVGTTATTAGCCACCCAGGAACCpseudoknotAntisense:OR45GGTTCCTGGGTGGCTAATAACTACTTACAACTGACGCCACACAGGAGAATATCCACGTCTTACGGCCCGTCGTGAGGCGCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCGCCTCTGTTGGGGCCGTAAGACGTGGATATTCTCCTGTGTGGCGTCATGTTGAAGTAEAVGTTATTAGCCACCCAGGAACCpseudoknotAntisense:SW4GGTTCCTGGGTGGCTAATAACTACTTCAACATGACGCCACACAGGAGAATATCCACGTCTTACGGCCCCAACAGAGGCGCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCGCCTCCAGCAGGGCCGTAAGACGTGGATATTCTCCTGTGTGGCGTCACAGCAAAGTAEAVGTTATTAGCCACCCAGGAACCpseudoknotAntisense:SW5GGTTCCTGGGTGGCTAATAACTACTTTGCTGTGACGCCACACAGGAGAATATCCACGTCTTACGGCCCTGCTGGAGGCGCCCTATAGTGAGTCGTATTASense:TAATACGACTCACTATAGGGCGCCTCTGTTGGGGCCGTAAGACGTGGATATTCTCCTGTGTGGCGTCACAGCAAAGTAEAVGTTATTAGCCACCCAGGAACCpseudoknotAntisense:SW45GGTTCCTGGGTGGCTAATAACTACTTTGCTGTGACGCCACACAGGAGAATATCCACGTCTTACGGCCCCAACAGAGGCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA3.3.8RNA二级结构预测3.3.8.1利用生物信息学软件预测RNA二级结构本实验中RNA二级结构预测使用Mfold3.2在线软件：http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold。RNA二级结构预测采用标准参数即37℃1MNaCl，无二价离子，碱基配对无最大距离限制。3.3.8.2使用RNAviz软件编辑RNA二级结构Mfold预测后的RNA二级结构保存为str格式，然后根据需要用RNAviz软件进行编辑。 54猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究3.3.9真核表达载体构建3.3.9.1cDNA模板制备用PRRSVBJ-4感染PAM12h后，提取样品RNA。以总RNA为模板对样品进行反转录。在冰上配制反转录反应液如表3-11所示，在PCR仪上进行反转录，程序为42℃1h，75℃15min，反转录结束后置于4℃备用。表3-11反转录体系Table.3-11Thereactionsystemofreversetranscription试剂名称加入量5×AMVBuffer10μlRTaseAMV1.25μldNTPMixture2.5μlRNaseInhibitor1.25μlTemplateRNA5μl总体积20μl3.3.9.2目的基因的克隆根据GenBank猪RIG-I（GenBank登录号：EU126659）和猪TLR3（GenBank登录号：NM_001097444）的序列设计引物，并由上海生物工程有限公司合成。目的基因克隆引物序列如表3-12所示。表3-12载体构建所需引物Table.3-12SequencesofprimersusedforvectorconstructionorPCRamplification.基因名称引物（5’-3’）Sense:AGGATGATGATGATAAAGGTACAGCAGAGCAGCGGCGGpRIG-I(1-943aa)Antisense:TGAAGATTGAGGACCTGATATCACTCAAGGTTGCCCATTCCSense:AGGATGATGATGATAAAGGTATGACAGCAGAGCAGCGGpRIG-I-N(1-172aa)Antisense:TGAAGATTGAGGACCTGATATCATTTCAAAGTTTTAGGCCAATTCTCSense:AGGATGATGATGATAAAGGTCTTGCTTTACCTGCTpRIG-I-HelicaseCAG(249-779aa)Antisense:TGAAGATTGAGGACCTGATATCATACTGCTTCATCCCATG 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答55基因名称引物（5’-3’）Sense:AGGATGATGATGATAAAGGTAGGGATAATCAAGGAAAACCAGpRIG-I-RD(795-928aa)Antisense:TGAAGATTGAGGACCTGATATCAGGCCATTTCTGCAGCSense:GCTCTAGATAAGCCACCATGGATTATAAGGATGATGATGATAAAGGTGATTATAAGGATGATGATGATpTLR3-TIR(27-703aa)AAAGGTAACAAATGTACTGTTAGACATGAAATAGCAntisense:GGGGTACCTCAAAATGGGGCACTGTCTTTGCASense:GCTCTAGATAAGCCACCATGGATTATAAGGATGATGATGATAAAGGTGATTATAAGGATGATGATGATpTLR3-ECDAAAGGTGAAGGCTGGCGGATATCTTTTTATTGG(727-905aa)Antisense:GGGGTACCTTAATGTACTGAATTTCTGGAACCAAGTGCPCR反应体系如表3-13所示，反应程序为（1）预变性：98℃，2min。（2）PCR扩增：98℃，30s，55℃30s，72℃1min，进行35个循环。（3）延伸：72℃8min。（4）4℃保存。表3-13PCR体系Table.3-13ThereactionsystemofPCR试剂名称加入量2×Q5ReactionBuffer10μlQ5DNA聚合酶1μl上游引物1μl下游引物1μl模板cDNA7μl总体积20μl3.3.9.3PCR产物回收连接转化。（1）将PCR产物进行核酸电泳，回收目的条带。（2）利用双酶切方法对目的基因及载体（pEF-BOS）同时酶切并回收，用T4DNA连接酶进行连接。 56猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究（3）按标准操作转化感受态细胞JM109。3.3.9.4阳性克隆鉴定及测序。（1）采用菌液PCR方法初步筛选阳性克隆。（2）将阳性克隆提取质粒并送公司进行测序。3.3.10RNA-pulldown实验3.3.10.1脱硫生物素标记RNA（1）根据3.3.7步骤体外转录制备RNA（2）脱硫生物素标记RNA：A将待标记RNA与对照RNA各取8μl于85℃水浴锅中热激3-5min，立即置于冰上。B配制连接反应体系，用T4RNA连接酶进行连接，反应体系如表3-14所示。表3-14RNA连接体系Table.3-14ThereactionsystemofRNAligation试剂名称加入量10×RNALigaseReactionBuffer3μlT4RNA连接酶2μlBiotinylatedCytidineBisphosphate1μlRNaseInhibitor1μl待标记RNA8μlPEG30%15μl总体积30μlC将此反应体系置于16℃过夜反应。D连接反应结束后加入70μl无RNase水。E加入100μl氯仿异戊醇将RNA连接酶抽提，涡旋震荡后以高转速离心2-3min，轻轻吸取上层液到另一个无RNaseEP管中。F加入10μl5MNaCl，1μl肝糖原和300μl冰上预冷的无水乙醇，在-20℃沉淀1h。G4℃13000g离心15min，小心倒掉上清。H用70%冰上预冷的乙醇洗涤沉淀一次后，风干5min。I用20μl无RNase水重悬RNA沉淀。3.3.10.2RNApulldown实验（1）细胞转染：准备Flag-pRIG-I-FL、Flag-pRIG-I-N、Flag-pRIG-I-Helicase、Flag-pRIG-I-RD/CTD、Flag-pTLR3-ECD和Flag-pTLR3-TIR质粒置于冰上待用，转染试剂为LTXPlus。转染试剂与质粒的比例需要进行优化，以得到最佳表达量。细胞转染具体实验步骤如下： 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答57A铺设HEK293T细胞板，待细密度约80%时进行质粒转染实验。B用100μlOptiMEM对转染试剂LTX进行稀释。C用100μlOptiMEM对需要转染的质粒进行稀释，同时按比例加入Plus试剂。D将以上两者混合均匀，室温孵育10min。E轻轻滴入待转染细胞。F6h后更换为新鲜的培养基。G细胞转染48h后裂解并收集细胞。（2）裂解细胞：准备细胞裂解液含有蛋白酶抑制剂（Cocktail）及RNA酶抑制剂置于冰上待用。将处理后的HEK293T细胞用PBS轻轻洗2次，然后加入10ml预冷的PBS将细胞用细胞刮刮下来并转移到离心管中，4℃1500g离心5min，弃掉上清，用准备好的裂解液重悬细胞，混匀后于冰上静置5min使细胞彻底裂解，分装冻于-80℃。（3）将标记的RNA与磁珠连接：A向1.5mlEP管中各加50μl链霉亲和素磁珠。B用磁力架将磁珠吸附到一侧，弃掉上清。C加入50μl20mMTris（pH7.5）缓冲液重悬磁珠，清洗2次。D用磁力架将磁珠吸附到一侧，弃掉上清。E加入50μl1×RNACaptureBuffer，重悬磁珠并加入50pmol标记的RNA混合均匀。F室温孵育20min。（3）将蛋白与标记的RNA结合：A用磁力架将磁珠吸附到一侧，弃掉上清。B用50μl20mMTris（pH7.5）缓冲液清洗2次。C用磁力架将磁珠吸附到一侧，弃掉上清。D加入100μl1×Protein-RNA结合缓冲液，混匀。E准备RNA蛋白结合反应液，反应体系如表3-15所示。表3-15RNA蛋白结合反应体系Table.3-15ThereactionsystemofRNA-ProteinBinding试剂名称加入量10×Protein-RNABindingBuffer10μl50%甘油30μl细胞裂解液30μl无RNase水30μl总体积100μlF用磁力架将磁珠吸附到一侧，弃掉上清，加入配制好的RNA蛋白结合反应液。 58猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究G置于4℃旋转孵育60min。（3）洗脱RNA结合的蛋白质：A用磁力架将磁珠吸附到一侧，收集上清液待用。B加入100μl1×洗液清洗两次，用磁力架将磁珠吸附到一侧，收集上清液待用。C加入50μl洗脱缓冲液涡旋混匀，37℃孵育15min。D用磁力架将磁珠吸附到一侧，收集上清液，即为目的蛋白。E处理蛋白样品进行WesternBlot分析。3.3.11统计学分析所有实验均至少进行三次独立重复，数据分析采用GraphPadPrism7.0软件进行，统计学分析采用Student’sttest进行，p值小于0.05表示数据间有显著差异。3.4实验结果与分析3.4.1PRRSV感染诱导抗病毒免疫应答3.4.1.1PRRSV感染CRL2843-CD163细胞诱导抗病毒免疫应答为揭示在PRRSV感染过程中宿主天然免疫应答机制，本研究首先评价了PRRSV不同毒株感染CRL2843-CD163细胞后诱导Ⅰ型干扰素（IFN-β）的水平。PRRSVBJ-4和HP-PRRSVHN07-1毒株按照MOI=1感染CRL2843-CD163细胞，未感染细胞作为阴性对照。病毒感染24、48和72h后收集细胞，用Trizol将细胞裂解，提取细胞总RNA，并进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板用SYBRGreen染料进行qRT-PCR反应，检测细胞内IFN-βmRNA的相对表达量，以未感染细胞的IFN-βmRNA表达水平设置为1。结果表明，PRRSV不同毒株感染CRL2843-CD163细胞后均能诱导IFN-βmRNA水平上调，两种毒株均在感染后48hIFN-βmRNA表达水平达到最高（如图3-1A）。为探讨PRRSV感染诱导IFN-βmRNA是否具有剂量依赖效应，将PRRSV以不同剂量（MOI=0.01、0.1或1）感染CRL2843-CD163细胞，同时以poly(I:C)作为阳性对照，感染后24h收集细胞，用qRT-PCR方法检测细胞内IFN-βmRNA的相对表达量，以未感染细胞的IFN-βmRNA表达水平设置为1。结果表明，PRRSV呈剂量依赖性诱导细胞内IFN-βmRNA表达（图3-1B）。同时本研究分析了PRRSV感染对IFN-β启动子活性的影响，CRL2843-CD163细胞同时转染pGL4.17-IFN-β及内参质粒pRL-TK，转染24h后用不同剂量的PRRSV感染细胞，病毒感染24h后用双荧光报告试剂盒检测细胞内荧光素酶活性，实验过程中以未感染细胞作为阴性对照，以poly(I:C)刺激作为阳性对照。双荧光素酶检测结果表明，与未感染细胞相比，PRRSV感染后IFN-β启动子活性至少增强了5倍，表明PRRSV感染可以显著上调IFN-β启动子活性并呈剂量依赖性（图3-1C）。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答59图3-1PRRSV感染CRL2843-CD163细胞诱导IFN产生（A）CRL2843-CD163感染BJ-4或HN07-1（MOI=1）,以未感染细胞为对照，病毒感染后24、48和72h后收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-βmRNA表达水平。（B）PRRSVBJ-4以MOI=0.01、0.1、1.0和10分别感染CRL2843-CD163，以未感染细胞为阴性对照，以转染1μgpoly(I:C)为阳性对照，24h后收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-βmRNA表达水平。（C）CRL2843-CD163转染1μgIFN-β-Luc和100ngpRL-TK质粒后，PRRSVBJ-4以MOI=0.05、0.1和0.5分别感染CRL2843-CD163，24h后收集细胞，双荧光报告基因检测细胞内IFN-β启动子活性。RE：相对表达量；RLU：相对荧光强度。Fig.3-1IFNinductioninCRL2843-CD163inresponsetoPRRSVinfection.