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分类号：R392密级：公开学校代码：11065学号：Y2015130940学术硕士学位论文2型糖尿病合并急性脑梗死患者炎症因子与血栓弹力图变化的研究作者姓名苏菲亚指导教师王静副教授学科免疫学培养单位医学部基础医学院答辩日期2018年5月9日 2型糖尿病合并急性脑梗死患者炎症因子及血栓弹力图变化的研究摘要目的探讨血清炎症因子超敏C反应蛋白（highsensitivityC-reactiveprotein,hs-CRP）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、可溶性P-选择素（solubleP-selectin,sP-selectin）和血栓弹力图（thrombelastography,TEG）在2型糖尿病合并急性脑梗死患者的变化规律，为2型糖尿病合并急性脑梗死疾病的预防和治疗提供帮助。方法选取94例在淄博市第一医院内分泌科和神经内科收治住院患者，其中2型糖尿病合并急性脑梗死患者31例为Ⅰ组；单纯急性脑梗死患者31例为Ⅱ组；2型糖尿病且无明显并发症的患者32例为Ⅲ组。另选择本院体检科同期体检正常者32例为Ⅳ组。各组之间生活环境等因素类似，年龄以及性别不具有统计学意义，各组之间存在可比性。Ⅰ组患者与Ⅲ组的糖尿病病史无显著性差异。检测各组患者血清超敏C反应蛋白、白介素-6、可溶性P-选择素水平和血栓弹力图参数，统计学分析使用SPSS19.0统计学软件进行。此项研究经过医院伦理委员会和学术委员会的批准，研究过程中征得所涉患者或家属知情同意，并签署知情同意书。结果①患者血清超敏C反应蛋白和可溶性P-选择素水平，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别明显高于Ⅳ组，差别均具有统计学意义（P<0.001，P<0.01，P<0.05）；血清白介素-6水平，Ⅰ组和Ⅱ组分别明显高于Ⅳ组，差别均具有统计学意义（P<0.001，P<0.01），但Ⅲ组与Ⅳ组比较差别无统计学意义（P>0.05）；②血栓弹力图参数R值、K值、MA值和CI值比较显示：Ⅰ组与Ⅳ组比较差异均具有统计学意义（P<0.01）；Angle值Ⅰ组分别与Ⅲ组、Ⅳ组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；R值Ⅰ组与Ⅲ组比较具有统计学意义（P<0.05）；③血栓弹力图参数R值、K值、Angle值、MA值和CI值比较显示：Ⅱ组与Ⅳ组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；R值和Angle值，Ⅱ组与Ⅲ组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；④血栓弹力图参数K值和MA值，Ⅲ组与Ⅳ组相比均具有统计学意义（P<0.05）；⑤Ⅰ组患者血栓弹力图各参数与超敏C反应蛋白、白介素6、可溶性P-选择素呈正相关（r=0.389,0.375,0.468；P=0.036,0.044,026）；Ⅱ组患者血栓弹力图各参数与超敏C反应蛋白、白介素6、可溶性P-选择素也呈正相关，但Ⅲ组患者血栓弹力图各参数与超敏C反应蛋白、白介素-6、可溶性P-选择素之间无显著相关性。结论①血清超敏C反应蛋白、白介素-6、可溶性P-选择素水平升高与2型糖尿病合并急性脑梗死的发生发展存在相关性。②血栓弹力图各参数尤其是MA值增高可能预示发生血栓的概率明显增加。I 硕士研究生：苏菲亚（免疫学）指导教师：王静（副教授）关键词：血栓弹力图；超敏C反应蛋白；白介素-6；可溶性P-选择素；2型糖尿病II Studyonthechangesofthrombelastographyparametersandinflammatoryfactorsinpatientswithtype2diabetesmellituscomplicatedwithacutecerebralinfarctionAbstractObjective:ThechangesofseruminflammatoryfactorssuchashighsensitivityC-reactiveprotein(hs-CRP),interleukin-6(IL-6),solubleP-selectin,andthrombelastography(TEG)inpatientswithtype2diabetescombinedwithacutecerebralinfarctionwerediscussed.Inordertoprovidehelpforpreventionandtreatmentoftype2diabetesmellituscomplicatedwithacutecerebralinfarction.Methods:Atotalof94patientstreatedinzibofirsthospital，departmentofEndocrinologyandNeurology,31casesofpatientswithtype2diabetesmellituscomplicatedwithacutecerebralinfarctionweregroupI;31casesofpatientswithpureacutecerebralinfarction(nodiabetes)weregroupII;32casesoftype2diabeteswithoutobviouscomplicationsinpatientsofgroupIII.Inaddition,32casesofphysicalexaminationinsamehospitalduringthesameperiodwereselectedasthegroupIV.Thelivingenvironmentofeachgroupwassimilar,ageandsexdidnothavestatisticalsignificance,andtherewasacomparabilitybetweeneachgroup.TherewasnodifferenceinthehistoryofdiabetesbetweengroupIandgroupIII.ThethrombelastographyparametersandserumlevelsofthehighsensitivityCreactiveprotein,interleukin-6,solubleP-selectinineachgroupweredetectedandthestatisticalanalysiswascarriedoutwithSPSS19.0statisticssoftware.Theresearchplanwasapprovedbytheacademiccommitteeofthehospitalandtheethicscommittee.Duringtheresearchprocess,theinformedconsentofthepatientsorfamilymemberswasobtained,andtheinformedconsentwassigned.Results：①ThelevelsofserumhighsensitivityCreactiveproteinandsolubleP-selectinshowedthatgroupI,groupIIandgroupIIIweresignificantlyhigherthanthoseingroupIV,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.001,P<0.01,P<0.05).Seruminterleukin-6levelsingroupIandgroupIIweresignificantlyhigherthanthoseingroupIV,withstatisticallysignificantdifference(P<0.001,P<0.01).However,therewasnosignificantdifferencebetweengroupIIIandgroupIV(P>0.05).②TheTEGparametersIII ofR,K,MAandCIshowedthatthedifferencebetweengroupIandgroupIVwasstatisticallysignificant(P<0.01).ThedifferenceofTEGparametersofAnglebetweengroupIandgroupIIIwasstatisticallysignificant(P<0.05).thesameasgroupIV.TheRvalueofgroupIwasstatisticallysignificantcomparedwithgroupIII(P<0.05).③TheTEGparametersofR,K,Angle,MAandCIshowedthatthedifferencebetweengroupIIandgroupIVwasstatisticallysignificant(P<0.05).ThedifferenceofRandAnglebetweengroupIIandgroupIIIwasstatisticallysignificant(P<0.05).④TheTEGparametersofKandMAingroupIIIwerestatisticallysignificantcomparedwiththoseingroupIV(P<0.05).⑤TheTEGparametersingroupIwerepositivelycorrelatedwithhighsensitiveCreactiveprotein,interleukin-6,solubleP-selectin(r=0.389,0.375,0.468;P=0.036,0.044,026).theTEGparametersingroupIIwerealsopositivelycorrelatedwithhighsensitiveCreactiveprotein,interleukin6,solubleP-selectin,buttheTEGparametersingroupIII,therewasnosignificantcorrelationbetweentheparametersandhypersensitivityCreactiveprotein,interleukin6andsolubleP-selectin.Conclusion:①TheelevatedlevelsofserumhypersensitiveCreactiveprotein,interleukin-6andsolubleP-selectiniscorrelatedwiththeoccurrenceanddevelopmentoftype2diabeteswithacutecerebralinfarction.