(A)CRL2843-CD163cellswereeithermock-infected(Control)orinfectedwiththePRRSVBJ-4orHN07-1(MOI=1.0),respectively.At24,48,72hpi,theIFN-βmRNAlevelsinthecellsweredeterminedbyqRT-PCR.(B)CRL2843-CD163cellswereeithermock-infected(Control)orinfectedwiththePRRSVBJ-4atanMOI=0.01,0.1,1.0and10,respectively.At24hpi,theIFN-βmRNAlevelsinthecellsweredeterminedbyqRT-PCR.Transfectionof1μgpoly(I:C)wasusedaspositivecontrol.(C)CRL2843-CD163cellsweretransfectedwith1μgIFN-β-Lucand100ngpRL-TKrenillaluciferasereporterplasmid,followedbyinfectionwiththePRRSVBJ-4atanMOI=0.05,0.1and0.5,respectively,ortransfectionof1μgpoly(I:C).At24hpi,theIFN-βreporterlevelsinthecellsweredeterminedbyluciferaseactivity.RE,relativeexpression.RLU,relativeluciferaseunits.3.4.1.2PRRSV感染PAM诱导抗病毒免疫应答为进一步研究PRRSV感染对干扰素产生的影响，本研究在PRRSV天然宿主细胞PAM上评价了PRRSV不同毒株感染后诱导Ⅰ型干扰素（IFN-α、IFN-β）、Ⅱ型干扰素（IFN-γ）、Ⅲ型干扰素（IFN-λ1）以及干扰素刺激基因PKR、OAS、ISG56和MX1的表达水平。PRRSVBJ-4和HP-PRRSVHN07-1毒株按照MOI=1感染PAM，未感染细胞作为阴性对照。病毒感染6、12、24和48h后收集细胞，使用qRT-PCR检测细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ1、PKR、OAS、ISG56和MX1mRNA的相对表达量，以未感染细胞的mRNA表达水平设置为1。结果显示，PRRSVBJ-4感染PAM后均能诱导IFN-α和IFN-βmRNA水平上调，且在12h达到高峰，mRNA水平升高倍数分别为17.1倍及192倍（图3-2）。高致病性毒株PRRSVHN07-1感染PAM后，其IFN-α、IFN-β产生 60猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究与BJ-4类似，但是分别在48h达到峰值5.34倍及24h到达峰值191倍，此结果显示HN07-1与BJ-4相比其对细胞的刺激效应更缓慢且更低。然而IFN-γ、IFN-λ1的表达水平不高，直到感染后6h或12h才能检测到低水平表达。同时我们评价了PRRSV感染后PKR、OAS、ISG56和MX1mRNA的相对表达量，这些基因mRNA在PRRSV感染后都能表达，且在24h达到最高。图3-2PRRSV感染PAM诱导IFN产生（A，B）PAM分别感染BJ-4和HN07-1（MOI=1），以未感染细胞为阴性对照，6、12、24和48h后收集细胞，qRT-PCR分析IFN-β、IFN-α、IFN-γ、IFN-λ1、PKR、OAS、ISG56和MX1mRNA表达水平，每次实验至少重复三次，RE：相对表达量。Fig.3-2IFNinductioninPAMinresponsetoPRRSVinfection.(A,B)PAMsweremock-infected(Control)orinfectedwiththePRRSVBJ-4orHN07-1(MOI=1).TotalRNAwasextractedfromcelllysates.IFN-β,IFN-α,IFN-γ,IFN-λ1,PKR,OAS,ISG56andMX1werequantifiedbyqRT-PCRattheindicatedtimes.RE,relativeexpression.3.4.1.3灭活的PRRSV不能诱导抗病毒免疫应答为研究灭活的PRRSV是否能诱导抗病毒免疫应答，本实验中采用UV灭活和热灭活两种方法对PRRSV进行灭活，以未感染细胞为阴性对照，以未灭活病毒为阳性对照，以相同的MOI感染PAM，感染6、12和24h后，使用qRT-PCR检测细胞内IFN-α、IFN-β、ISG56和MX1mRNA的相对表达量，以未感染细胞的mRNA表达水平设置为1，采用绝对定量的方法分析细胞上清及细胞内PRRSV含量，结果显示，与未灭活的病毒相比，UV灭活和热灭活的病毒均不能感染细胞，表明病毒灭活成功（图3-3）。同时对灭活病毒诱导的IFN-α、IFN-β、ISG56和MX1mRNA进行分析，发现与未灭活病毒相比，这些基因的mRNA水平都没有上调，尤其是UV灭活的病毒不能诱导干扰素相关基因的上调，表明宿主的免疫识别和PRRSV复制相关。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答61图3-3UV灭活和热灭活的PRRSV未能诱导干扰素（A，B）PAM分别感染PRRSVBJ-4（MOI=1）,UV灭活的PRRSVBJ-4（MOI=1），热灭活的PRRSVBJ-4（MOI=1）以未感染细胞为阴性对照，病毒感染后6、12和24h收集细胞上清测定细胞上清中PRRSVBJ-4的含量，同时收集细胞qRT-PCR测定细胞内IFN-β、IFN-α、ISG56和MX1mRNA表达水平，及细胞内PRRSVBJ-4的含量。Fig.3-3UVandHeat-inactivatedPRRSVfailedtoinduceIFNinPAM.(A,B)PAMsweremock-infected(Control)orinfectedwithPRRSVstrainBJ-4(MOI=1),UV-inactivated,heat-inactivatedBJ-4inPAMs.IFN-β,IFN-α,ISG56andMX1werequantifiedbyqRT-PCRattheindicatedtimes.ViralcopynumberswereperformedbyanalysisofORF7RNAlevels.RE,relativeexpression.3.4.2PRRSV诱导IFN与RIG-I、MDA5和TLR3相关3.4.2.1在CRL2843-CD163细胞中PRRSV诱导IFN与RIG-I、MDA5和TLR3相关PRRSV感染可以被免疫系统识别，进而激发宿主细胞的抗病毒免疫应答，然而具体识别机制还未研究清楚。本实验使用抑制剂及siRNA基因沉默的方法，进一步研究了不同的宿主模式识别受体在PRRSV感染过程中的作用，主要分析了与RNA免疫识别相关的宿主模式识别受体，如位于细胞浆中的RIG-I和MDA5以及位于胞内体上的TLR3及TLR7。首先，我们使用胞内体抑制剂氯喹来抑制胞内体上的TLR3和TLR7的酶活性，以不同剂量抑制剂处理1h后，向细胞接种同等剂量的PRRSVBJ-4病毒，同时以poly(I:C)刺激作为阳性对照，用qRT-PCR方法检测细胞内IFN-βmRNA表达水平。氯喹对于poly(I:C)刺激所诱导的IFN-β表达水平呈剂量依赖的抑制作用，这与之前报道poly(I:C)被胞内体上的TLR3受体识别并诱导IFN产生一致，同时氯喹对于PRRSV感染所诱导的IFN-β表达水平同样呈剂量依赖的抑制作用，表明PRRSV所诱导的IFN-β与胞内体上的模式识别受体TLR3/7相关（图3-4A）。同时，我们采用siRNA基因沉默的方法，设计并合成特异性靶向RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的siRNA，将此siRNA以合适的浓度转染到CRL2843-CD163细胞中，24h后接种相同剂量的PRRSV，病毒感 62猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究染36h后收集细胞上清液用于测定TCID50，使用qRT-PCR方法分析siRNA的沉默效率以及细胞内IFN-βmRNA表达水平。结果表明，siRNA对于靶基因RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的沉默效率都高于70%，靶基因沉默成功（图3-4B）。对IFN-βmRNA表达水平进行分析发现，当RIG-I、MDA5和TLR3被沉默后其IFN-βmRNA表达水平也显著下降，然而TLR7沉默对于IFN-β的表达水平没有显著影响。对细胞上清中病毒的TCID50进行分析，结果表明当RIG-I、MDA5和TLR3被沉默后细胞上清中的病毒含量显著升高至少2.18倍。病毒含量升高与IFN-βmRNA表达水平显著下降呈正相关性，然而TLR7沉默对于上清中的病毒含量没有显著影响。以上结果表明，PRRSV刺激细胞产生IFN与RIG-I，MDA5和TLR3相关。图3-4在CRL2843-CD163细胞中PRRSV诱导IFN与RIG-I，MDA5和TLR3相关（A）CRL2843-CD163预处理0μM,20μM,40μM或80μM氯喹1h后，感染PRRSVBJ-4（MOI=1）同时转染1μgpoly(I:C)作为阳性对照，24h后收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-βmRNA表达水平。（B）CRL2843-CD163预处理RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的siRNA同时以siNC为阴性对照，感染PRRSVBJ-4(MOI=1)，36h后收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-βmRNA表达水平及RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的敲低效率，同时收集细胞上清检测细胞上清中PRRSVBJ-4的含量。Fig.3-4IFNinductionbyPRRSVisdependentonRIG-I,MDA5andTLR3inCRL2843-CD163.(A)CRL2843-CD163cellswerepretreatedwith0μM,20μM,40μMor80μMchloroquinefor1h,followedbyinfectionwithPRRSVBJ-4(MOI=1)24hortransfectionwith1μgpoly(I:C)for24hinthepresenceofinhibitor.IFN-βmRNAproductionwasdeterminedbyqRT-PCR.(B)CRL2843-CD163cellsweretreatedwithcontrolsiRNA(NC)ortheindicatedsiRNAsagainstRIG-I,MDA5,TLR3,TLR7andtheninfectedwithPRRSVBJ-4(MOI=1).At36hpi,totalRNAsweresubjectedtoqRT-PCRanalysisforIFN-βmRNA.KnockdownefficiencywasanalyzedbyqRT-PCR.3.4.2.2在PAM中PRRSV诱导IFN与RIG-I、MDA5和TLR3相关为进一步验证RIG-I，MDA5和TLR3在PRRSV诱导IFN过程中的作用，我们同时在PRRSV天然宿主细胞PAM上进行了验证。采用siRNA基因沉默的方法，分别沉默RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7，24h后接种相同剂量的PRRSV，感染24h后收集细胞上清液用于测定TCID50，qRT-PCR方法分析siRNA的沉默效率以及IFN-α/βmRNA 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答63表达水平。qRT-PCR及WestrnBlot结果表明，siRNA在PAM上对于靶基因RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的沉默效率都高于60%，靶基因沉默成功（图3-5）。对IFN-α/βmRNA表达水平分析发现，当RIG-I、MDA5和TLR3被沉默后其IFN-α/βmRNA表达水平也显著下降，然而TLR7沉默对于IFN-α/β没有显著影响。对细胞上清中病毒的TCID50进行分析，结果表明当RIG-I、MDA5、TLR3被沉默后细胞上清中的病毒含量显著升高至少2倍，此结果与CRL283-CD163细胞上的结果一致。上述结果表明在PAM中PRRSV诱导IFN与RIG-I，MDA5和TLR3相关。图3-5在CRL2843-CD163细胞中PRRSV诱导IFN与RIG-I，MDA5和TLR3相关（A）PAM预处理RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的siRNA同时以siNC为阴性对照，感染PRRSVBJ-4(MOI=1)，12h后收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-β/αmRNA表达水平及RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的敲低效率，同时收集细胞上清检测细胞上清中PRRSVBJ-4的含量。（B）WesternBlot检测RIG-I、MDA5敲除效率。Fig.3-5IFNinductionbyPRRSVisdependentonRIG-I,MDA5andTLR3inPAMs.(A)PAMsweretreatedwithcontrolsiRNA(NC)ortheindicatedsiRNAsandtheninfectedwithPRRSVBJ-4(MOI=0.5).At12hpi,totalRNAsweresubjectedtoqRT-PCRanalysisforIFN-β,andIFN-αmRNAandthesupernatantswerecollectedforTCID50determination.KnockdownefficiencywasanalyzedbyqRT-PCR(A)andwesternblot(B).RE,relativeexpression.3.4.3PRRSV基因组5’UTR和3’UTR能诱导IFN产生之前研究表明，具有复杂结构的RNA，例如A型流感病毒（IAV）的柄状结构，可以作为病原相关分子模式被宿主模式识别受体识别从而激活天然免疫反应(Liuetal.2015)。