②TheTEGparameters,especiallytheincreaseofMAvalue,mayindicatetheprobabilityofthrombosis.Graduatestudent:Fei-yaSu(Immunology)DirectedbyProf.JingWangKeywords:Thrombelastography;HighsensitivityC-reactiveprotein;Interleukin-6;SolubleP-selectin;Type2diabetesmellitusIV 目录引言········································································································································1材料与方法····························································································································41材料································································································································41.1病例选择······················································································································41.2标本收集······················································································································42主要仪器与试剂·············································································································42.1主要仪器设备··············································································································52.2主要试剂······················································································································53实验方法与步骤·············································································································53.1血糖、血脂、hs-CRP等一般资料的收集································································53.2白介素-6的检测·········································································································63.3可溶性P-选择素的检测·····························································································73.4血栓弹力图的检测·····································································································84统计学分析··················································································································14结果······································································································································151各组患者血糖、血脂等一般资料的比较··································································152各组患者炎症因子表达水平的比较··········································································163各组患者血栓弹力图结果的比较··············································································194TEG与IL-6、hs-CRP、sP-selectin等指标相关性····················································21讨论······································································································································22结论······································································································································26参考文献······························································································································27综述······································································································································30综述参考文献······················································································································41攻读学位期间的研究成果··································································································49英文缩略词汇表及中文对照······························································································50致谢······································································································································511 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明······························································522 引言引言糖尿病已成为一个世界性的健康问题，我国随着人口老龄化、经济高速发展及生活方式改变，糖尿病患病率越来越高，呈快速上升趋势。2008年[1]流行病学调查结果显示：中国20岁以上成人糖尿病的患病率为9.7%。而2010年流行病学调查的结果[2]为：中国18岁以上成年人，糖尿病的患病率高达11.6%，且处于糖尿病前期的比率高达50.1%[3]。2015年，国际糖尿病联盟（IDF）预测，中国现在拥有世界上数量最多的糖尿病患者，其数量已达到1亿，而且还在增加。估计到2040年，中国患糖尿病的人数将增加到1亿5000万。在我国糖尿病患者中，90%以上为2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM）。糖尿病及其并发症的治疗费用逐年增高，因此，糖尿病的防治刻不容缓。现在，急性脑梗死（acutecerebralinfarction,ACI）是临床上较为常见的脑血管疾病，严重危害人们的健康，逐渐发展成危及中国城乡居民生命的第二大病因[4]。急性脑梗死是一种由多种因素引起的疾病，其中动脉粥样硬化尤为重要。动脉粥样硬化不但与脂质代谢过程出现紊乱相关，而且在动脉粥样硬化的产生、发展及斑块组织破碎脱落致血栓形成等过程中炎症反应均起到关键性作用。动脉粥样硬化是机体应对各类慢性炎症反应刺激的结果。事实证明：2型糖尿病是大血管伴发动脉粥样硬化性疾病的重要危险因素。动脉粥样硬化引起的大血管疾病也是2型糖尿病常见的、重要的并发症。糖尿病同慢性炎症一样，是动脉粥样硬化的始动环节[5,6]。2型糖尿病引发动脉粥样硬化的机制可能是：糖尿病患者长期的高血糖，可引起血管内皮细胞功能和结构受损，导致血小板功能亢进、凝血酶活性增强、纤维蛋白原水平增高、血管舒缩功能失调、血液流变学异常、红细胞变形能力下降等，使血液呈高粘、高滞、高凝状态，引起大血管的动脉粥样硬化，从而导致大血管疾病的发生、发展。同时，2型糖尿病也是一种慢性的、亚临床性的炎症[7]，可合成和分泌大量炎症介质因子，启动并促进动脉粥样硬化的发生发展。2型糖尿病是诱发心脑血管疾病的一个重要原因，可以引起严重的心脑血管疾病，而急性缺血性脑卒中以及冠心病等常见病，又是2型糖尿病严重的血管并发症。2型糖尿病并发缺血性脑卒中的患者，在全部脑卒中患者的比率是21.0%~44.4%[8,9]，这部分患者的病情严重，血糖明显增高，梗死范围多数较大、多发，而且症状重、恢复慢，预后不良，病死率、致残率明显增加。在2型糖尿病合并急性脑梗死病发病过程当中，高血糖所致的炎症反应、血管1 青岛大学硕士学位论文内皮细胞功能紊乱及血液高凝等病理因素共同参与了急性脑梗死的发生和发展。近年来研究表明[10,11,12,13]，炎症介质因子白介素-6、超敏C反应蛋白、血清可溶性P-选择素和血栓弹力图检测在急性脑梗死的诊断和治疗中发挥了较大作用，受到越来越多的学者重视。白介素-6是炎症的早期反应指标，是一种典型的具有多种生物学功能的细胞因子。如今的研究已经十分清楚，人类白介素-6基因位于第7号染色体上，白介素-6的分子量为26KD。有许多种细胞可以产生白介素-6，例如单核/巨噬细胞能够产生，血管内皮细胞也可以产生，除此以外，T淋巴细胞、肥大细胞、腹膜上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等也都可以释放。白介素-6在炎症反应中具有重要作用，当机体发生组织损伤、感染及炎症等应激原的作用后，在白介素-6以及肿瘤坏死因子等物质的刺激下，肝脏能够合成一些特殊蛋白质，称为急性时相反应蛋白（acrtephase蛋白、AP蛋白），例如，C反应蛋白、补体C3和α1抗胰凝乳蛋白酶等。白介素-6可以诱导细胞增殖分化、生长，参与组织纤维化，具有于血管内皮有关的组织损伤作用。白介素-6在内分泌和代谢调节中也发挥重要作用，是炎症反应的细胞因子网络中一个中枢性调节因子，是炎性应激状态刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要细胞因子之一，参与机体的各种病理生理过程。在急性炎症反应时，肝脏可以产生一种非特异性标记物——C反应蛋白。这是一种急性时相蛋白，它是一种环状五聚体蛋白样的分子结构，包括5个相同的亚单位，在这些亚单位之间，主要依靠非共价键作用力相互结合，其分子量在11.5万至14万的范围内，具有显著的耐热能力，可以抗蛋白酶的降解。C反应蛋白能够和多糖物质结合，同时能和卵磷脂结合，而且能够结合核酸。可通过作用于补体激活补体系统，对入侵的细胞吞噬作用和免疫调节作用，并显示炎症反应。超敏C反应蛋白（hs-CRP）实际上和C反应蛋白是同一种蛋白，只是在检测灵敏度上有差别来加以区分。伴随生物化学测定技术的日趋提高，超敏C反应蛋白的最低检测限可达0.01mg/l，超敏C反应蛋白的测定在临床上成为了现实。超敏C反应蛋白的测定在早期评估心脑血管疾病和其他动脉粥样硬化事件中较常规方法检测的CRP更敏感，冠状动脉事件、卒中和外周血管疾病与超敏C反应蛋白密切相关。超敏C反应蛋白升高可作为动脉粥样硬化性心脑血管疾病的独立危险因素。在选择素家族中，P-选择素的分子量为14万。它富含半胱氨酸，高度糖化，是一种整合蛋白质，亦是一种细胞黏附分子。它主要存在于巨核细胞、静止血小板α颗粒膜上和内皮细胞棒管状小体内。P-选择素分子有2种类型，一种是表达于血小板和内皮细胞膜上的跨膜P-选择素分子，介导血小板与内皮细胞的黏附功用，称为血小板膜P-选择素分子；另一种是血清中可溶性P-选择素，当内皮细胞受损或血2 引言小板活化时释放到血液中。因此，血清可溶性P-选择素可作为体内血栓形成的诊断指标。血栓弹力图（TEG）分析仪是最近几年新发展起来用于评价凝血功能的仪器[8]。血栓弹力图是血栓弹力仪检测除血管成分以外从凝血到纤溶的全部凝血过程而描绘出的特殊图形，对血小板聚集功能、凝血因子活性、纤维蛋白原含量及纤维蛋白溶解等各方面进行凝血全貌的评价和检测，是分析评估血凝状况的一种敏感方法，从而为血栓性疾病是否处于高凝状态提供有利证据[9,10]。目前常规的四种凝血试验都是以一定的凝血过程或某些凝血产物为基础，不能反映全血凝固情况，不能反映机体内的凝血状态，缺乏敏感性。因此，血栓图力图通过测定血块的形成速度以及凝血块最终的强度、稳定性来反应机体的凝血状态[11]。为了探究2型糖尿病合并急性脑梗死患者血栓弹力图和血清炎症因子的变化情况，以期为预防和治疗2型糖尿病合并急性脑梗死疾病提供科学依据，本研究拟测定分析2型糖尿病合并急性脑梗死患者及对照组的血清炎症因子（IL-6、hs-CRP、sP-selectin）表达水平和血栓弹力图的参数特征，现报道如下。3 青岛大学硕士学位论文材料与方法1材料1.1病例选择选取了2017年1月至2017年6月在淄博市第一医院神经内科和内分泌科住院的患者94例，其中男性54例，女性40例，年龄47~76岁，平均（56.8±10.8）岁。将94例患者中2型糖尿病合并急性脑梗死患者31例为Ⅰ组，其中男性18例，女性13例，年龄48~75岁，平均（63.5±7.6）岁；单纯急性脑梗死患者（没有合并糖尿病）31例为Ⅱ组，其中男性17例，女性14例，年龄47~76岁，平均（64.1±8.2）岁；2型糖尿病无明显并发症的患者32例为Ⅲ组，其中男性19例，女性13例，年龄47~74岁，平均（60.2±9.6）岁。另选择同期我院体检科查体正常者完全没有重大疾病32例为Ⅳ组，其中男性18例，女性14例，年龄47~72岁，平均（58.6±10.6）岁。急性脑梗死的诊断标准采用2014年《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》：有脑卒中的危害因素；中老年患者；休息或活动中急性起病；有颈动脉系统和（或）椎动脉系统的症状和体征；腰部穿刺脑脊液一般不含血；经头颅CT或MRI影像学检查证实。2型糖尿病的诊断标准采用2015年《中国2型糖尿病防治指南》：有典型临床症状，加空腹血糖≥7.0mmol/L或即刻血糖≥11.1mmol/L或糖耐量试验餐后2小时血糖≥11.1mmol/L；无典型糖尿病的症状，有符合上述一项血糖标准者，在次日复查仍符合上述三项之一者便可诊断为糖尿病。排除标准：既往得过脑卒中、外伤致颅脑损伤、恶性肿瘤、冠心病、严重肝肾功能不全、严重自身免疫性疾病患者。各组之间年龄、性别、居住环境等情况相近，差异无统计学意义，具备可比性。2型糖尿病合并急性脑梗死组患者的糖尿病病史与2型糖尿病无明显并发症组患者的病史无显著性差异。该研究方案经过医院学术委员会和伦理委员会批准，研究过程中向所涉患者或家属讲明情况，并签署知情同意书。1.2标本收集全部患者标本均于住院后24h内清晨空腹采血，抽取空腹静脉血5ml，分装1.8ml静脉血分装于枸橼酸钠（蓝盖）抗凝管中颠倒混匀，用于血栓弹力图的测定；另外3.2ml于普通试管中，分离血清后，吸取0.5ml血清于另一试管中置-70℃冰柜冻存，用于检测白介素-6和P-选择素，剩余血清用于血糖、血脂、超敏C反应蛋白等测定。正常对照组在体检当天早晨空腹静脉采血。4 材料与方法2主要仪器与试剂2.1主要仪器设备Modular型全自动生化分析仪德国罗氏医疗器械有限公司CFMSLEPU-8800型血栓弹力图仪北京乐普诊疗科技有限公司Anthos2010型全自动酶标仪奥地利安图斯医疗仪器有限公司全自动洗板机奥地利安图斯医疗仪器有限公司医用台式低速离心机北京白洋公司台式低温离心机美国ThermoFisher有限公司冰箱海尔电器股份有限公司-70℃超低温冰柜日本三洋公司37℃水浴箱山东新华医疗器械有限公司平板振荡器上海医大仪器有限公司移液器Eppendorf/Thermo，德国2.2主要试剂白介素-6测定试剂盒（96T）深圳晶美生物试剂公司可溶性P-选择素测定试剂盒（96T）深圳晶美生物试剂公司超敏C反应蛋白测定试剂德国罗氏公司血栓弹性试剂北京乐普医疗科技有限公司3实验方法与步骤3.1血糖、血脂、超敏C反应蛋白等一般资料的收集血糖、总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇测定全部采用酶法；超敏C反应蛋白测定采用透射免疫增强比浊法。全部用全自动生化分析仪测定。我院住院患者常规检查血糖、血脂、肝功、肾功等生化指标，超敏C反应蛋白的测定包含在血脂套餐中。经过授权，通过医院的电子病历系统，可以查到所选患者的一般资料，包括了姓名、性别、出生年月、身高、体重、血压、血糖、血脂、5 青岛大学硕士学位论文超敏C反应蛋白等信息。我设计了一个表格，将这些所需信息登记备用。3.2白介素-6的检测（1）检测方法：ELISA-双抗体夹心法（2）实验原理本试验为检测血清中的白介素-6含量，采用了ELISA-双抗体夹心法。将特异性的白介素-6抗体包被到微孔板上，样本中的炎症反应因子白介素-6与固相载体表面的抗体特异性结合。通过洗涤去除液体中的未反应的游离物质。加入酶标抗体后，通过孵育，能够在固相载体的上面形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物。然后加入底物，酶催化底物显色，并且颜色深浅与酶结合复合物含量呈正相关，以此测定抗原含量。（3）样本及试剂准备样本血清准备：将待测血清从低温冰箱中取出融解，平衡至室温，待用。试剂准备：将试剂盒从冰箱中取出，恢复至室温后，按照说明书对标准品进行倍比稀释，在酶标微孔板上用记号笔做好标记。（4）样本检测①分别将稀释后的参考品和样本加入预先标记的酶标板微孔中，各加入100μl。参考品每一个浓度加2孔，空白对照孔内加入100μl稀释液。②酶标板上贴好覆膜后，37℃水浴箱内放置孵育2h。③弃上清，每孔加300μl洗涤液洗涤，1min后甩弃洗液。重复3次。将板子倒扣于吸水纸，吸净孔内液体。④每孔加入兔抗人白介素-6多抗100μl，酶标板上贴覆膜，放置37℃水浴箱内孵育1h。⑤重复上述C步骤，洗板3次，最后一次用吸水纸拍干孔内液体。每孔加入酶标试剂（羊抗兔IgG）100μl，贴覆膜，再放37℃水浴箱孵育30min。