由于PRRSV基因组5’UTR和3’UTR具有复杂的结构，同时套式病毒目的病毒基因组及亚基因组都含有共同的5’UTR和3’UTR结构，其对于病毒复制至关重要，本研究分析了具有复杂结构的5’UTR和3’UTR区域对于免疫识别的作用。我们用体外转录的方法成功得到了PRRSV5’UTR和3’UTRRNA，以相同剂量转染PAM，研究其是 64猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究否能够被宿主模式识别受体识别诱导IFN产生。如图3-6A和B所示，PRRSV基因组5’UTR和3’UTRRNA均能显著诱导IFN产生，且呈剂量依赖性。为进一步研究PRRSV基因组5’UTR和3’UTR诱导IFN的具体结构域，我们采用生物信息学方法利用在线RNA二级结构预测软件Mfold对PRRSV基因组5’UTR和3’UTR的二级结构进行预测，如图3-6C和D所示，PRRSV基因组5’UTR含有5个茎环结构，3’UTR含有2个茎环结构。基于此预测的二级结构，我们设计并合成了5条5’UTR截短的RNA（1-47、46-79、71-108、107-158和155-190）以及3条3’UTR截短的RNA（1-16&131-151、15-84和79-131），并将这些截短的RNA分别转染CRL2843-CD163和PAM，然而这些截短的RNA都未能有效地诱导IFN产生（图3-6E和F）。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答65图3-6PRRSV基因组5’UTR和3’UTR能诱导IFN产生（A,B）PAM分别转PRRSVBJ-4基因组5’UTR或3’UTR不同剂量RNA(0.25,0.5或1μg)，同时以不转染RNA为阴性对照，以转染1μgpoly(I:C)为阳性对照，转染后6h收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-β、IFN-αmRNA表达水平。（C,D）示意图表示Mfold预测的PRRSVBJ-4基因组5’ 66猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究UTR、3’UTR二级结构。（E,F）CRL2843-CD163或PAMs转染1μg截短的PRRSVBJ-4基因组5’UTR、3’UTR，同时转染1μgpoly(I:C)作为阳性对照，未转染RNA作为阴性对照，转染后6h收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-βmRNA表达水平。Fig.3-6Thefull-length5’and3’UTRofPRRSVinduceanIFNresponse.(A,B)PAMsweretransfectedwiththeentire5’UTRor3’UTRtranscriptsofPRRSVBJ-4atdifferentdoses(0.25,0.5or1μg),poly(I:C)(1μg)ornoRNAcontrol,respectively.At6hpost-transfection,RNAwasisolatedtodetermineIFN-βandIFN-αmRNAlevelsbyqRT-PCR.(C,D)Aschematicrepresentationof5’UTRand3’UTRofBJ-4wasshown.(E,F)CRL2843-CD163orPAMsweretransfectedwith1μgof5’UTRor3’UTRtruncatedtranscriptsofPRRSVBJ-4genome,poly(I:C),ornoRNAcontrolfor6h.Then,theIFN-βmRNAlevelsinthecellswereanalyzedbyqRT-PCR.RE,relativeexpression.3.4.4PRRSV基因组3’UTR假结结构是诱导IFN的关键3.4.4.1PRRSV基因组3’UTR假结结构是诱导IFN的关键由于Mfold软件预测的RNA二级结构主要基于能量最低原则，然而在病毒复制过程中可能存在其它的构象，有研究报道，在PRRSVRNA合成过程中，PRRSV3’UTR末端的两个茎环结构存在构象改变，可以形成假结结构，这种构象改变作为重要的分子开关调控病毒复制过程(Beerensetal.2007b)。同时本研究发现PRRSV诱导IFN产生与病毒复制相关（图3-3），因此，我们猜想，PRRSV3’UTR假结结构可能作为PAMP在PRRSV复制过程中被宿主PRRs识别。根据此假结结构对PRRSV3’UTR区域进行截短（1-49、50-88、89-151、1-88和50-151）并体外转录合成RNA，同时将这些截短的RNA片段转染PAM，转染后6和12h分析其诱导IFN的能力。实验结果显示，这些截短的片段与5’UTR和3’UTR全长都能诱导IFN-α/β产生，然而各片段的诱导能力不同，其中50-151片段即3’UTR假结结构诱导IFN-α/β的能力最强（图3-7B和C）。为进一步分析50-151假结结构对IFN产生的影响，在Marc145细胞上分析了此假结结构片段对于IFN-β启动子活性的影响。双荧光素酶活性检测实验结果表明50-151假结结构与对照相比能显著增强IFN-β启动子活性（图3-7D）。为研究PRRSV基因组3’UTR假结结构在不同时间点诱导干扰素的情况，在PAM上同时转染3’UTR全长以及假结结构片段，以poly(I:C)为阳性对照，转染后6、12和24h收集细胞，qRT-PCR方法检测IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA表达量。结果如图3-7E所示，IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA分别在6、12和6h达到峰值。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答67图3-7PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN产生（A）示意图表示PRRSVBJ-43’UTR假结结构，假结间相互作用的核苷酸标记为灰色，连线的为配对碱基。（B,C）PAM转染PRRSVBJ-4基因组3’UTR截短片段(1-151,1-49,50-88,89-151,1-88,50-151(假结结构))以未感染细胞为阴性对照，转染后6h或12h收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-β和IFN-αmRNA表达水平。（D）Marc145转染1μgIFN-β-Luc和100ngpRL-TK质粒后，转染1μgBJ-43’UTR1-151、BJ-43’UTR、BJ-43’UTR50-88RNA片段，以未转染细胞为阴性对照，0、6、12、24h分别收集细胞检测IFN-β启动子活性。（E）PAM转染1μgPRRSVBJ-4基因组3’UTR片段，转染6、12和24h分别收集细胞qRT-PCR检测细胞内IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA表达水平。Fig.3-7The3’UTRpseudoknottranscriptsofPRRSVBJ-4induceanantiviralresponse.(A)Aschematicrepresentationof3’UTRpseudoknotofPRRSVBJ-4.Thenucleotidesinvolvedinthepseudoknotinteractionaremarkedingray,andthebase-pairinginteractionisdepictedbylines.(B,C)PAMsweretransfectedwith1μgof3’UTRtruncatedtranscriptsofPRRSVBJ-4genome(1-151,1-49,50-88,89-151,1-88,50-151(pseudoknot))for6hor12h,theIFN-βandIFN-αmRNAlevelsinthecellswereanalyzedbyqRT-PCR.(D)Marc145cellswereco-transfectedwithplasmidsencodingconstitutiverenillaluciferaseandIFN-βpromoterfireflyluciferaseconstruct.After24h,thecellsweretransfectedwith1μgoftheindicatedRNAs(BJ-43’UTR1-151,BJ-43’UTRpseudoknot,BJ-43’UTR50-88)constructsorcontrol.Cellswereharvested0,6,12,24hlaterfordualluciferaseassay.(E)PAMsweretransfectedwith1μgof3’UTR1-151or3’UTRpseudoknottranscriptsofPRRSVBJ-4genomefor6h,12h,24h,theIFN-β,IFN-αandISG56mRNAlevelsinthecellswereanalyzedbyqRT-PCR. 68猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究3.4.4.2PRRSV基因组3’UTR假结结构呈剂量依赖性诱导IFN为进一步分析PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN的特征，我们在PAM上比较了低致病性经典毒株BJ-4与高致病性毒株HN07-1基因组的3’UTR假结结构诱导IFN的能力，使用体外转录得到的不同剂量（0.125、0.25、0.5和1μg）的BJ-4和HN07-13’UTR假结结构转染PAM，同时以转染poly(I:C)作为阳性对照，以未转染细胞作为阴性对照，转染后6和12h分别收取细胞，用qRT-PCR方法检测细胞内IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA的表达水平，结果如图3-8所示，PRRSVBJ-4和HN07-1的3’UTR假结结构均能有效诱导IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA显著上调，并无毒株特异性；各假结结构诱导IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA的能力呈剂量依赖性。图3-8PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN产生（A,B）PAM转染0.125,0.25,0.5和1μgPRRSV基因组3’UTR假结片段，转染后6h（A）或12h（B）收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA表达水平，转染1μgpoly(I:C)作为阳性对照。Fig.3-8The3’UTRpseudoknottranscriptsofPRRSVBJ-4induceanantiviralresponse.(A,B)PAMsweretransfectedwith0.125,0.25,0.5and1μgofthe3’UTRpseudoknottranscriptsofPRRSVBJ-4orHN07-1genomefor6h(A)or12h(B),theIFN-β,IFN-αandISG56mRNAlevelswereanalyzedbyqRT-PCR.Transfectionof1μgpoly(I:C)wasusedforpositivecontrol.ControlstandsfornoRNAtreatment.RE,relativeexpression.3.4.5PRRSV基因组3’UTR假结之间的相互作用是诱导IFN产生的关键之前研究报道，PRRSV基因组3’UTR假结之间的相互作用对于PRRSV的复制至关重要，破坏其相互作用则病毒复制不能进行，因此，本实验分析了PRRSV基因组3’ 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答69UTR假结之间的相互作用对PRRSV诱导IFN产生的影响。首先根据PRRSV基因组3’UTR假结之间的相互作用的模型，设计并合成了一系列突变体，如图3-9所示，这些突变体仅破坏假结之间的相互作用，并不影响其二级结构中两个茎环结构的形成，具体突变策略如下：（1）在突变体SW1和SW2中，破坏了PRRSV基因组3’UTR茎环结构SL1与SL2之间的相互作用，通过将SL1或SL2loop区域的7个相互作用碱基换成另一个茎环的7个碱基从而破坏了两个茎环之间的相互作用。（2）在突变体SW12中，将SL1和SL2loop区域的7个相互作用碱基同时互换，因此恢复了SL1和SL2茎环结构之间的相互作用。（3）在突变体OR1和OR2中，分别改变了PRRSV基因组3’UTR茎环结构SL1或SL2loop区域的7个相互作用碱基的顺序，从而破坏了SL1和SL2茎环结构之间的相互作用。（4）在突变体OR12中，同时改变了PRRSV基因组3’UTR中茎环结构SL1与SL2loop区域的7个相互作用碱基的顺序，从而恢复了SL1和SL2茎环结构之间的相互作用。分别将这些突变体RNA与未突变的PRRSV基因组3’UTR假结结构转染PAM，以未转染细胞作为阴性对照，转染后6和12h收集细胞，并用qRT-PCR方法比较其诱导IFN-β和IFN-α的能力，如图3-9所示，突变体SW1，SW2，OR1，OR2与未突变的RNA相比其诱导IFN的能力显著下降，而突变体OR12和SW12诱导IFN-β和IFN-α的能力并无显著变化。因此，假结结构的两个茎环之间相互作用对于其有效诱导IFN-β和IFN-α产生具有重要作用。 70猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图3-9PRRSV基因组3’UTR假结结构突变破坏了IFN刺激效应（A）示意图表示PRRSV基因组3’UTR假结结构突变策略，假结相互作用的7个核心碱基互换或改变方向，回复突变为同时互换或改变方向。（B,C）PAM同时转染PRRSV基因组3’UTR假结结构及其突变体，以未感染细胞为阴性对照，转染后6h（B）或12h（C）收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-β和IFN-αmRNA表达水平Fig.3-9ThepseudoknotmutationssignificantlyweakenIFNstimulatoryactivity.