⑥洗板5遍，最后一次用吸水纸拍干孔内液体。每孔各滴入50μl底物A液、B液，轻轻震动酶标板，充分混匀板孔内液体。贴覆膜，置37℃水浴箱中避光孵育30min，每孔滴入终止液50μl，液体由蓝色变成黄色。6 材料与方法⑦酶标仪测定OD450读数。各孔读数减去空白孔读数。描绘参考曲线图：以读取的OD值作为横坐标，用全部参考品的浓度作为纵坐标，描绘参考曲线图，得出计算公式。根据计算公式计算各样品孔的白介素-6的含量。（5）实验注意事项①血清标本制备进程中，需不能发生溶血，溶血的标本可能会释放出含有过氧化物酶活性的物质，影响检测结果。②冷冻的血清恢复至室温后，应充分轻轻地混匀，不能有气泡产生，可来回颠倒混匀，不能在振荡器上剧烈振荡。此外有浑浊或絮状物的标本应该离心沉淀，检测时吸取标本上清液进行测定。③避免标本测定前保存过程中反复冻融。④加样时必须加在板孔的底部，不能产生气泡，避免液体粘挂在侧壁，并且要防止液体外溅。⑤注意样本加样必须一人一吸头。⑥洗板时每次都要将洗涤液加满板孔，间歇摇动1min。3.3可溶性P-选择素的检测（1）检测方法：ELISA-双抗体夹心法（2）实验原理本试验采用ELISA-双抗体夹心法检测样本中sP-selectin含量。将具有免疫学活性的抗体固相化包被在微孔板上，样本中的可溶性P-选择素分子与固相载体表面的抗体特异性结合。通过洗涤去除液体中的未反应的游离物质。加入酶标记的抗体后，在固相载体表面，经过孵育能够形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物。然后加入底物，酶催化底物显色，并且颜色深浅与酶结合复合物含量呈正相关，以此判断抗原含量。（3）样本及试剂准备样本准备：将血清样本从超低温冰箱中取出融解，平衡至室温，待用。试剂准备：从冰箱中取出试剂盒，放置恢复到室温，依照说明书对标准品进行稀释，在酶标微孔板上用记号笔做好标记。（4）样本检测7 青岛大学硕士学位论文①将稀释后的参考品和样本分别加入预先标记的酶标板孔中，各加入100μl。参考品每一个浓度加2孔，空白对照孔内注入100μl稀释液。②酶标板上贴覆膜，放置37℃水浴箱孵育1h。③弃上清液，每孔加300μl洗涤液洗涤，1min后甩弃洗液。重复3次。将板子倒扣于吸水纸上，拍打吸净孔内液体。每孔加入酶标试剂100μl，贴覆膜，再放37℃水浴箱孵育30min。④弃去上清液，每孔注入洗涤液300μl洗涤，洗板5遍，弃洗液，最后一遍用吸水纸将酶标板拍干，吸净孔内液体。⑤每孔逐个滴入50μl底物A液、B液，贴好覆膜，37℃水浴箱放置温育30min，再每孔滴入中止液50μl，液体由蓝色或浅蓝色变成黄色。轻轻晃动酶标板，混匀板孔中液体。⑥酶标仪测定OD450读数。各孔读数减去空白孔读数。绘制参考曲线图：以读取的OD值作为横坐标，用全部参考品的浓度作为纵坐标，描绘参考曲线图，计算得出计算公式。根据计算公式计算各样品孔的sP-selectin的含量。（5）实验注意事项①血清标本制备进程中，不能发生溶血，溶血的标本可能会释放出含有过氧化物酶活性的物质，影响检测结果。②冷冻的血清恢复至室温后，应充分轻轻地混匀，不能有气泡产生，可来回颠倒混匀，不能在振荡器上剧烈振荡。此外，有絮状物或混浊的标本应离心，沉淀，吸取样品上清液进行测试。③反复冻融样本会破坏可溶性P-选择素的分子，降低血清中浓度，所以测定前样本不能反复冻融。④加样时必须将所加物加在板孔的底部，不能产生气泡，避免液体粘挂在侧壁，并且要防止液体外溅。⑤注意样本加样，避免交叉污染的发生。⑥洗板时每次都要将洗涤液加满板孔，间歇摇动1min。3.4血栓弹力图的检测（1）检测方法：血栓弹力图仪检测法8 材料与方法（2）实验原理血液中的钙离子能够与枸橼酸根形成络合物，难以解离。在整个凝血过程中必须有钙离子参与，血液中钙离子的减少，会阻碍血液凝固。在样品测定杯中加入氯化钙及促凝剂，血液便开始凝固，随后出现纤溶过程。血栓弹力图仪经过测定杯盖和杯体间发生的切应力，就可以描绘出血块强度随时间改变的弧线。利用传感器能够将全部变化过程反映到描图纸上，便构成独特的血栓弹力图。（3）仪器及试剂准备测试前检查：①检查仪器顶端的水平气泡，如果其不在水平位置，可以调节仪器前端底座左右和后部底座中间的三个水平调节杆，以保证气泡至水平位置；②使用仪器外置电源时，确认仪器各个连接线连接正确无误，电源线与220V电源连接；③确保杯槽内的干净及干燥，必要时，可用干净棉签清洁杯槽；④按下电源开关打开血栓弹力图仪，10min后查看温控表显示温度是否达到37℃；⑤确认工作台保持水平、洁净、没有其他可能影响实验的杂物。测试准备工作：①如果有患者需要进行的检测，须对试剂进行复温，复温时间保证10min以上；②打开电脑主机的“电源”键，电脑桌面上双击“CFMS”图标进入CFMS专用分析软件；③下拉菜单中输入默认用户名“？管理员”，输入密码为空白，点击“确定”，弹出选择操作者对话框；④点击“操作员”（选中变成蓝色），点击“登陆”，进入CFMS主界面，点击右上角“CFMS”图标，进入操作界面。弹出如下对话框，给予“开始测试”指令，进入水平测试界面；⑤将测试杆拨到测试位置，每一个通道都要进行水平测试，当电脑显示“eTestvalueisOK”，说明通过测试，点击“完成”按钮。⑥把测试杆移回装载位置，点击“确定”。试剂准备：将试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温。9 青岛大学硕士学位论文（4）标本检测普通杯检测：①将杯架滑到平台位置，位于杯杆的底部。（测试杆必须在装载位置垂直于机身），将普通杯（透明杯）放在杯架上，然后将杯架推到杯杆上。一只手用力按住分析仪的底座，另一只手按下杯架底部的按钮。听到上杯成功的声音之后，再按压三次，以确保杯盖被金属探针插入。向下滑杯架，使杯架位于杯杆一半的位置上，用两手持握杯架，用力压杯子，确保杯子在杯槽中压紧，完成上杯；②加样枪吸取20μl的试剂2溶液，加入已经上好的杯中；③在工具栏上点击“病例”，选择“添加病例”，点击“完成”输入患者本次实验的编号（2011）、姓名、住院号，点击“完成”，选择检测通道一，点击下拉按钮，从中选则本次检测类型——普通杯检测（CK），在下拉菜单中选则患者姓名，填写科别和床号；④打开试剂1瓶盖，向瓶中注入1000μl患者标本，盖紧瓶盖后上下颠倒5次（请勿剧烈摇晃），按下计时器开始按钮；⑤为确保试剂1充分激活血标本，将试剂1激活的血标本静置4min；⑥从试剂1瓶中用加样枪吸取340μl标本，缓缓注入杯中（一定沿杯内壁），抬杯卡到仪器顶部，将测试杆拨到测试位置；⑦选中加样的通道，点击“开始”。肝素酶杯检测：①把普通杯（透明杯）和肝素酶杯（橙色杯）分别置于一和二通道的杯架上，然后将杯架推到杯杆上方。一只手用力按压分析仪的底座，另一只手按下杯架底部的按钮。听到上杯成功的声音之后，继续按压三次，以确保杯子盖被金属探针插入。向下滑杯架，使杯架位于杯杆一半的位置上，用两手持握杯架，用力压杯子，确保杯子在杯槽中压紧，完成上杯；②加样枪吸取20μl的试剂2溶液，分别加入已经上好的两个杯中；③选择患者名字或建立新病历：①在屏幕上方的工具栏上点击“病例”，选择“添加病例”，输入患者实验编号（2011）、姓名、住院号，点击“完成”；②再次点击“添加病例”输入患者实验编号（2022）、姓名，点击“完成”。选择检测通道一，点击下拉按钮，从中选则本次检测类型——普通杯检测（CK），在下拉菜单10 材料与方法中选则患者姓名，填写科别和床号；选择检测通道二，选定肝素酶杯检测（CKH），在下拉菜单中选择患者名字，填写科别和床号；④打开试剂1瓶盖，向瓶中注入1000μl血，盖紧瓶盖后上下颠倒5次（请勿剧烈摇晃），按下计时器开始按钮；⑤为确保试剂1充分激活血标本，将试剂1激活的血标本静置4min；⑥从试剂1瓶中用加样枪吸取340μl标本，缓缓注入杯中（一定沿杯内壁），抬杯卡到仪器顶部，将测试杆拨到测试位置；⑦选中加样的通道，点击“开始”。⑧二通道按同样步骤进行。血小板检测：①把杯托往下滑，直到平台位置，注意要紧贴杯杆向下，使测试杆务必与机身垂直，处于装载位置，把普通杯（透明杯）放在杯托上，然后将杯托推到杯杆上方。一只手使劲压住分析仪的底座，另一只手用力向上抬杯架底部的圆柱，听到上杯成功声音后，再用力按压三次，保证杯盖已经被金属探针插入。向下滑杯架，使杯架位于杯杆一半的位置上，用两手持握杯架，用力压杯子，确保杯子在杯槽中压紧，完成上杯；由于血小板检测要用4个杯（透明杯、蓝色杯、绿色杯、紫色杯），四个检测通道，所以需要上杯四次；②把所用到的蓝色的试剂A、绿色的试剂B、紫色试剂C和蒸馏水分别从试剂盒中取出，开启试剂A和蒸馏水水的瓶盖，在试剂A瓶中加入40μl蒸馏水，把试剂A的瓶盖盖上，轻轻旋转、复融试剂；开启试剂B瓶盖，在试剂B瓶中加入40μl蒸馏水，把试剂B的瓶盖盖上，轻轻旋转、复融试剂；打开试剂C瓶盖，在试剂C瓶中加入40μl蒸馏水，把试剂C的瓶盖盖上，轻轻旋转、复融试剂；室温下静置8min；③选取患者的姓名或创建新的病历：①在屏幕上方的工具栏上点击“病例”，点击“添加病例”，输入患者实验编号（2011）、姓名、住院号，点击“完成”。②点击“添加病例”，输入患者实验编号（2012）、姓名，点击“完成”；③选择“添加病例”，输入患者实验编号（2013）、姓名，点击“完成”；④选择“添加病例”，输入患者实验编号（2014）、姓名，点击“完成”。选择检测通道一，点击下拉按钮，从中选则本次检测类型——普通杯检测（CK），在下拉列表中点击病人姓名，填写科别和床号；选择检测通道二，选则巴曲酶杯检测（A），在下拉列表中点击11 青岛大学硕士学位论文患者名字，填写科别和床号；选择检测通道三，选则腺苷二磷酸样品检测杯（ADP），在下拉列表中点击患者名字，填写科别和床号；选择检测通道四，选则花生四烯酸样品检测杯（AA），在下拉列表中点击患者名字，填写科别和床号；④用加样枪吸取20μl的试剂2溶液，加入已经上好的透明杯中。打开试剂1瓶盖，向瓶中注入1000μl患者标本，盖紧瓶盖后上下颠倒5次，请勿剧烈摇晃；⑤为确保试剂1充分激活血标本，将试剂1激活的血标本静置4min；⑥从试剂1瓶中用加样枪取340μl标本，缓缓注入杯中（一定沿杯内壁），抬杯卡到仪器顶部，将测试杆拨到测试位置；⑦选中加样的通道，点击“开始”。用加样枪分别在通道二、三、四的杯中，加入10μl试剂A；⑧将肝素抗凝标本颠倒混匀，抽取360μl，加入通道二的蓝色杯中，吹打混吸5次，抬杯，拨杆，选中加样的通道，点击“开始”；⑨用加样枪抽取10μl试剂B，加入通道三的绿色杯中，将肝素抗凝标本颠倒混匀，抽取360μl，加入杯中，吹打混吸5次，抬杯，拨杆，选中加样的通道，点击“开始”；⑩用加样枪抽取10μl试剂C，加入通道四的紫色杯中，将肝素抗凝标本颠倒混匀，抽取360μl，加入杯中，吹打混吸5次，抬杯，拨杆，选中加样的通道，点击“开始”。停止检测：①点击“完成”回到CFMS主界面，查看描记图形；②双击小图可以全屏显示图形，直到右侧数据表格中五组数值均暂停闪烁，星号消失，表明结束检测，可以停止；③将测试杆从水平位置拨到垂直于仪器，向下压，可卸载杯盖，用力将杯架下压到底，弹出使用后的杯子，用镊子夹出，按医疗废物处理。结果输出：①肝素酶杯检测和血小板检测结果为复合图形。①肝素酶杯：点击“复合显示”图标，先选中CKH杯的图形，再选中CK杯的图形（注意千万不要颠倒选择顺序），两个图形变成蓝色后，点击“完成”，通过复合图形，可以判断结果；②血小板：点击“复合显示”图标，先选中ADP杯的图形，后选中A杯的图形，最后选中CK12 材料与方法杯的图形（注意一定不要颠倒选择顺序），三个图形变为蓝色后，点击“完成”，通过复合图形，可以判断结果；点击“复合显示”图标，先选中AA杯的图形，后选中A杯的图形，最后选中CK杯的图形（注意一定不要颠倒选择顺序），三个图形变为蓝色后，点击“完成”，通过复合图形，可以判断结果；②选中普通杯检测图形，在工具栏中点击“试样记录”，选择试样选项卡，将结论填写至报告处，填写报告者及报告日期；③点击“报告”图标（如果需要则选择“所有测试”），点击“继续”，再点击“打印”；④肝素酶杯和血小板杯：在复合图形界面中点击工具栏中“报告”，点击“继续”，再点击“打印”完成复合图形的打印；⑤按上述流程开始下一个样本。结果上传：①数据上传：选中需要上传的数据，点击工具栏中的“文件”，选择“另存为”，在弹出的对话框中选择“txt”格式，文件命名需在原样本号的基础上添加“-1”，保存在“E盘/CFMS”根目录下；②图形上传：普通杯图形上传：选中普通杯图形并双击鼠标左键，得到放大的普通杯图形，按“Ctrl+C”复制图形，打开电脑画图板，按“Ctrl+V”将图形粘贴到画图板上，点击工具栏中的“文件”，选择“另存为”，在弹出的对话框中选择“JPEG”格式，保存在“E盘/CFMS”根目录下；肝素酶杯图形上传：除了上传普通杯图形外，需要上传肝素酶杯的复合图形，在主界面工具栏中点击“复合显示”图标，先选中CKH杯的图形，再选中CK杯的图形（注意千万不要颠倒选择顺序），两个图形变成蓝色后，点击“完成”，得到复合图形，按“Ctrl+C”复制图形，打开电脑画图板，按“Ctrl+V”将图形粘贴到画图板上，点击工具栏中的“文件”，选择“另存为”，在弹出的对话框中选择“JPEG”格式，保存在“E盘/CFMS”根目录下；血小板图形上传：除了上传普通杯图形外，需要上传血小板的复合图形，在主界面工具栏中点击“复合显示”后选择CK、A和ADP（或CK、A和AA）的图形使三个图形变为蓝色后，点击“完成”，得到复合图形，按“Ctrl+C”复制图形，打开电脑画图板，按“Ctrl+V”将图形粘贴到画图板上，点击工具栏中的“文件”，13 青岛大学硕士学位论文选择“另存为”，在弹出的对话框中选择“JPEG”格式，保存在“E盘/CFMS”根目录下。（5）注意事项①仪器调试前请确保仪器的水平，分析台面的稳定；②仪器测试前，请将测试杆重复进行测试和锁定活动，重复进行下按活动；③检测试剂保证足够的室温复温时间，加样时避免出现较多的气泡；④上杯时，确保杯盖和杯身固定到位，保证样品杯与机器的结合紧密；⑤测试过程中请勿震动桌面；⑥样本测试结束时，请先点击“停止”，结束测试，再卸下样品杯，装卸样品杯时测试杆一定要在锁定位置；⑦试剂A/B/C请在复溶后的2小时内使用。4统计学分析统计学分析使用SPSS19.0统计软件进行，用均数±标准差（x±s）表示计量资料，多组均数之间的比较采用单因素方差分析，两两之间对比采用LSD-t检验，相关性分析采用Pearson分析，并进行多元线性回归分析，P<0.05有统计学意义。14 结果结果Ⅰ组为2型糖尿病合并急性脑梗死患者31例；Ⅱ组为单纯急性脑梗死患者31例；Ⅲ组为2型糖尿病且无明显并发症的患者32例。Ⅳ组为体检科同期健康体检者32例。下面就用Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组表示各组结果。1各组患者血糖、血脂等一般资料的比较①各组之间性别、年龄对比无显著性差异，P>0.05；②血清TC、TG水平，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别与Ⅳ组比较均具有统计学意义（P<0.01），但Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅰ组与Ⅲ组及Ⅱ组与Ⅲ组比较均无统计学意义（P>0.05）；③血清LDL-C水平，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别与Ⅳ组比较均具有统计学意义（P<0.01、P<0.01、P<0.05），但Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅰ组与Ⅲ组及Ⅱ组与Ⅲ组比较均无统计学意义（P>0.05）；④血清HDL-C水平，Ⅰ组和Ⅱ组分别与Ⅳ组比较均具有统计学意义（P<0.01），Ⅰ组和Ⅱ组分别与Ⅲ组比较均具有统计学意义（P<0.01、P<0.05），但Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅳ组比较均无统计学意义（P>0.05）；⑤血清FPG水平，Ⅰ组和Ⅲ组分别与Ⅳ组比较均具有统计学意义（P<0.01），Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅱ组与Ⅲ组比较均具有统计学意义（P<0.01），但Ⅰ组与Ⅲ组、Ⅱ组与Ⅳ组比较均无统计学意义（P>0.05）。见表1，图1。表1各组患者血糖、血脂等一般资料的数据(x±s)例数（男/年龄TCTGHDL-CLDL-CFPG组别女）（岁）（mmol/L）（mmol/L）（mmol/L）（mmol/L）（mmol/L）Ⅰ组31（18/13）63.5±9.75.82±1.26a2.88±0.95a0.95±0.41ac3.56±0.87a8.87±0.77aeⅡ组31（17/14）64.1±10.25.66±1.32b2.76±0.87b1.08±0.48hd3.45±0.91b4.75±0.51dⅢ组32（19/13）60.2±9.65.45±1.18f2.44±1.16f1.35±0.373.12±0.95f7.12±0.82gⅣ组32（18/14）58.6±10.64.41±1.251.36±0.571.52±0.452.61±0.564.66±0.62注：Ⅰ组与Ⅳ组比较，aP<0.01；Ⅱ组与Ⅳ组比较，bP<0.01，hP<0.05；Ⅰ组与Ⅲ组比较，cP<0.01；Ⅱ组与Ⅲ组比较，dP<0.05；Ⅰ组与Ⅱ组比较，eP<0.01；Ⅲ组与Ⅳ组比较，gP<0.01，fP<0.05。15 青岛大学硕士学位论文注：***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05图1Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组基本指标比较2各组患者炎症因子表达水平比较Ⅰ组患者血清白介素-6、超敏C反应蛋白、可溶性P-选择素水平均明显高于Ⅳ组，差异均具有统计学意义（P<0.001）；Ⅱ组患者的血清白介素-6、超敏C反应16 结果蛋白、可溶性P-选择素水平分别与Ⅳ组比较差异均具有统计学意义（P<0.01）；Ⅲ组患者血清超敏C反应蛋白、可溶性P选择素水平高于Ⅳ组（均P<0.05），但Ⅲ组患者血清白介素-6水平与Ⅳ组相比无统计学意义（P>0.05）；见表2，图2，图3，图4。表2各组患者炎症因子表达水平(x±s)组别hs-CRP（mg/L）IL-6（µg/L）sP-selectin（µg/L）Ⅰ组16.21±4.56ade97.12±26.60ade16.56±2.04adeⅡ组10.86±1.72bf76.31±12.87bf13.65±1.73bfⅢ组6.59±1.59c12.76±5.2210.04±1.96cⅣ组3.62±1.065.61±1.333.69±1.39注：Ⅰ组与Ⅳ组比较，aP<0.001；Ⅱ组与Ⅳ组比较，bP<0.01；Ⅲ组与Ⅳ组比较，cP<0.05；Ⅰ组与Ⅲ组比较，dP<0.05；Ⅰ组与Ⅱ组比较，eP<0.05；Ⅱ组与Ⅲ组比较，fP<0.05注：***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05图2各组患者hs-CRP水平对比17 青岛大学硕士学位论文注：***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05图3各组患者IL-6水平对比注：***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05图4各组患者sP-selectin水平对比18 结果3各组患者血栓弹力图结果比较①血栓弹力图参数R值、K值、MA值和CI值，Ⅰ组与Ⅳ组比较差异均具有统计学意义（P<0.01）；Angle值Ⅰ组分别与Ⅲ组、Ⅳ组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；R值Ⅰ组与Ⅲ组比较具有统计学意义（P<0.05）。②血栓弹力图参数R值、K值、Angle值、MA值和CI值，Ⅱ组与Ⅳ组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；R值和Angle值，Ⅱ组与Ⅲ组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。③血栓弹力图参数K值和MA值，Ⅲ组与Ⅳ组相比均具有统计学意义（P<0.05）。见表3，图5，图6。