(A)AschematicrepresentationofBJ-43’UTRpseudoknotmutanttranscripts.ThesevennucleotidesofSL1wereswitchedwiththatofSL2inmutantSW1,andviceversainmutantSW2.Thebase-pairingpossibilitieswererestoredinmutantSW12byswitchthesevennucleotides,simultaneously.ThemutantsOR1andOR2weregeneratedbychangingtheorientationofthecentralsevennucleotidesintheloopofSL1orSL2.TheorientationofthecentralsevennucleotideswasbothchangedinmutantOR12,which 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答71restoredthebase-pairingpossibilities.(B,C)PAMsweretransfectedwith3’UTRpseudoknotwildtypeormutanttranscriptsofPRRSVBJ-4genomeconstructsornoRNAcontrolfor6h(B)or12h(C),theIFN-β,andIFN-αmRNAlevelswereanalyzedbyqRT-PCR.RE,relativeexpression.3.4.6PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN与RIG-I和TLR3相关为研究PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN相关的模式识别受体，我们用siRNA基因沉默的方法，设计并合成特异性靶向RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的siRNA，将此siRNA以合适的浓度转染到PAM中，24h后转染相同剂量的PRRSV基因组3’UTR假结结构RNA，转染后6h后用qRT-PCR方法和WesternBlot方法分析siRNA的沉默效率以及IFN-β、IFN-α、ISG56和MX1mRNA表达水平。如图3-10E和F所示，siRNA对于靶基因RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7的沉默效率都高于70%，靶基因沉默成功。对IFN-β、IFN-α、ISG56和MX1mRNA表达水平分析发现，当RIG-I和TLR3被沉默后其IFN-β、IFN-α、ISG56和MX1mRNA表达水平也显著下降将近1倍，然而MDA5和TLR7沉默对于IFN-β、IFN-α、ISG56和MX1mRNA表达水平没有显著影响。这些结果表明PRRSV基因组3’UTR假结结构可被RIG-I和TLR3识别从而诱导IFN产生。图3-10PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN与RIG-I和TLR3相关（A-D）PAM预处理20nMsiRNA（siNC）或靶向RIG-I、MDA5、TLR3和TLR7siRNA，然后转染PRRSV基因组3’UTR假结结构片段，转染后6h，收集细胞检测细胞内IFN-β、IFN-α、ISG56和MX1mRNA表达水平，同时检测靶基因沉默效率。(E,F)WesternBlot检测靶基因沉默效率。Fig.3-10RecognitionofthepseudoknotofPRRSV3’UTRismediatedbyRIG-IandTLR3.(A-D)PAMsweretreatedwith20nMofcontrolsiRNA(siNC)orsiRNAagainstRIG-I,MDA5,TLR3,TLR7andthentransfectedwithBJ-43’UTRpseudoknotornoRNAcontrolfor6h,theIFN-β,IFN-α,ISG56andMX1mRNAlevelswereanalyzedbyqRT-PCR.Toensureknockdownefficiency,RIG-I,MDA5,TLR3,TLR7mRNAlevelswereanalyzedbyqRT-PCRandimmunoblotting(IB)(E,F).RE,relativeexpression. 72猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究3.4.7PRRSV基因组3’UTR假结结构与RIG-I和TLR3相互作用根据图3-10的结果，PRRSV基因组3’UTR假结结构能被RIG-I和TLR3识别，从而启动天然免疫应答。为验证PRRSV3’UTR假结结构与RIG-I和TLR3间直接的相互作用，本实验采用RNA-pulldown方法进行验证。我们首先分析了Flag-pRIG-I-FL与脱硫生物素标记的PRRSV基因组3’UTR假结结构是否存在相互作用，同时以之前报道的能被RIG-I识别的配体3pRNA作为阳性对照，并以之前报道的不能被RIG-I识别的加帽RNAContRNA作为阴性对照。将表达Flag-pRIG-I-FL的HEK293T细胞裂解液与脱硫生物素标记的PRRSV基因组3’UTR假结结构RNA及对照RNA分别孵育，经RNA-pulldown后进行Western-Blot检测。如图3-11A所示，PRRSV基因组3’UTR假结结构与阴性对照ContRNA相比能特异性结合Flag-pRIG-I-FL。由于RIG-I包含三个主要结构域：N端信号转导作用区包含两个CARD招募结构域、中间区域为RNA解旋酶结构域和C端调节区；TLR3主要包括2个结构域：腔内区（胞外结构域）和腔外区（胞内结构域），因此为了进一步研究与PRRSV基因组3’UTR假结结构相互作用的RIG-I和TLR3具体结构域，我们按照二者的结构区域将其进行截短表达：RIG-I三个截短片段（Flag-pRIG-I-N、Flag-pRIG-I-Helicase和Flag-pRIG-I-RD/CTD）和TLR3两个截短片段Flag-pTLR3-ECD和Flag-pTLR3-TIR，然后进行RNA-pulldown和Western-Blot检测。如图3-11B所示，PRRSV基因组3’UTR假结能特异性结合Flag-pRIG-I-RD/CTD区和Flag-pTLR3-ECD区。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答73图3-11PRRSV基因组3’UTR假结结构与RIG-I和TLR3相互作用(A)RNA-pulldown实验分析标记的PRRSV基因组3’UTR假结结构片段与HEK293T细胞表达的Flag-pRIG-I的结合活性。HEK293T细胞裂解液与脱硫生物素标记的PRRSV基因组3’UTR假结结构片段孵育，以5’带帽的RNA（ContRNA）为阴性对照，以RIG-I刺激剂5’三个磷酸基团的RNA作为阳性对照。使用链霉亲和素磁珠pulldown后，磁珠上结合的蛋白用WesternBlot以Flag单抗进行检测。（B）HEK293T过表达Flag-pRIG-I或Flag-pTLR3截短的蛋白的细胞裂解液与脱硫生物素标记的PRRSV基因组3’UTR假结结构片段孵育，使用链霉亲和素磁珠pulldown后，磁珠上结合的蛋白用WesternBlot以Flag单抗进行检测。Fig.3-11RIG-IandTLR3interactwiththepseudoknotofPRRSV3’UTR.(A,B)RNA-pulldownassayshowingthebindingactivityoftheindicatedRNAstoFlag-pRIG-IinHEK293Tcells.(A)TheHEK293TcelllysatesoverexpressingFlag-pRIG-IwereincubatedwithunlabeledorbiotinylatedBJ-43’UTRpseudoknottranscripts,negativecapped-RNAcontrol(ContRNA)or3pRNA(aRIG-Iligandaspositivecontrol).Afterstreptavidinbeadspulldown,theboundproteinswereanalyzedbyWBwithanti-FlagmAb.(B)TheHEK293TcelllysatesoverexpressingFlag-pRIG-IorFlag-pTLR3truncatedmutantswereincubatedwithbiotinylated3’UTRpseudoknottranscripts.Afterstreptavidinbeadspulldown,theboundproteinswereanalyzedbyWBwithanti-FlagmAb. 74猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究3.4.8PRRSV基因组3’UTR假结结构能特异性抑制PRRSV感染3.4.8.1在PAM中PRRSV基因组3’UTR假结结构能特异性抑制PRRSV感染由于PRRSV基因组3’UTR假结结构具有干扰素刺激效应，因此我们推测PRRSV基因组3’UTR假结结构可能具有抗病毒作用。在PAM上，转染不同剂量（0.125、0.25、0.5和1μg）PRRSV基因组3’UTR假结结构或其突变体SW1，同时以转染poly(I:C)作为阳性对照，以未转染RNA的细胞作为阴性对照，细胞转染24h后，同时接种PRRSVBJ-4病毒（MOI=0.5），病毒感染12或18h后分别收集细胞上清液用于测定病毒的TCID50或用绝对定量分析细胞上清中病毒的拷贝数。用Trizol进行裂解PAM提取总RNA，同样进行绝对定量分析细胞内的病毒拷贝数。如图3-12结果所示，PRRSV基因组3’UTR假结结构能够显著抑制PRRSV的复制，并且呈剂量依赖性。病毒感染12或18h时，与未转染细胞相比，PRRSV基因组3’UTR假结结构实验组在细胞上清中病毒滴度至少降低了2倍，而突变体SW1没有显著的抑制效应（图3-12A）。细胞上清中PRRSV拷贝数分析结果表明，病毒感染12h时，与阴性对照相比PRRSV基因组3’UTR假结结构实验组病毒拷贝数至少下降1.4倍；病毒感染18h时，与阴性对照相比病毒拷贝数至少下降4.9倍，然而突变体SW1转染的细胞上清中PRRSV拷贝数有一定程度下降但与PRRSV基因组3’UTR假结结构实验组相比并不显著（图3-12B）。同时对细胞内的PRRSV拷贝数进行分析发现，PRRSV基因组3’UTR假结结构在12和18h均能显著抑制PRRSV（图3-12A）。以上结果表明，PRRSV基因组3’UTR假结结构抑制PRRSV的感染，并且抑制程度与假结结构的完整性相关。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答75图3-12PRRSV基因组3’UTR假结结构抑制PRRSV（A，B，C）PAM转染PRRSVBJ-4基因组3’UTR假结结构，以及突变体SW1同时转染1μgpoly(I:C)作为阳性对照，以未转染RNA细胞作为阴性对照，转染后6h感染PRRSVBJ-4（MOI=0.5），转染后12、18h收集细胞上清用于测定病毒的含量及qRT-PCR测定病毒拷贝数（A，B）。（C）以上处理后收集细胞用于qRT-PCR测定病毒拷贝数。Fig.3-12TheBJ-43’UTRpseudoknottranscriptsrestrictPRRSVreplicationinPAMs.(A,B,C)PAMsweretransfectedwithBJ-43’UTRpseudoknots,BJ-43’UTRpseudoknotSW1transcripts,1μgpoly(I:C)ornoRNAcontrol,respectively.ThencellswereinfectedwithPRRSVBJ-4for12hor18h.ThesupernatantswerecollectedforTCID50determination(A)andanalysisofcopynumbersofPRRSV(B).CellswerecollectedforthePRRSVdetectionbyqRT-PCR(C).3.4.8.2PRRSV3’UTR假结结构上调IFN抑制PRRSV 76猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究为了阐明PRRSV3’UTR假结结构抑制病毒复制是否与IFN表达量升高相关，本实验在PAM上转染不同剂量（0.125、0.25、0.5和1μg）PRRSV基因组3’UTR假结结构或其突变体SW1，同时以转染poly(I:C)作为阳性对照，以未转染细胞作为阴性对照，细胞转染24h后，同时接种PRRSVBJ-4病毒（MOI=0.5），病毒感染12或18h后分别收集细胞，用qRT-PCR分析IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA表达水平。如图3-13所示，PRRSV3’UTR假结结构能显著上调IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA表达量，而突变体SW1上调效应并不显著。因此，PRRSV3’UTR假结结构可以通过上调IFN-β、IFN-α和ISG56mRNA表达从而产生抗病毒免疫应答效应。图3-13PRRSV基因组3’UTR假结结构上调IFN抑制PRRSV（A，B，C）PAM转染PRRSVBJ-4基因组3’UTR假结结构以及突变体SW1同时转染1μgpoly(I:C) 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答77作为阳性对照，以未转染RNA细胞作为阴性对照，转染后6h感染PRRSVBJ-4（MOI=0.5），转染后12、18h收集细胞，qRT-PCR检测细胞内IFN-β,IFN-α和ISG56mRNA表达水平。Fig.3-13TheBJ-43’UTRpseudoknottranscriptsinduceIFNtorestrictPRRSVreplicationinPAMs.(A,B,C)PAMsweretransfectedwithBJ-43’UTRpseudoknot,BJ-43’UTRpseudoknotSW1transcripts,1μgpoly(I:C)ornoRNAcontrol,respectively.ThencellswereinfectedwithPRRSVBJ-4for12or18h,IFN-β,IFN-αandISG56wereanalyzedbyqRT-PCR.RE,relativeexpression.