表3各组患者血栓弹力图测定结果(x±s)血栓弹力图组别例数R值（min）K值（min）Angle（°）MA值（mm）CIⅠ组304.64±1.49ae1.82±0.67a65.26±5.51be65.49±7.19a1.46±1.47aⅡ组314.87±1.01cf1.95±0.89c64.56±11.86cf63.53±6.26c1.15±1.56cⅢ组326.64±1.202.07±0.79d59.98±7.2562.82±6.67d0.6±1.98Ⅳ组326.96±1.222.59±0.5659.10±6.1858.78±6.76-0.03±1.69注：Ⅰ组与Ⅳ组比较，aP<0.01；Ⅰ组与Ⅳ组比较，bP<0.05；Ⅱ组与Ⅳ组比较，cP<0.05；Ⅲ组与Ⅳ组比较，dP<0.05；Ⅰ组与Ⅲ组比较，eP<0.05；Ⅱ组与Ⅲ组比较，fP<0.0519 青岛大学硕士学位论文注：***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05图5血栓弹力图各项指标对比图6血栓弹力图高凝状态图谱20 结果4TEG与IL-6、hs-CRP、sP-selectin等指标相关性TEG参数R值、K值与IL-6、hs-CRP、可溶性P-选择素水平呈负向相关，Angle角、MA值与IL-6、hs-CRP、可溶性P-选择素年度呈正向相关。以TEG为因变量，以年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、IL-6、hs-CRP、可溶性P-选择素作为自变量举行多元线性回归分析，Ⅰ组患者血栓弹力图与白介素6、超敏C反应蛋白、可溶性P-选择素呈正向相关（r=0.389,0.375,0.468；P=0.036,0.044,026），与LDL-C、TG呈正向相关（P<0.05），与血糖、HDL-C呈负向相关（P<0.05），与年龄、TC无相关性（P>0.05）。在调整年龄、性别校正后，各指标之间仍然存在上述相关性。见表4。II组患者血栓弹力图各参数与超敏C反应蛋白、白介素6、可溶性P-选择素也呈正相关，但III组患者血栓弹力图各参数与超敏C反应蛋白、白介素6、可溶性P-选择素之间无显著相关性。表4TEG与IL-6、hs-CRP、sP-selectin等指标单因素相关性TEG项目r值P值年龄0.2240.54TC0.2650.345TG0.3640.044HDL-C-0.3120.050LDL-C0.3950.027FPG-0.3510.042IL-60.3890.036hs-CRP0.3750.041sP-selectin0.4680.02621 青岛大学硕士学位论文讨论糖尿病同动脉粥样硬化一样是一种慢性、亚临床性的炎性疾病，长期高血糖状态及胰岛素抵抗均介导了这类炎症进程[14]。长时间的高血糖可引起血管内皮细胞结构和功能受损，是启动动脉粥样硬化的关键环节，进而合成和分泌IL-6、hs-CRP、sP-selectin等大量炎症因子，致使血小板功能亢进，血流动力学异常，血管舒缩功能失调，使血液高滞、高粘、高凝，并伴随微血管病变及循环不畅，促发动脉粥样硬化斑块的生成，引起大血管及微血管病变，从而导致心脑血管疾病的发生、发展[15,16]。炎症对2型糖尿病的发生起着一定作用，2型糖尿病是一种低级的、亚临床状态的炎症性疾病。Pickup等[17]的研究将2型糖尿病和亚临床炎症关联起来，发现糖尿病患者血浆白介素-6水平显著高于对照组，并且研究证实2型糖尿病患者血清中高表达的白介素-6不是由血细胞产生的。Pradhan等[18]为了探讨炎症标志物（IL-6、CRP等）可否单独地预测2型糖尿病的发生，采用前瞻性病例对照研究，证实白介素-6、CRP水平升高能够预测2型糖尿病的产生。这两项研究显示：炎症产生于2型糖尿病的临床体征以前，而且伴随2型糖尿病的病程生长，是一种慢性的、低级的炎症性疾病。白介素-6作为活化的促炎性细胞因子，能够刺激肝细胞生成大量的hs-CRP，造成级联反应，引发或加剧炎症[19]。炎症反应可以激活蛋白β抗体，导致胰岛素信号转导受阻，从而引起胰岛素抵抗。在一般情况下，胰岛素能阻止肝脏合成CRP和纤维蛋白原，然而当机体存在胰岛素敏感性降低时或胰岛素抵抗时，则造成胰岛素的生理作用下降，以致合成CRP增多。超敏C反应蛋白可以同脂蛋白结合从而激活补体系统，引起血管内膜损伤、释放大批炎症因子，引发血管痉挛及不牢固的斑块破碎和脱落，继而加剧动脉粥样硬化。有研究[20,21]发现，超敏C反应蛋白能够作为2型糖尿病预测亚临床动脉粥样硬化的一项好指标。近年来有文章[22-24]报道，2型糖尿病并发症的产生、发展与炎症关系密切，认为炎症因子如白介素-6、超敏C反应蛋白等通过远分泌和/或旁分泌可极大干扰胰岛素敏锐细胞内胰岛素信号下传（INR/IRS/PI3K通路），使糖、脂代谢受阻。主要表现为白介素-6、超敏C反应蛋白等炎症因子通过激活蛋白激酶β抗体（IKKβ）使抑止胰岛素受体底物1的酪氨酸磷酸化，引起胰岛素信号不能顺畅转导，同时通过激活核因子-B（nuclearfactor-κB，NF-B）上调炎症因子，从而引发胰岛素抵抗。胰岛素敏感性降低是2型糖尿病发病机制中至关重要的一环。糖尿病发生后，由于高血22 讨论糖的作用，多元醇旁路激活，导致脂质过氧化增强与氧自由基产生增多，进一步加重炎症反应，使白介素-6产生更多。同时，大批的白介素-6、CRP能促进B淋巴细胞分化，生成过多的IgG，可导致胰岛β细胞凋亡。说明C反应蛋白、白介素-6作为炎性因子，通过炎症反应可能参与了糖尿病合并大血管病变的发生、发展过程。急性脑梗死的首要病理改变为颅内血管动脉硬化，斑块不牢固性如斑块破碎出血、堵塞是急性脑梗死的主要原因。杨靖等研究表明[25]：白介素-6是脑组织受到损伤时，重要的生物标志物。据VilaN等[26]研究发现，急性脑梗死患者血清白介素-6浓度不但与神经功能缺损程度相关，还与早期临床严重程度有关，老年人认知能力的下降与血浆白介素-6水平的升高有关。国内沈晓明等研究[27]发现，急性脑梗死患者起病后一周内血清白介素-6水平显著高于对照组，第1天达到高峰值，以后逐渐下降，至第7天则接近于正常对照水平；还发现，患者血清白介素-6浓度的升高与影像学上脑梗死体积的大小有密切的关系，梗死病灶越大则血清白介素-6浓度越高。可通过测定血清中白介素-6水平，用作初期预测脑梗死严重程度的一项指标。本研究结果证实2型糖尿病合并急性脑梗死组患者的血清中白介素-6、超敏C反应蛋白水平均显著高于正常对照组,差异均具有统计学意义（P<0.001）；单纯性急性脑梗死组患者血清白介素-6、超敏C反应蛋白表达水平显著高于正常对照组（P<0.01）；2型糖尿病无明显并发症组患者血清超敏C反应蛋白水平明显高于健康对照组（P<0.05），证实在糖尿病初期就已经处于低级炎症状态，随着病程的进展，炎症进一步加重了动脉粥样硬化，导致糖尿病合并急性脑梗死的发生，也说明急性脑梗死也是一种无菌性炎症或者是伴有严重炎症反应。正常情况时，血清中可溶性P-选择素表达水平极低。当急性脑梗死发生时，种种炎性介质刺激活化血小板和血管内皮细胞，导致血清可溶性P-选择素表达水平显著升高，P-选择素能调解细胞间的信息及能量传递，并有效活化血小板，继而引导血小板或血管内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞互相黏附作用，最后促进血管内血栓结构的生成[28]，P-选择素还能激活凝血系统导致凝血功能增强，使机体处于高凝状态。P-选择素能够引导中性粒细胞在损伤的神经细胞周围聚集、黏附及浸润，引发脑血流的改变，此时炎性介质生成进一步增加、血脑屏障破损、脑水肿加剧，所以P-选择素参与神经细胞的继发性损伤[29]。在急性脑梗死患者中，P-选择素的水平与急性脑梗死的病情严重程度紧密相关[30]，随着病情的加剧，P-选择素水平进一步升高。本研究结果显示，2型糖尿病合并急性脑梗死组患者的血清可溶性P-选择素表达水平均明显高于单纯急性脑梗死组、2型糖尿病无明显并发症组和正常对照组（均23 青岛大学硕士学位论文P<0.001）；单纯性急性脑梗死组患者的血清可溶性P-选择素表达水平明显高于2型糖尿病无明显并发症组和正常对照组（均P<0.01）；2型糖尿病无明显并发症组患者的血清可溶性P-选择素表达水平高于正常对照组（P<0.05），证明P-选择素在糖尿病阶段就已表达升高，脑梗死初期既有大量的血小板活化，活化的血小板黏附、聚集在内皮损伤部位，造成微循环障碍，促进和加重血栓的形成，参与了ACI的产生和生长。有研究表明[31,32]，P-选择素的表达水平与糖尿病脑梗死的产生危险具有紧密的关联性，糖尿病的有效治疗，可靠的控制血糖，能够改进脑组织血管内皮功能状态，减轻脑组织血管内皮损伤，P-选择素分子生成明显下降，部分P-选择素分子代谢排出，故P-选择素分子表达水平显著下降；P-选择素分子的表达下降能够更有效的阻止炎症因子聚集和抑制巨噬细胞移动，起到了保护大脑血管动脉粥样硬化斑块，防止斑块破裂的作用，预防和降低了脑梗死复发的作用。田爱荣等[33]研究认为，P-选择素与2型糖尿病的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗有关，但与2型糖尿病引发的大血管并发症之间无相关性。血栓弹力图是用描绘图形的方法，通过检测血液凝固全过程来评价血凝状况的一种敏锐方法，能对纤维蛋白原、凝血因子、血小板聚集功能及纤维蛋白溶解等方面进行完全检测和评价，分析呈现凝血异常的原因，为血栓性疾病是否存在高凝状态提供有力证据[34,35]。TEG检查有五个常用参数：R值反映凝血过程的启动时间，代表凝血因子的整体活性，正常范围5~10min，R>10min表示凝血因子缺少，R<5min表示凝血因子活性加强；K值表示血凝块的形成时间，代表纤维蛋白原水平，正常范围1~3min，K>3min表示纤维蛋白原含量低，K<1min为纤维蛋白原含量高；MA值表示血凝块的强度和稳定性，代表血小板的聚集功能，一般参考范围50~70min，MA值>70min表示血小板活性升高，MA值<50min表示血小板功能低下；Angle角。表示血块形成速度，主要受纤维蛋白和血小板功能的共同作用，一般参考范围53。~72，Angle角增大表示纤维蛋白原含量高，Angle角减小则表示纤维蛋白原含量减少；血凝指数（CI）用来表示患者的整体的凝血状况，CI的正常参考范围-3~+3，CI小于-3为低凝，CI大于+3为高凝。本研究中，2型糖尿病合并急性脑梗死组R值明显低于2型糖尿病无明显并发症组和正常对照组，Angle角、MA值均明显高于2型糖尿病无明显并发症组和健康对照组，说明2型糖尿病合并急性脑梗死组患者血液明显处于高凝状态；2型糖尿病合并急性脑梗死组与单纯急性脑梗死组相比R值、K值、Angle角、MA值、CI指数变化不明显，P>0.05，说明2型糖尿病合并急性脑梗死组与单纯急性脑梗死组这两组患者的血液都处于高凝状态；而在2型糖尿病无明显并发症组与正常对照组对比，仅K值和MA值改变有统计学意义（P<0.05），R值、Angle角、CI指数24 讨论改变不明显，P>0.05，说明在糖尿病无明显并发症阶段，血液中血小板活化加强，MA值增高，形成血栓的概率明显增大，这一对应关系有较高的敏感性和特异性，这与国内研究结果一致[36]。慢性炎症引起糖尿病及其并发症的发生，并使血液处于高凝状态。本研究结果显示，TEG参数R值、K值与IL-6、hs-CRP、可溶性P-选择素水平呈负相关，Angle角、MA值与IL-6、hs-CRP、可溶性P-选择素水平呈正相关。以TEG为因变量，以年龄、TC、TG、HDL-L、LDL-L、FPG、IL-6、hs-CRP、可溶性P-选择素为自变量进行多元线性回归分析，2型糖尿病合并急性脑梗死组患者血栓弹力图与白介素6、超敏C反应蛋白、可溶性P-选择素呈正向关系（r=0.389,0.375,0.468；P=0.036,0.044,026），与LDL-L、TG呈正向相关（P<0.05），与血糖、HDL-L呈负向相关（P<0.05），与年龄、TC相关性不明显（P>0.05）。单纯性急性脑梗死组患者血栓弹力图参数与超敏C反应蛋白、白介素6、可溶性P-选择素也呈正相关，但糖尿病无明显合并症组患者血栓弹力图参数与超敏C反应蛋白、白介素6、可溶性P-选择素之间相关性不明显。在调整年龄、性别校正后，各指标之间仍然存在上述相关性。25 青岛大学硕士学位论文结论1、血清超敏C反应蛋白、白介素-6、可溶性P-选择素水平升高与2型糖尿病合并急性脑梗死的发生发展存在相关性。2、血栓弹力图各参数尤其是MA值增高可能预示发生血栓的概率明显增加。26 参考文献参考文献[1]YangW,LuJ,WengJ,etal.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina.NEnglJMed,2010,362:1090-1101.[2]XuY,WangL,HeJ,etal.PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadults.JAMA,2013,310:948-959.[3]ChanJC,ZhangY,NingG.Diabetesinchina:asocietalsolutionforapersonalchallenge.LancetDiabetesEndocrinol,2014,2:969-979.[4]魏衡，余勇飞，尹虹祥，等.hs-CRP联合ABCD2评分预测短暂性脑缺血发作后短期发生脑梗死的风险[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2014,21（1）：28-31；35.[5]凌莉，李小强，张素平，等.急性脑梗死合并2型糖尿病患者大血小板比率和平均血小板体积的变化[J].实用医学杂志，2015,31（13）：2127-2129.[6]JiaQ,ZhaoX,WangC,etal.Diabetesandpooroutcomeswithin6monthsafteracutestroke:theChinaNationalStrokeRegistry[J].Stroke,2011,42(10):2758-2762.[7]WieserV,MoschenAR,TilgH.Inflammation,cytokinesandinsulinresistance:aclinicalperspective[J].ArchImmunolTherExp(Warsz),2013,61（1）:119-125.[8]罗云，李敬伟，王冲，等.糖尿病影响脑梗死的形成与颈动脉斑块相关[J].中华神经医学杂志，2012,11(1):84-86.[9]VazzanaN,RanalliP,CuccurulloC,etal.Diabetesmellitusandthrombosis[J].ThrombRes,2012,129(2):371-377.[10]KellyKJ,DominguezJH.Rapidprogressionofdiabeticnephropathyislinkedtoinflammationandepisodesofacuterenalfailure[J].AmJNephrol，2010,32（5）：469-475.[11]PerlmanAS,ChevalierJM,WilkinsonP,etal.Seruminflammatoryandimmunemediatorsareelevatedinearlystagediabeticnephropathy[J].AnnClinLabSci，2015,45（3）：256-263.[12]常莉莎，张江，程焱，等.血清可溶性p-选择素水平与急性脑梗死的相关性研究[J].山东医药，2011,51（44）：75-76.[13]相春霞，陈云霞，陈景红，等.缺血性脑卒中合并糖尿病患者血栓弹力图特点分析[J].北京医学，2016,38（5）：433-435.27 青岛大学硕士学位论文[14]WieserV,MoschenAR,TilgH.Inflammation,cytokinesandinsulinresistance:aclinicalperspective.ArchImmunolTherExp(Warsz),2013,61（1）:119-125.[15]罗云，李敬伟，王冲，等.糖尿病影响脑梗死的形成与颈动脉斑块相关[J].中华神经医学杂志，2012，11（1）:83-86.[16]VazzanaN,RanalliP,CuccurulloC,etal.Diabetesmellitusandthrombosis[J].ThrombRes,2012,129：371-377.[17]PickupJC,ChusneyGD,ThomasST,etal.P1asmainterleukin-6,tumournecrosisfactor-αandbloodcytokineproductionintype2diabetes[J].LifeScience.2000.67;291-300.[18]PradhanAD，MansonJE，RifaiN，etal.C-reactiveprotein,interleukin-6,andriskofdevelopingtype2diabetesmellitus[J].JAMA,2001,286(3):327-334.[19]SenA,PaineSK,ChowdhuryIH,etal.Impactofinterleukin-6promoterpolymorphismandseruminterleukin-6levelontheacuteinflammationandneovascularizationstagesofpatientswithEales’disease[J].MolVis,2011,17:2552-2563.[20]SamaropoulosXF,LightL,AmbrosiusWT,etal.Theeffectofintensiveriskfactormanagementintype2diabetesoninflammatorybiomarkers[J].DiabetesResClinPract,2012,95(3):389-398.[21]张敏，李卫征.2型糖尿病合并脑梗死患者血清超敏C反应蛋白及同型半胱氨酸与颈动脉硬化的关系[J].中国全科医学，2012，15（7B）：2292-2294.[22]TuttolomondoA,LaPlacaS,DiRaimondoD,etal.Adiponectin,resistinandIL-6plasmalevelsinsubjectswithdiabeticfootandpossiblecorrelationswithclinicalvariablesandcardiovascularco-morbidity[J].CardiovascDiabetol,2010,9(1):50.[23]AltayFA,SencanI,SenturkGC,etal.Doestreatmentaffectthelevelsofseruminterleukin-6,interleukin-8andprocalcitoninindiabeticinfection?Apilotstudy[J].JDiabetesComplications,2012,26(3):214-218.[24]陈基快，倪敏，沈甫名.治疗炎性疾病的新靶点-α7烟碱型乙酰胆碱受体[J].第二军医大学学报，2012,33（6）：897-899.[25]杨靖，王杨杨，许予明，等.脑血管病的生物标志物研究进展[J].中华神经医学杂志，2015,14（4）：537-539.[26]VilaN,ChamorroA,CastilloJ,etal.Glutamate,interleukin-6,andearlyclinicalworseninginpatientswithacutestroke[J].Stroke,2001,32(5):1234-1237.28 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青岛大学硕士学位论文综述2型糖尿病及其大血管并发症患者血栓弹力图与炎症因子的变化研究摘要：在中国2型糖尿病的患病率非常高，它已成为一个严重的公共卫生问题。作者就查阅到有关2型糖尿病及其大血管并发症患者中血栓弹力图及炎症因子的文献结果进行综述，认为2型糖尿病及其大血管并发症患者，其血液处于高凝状态，炎症因子参与了2型糖尿病大血管并发症的发生、发展。关键词：2型糖尿病，血栓弹力图，白介素-6，超敏C反应蛋白，P-选择素糖尿病已经在全世界范围内流行，是一个十分严重的健康问题。10年来，在我国，伴随着人们生活方式的改变，生活水平的提高，平均寿命的延长，糖尿病患病人数呈逐年增加态势，患病率增加异常迅猛。2008年我国的流行病学调查[1]发现，糖尿病前期在的20岁以上人口中的比例达到15.5%，患病率在成年人中达到了9.7%。而到了2010年，流行病学调查[2]发现，我国18岁以上成年人口中，50.1%的处于糖尿病前期状况[3]，糖尿病患病率上升为11.6%。中国成人糖尿病总人数可能已达1亿多人，已成为严重危害国民健康的疾病。在我国糖尿病患者中，90%以上为2型糖尿病（type2diabetesmellitus,T2DM）。糖尿病及其并发症的治疗费用逐年增高，因此糖尿病防治刻不容缓。2型糖尿病有许多严重的并发症，1.