#,P<0.05;##,P<0.01,###,P<0.001(forBJ-43’UTRpseudoknotSW1comparedtoBJ-43’UTRpseudoknot).3.4.9病毒基因组3’UTR假结结构诱导IFN在动脉炎病毒科保守之前研究表明，动脉炎病毒科成员包括EAV，LDV，SHFV和PRRSV都含有假结结构，且序列非常保守。为进一步分析动脉炎病毒科成员基因组3’UTR假结结构相互作用的保守性，本实验对PRRSV美洲型、欧洲型毒株及EAV毒株基因组3’UTR假结结构进行了序列比对。序列比对结果显示，PRRSVBJ-4和A2MC2毒株序列与经典毒株VR2332相同，HN07-1、15GD1、Ingelvac、HB-1和HB-2毒株在假结结构的SL1loop区域都有一个U-C突变，同时在假结结构的SL2loop区域都有一个A-G突变，这种突变能形成更加稳定的G-C相互作用，如图3-14A灰色下划线所标注。HENXX-8、HNjz15、IAF-exp91、HENXX-1、HNhx、FJWQ16、FJXS15、FJZ03和PrimePac毒株都在假结结构的SL1loop区域有一个C-U突变，同时在假结结构的SL2loop区域有一个G-A突变，这种突变能使假结之间的相互作用更加稳定，如图3-14A黑色下划线所标注。对于EAV毒株，大多数毒株都与经典毒株序列相同，但是Vienna、CW01和F27毒株有1到2个碱基的突变，总之，序列比对结果显示在动脉炎病毒科不同成员中，其假结序列非常保守。利用生物信息学软件Mfold对PRRSV、EAV、LDV和SHFV二级结构进行预测，预测结果显示这些病毒3’UTR区域均存在保守的假结相互作用区（图3-14B）。同时之前研究也报道EAV的3’UTR确实存在假结结构(Beerensetal.2007b)。然后我们分析了这些动脉炎病毒科所有成员的3’UTR假结结构对于诱导IFN的影响，将这些体外转录得到的动脉炎病毒科成员的3’UTR假结结构分别转染PAM，转染后6h收集细胞，用qRT-PCR检测细胞内IFN-β和IFN-α的mRNA水平。如图3-14C所示，这些动脉炎病毒科成员的3’UTR假结结构都能有效诱导IFN-β和IFN-αmRNA水平上调，因此其诱导IFN的能力在动脉炎病毒科不同成员间保守。本实验进一步对EAV基因组3’UTR假结结构进行突变，突变策略与图3-9相同，突变体分别命名为SL4、SL5、SL45、OR4、OR5和OR45。将这些突变体RNA与未突变的EAV基因组3’UTR假结结构同时转染PAM，转染后6和12h分别收集细胞，进行qRT-PCR检测细胞内IFN-β和IFN-αmRNA水平，结果如图3-14D所示，突变体SW1，SW2，OR1，OR2与未突变的RNA相比其诱导IFN的能力显著下降，而突变体OR12和SW12其诱导IFN-β、IFN-α的能力与未突变RNA相比并无显著变化。因此，EAV基因组3’UTR假结结构的两个茎环 78猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究之间相互作用对于其有效诱导IFN-β和IFN-α具有重要作用。图3-14病毒基因组3’UTR假结诱导IFN在动脉炎病毒科保守（A）动脉炎病毒科成员基因组3’UTR假结结构序列比对，采用BioEdit软件，粉色区域为假结结构相互作用区域，下划线表示突变碱基。序列比对中使用的毒株GenBank序列号如下：（1）PRRSV2型（美洲型）毒株分别为VR2332（U87392）、BJ-4（AF331831）、A2MC2（JQ087873）、HN1（AY457635）、LMY（DQ473474）、HN07-1（KX766378）、15GD1（KX815407）、P129（AF494042）、CH-1a（AY032626）、PL97-1（AY585241）、TJnh1501（KX510269）、Ingelvac（DQ988080）、HB-1（sh）（AY150312）、HB-2（sh）（AY262352）、FJZ03（KP860909）、HENXX-1（KU950372）、HNhx（KX766379）、HNjz15（KT945017）、IAF-exp91（U02095）、FJWQ16（KX758249）、FJXS15（KX758250）、HENXX-8（KY041782）和PrimePac（DQ779791）。（2）PRRSV1型（欧洲型）毒株为Lelystad（M96262）、14432/2011（KR296711）、LV4.2.1（AY588319）、DV（KF991509）、EuroPRRSV（AY366525）、Olot/91（X92942）。（3）EAV毒株分别为Bucyrus（NC002532）、VIENNA（X78497）、CW01（AY349168）、F27（JN211316）。（B）用Mfold软件预测动脉炎病毒科成员基因组3’UTR假结结构，假结结构相互作用碱基标注为灰色。图中所用毒株为EAVBrucyrus株（GenBank登录号：DQ846750）、SHFVM6941株（GenBank登录号：KM371105），LDVPlagemann株（GenBank登录号：U15146)，PRRSVVR2332株（GenBank登录号：U87392）。 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答79（C）PAM转染PRRSV、EAV、LDV和SHFV基因组假结结构RNA，同时转染1μgpoly(I:C)作为阳性对照，以未转染细胞作为阴性对照，转染6h后收集细胞，qRT-PCR检测IFN-β和IFN-αmRNA表达水平。（D）PAM同时转染EAV基因组3’UTR假结结构RNA及其突变体（SW4、SW5、SW45、OR4、OR5和OR45）RNA，转染6h或12h后收集细胞，qRT-PCR检测IFN-β和IFN-αmRNA表达水平。Fig.3-14TheIFNstimulatoryactivityofthepseudoknotisconservedinallknownarteriviruses.(A)Alignmentofthenucleotidesinvolvedinthepseudoknotinteractionindifferentmembersofarteriviruses.PseudoknotinteractionwasrepresentedinpinkregionsusingBioEditprogram.Thecovaryingbasechangeswithinpseudoknotwerediscriminativelyunderlined.Thesequenceandaccessionnumbersusedhereareasfollows:ForPRRSVType2(NorthAmericantype),theisolateswereVR2332(U87392),BJ-4(AF331831),A2MC2(JQ087873),HN1(AY457635),LMY(DQ473474),HN07-1(KX766378),15GD1(KX815407),P129(AF494042),CH-1a(AY032626),PL97-1(AY585241),TJnh1501(KX510269),Ingelvac(DQ988080),HB-1(sh)(AY150312),HB-2(sh)(AY262352),FJZ03(KP860909),HENXX-1(KU950372),HNhx(KX766379),HNjz15(KT945017),IAF-exp91(U02095),FJWQ16(KX758249),FJXS15(KX758250),HENXX-8(KY041782),andPrimePac(DQ779791).ForPRRSVType1(Europeantype),theisolatesshownwereLelystad(M96262),14432/2011(KR296711),LV4.2.1(AY588319),DV(KF991509),EuroPRRSV(AY366525),Olot/91(X92942).ForEAV,theisolatesshownwereBucyrus(NC002532),VIENNA(X78497),CW01(AY349168),F27(JN211316).(B)TheRNAsecondarystructurepredictionsindifferentarterivirusgenomesforthepossiblepseudoknotinteractionbetweentheterminalhairpinandtheupstreamhairpinwereshownandmarkedingray.ThepredicatedpseudoknotofEAV(Brucyrus(accessionnumberDQ846750)),SHFV(M6941(accessionnumberKM371105)),LDV(Plagemann(accessionnumberU15146)),PRRSV(VR2332(accessionnumberU87392))wereshown.(C)AnalysisoftheIFNstimulatoryactivityofPRRSV,EAV,LDV,SHFV.PAMswererespectivelytransfectedwiththepseudoknotofPRRSV,EAV,LDV,SHFVgenomeconstructs,1μgpoly(I:C)ornoRNAcontrolfor6h,andtheIFN-β,andIFN-αmRNAlevelswereanalyzedbyqRT-PCR.(D)PAMsweretransfectedwithoriginalormutantpseudoknottranscriptsofEAV(SW4,SW5,SW45,OR4,OR5andOR45)ornoRNAcontrolfor6hor12h,andtheIFN-β,andIFN-αmRNAlevelswereanalyzedbyqRT-PCR.RE,relativeexpression.3.5讨论本研究结果显示PRRSV感染PAM和CRL2843-CD163细胞后可以诱导IFN及ISG表达，同时宿主模式识别受体RIG-I、TLR3和MDA5在PRRSV诱导IFN过程中，起到重要作用（图3-1、图3-2和图3-4）。进一步研究发现，在PRRSV基因组3’UTR区域有一个假结结构，此结构可以作为PAMP被PRRs识别，从而激活IFN信号通路，同时此假结结构相互作用破坏后其诱导IFN的能力也显著受到影响（图3-7、图3-8和 80猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图3-9）。通过siRNA基因沉默和RNA-pulldown实验分析发现PRRSV基因组3’UTR区域假结结构能被RIG-I和TLR3特异性识别而激活天然免疫（图3-10）。序列比对及二级结构预测发现动脉炎病毒科其它成员包括EAV，LDV，SHFV在基因组3’UTR都含有假结结构，这种相互作用在动脉炎病毒科基因组中非常保守，同时这些病毒的基因组3’UTR假结结构都能诱导IFN应答（图3-14）。总之，本实验发现了位于PRRSV基因组3’UTR区域假结结构，能够特异性刺激RIG-I和TLR3介导抗病毒免疫应答。PRRSV拥有非常复杂的复制机制，可以利用很多非典型的复制转录策略，例如其亚基因的合成是利用非连续的合成方式进行的(Lietal.2014a)，因此在PRRSV感染和复制过程中，有多种形式的核酸存在，其中包括正链RNA、负链RNA以及双链RNA，因此推测PRRSV的识别机制也很复杂。本研究首先分析了PRRSV基因组5’和3’UTR区域诱导IFN的效应，结果显示5’和3’UTR都能诱导IFN产生并呈剂量依赖性（图3-6）。为研究诱导IFN的具体区域，首先采用Mfold预测了5’和3’UTR的二级结构，截短并合成了一系列RNA，然而这些片段诱导IFN的能力均不强（图3-6）。于是我们分析是否有其它的PRRSV3’UTR结构能作为PAMP，之前研究报道在PRRSV基因组3’UTR存在一个假结结构，本实验对其进行研究发现其可以有效诱导IFN产生（图3-7）。套式病毒目亚基因组都有一个共同的3’UTR末端，其对于病毒的复制以及亚基因组的合成至关重要(Baricetal.1983;Kuoetal.1991;Mengetal.1996)，可以作为一个分子开关调控病毒的生命周期。本研究发现动脉炎病毒科成员3’UTR的假结结构都能诱导IFN产生，这种免疫识别方式在动脉炎病毒科病毒中非常保守（图3-14）。PRRSV在临床上具有免疫抑制及持续性感染的特征，研究表明PRRSV诱导IFN的能力比一些干扰素刺激剂（例如TGEV或poly(I:C)）弱很多，因此，许多研究都将重点放在了PRRSV是如何逃逸宿主的免疫应答，例如PRRSV阻断ISGF3的核转位等(Wangetal.2013)。然而Ⅰ型干扰素对于抗病毒免疫应答非常重要，同时很多研究结果显示，Ⅰ型干扰素无论在体内还是体外都能够抑制PRRSV增殖(Brockmeieretal.2009;Changetal.2005;VanReethetal.1999)。抗病毒免疫应答的前提是对病毒的识别，因此研究病毒的免疫识别机制非常重要。本研究中，我们发现PRRSV基因组3’UTR假结结构能显著诱导IFN-β和IFN-α的产生（图3-7），同时我们发现PRRSV诱导IFN产生与复制相关（图3-3），此结果与之前报道假结结构作为分子开关调控RNA复制一致(Beerensetal.2007b)。同时发现，在PAM上转染假结结构RNA可以抑制PRRSV的复制，此抑制效应可能与假结结构RNA诱导IFN及ISG的表达相关（图3-12和13），同时假结结构可以调控病毒复制，因此也可能是假结结构作为一种竞争性抑制剂与病毒蛋白或其它成分结合，从而干扰了病毒的复制。假结结构可以与病毒的复制转录复合体相互作用而调控RNA复制，并且假结结构的上游茎环结构可以与N基因的下游发卡结构结合从而形成“Kissingloopinteraction”，对RNA复制也非常重要(Verheijeetal.2002)，因此本研究中转染的RNA可能作为竞争性抑制剂与病毒的复制转录复合体或其 第三章PRRSV基因组3’端假结结构作为PAMP通过RIG-I和TLR3激活抗病毒免疫应答81它病毒RNA元件结合而影响病毒的复制（图3-12和13）。在模式识别受体中，TLRs和RLRs在病毒感染过程中能识别不同类型的核酸，例如RIG-I可以识别5’端三个磷酸基团的双链RNA或柄状结构(Liuetal.2015;Schleeetal.2009)。同时双链RNA的长度对于RIG-I和MDA5识别也至关重要，例如RIG-I可以识别短的双链RNA，而MDA5可以识别长的双链RNA(Katoetal.2008;Schleeetal.2009)，且识别机制与细胞类型有关(Katoetal.2006a)。最近有研究表明，MDA5可以识别EAV的基因组从而诱导IFN表达(vanKasterenetal.2012)。本研究表明，在PRRSV感染过程中RIG-I、TLR3和MDA5都参与对PRRSV基因组的识别，同时PRRSV基因组3’UTR假结结构与RIG-I和TLR3相关（图3-10）。RNA-pulldown实验进一步分析了PRRSV基因组3’UTR假结结构结合RIG-I和TLR3的具体结构域，结果表明，假结结构能够结合RIG-I的RD区和TLR3的腔内区（胞外区）（图3-11）。Devarkar等人研究表明，RIG-I的Helicasse-RD区域可以结合Cap-0双链RNA，其亲和力与5’三磷酸基团双链RNA类似(Devarkaretal.2016)，本研究中PRRSV基因组3’UTR假结结构也能够结合到RIG-I的RD区，因此RD区对于RNA识别非常重要。3.6小结宿主细胞一旦被病毒感染，病毒的核酸等可作为PAMPs被宿主的PRRs识别，从而启动抗病毒免疫应答。目前关于PRRSV的免疫识别机制还未研究清楚。本研究结果表明，位于PRRSV基因组3’UTR的假结结构能够作为一种新的PAMP被模式识别受体RIG-I和TLR3识别，从而诱导Ⅰ型干扰素及下游ISGs的产生。并且进一步研究结果表明，该假结结构具有抗病毒能力。序列比对及二级结构预测结果表明，动脉炎病毒科其它成员在基因组3’UTR都含有假结结构，这种相互作用在动脉炎病毒科基因组中非常保守，并且都具有刺激机体产生IFN的作用。总之，本研究首次发现了一种在动脉炎病毒科中普遍存在的PAMP，阐明了RIG-I和TLR3识别该PAMP的机制，为研究动脉炎病毒科病毒的天然免疫应答及抗病毒机制奠定了基础。 82猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究4.1引言之前研究结果表明，RIG-I在RNA病毒识别过程中起到关键作用，同时RIG-I对于病毒的识别基于外源RNA的特征，例如RNA的序列、RNA的5’端修饰及RNA的二级结构。第四章研究发现在PRRSV感染过程中RIG-I起到至关重要的作用，同时鉴定了PRRSV基因组3’UTR假结结构作为PAMP被RIG-I特异性识别激活天然免疫应答的机制，且采用RNApulldown的方法证实了PRRSV基因组3’UTR假结结构与RIG-I的相互作用。本章对猪源RIG-I的RD区进行了表达和纯化，验证其与PRRSV基因组3’UTR假结结构RNA的相互作用，并初步筛选了复合物的晶体生长条件及分析了复合物在溶液中的状态，为阐明PRRSV基因组3’UTR假结结构与RIG-I之间的相互作用机制奠定了基础。4.2实验材料4.2.1试剂及耗材JM109感受态细胞（Takara公司）；Transetta（DE3）感受态细胞（全式金公司）；限制性内切酶及高保真DNA聚合酶（NEB公司）；IPTG、氨苄青霉素、甘氨酸和琼脂糖等常用试剂（索莱宝公司）；HisTrapexcel、HiTrapHeparinHP、HiTrapSPHP和分TM子筛层析柱Superdex20010/300GL（GEHealthcare公司）；结晶条件筛选试剂盒TMTMTMTMNatrix-HR2-116，Natrix-HR2-117，PEGRx1-HR2-082，PEGRx2-HR2-084，TMTMTMPEG/IonIIScreen-HR2-098，SaltRx1-HR2-107，SaltRx2-HR2-109，CrystalscreenTMTMTM1-HR2-110，Crystalscreen2-HR2-112，PEG/IONScreen-HR2-126，CrystalscreenTMlite-HR2-128，Index-HR2-144（Hamptonresearch公司）；超滤管和PVDF膜（MerkMillipore公司）；ECL化学发光液（CST公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠或兔IgG（JacksonImmunoResearch公司）；EasyPureHiPurePlasmidMiniPrepKit（OMEGA公司）4.2.2主要仪器设备超纯水仪（Millipore公司）；超低温冰箱（SANYO公司）；核酸电泳仪（北京六一公司）；琼脂糖水平电泳槽（北京六一公司）；蛋白电泳仪（Bio-Rad公司）；蛋白转印仪（Bio-Rad公司）；37℃恒温细胞培养箱（ThermoFisherscientific公司）；晶体培养箱（MemMert公司）。4.3实验方法 第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究834.3.1pRIG-I-RD表达载体的构建（1）cDNA模板制备：取适量PAMs，用Trizol法提RNA，按照说明书以此总RNA为模板，使用AMV反转录酶对样品进行反转录。参照3.3.9.1步骤。（2）pRIG-I-RD基因的克隆：根据GenBank猪RIG-（IGenBank登录号：EU126659）的序列设计引物（表4-1）。表4-1原核载体构建所需引物Table.3-1SequencesofprimersusedforvectorconstructionorPCRamplification.基因名称引物（5’-3’）Sense:GAACAGATTGGAGGTGATAAGAAAACTAAAAAApRIG-I-RD(806-943aa)CTACTCTAntisense:ATTCGGATCCTCTAGTCACTCAAGGTTGCCCATPCR反应体系如表3-13所示，反应程序为参照3.3.9.2。（3）回收PCR产物。使用限制性内切酶BsaⅠ和XbaⅠ对PCR产物和原核表达载体pE-SUMO进行酶切，酶切产物回收后进行连接转化。参照3.3.9.3步骤。（4）阳性克隆鉴定及测序：使用菌液PCR方法初步鉴定出阳性克隆，将阳性克隆克隆扩大培养并提取质粒，送上海生物工程有限公司进行测序。4.3.2pRIG-I-RD蛋白表达4.3.2.1pRIG-I-RD蛋白诱导表达（1）将测序正确的pE-SUMO-pRIG-I-RD质粒转化Transetta（DE3）感受态细胞，取适量菌液涂布LB（含氨苄）平板，37℃培养12-16h。（2）挑取生长状态良好的单克隆，并接种于10mlLB培养基（含氨苄），于37℃220rpm培养至细菌生长到对数期OD值达到0.6时取1ml菌液标记为“未诱导”，剩余菌液加入0.2mMIPTG，继续于18℃200rpm诱导16h。4.3.2.2pRIG-I-RD菌体收集破碎（1）收菌：诱导后菌液于4℃8000g离心20min，弃掉LB培养基收集菌体。（2）重悬：以1/20比例用20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液将菌体重悬，充分混匀。（3）破碎：将重悬后的菌液置于冰上，用超声破碎仪进行破碎，功率为40%，工作5s，暂停5s，工作时间为10min。（4）去除包涵体：将超声破碎后的菌液，4℃12000g离心40min后，收集含有可溶目的蛋白的上清样品。4.3.2.3重组蛋白的SDS-PAGE分析 84猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究（1）按照3.3.6方法制备凝胶板（2）样品处理：将蛋白样品及对照样品分别与5×SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸10min。（3）上样：将蛋白胶板组装到电泳槽中，将蛋白样品加入到点样孔中。（4）电泳：SDS-PAGE凝胶以恒定电压200V进行电泳，当溴酚蓝至凝胶底部时电泳结束。（5）考马斯亮蓝染色：将凝胶小心拆出，并转移至含有考马斯亮蓝的染色盒中。（6）脱色：将染色结束的蛋白凝胶放到脱色液中进行脱色，直至蛋白胶上出现蛋白条带且背景清晰为止。4.3.2.4WesternBlot检测（1）重组蛋白的SDS-PAGE电泳，参照3.3.6步骤。（2）WesternBlot检测步骤参照3.3.6。采用检测重组蛋白His标签的鼠源His单克隆抗体，按1:5000进行稀释，按标准操作步骤进行WesternBlot检测重组蛋白是否正确表达。4.3.3pRIG-I-RD蛋白纯化4.3.3.1pRIG-I-RD蛋白的大量诱导表达参照4.3.2的方法，按比例将pRIG-I-RD表达菌进行扩大培养并诱导表达，收集菌体超声破碎，高速离心收集上清备用。4.3.3.2Ni亲和层析纯化pRIG-I-RD蛋白（1）平衡：使用HisTrapexcel（GEhealthcare）亲和层析柱，用5倍柱体积20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速平衡柱子。（2）上样：将高速离心收集的上清用0.22μm滤膜进行过滤后上样，流速控制为1ml/min，同时收集穿透液。（3）冲洗：用5倍柱体积20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速冲洗未结合蛋白，收集样品标记为“冲洗液”。（4）洗涤：用5倍柱体积20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2，20mM咪唑缓冲液，以2ml/min流速洗掉杂蛋白，收集样品标记为“洗涤液”。（5）洗脱：用5倍柱体积20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2，200mM咪唑缓冲液，以2ml/min流速洗脱目的蛋白，收集样品标记为“洗脱液”。（6）SDS-PAGE电泳：将Ni柱纯化各个步骤所收集的样品，进行SDS-PAGE电泳，染色脱色后对结果进行分析。4.3.3.3阳离子交换层析纯化pRIG-I-RD蛋白（1）将Ni柱洗脱的目的蛋白，用20mMTris，4mMDTT，2mMMgCl2将溶液电导稀释到20mS/cm，并用0.22μm滤膜进行过滤。 第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究85（2）按照仪器操作说明将HiTrapSPHP阳离子柱安装到AKTA纯化仪上。（3）平衡：使用5倍柱体积20mMTris，20mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速平衡柱子。（4）上样：将调整好电导的蛋白样品流过HiTrapSPHP阳离子柱，流速为2ml/min，同时收集样品流穿液。（5）冲洗：用5倍柱体积20mMTris，20mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速冲洗未结合蛋白，收集样品标记为“冲洗液”。（4）洗涤：用5倍柱体积20mMTris，100mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速洗掉杂蛋白，收集样品标记为“洗涤液”。（5）洗脱：用5倍柱体积20mMTris，500mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速洗脱目的蛋白，收集样品标记为“洗脱液”。（6）SDS-PAGE电泳：将HiTrapSPHP柱纯化各个步骤所收集的样品，进行SDS-PAGE电泳，染色脱色后对结果进行分析。4.3.3.4切除SUMO标签（1）向目的蛋白溶液中加入10×SUMO蛋白酶缓冲液。（2）按照目的蛋白含量，根据说明书比例加入SUMO蛋白酶。（3）置于4℃旋转摇床过夜孵育。（4）切标签前后样品同时进行SDS-PAGE电泳，染色脱色后对结果进行分析。4.3.3.5Ni亲和层析除去SUMO标签蛋白（1）平衡：使用HisTrapexcel（GEhealthcare）亲和层析柱，用5倍柱体积20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速平衡柱子。（2）上样：将切除标签后的目的蛋白用0.22μm滤膜进行过滤后直接上样，流速控制为1ml/min，收集样品穿透液。（3）冲洗：用5倍柱体积20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以2ml/min流速冲洗未结合蛋白。（4）洗脱：用5倍柱体积20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2，500mM咪唑缓冲液，以2ml/min流速洗脱蛋白，弃掉此样品。（6）SDS-PAGE电泳：将Ni柱切除标签后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，染色脱色后对纯化结果进行分析。4.3.3.6对切除标签的样品进行阳离子交换纯化pRIG-I-RD蛋白阳离子交换纯化切除标签后的蛋白样品步骤同4.3.3.3。将切除标签的蛋白再次用阳离子交换柱进行纯化，得到纯度更高的目的蛋白。4.3.3.7凝胶过滤层析纯化pRIG-I-RD蛋白（1）将Superdex20010/300GL预装柱按照操作说明安装到AKTA纯化仪上。（2）平衡：使用5倍柱体积的20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2 86猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究缓冲液，以0.5ml/min流速平衡柱子。（3）上样：安装并冲洗样品进样环，用注射器将300μl样品注入样品环，将程序设置为inject状态进行上样。（4）分离：使用3倍柱体积的20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以0.5ml/min流速分离样品，收集目的蛋白，每管0.5ml。（5）SDS-PAGE电泳：将Superdex20010/300GL收集的样品进行SDS-PAGE电泳，染色脱色后对结果进行分析。（6）超滤浓缩：将纯度好的样品使用超滤管进行浓缩，并测定蛋白浓度，液氮速冻后，保存在-80℃冰箱。4.3.4体外转录制备PRRSV3’UTR假结结构RNA参照3.3.7步骤。4.3.5凝胶过滤层析分析PRRSV3’UTR假结结构与pRIG-I-RD结合（1）将Superdex20010/300GL预装柱按照操作说明安装到AKTA纯化仪上。（2）平衡：使用5倍柱体积的20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2缓冲液，以0.5ml/min流速平衡柱子。（3）将PRRSV3’UTR假结结构RNA与pRIG-I-RD蛋白按照摩尔比1：2混匀，置于冰上孵育1h形成复合物。（4）上样：安装并冲洗样品环，用注射器将300μl复合物样品注入样品环，将程序设置为inject状态进行上样。（5）分离：使用3倍柱体积的20mMTris，150mMNaCl，4mMDTT，2mMMgCl2，流速0.5ml/min进行纯化，收集复合物蛋白峰，每管0.5ml。（6）SDS-PAGE电泳：将收集的样品按顺序进行SDS-PAGE电泳，染色脱色后对纯化结果进行分析。（7）超滤浓缩：将复合物样品使用超滤管进行浓缩，并测定蛋白浓度，液氮速冻后，保存在-80℃冰箱。4.3.6pRIG-I-RD结晶条件的筛选与优化本实验采用坐滴法进行晶体生长条件筛选。首先，将1μl蛋白点到晶体生长孔中，然后滴加1μl槽液，使用胶带密封晶体生长孔，置于20℃或4℃晶体培养箱中进行晶体生长。分别于pRIG-I-RD蛋白浓度为5、13或20mg/ml，PRRSV3’UTR假结结构与pRIG-I-RD复合物蛋白浓度为9或18mg/ml时，筛选适宜的晶体生长条件。蛋白结晶条TMTM件的初步筛选采用Hamptonresearch公司的Natrix-HR2-116，Natrix-HR2-117，PEGTMTMTMRx1-HR2-082，PEGRx2-HR2-084，PEG/IonIIScreen-HR2-098，SaltTMTMTMRx1-HR2-107，SaltRx2-HR2-109，Crystalscreen1-HR2-110，CrystalscreenTMTMTM2-HR2-112，PEG/IONScreen-HR2-126，Crystalscreenlite-HR2-128和 第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究87Index-HR2-144试剂盒。4.3.7SAXS数据收集与解析SAXS是一种与X射线大角不同的结构生物学分析方法，其散射角2θ在5-7之间，SAXS可以测定超细粉末离子的形状大小、分析高聚物的结构以及分析纳米尺度蛋白质的结构。当X射线透过蛋白溶液时，蛋白内部1-100nm电子密度会有起伏，射线透过蛋白后在非常小角区域散射，其散射强度不同代表蛋白的粒度分布不同，从而得到蛋白在溶液中的聚集信息。还可以研究不同溶液环境下，蛋白质的稳定性和构象改变。小角X射线散射探测到的信号来源于X射线照射到物体上电子产生的汤姆逊散射，其X射线波长与入射波长相同，同时会有干涉效应，且其散射强度与粒子质量的平方成反比，因此忽略原子核的散射。在数据处理过程中，假设蛋白质样品信号是在无限稀浓度下（稀疏体系）测定的，忽略蛋白之间的散射干扰，将小角散射信号看作是单个蛋白分子的散射信号的简单加和。（1）准备样品：pRIG-I-RD-RNA复合物蛋白浓度分别设置1、3和5mg/ml梯度，每个样品至少60ul，置于冰上待测。（2）收据收集：以样品缓冲液作为对照，将不同浓度的样品及对照分别收集小角散射数据。（3）数据处理：采用ATSASpackage软件分析数据。具体流程如下：A强度归一化：得到一维散射曲线后，对散射曲线归一化处理，根据两次散射曲线的归一化因子将散射曲线归一化到同一光源强度下。B除去背景：归一化后的散射曲线，用蛋白溶液的散射强度减去相应的溶剂的散射强度，就得到蛋白在真空中的散射信号。低浓度溶液的小角散射强度随着散射矢量s的增大而迅速衰减，散射曲线的统计误差很大。为了进一步提高s值，通常会测量高浓度溶液的散射曲线。但高浓度溶液中分子间作用力不能忽略，因而小角度区域的散射曲线发生畸变，但是散射曲线的高角度部分与大分子的内部结构相关，不受小角度区域信号畸变的影响。因此，可以将低浓度溶液散射曲线的小角度部分与高浓度溶液散射曲线的高角度部分拼接，组成新的散射曲线，与原来的低浓度溶液散射曲线相比，解析的分子结构模型空间分辨率提高。C模型搭建：得到散射曲线后，作出Guinier图，可以得到分子的回转半径Rg，零角度散射强度Io等。利用这两个参数，使用GNOM计算分析内部距离分布函数P(r)。有了实空间的分布函数后，可以通过Abinitio方法构建三维结构模型，来拟合P(r)，利用模拟退火等方法来寻找最合适的三维模型，如果有晶体结构，可以利用晶体结构来判断模型的合理性。4.4实验结果与分析 88猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究4.4.1pRIG-I-RD蛋白表达纯化4.4.1.1pRIG-I-RD蛋白表达将测序正确的pE-SUMO-pRIG-I-RD质粒转化Transetta(DE3）感受态细胞，挑取阳性菌落并验证表达，采用0.2mMIPTG18℃200rpm诱导16h，4℃8000g离心20min收集菌体并超声破碎，高速离心后取上清即为可溶性目的蛋白，如图4-1A中SDS-PAGE箭头所示，目的蛋白大小与预测一致。Western-Blot结果表明，目的蛋白可以被His单抗识别（图4-1B）。以上结果表明pE-SUMO-pRIG-I-RD重组蛋白得到表达，且为可溶性表达。图4-1pE-SUMO-pRIG-I-RD蛋白表达鉴定（A)SDS-PAGE检测pRIG-I-RD蛋白的表达，S：高压破碎后上清P：高压破碎后沉淀。（B)His单抗检测pRIG-I-RD蛋白的表达；“-”：未诱导，“+”：诱导Fig.4-1ConfirmationofpE-SUMO-pRIG-I-RDexpression.(A)SDS-PAGEanalysisofpE-SUMO-pRIG-I-RDproteinexpression,S:bacteriallysatesupernatant,P:bacteriallysateprecipitate.(B)WesternBlotanalysisofpE-SUMO-pRIG-I-RDproteinexpressionusinganti-Hisantibody,“-”:non-inducedbacteria,“+”:inducedbacteria.4.4.1.2pRIG-I-RD蛋白纯化为了对pRIG-I-RD蛋白进行纯化，本实验首先采用Ni亲和层析柱对细菌超声破碎裂解液上清中的目的蛋白进行了初步纯化，结果显示pRIG-I-RD蛋白可以结合到Ni亲和层析柱上，且除去了大部分细菌的杂蛋白，然而此蛋白纯度依然不够。因此将经过Ni亲和层析柱收集到的目的蛋白溶液电导稀释到20mS/cm，使目的蛋白结合到HiTrapSPHP阳离子柱上，从而使pRIG-I-RD蛋白纯度更高。由于pRIG-I-RD蛋白含有SUMO 第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究89标签，因此向pRIG-I-RD蛋白溶液中加入SUMO蛋白酶将标签蛋白切除，并采用Ni亲和层析成功除去SUMO标签蛋白。经过Ni亲和层析柱除去标签蛋白的pRIG-I-RD蛋白，还会残留一些标签蛋白等杂蛋白，因此将除去标签的pRIG-I-RD蛋白再次结合到HiTrapSPHP阳离子柱上，从而得到纯度非常高的pRIG-I-RD蛋白。经过以上步骤的目的蛋白，经超滤管进行浓缩后，使用Superdex20010/300GL凝胶过滤层析柱对样品进行精细纯化，收集pRIG-I-RD蛋白峰将目的蛋白峰附近收集的蛋白同时进行SDS-PAGE电泳，结果如图4-2所示，蛋白样品条带单一，大小正确，然后将pRIG-I-RD蛋白使用超滤管进行浓缩，并测定蛋白浓度，即可用于后续实验。图4-2凝胶过滤层析纯化pE-SUMO-pRIG-I-RD蛋白Fig.4-2Superdex20010/300GLanalysisofpE-SUMO-pRIG-I-RDprotein.4.4.2凝胶过滤层析分析RNA与pRIG-I-RD结合将PRRSV3’UTR假结结构与pRIG-I-RD蛋白按照摩尔比1：2混匀，置于冰上孵育1h形成复合物。使用Superdex20010/300GL预装柱对复合物进行了纯化，结果如图4-3所示，3’UTR假结结构与pRIG-I-RD蛋白的复合物与pRIG-I-RD蛋白单体的分子筛结果相比，复合物样品出峰位置明显前移，表明成功形成了复合物。 90猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图4-3凝胶过滤层析分析pE-SUMO-pRIG-I-RD-RNA复合物（A，B）pRIG-I-RD蛋白和BJ-43’UTR假结结构按2:1比例混匀，在冰上孵育1h，将此复合物过Superdex20010/300GL凝胶过滤层析柱，图中纵坐标分别表示260nm和280nm吸收峰，横坐标为洗脱体积。Fig.4-3BindinganalysisofpRIG-I-RDandBJ-43’UTRpseudoknottranscriptsbygelfiltrationchromatography.(A,B)ThepRIG-I-RDandBJ-43’UTRpseudoknottranscriptschromatogramsweremixedata2:1molarratioonicefor1h.PlottedareUVabsorptionprofiles(260nm,280nm).Theretentionvolumesforeachelutionwereshownonthechromatograms.4.4.3pRIG-I-RD与pRIG-I-RD-RNA复合物结晶条件的筛选与优化经过以上步骤得到纯度高的pRIG-I-RD蛋白和pRIG-I-RD-RNA复合物后，使用晶体筛选试剂盒，对pRIG-I-RD蛋白和pRIG-I-RD-RNA复合物晶体生长条件进行了优化。本实验中分别在pRIG-I-RD蛋白浓度为5、13和20mg/ml时，对晶体结晶条件进行了筛选，但是目前没有生长出衍射良好的晶体。同时对于PRRSV3’UTR假结结构与 第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究91pRIG-I-RD复合物分别在蛋白浓度为9和18mg/ml时，对晶体生长条件进行了筛选，同时也对不同的生长温度进行了尝试，但是目前也没有生长出衍射良好的晶体。4.4.4pRIG-I-RD-RNA小角散射数据收集及结构分析为了研究pRIG-I-RD-RNA复合物在溶液中的状态，本实验使用小角X射线散射收集数据并分析，每组样品收集顺序为缓冲液、低浓度样品、高浓度样品、缓冲液。每个样品在蠕动过程中曝光10次，每次曝光时间1s。为了得到更好的信噪比，对同一样品连续收集多张图像，通过平均来降低噪声。数据处理主要用Primus软件进行处理，得到了pRIG-I-RD-RNA复合物在溶液中的基本形态特征。4.4.4.1pRIG-I-RD-RNA复合物小角X射线散射数据收集本实验中，采用小角散射对pRIG-I-RD-RNA复合物进行分析，首先得到1mg/ml和5mg/ml的散射曲线，且两个浓度的散射曲线能依据比例很好地重合到一起，证明我们收集的数据质量可靠，如图4-4所示。图4-4pRIG-I-RD-RNA小角散射曲线Fig.4-4ScatteringcurveofpRIG-I-RD-RNASAXS4.4.4.2pRIG-I-RD-RNA复合物小角X射线散射数据Gniunier分析小角散射强度只与散射角有关，当已知散射体的原子种类和坐标时，即了解散射体中的电子密度分布情况，就可以利用公式计算其小角散射曲线。在小角区域内，Guinier定律对任何形状的粒子都适用。具有相同的回转半径（Rg），在小角一侧的散射强度分布就相同，但是大角一侧就会随形状的不同而出现差异。在小角散射实验中，由于直通光的强度大，无法直接测量，往往利用Guinier定量来推导零度角的散射强度。Guinier分析结果如图4-5所示，Rg值为36.19，sRg范围为0.73-1.3，零角度散射强度Io为18.11，pRIG-I-RD-RNA复合物的sRg值小于1.3，在合理范围内，大多数点在直线上且底部绿色误差线波动很小，因此所得到的小角散射数据质量很好，可用于下一步继续分析。 92猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图4-5pRIG-I-RD-RNA小角散射曲线Guinier分析Fig.4-5GuinierannalysisofpRIG-I-RD-RNASAXSscatteringcurve4.4.4.3pRIG-I-RD-RNA复合物小角X射线散射数据GNOM分析GNOM程序原理为距离分布函数P(r)，在实际计算过程中会有许多参数调整，主要是Dmax值，即分子中距离最大的两个原子之间的距离值，不同的Dmax会计算出不同的P(r)，P(r)在大r区域与横坐标的结合处不能非常陡峭也不能有多个交点。pRIG-I-RD-RNA复合物的GNOM分析结果如图4-6所示，左侧为实验值与理论曲线的叠加，当Dmax值为161.47时，两条曲线吻合的很好。右侧为P(r)，P(r)在大r区域与横坐标的结合处比较平缓均匀有拖尾，且P(r)曲线有两个峰，因此预测pRIG-I-RD-RNA复合物是细长的大分子结构，可能含有多个区域，至少有两个中心。 第四章PRRSV基因组3’UTR假结与RIG-I互作结构生物学研究93图4-6pRIG-I-RD-RNA小角散射曲线GNOM分析Fig.4-6GNOMannalysisofpRIG-I-RD-RNASAXSscatteringcurve4.5讨论RIG-I在没有RNA存在的情况下，呈自抑制状态，其CARD区与HEL区或RD区相互作用。当RD区与外源RNA结合时，RIG-I会迅速结构调整而处于激活状态，释放CARD区域从而激活机体抗病毒免疫级联反应(Luoetal.2011)。RIG-I识别外源RNA的策略和其它的模式识别受体不同。TLRs家族的TLR3结合RNA的显著特征是能够识别两个RNA分子，TLR3“新月形”的分子结构含有丰富的亮氨酸，可以结合双链RNA形成二聚体，与RIG-I环绕在RNA周围不同，TLR3单体位于RNA二聚体旁边，每个“新月形”结构末端形成一个共线性复合物的连接区域(Liuetal.2008)。RIG-I与TLR3的识别机制有很大差异，因此研究RIG-I识别不同RNA的机制，对揭示RIG-I的识别模式有重要意义。RIG-I、MDA5、LGP2的CTD结构非常保守，并且具有相似的结合表面，然而该三种受体结合的配体类型差别很大，因此在抗病毒免疫中所起的作用不同(Luoetal.2011)。本研究，成功表达并纯化了pRIG-I-RD蛋白，且证明了PRRSV3’UTR假结结构可与其相互作用，如图4-3所示。之前有报道称RIG-I可以结合5’端三个磷酸基团的双链或单链RNA(Saitoetal.2008)，本研究中所用的PRRSV3’UTR假结结构是带有帽子的RNA，其识别机制与之前报道的识别机制不同，因此，本研究丰富了RIG-I的识别模式。为了阐明RIG-IRD区与PRRSV3’UTR假结结构的结合特征，我们首先尝试制备 94猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究复合物晶体。在不同晶体生长条件下，使用不同浓度复合物对晶体生长条件进行筛选，经过努力没有得到复合物的晶体。于是又采用SAXS小角散射技术分析了复合物在溶液中的特性。Guinier分析结果显示pRIG-I-RD-RNA复合物的sRg值小于1.3，大多数点在直线上且误差很小，表明小角散射数据质量很好（图4-5）。进一步进行了GNOM分析，结果显示当Dmax值为161.47时，pRIG-I-RD-RNA复合物复合物的实验值与理论曲线的吻合得很好。P(r)曲线在大r区域与横坐标的结合处比较平缓均匀有拖尾，且P(r)曲线有两个峰，因此预测pRIG-I-RD-RNA复合物为细长的大分子结构，可能含有多个区域，至少有两个中心（图4-6）。然而，小角散射技术分辨率较低，不能确定假结结构RNA与RIG-I-RD的结合位点，因此需要继续优化晶体的生长条件，对晶体进行结构解析，从而解析PRRSV3’UTR假结结构与RIG-I-RD的结合模式。4.6小结本研究中，成功表达并纯化了pRIG-I-RD蛋白，且验证了其与PRRSV3’UTR假结结构的相互作用，同时对pRIG-I-RD-RNA复合物溶液中的状态进行了分析，结果显示此复合物为细长的大分子结构，可能含有多个区域，至少有两个中心。由于PRRSV基因组是带有帽子的RNA，其识别机制与之前报道的识别机制不同，本研究为深入研究RIG-I识别模式奠定了坚实的基础。 全文总结95全文总结本论文利用RIP-seq、细胞与分子生物学方法以及结构生物学方法探索了PRRSV与宿主相互作用的机制，研究总结如下：（1）RIP-seq结果表明，RIG-I和MDA5结合于PRRSV正链基因组的3’UTR区域，RIG-I和MDA5与3’UTR的结合有明显的U/C和U/G碱基序列特异性。（2）本研究发现位于PRRSV基因组3’UTR的假结结构能作为PAMP被模式识别受体RIG-I和TLR3识别从而诱导Ⅰ型干扰素及下游ISGs的产生。之前研究表明，PRRSV基因组3’UTR的假结结构对于调节病毒RNA合成以及病毒复制起到关键性作用，本研究发现此假结结构也能作为PAMP被PRRs识别，从而激活IFN信号通路。RNA-pulldown结果证明PRRSV基因组3’UTR的假结结构与RIG-I的RD区和TLR3的ECD区有直接相互作用。序列比对及二级结构预测发现动脉炎病毒科其它成员包括EAV、LDV和SHFV在基因组3’UTR都含有假结结构，这种相互作用在动脉炎病毒科基因组中非常保守，因此本研究丰富了RIG-I和TLR3的识别机制，同时对于PRRSV诱导天然免疫机制进行了详细地阐述。（3）本研究成功表达并纯化了pRIG-I-RD蛋白，且验证了其与PRRSV3’UTR假结结构的相互作用，同时采用SAXS技术分析了PRRSV3’UTR假结结构与pRIG-I-RD在溶液中的特性，结果显示pRIG-I-RD-RNA复合物是细长的大分子结构，可能含有多个区域，至少有两个中心。本论文提出了一个PRRSV基因组3’UTR的假结结构刺激IFN效应与PRRSV蛋白抑制IFN效应平衡的模型。在早期胞内体中，病毒基因组释放到细胞质内，基因组mRNA可以作为模板翻译复制转录酶蛋白（pp1a，pp1ab），经过切割后这些蛋白组装成RTC。然后RTC结合到PRRSV基因组3’UTR区域起始负链RNA的合成。在感染过程中，PRRSV基因组3’UTR假结结构能够被模式识别受体RIG-I的RD区和TLR3的ECD区识别从而激活IRF3或NF-κB产生IFN。病毒的蛋白例如NSP1/2/4/11和N蛋白可以通过靶向IRF3或NF-κB从而干扰宿主的抗病毒应答。因此，PRRSV基因组3’UTR假结结构既能作为分子开关调节病毒RNA合成，同时可以影响天然免疫识别以及下游IFN产生。总之，本研究发现位于PRRSV基因组3’UTR区域假结结构不仅可以影响PRRSV复制，同时还能作为PAMP被宿主的PRRs识别，该机制在动脉炎病毒科病毒中普遍存在。因此，本论文为研究动脉炎病毒科病毒的复制及免疫识别机制奠定了基础。 96猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究图：PRRSV基因组3’UTR假结结构调节PRRSV生命周期及免疫调控Fig:BalancebetweentheimmunerecognitionrolebythepseudoknotwithinthePRRSVlifecycleandtheimmunosuppressionphenotypebyPRRSVprotein. 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缩略语及中英文对照109缩略语及中英文对照缩写英文名称中文名称bpbasepair碱基对CARDCaspaseactivationandrecruitmentdomain胱天蛋白酶招募结构域CPEcytopathiceffect细胞病变效应dday天DCsdendriticcells树突状细胞ddH2ODoubledistilledH2O双蒸水DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯dNTPDeoxy-ribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FBSFetalbovineserum胎牛血清GFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白HRPHorseReddishPeroxidase辣根过氧化物酶IFAimmunefluorescenceassay免疫荧光实验IFNinterferon干扰素ILinterleukin白介素IPimmunoprecipitation免疫共沉淀IRFinterferonregulatoryfactor干扰素调节因子ISGF3interferon-stimulatedgenefactor3干扰素刺激基因因子ISGsinterferon-stimulatedgenes干扰素刺激基因ISREinterferon-stimulatedresponseelement干扰素刺激应答元件JAKjanuskinaseJanus激酶kDkilodalton千道尔顿LARIILuciferaseassaybufferII荧光素酶缓冲液IIminminute分钟MOImultiplicityofinfection感染复数mRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸NLSnuclearlocalizationsignal核定位信号Nspnon-structuralprotein非结构蛋白ORFopenreadingframe开放阅读框PAMPorcinealveolarmacrophage猪肺泡巨噬细胞PAMPpathogen-associatedmolecularpattern病原相关分子模式PCPpapain-likecysteineprotease木瓜样半胱氨酸蛋白酶PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应 110猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究PRRpatternrecognitionreceptor模式识别受体PRRSporcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征PRRSVporcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征病virus毒RDRPRNAdependentRNApolymeraseRNA依赖的RNA聚合酶RTreversetranscription反转录RIP-seqRNA-BindingProteinImmunoprecipitationRNA结合蛋白免疫沉淀sequence及测序ssecond秒STATsignaltransducerandactivatoroftranscription信号转导和转录激活子TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TLRToll-likereceptorToll样受体TNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子αμgmicrogram微克 致谢111致谢时光荏苒，岁月如梭，转眼间在西北农林科技大学的8年本硕博连读时光就要结束了，回首当年在桂花飘香的时节懵懂的我来到了西北农林科技大学，怀着对未来的憧憬，开始了我的求学生涯，回顾这8年的时光，我经历了很多，有辛酸的泪水，更有快乐的欢笑，在此谨向各位老师、同学表达深深的感激之情。首先，感谢我的导师张改平院士。一直以来，张老师都无微不至地关怀着我，不仅在科研上帮我解决遇到的问题，还在生活上给予了我莫大的关心。当我遇到困难时张老师都会耐心地帮我分析问题，不厌其烦地回答我的疑问；当我感到前途漫漫没有目标时，张老师会耐心地开导我，科研的道路没有一帆风顺的，只有经历了重重的探索才能看到事物的真相。张老师以他自身的人格魅力，时刻影响着我，他严谨求实，宽容大度，乐观自信，张老师对我倾注了大量的心血，在此，谨向张老师致以最崇高的敬意和衷心的感谢。感谢陈鑫鑫老师，乔松林老师，李睿老师的关怀和指导，在这里特别感谢陈鑫鑫老师对我的耐心指导、无私帮助和真诚鼓励。忘不了陈鑫鑫老师经常与我共同修改论文到深夜，忘不了她为了我牺牲了多少个周末，是她用自己的行为诠释了“老师”的深刻含义，无私奉献任劳任怨，是您带我克服一个又一个困难，是您在我最困难的时候给予我温暖，感谢您一路走来对我无微不至的关怀，祝您身体健康，工作顺利。感谢河南省动物免疫学重点实验室领导邓瑞广主任，感谢实验室老师赵东、柴书军、杨艳艳、郭军庆、等在实验中给予的热情帮助与无私指导。感谢实验室万博、殷萌琪、刘肖、党露、杨素珍、刘畅、郝慧芳、侯婕、丁培阳、刘运超、王攀、王林建、刘迎琦、王寅彪、罗俊、赵朴、罗雪刚、王丽、陈玉梅、邢广旭、黄晓静、鲍登克、陈静、李学伍、胡晓飞、杨琪、郅玉宝、何萍、夏爽飞、程娜、王瑞宁、李翔、李任峰、蒋大伟、李华玮、藤蔓、李青梅、李会珍、杨继飞、王建中、王聚财、金前跃、卢清侠等师兄师姐师弟师妹在我的实验和生活过程中对我的帮助。感谢赵钦老师、孙亚妮老师、杜涛峰老师、穆杨老师、肖书奇老师、王承宝老师及高继明师兄在学习生活上大力帮助和支持。特别感谢赵钦老师在我做实验的过程中给予我的关心帮助和支持，感谢赵钦老师在我最初进入实验室时研究课题的选择，研究内容的规划，以及实验过程中无微不至地关怀，感谢赵钦老师在我实验中遇到困难时给予我精神上的鼓励和支持，让我在迷茫的时候找到前进的方向，感谢赵钦老师和孙亚妮老师在生活上对我无微不至的关怀和照顾。感谢实验室刘宝元、赵冀楠、王鑫杰等师兄在实验方面及论文写作上对我的指导和帮助。感谢兽医免疫生物学实验室的张冲、王向鹏、李亮亮、张昂克、杜永坤、王鑫杰、蒋奉霖、李慧霞、黄柏成、刘红亮、李娜、李琼毅、 112猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究孔宁、张茂东、李亮亮、张泰、牛巧娜、魏蕊芳、陈宜阳、王立珍、王妍、薛碧云、蒲锋星、王雪、倪怀宝、王欣、王晓红、袁传奇、徐乐乐等师兄师姐们在学习和生活上对我的帮助，同时感谢我的同学及师弟师妹们的帮助。感谢我最好的朋友奚玉莲、覃春英、王丽静、李璠、雷婷、田树苗，是你们让我感受到温暖和快乐，谢谢你们的陪伴、支持与鼓励！在这里特别感谢我的父母在我的学习和生活中给予的关心和帮助，父母时刻关爱着我，陪伴着我，让我感到家的温暖。同时感谢我的舍友们对我的关心和支持，感谢我的朋友们对我的关心和照顾。感谢在我学习和实验期间帮助支持我的所有老师、同学、家人和朋友们，衷心祝福他们事业、学业一帆风顺。感谢参与论文评阅的各位老师，感谢答辩委员会主席和各位答辩委员，衷心的谢谢你们！谢莎2018年6月于西北农林科技大学 作者简介113作者简介谢莎，女，1991年9月出生，汉族，河北省衡水市人。2010年9月考入西北农林科技大学创新实验学院生物技术专业，本硕博连读。2014年6月本科毕业，获得理学学士学位。2014年9月，保送西北农林科技大学动物医学院预防兽医专业进行硕博连读培养，2015年9月转为博士研究生，师从张改平院士。主要研究病原体相关分子模式（PAMPs）与宿主模式识别受体（PRRs）研究。在博士期间发表的主要论文有：1.XieS,ChenXX,QiaoS,LiR,SunY,XiaS,WangLJ,LuoX,DengR,ZhouEM,ZhangGP.2018.IdentificationoftheRNAPseudoknotwithinthe3'EndofPRRSVGenomeasPathogenAssociatedMolecularPatterntoActivateAntiviralSignalingviaRIG-IandTLR3.JVirol.2.ZhaoQ,XieS,SunY,ChenY,GaoJ,LiH,WangX,SyedSF,LiuB,WangL,ZhangG,ZhouEM.2015.DevelopmentandevaluationofaSYBRGreenreal-timeRT-PCRassayfordetectionofavianhepatitisEvirus.BMCVetRes11:195。3.LiR,QiaoS,YangY,GuoJ,XieS,ZhouE,ZhangG.2016.GenomesequencingandanalysisofanovelrecombinantporcineepidemicdiarrheavirusstrainfromHenan,China.VirusGenes52:91-98.4.LiL,WuC,HouG,XueB,XieS,ZhaoQ,NanY,ZhangG,ZhouEM.2017.Generationofmurinemacrophage-derivedcelllinesexpressingporcineCD163thatsupportporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection.BMCBiotechnology17:77.5.WangLJ,WanB,GuoZ,QiaoS,LiR,XieS,ChenXX,ZhangG.2017.GenomicanalysisofarecombinantNADC30-likeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinchina.VirusGenes.6.ZhaoM,WanB,LiH,HeJ,ChenXX,WangL,WangY,XieS,QiaoS,ZhangG.2017.Porcine2’,5’-oligoadenylatesynthetase2inhibitsporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusreplicationinvitro.MicrobialPathogenesis111:14-21.参加学术会议2017年08月，参加第十二届全国病毒学学术研讨会。2018年6月，入选2018年国际猪繁殖与呼吸综合征学术研讨会暨第25届国际猪病大会口述报告。获奖情况2011-2012年“校级优秀学生干部”；“宣传先进个人”；“党课优秀学员” 114猪繁殖与呼吸综合征病毒病原相关分子模式鉴定及其免疫识别机制研究2012-2013年“校级优秀三好学生”；“创新实验学院学生会副主席”；“专业一等奖学金”；“校长奖学金”；“校级优秀学生干部”；“共青团中央青年马克思主义者培养工程优秀学员”；“院级优秀团干”。