主要的血管疾病，如主动脉、脑动脉、冠状动脉、肾动脉和四肢外周动脉，引起这些大血管的动脉粥样硬化。2.糖尿病微血管病变，诱发微循环障碍、微血管瘤生成和微血管基底膜增厚，最危险的是糖尿病肾病。3.病变部位以周围神经为主的神经病变，临床上先出现肢端感觉异常。4.糖尿病能够引发视网膜病变、白内障、黄斑病等。5.危害巨大的糖尿病足。急性脑梗死是目前当今临床上常见的脑血管疾病，已成为我国城乡居民致死的第二大病因[4]，严重危害人们的生命健康。急性脑梗死是由多种因素引发的疾病，而其中以动脉粥样硬化尤为重要。动脉粥样硬化不但与脂质代谢过程出现紊乱相关，且炎症反应在动脉粥样硬化的产生、发展及斑块破裂致血栓形成等过程中均发挥着关键性作用。动脉粥样硬化是机体应答各种慢性炎症刺激的结果。2型糖尿病已被证明是动脉粥样硬化性大血管疾病的首要危害因素，动脉粥样硬化性大血管疾病又是2型糖尿病常见的、重要的并发症。糖尿病同慢性炎症一样，是动脉粥样硬化的始动环节[5,6]。2型糖尿病引发动脉粥样硬化的机制是糖尿病患者长期的高血糖可引起血管内皮细胞功能和结构受损，导致血小板功能亢进、凝血酶30 综述活性增强、纤维蛋白原水平增高、血管舒缩功能失调、血液流变学异常、红细胞变形能力下降等，使血液呈高粘、高滞、高凝状态，引起大血管的动脉粥样硬化，从而导致大血管疾病的发生、发展。同时，2型糖尿病也是一种慢性的、亚临床性的炎症[7]，合成和分泌大量炎症介质因子，启动并促进动脉粥样硬化的发生发展。2型糖尿病可引起严重的脑血管疾病，是脑血管疾病的独立危险因素，而脑血管疾病又是2型糖尿病常见的、危害严重的血管并发症。在急性脑梗死中，2型糖尿病合并急性脑梗死患者占21.0%~44.4%[8,9]，这部分患者的病情严重，血糖明显增高，多数梗死范围较大或高发，且症状重、恢复慢，预后不良，病死率、致残率明显增加。1血栓弹力图血栓弹力图测定仪是近年新发展起来用于评估凝血功能的仪器[10,11]。血栓弹力图（TEG）是血栓弹力仪检测除血管因素以外从凝血到纤溶的全部凝血进程而描绘出的特别图形，对血小板聚集能力、凝血因子活性、纤维蛋白原含量及纤维蛋白溶解等各方面进行评价和检测，是分析评估血凝状况的一种敏感方法，从而为血栓性疾病是否处于高凝状态提供有利证据[12,13,14]。目前常规的四种凝血试验都是以一定的凝血过程或某些凝血产物为基础，但不能反映全血凝固情况，不能反映体内的凝血状态，缺乏敏感性。血栓弹力图是使用血栓弹力仪测量描绘出来的特殊图形，通过测定血液凝固的速度、血块的最终强度、稳定性等特性来反映机体的凝血状态[15]。血栓弹力图检测可分为以下几种：自然全血法：取出静脉血后，立即直接放入仪器盛血杯内测定。全血复钙法：抽取静脉血1.8ml，注入含有0.2ml浓度为38g/L柠檬酸钠抗凝剂的蓝色试管中颠倒混匀（血∶抗凝剂=9∶1）。取上述抗凝血0.6ml注入塑料试管或涂硅试管中，再加入12.9g/L的CaCl2液0.4ml混匀，立即开动秒表，取0.36ml混合液于盛血杯内测定。血浆复钙法：用离心机以1000r/min转速将柠檬酸钠抗凝血离心5nin，取表层血浆0.4ml和等量的12.9g/LCaCl2液混匀并立刻启动秒表，取0.36ml混合液于盛血杯内测定。TEG检查的常见参数如下[16,17]：代表凝血过程启动时间的R值，代表凝血因子的整体活性情况，正常参考范围5~10min。当R<5min时，提示血液中的凝血因子活性加强，当R>10min时，提示血液中的凝血因子减弱；代表血栓形成时间的K值，主要反应纤维蛋白原的含量，正常范围1~3min，K＜1min表明强纤维蛋白活性，K＞3min表明纤维蛋白活性较弱。代表血栓强度和稳定性的MA值，主要体现31 青岛大学硕士学位论文血小板的聚集功能，正常范围50~70min，MA值<50min表示血小板功能低下，MA值>70min表示血小板活性高；代表血块形成速度的Angle角，主要受血小板功能和。。纤维蛋白原含量的共同影响，正常范围53~72，Angle角减小则表示纤维蛋白原活性弱，Angle角增大表示纤维蛋白原活性强；CI是根据前边四个数据得来的一个综合血凝指数，用来反映患者的总体的凝血状态，正常参考范围-3~+3，CI值小于-3提醒患者低凝，CI值大于+3提醒患者高凝。TEG主要应用于：（1）血栓性疾病：例如冠心病、心肌梗死、心绞痛、动静脉血栓形成、脑梗死（脑梗塞）等，常常表现为R值明显降低、K值减少，而MA值升高、Angle角增大。（2）血小板异常性疾病：例如ITP、原发性血小板减少症、药源性血小板减少症、血小板无力症、巨型血小板病等，表现为R值延长、K值增大，而代表血小板功能的MA值明显降低、Angle角减小。（3）凝血因子缺陷性疾病：例如血友病、维生素K缺乏症等，R值升高、K值明显增加，而MA值降低、Angle值明显降低。（4）纤溶亢进性疾病：例如DIC，在纤溶突发时，血栓弹力图可直观展示纤溶的速度和强度。糖尿病的危害及慢性并发症的出现是一个连续的过程[18]。姚敏等[19]研究报道，2型糖尿病病程＞5年组的血栓弹力图提示：R值、K值明显缩短。R值、K值主要代表凝血时间，受凝血因子活性、血小板功能与数量以及纤维蛋白原含量的影响，MA值、Angle角明显增大，CI值增高，MA值反映血凝块的绝对强度，主要受血小板功能影响，提示高凝状态的突出程度，与2型糖尿病病程的进展存在正相关性。陆邦超等[20]的研究结果发现，糖尿病患者的R值、K值，与非糖尿病患者相比，明显缩短，而Angle角明显增大、MA值则明显升高，说明糖尿病患者血小板功能亢进、凝血因子活性高、纤维蛋白原含量高，血液呈高凝状态。在59例糖尿病患者中，血糖控制比较差、糖化血红蛋白≥6.5%患者有37例，其R值、K值缩短更明显，Angle角、MA值增大也更明显，说明没有经过有效治疗的糖尿病患者，其血液高凝状态更明显，发生心脑血管疾病的概率更高。MA值增高，血小板活性增高，更容易发生血栓[21,22,23]。多项研究[25-28]成果提示，T2DM患者血小板功能、纤维蛋白原、凝血活酶的生成增强，说明T2DM患者的体内总的凝血活性加强，更容易诱发血栓。近年来，TEG还在指导缺血性脑卒中的凝血监测中的有越来越广泛应用[29]。32 综述因而可知，TEG能代表血块的形成速率、形成凝块后的稳定性以及是否伴有纤溶亢进等动态情况，为预测糖尿病患者血栓风险提供了更准确的指标。张龙等[30]分析了糖尿病合并稳定性心绞痛患者的TEG检测结果，相对于非糖尿病组而言，糖尿病组的血栓弹力图R值、K值较低，而MA值、Angle值较高，提示糖尿病患者血液呈高凝状态。进一步研究发现，与非糖尿病患者相比，糖尿病合并稳定性心绞痛患者的血小板AA抑制率差异无统计学意义，主要表现为ADP抑制率低。由此可见，糖尿病患者和非糖尿病患者相比，对阿司匹林的抑制率差别不明显，但是对氯吡格雷的抵抗率明显高于非糖尿病组。刘虹宏等[31]研究了2型糖尿病合并冠状动脉疾病患者病情严重程度与血栓弹力图的关系，发现冠脉病变的数目越多，TEG参数变化越明显，说明糖尿病合并冠心病的病情严重程度与凝血功能异常相关。进一步比较糖尿病合并冠状动脉疾病组和单纯冠状动脉疾病组的TEG参数发现：与单纯冠心病组相比，糖尿病合并冠状动脉疾病组患者的R值、K值降低，而MA值、Angle角均有升高。揭示糖尿病合并冠心病患者较单纯冠心病患者血液更处于高凝状态，凝血因子更活跃。肖文琦[32]等和杨燕[33]等在冠心病方面也有TEG相关研究。2炎症因子2.1白介素-6（IL-6）（1）生物学特性和检测现在已经研究清楚，人类白细胞介素-6的分子量为26KD，基因位于第7号染色体上。IL-6受体组成包括2条糖蛋白链：其中1条为分子量等于80KD的α链；另外1条为分子量等于130KD的β链。α链缺乏胞内区，表现为与IL-6结合时的低亲合性，所构成的复合物可迅速结合在高亲和性的β链上。因此，向细胞内传递信息主要通过β链。多种细胞均可产生白介素-6，例如单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、血管内皮细胞、角质细胞、腹膜上皮细胞、肥大细胞、成纤维细胞等都可以产生。近年研究[34]显示，脂肪细胞也可以产生IL-6，尤其是网膜脂肪组织的脂肪细胞能释放大量IL-6。白介素-6在炎症反应中具有重要作用，当机体发生组织损伤、感染及炎症等应激原的作用后，由白细胞介素6、肿瘤坏死因子等刺激肝脏合成C反应蛋白、α1抗胰凝乳蛋白酶、补体C3等急性时相反应蛋白（acrtephase蛋白）。白介素-6可以诱导细胞增殖分化、生长，参与组织纤维化，具有与血管内皮有关的组织损伤作用。白介素-6在内分泌和代谢调节中也发挥重要作用，是炎症反应的细胞因子网络中一33 青岛大学硕士学位论文个中枢性调节因子，是炎性应激状态刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要细胞因子之一，参与机体的各种病理生理过程。在正常情况下，IL-6是胰岛功能的启动子，过多的IL-6可导致胰岛B细胞损伤[35]。白介素-6的检测目前主要有生物活性检测和免疫学检测[36]，其中免疫学检测又以ELISA（双抗体夹心法）和放射免疫最常用。IL-6的生物活性检测是利用MH60BSF2细胞株依附于IL-6而生长，经过检测待检样本对该细胞增殖的支撑水平便可直接反映IL-6的活性。取处于对数生长期的MH60细胞，首先用Hank液洗3次，继而重悬于RPM1640培养液（含10%NBS）中再孵育培养6h，以去除细胞表面的IL-6。倍比稀释待检样本及rIL-6参考品于96孔板中，每份样本重复做三个孔。重悬并离心沉集MH60细胞，弃去上清液，再用不完全1640细胞培养液调细胞浓度为2×105/ml，注入含待检品的96孔板中，每孔100μ1（含104细胞）。将细胞放置在细胞培养箱37℃5%CO2条件下共培养48h。在细胞培养达44h后，各孔加下MTT（5mg/m1）20μl，接连培育4h。拿出96孔板，用离心机以转速1000r/min离心，再以转速10r/min轻轻甩去上清，并用纸巾吸干边沿残留的上清液。每孔加入100μl酸化异丙醇，放置室温下20min，在这时段轻轻振荡96孔板，以使异丙醇完全消溶。每孔加入20μl浓度为30g/LSDS，以解除异丙醇引发的蛋白沉淀对A测定的干扰。用酶标测定仪各自测定每一孔在570nm和630nm处的A值，而且用A570-A630当作最后数值。将最后值以参考品（rIL-6）的最大值为分母，据此描绘出参照品和待测标本各稀释度的几率单元弧线。该线与各弧线交点所对应的稀释度各自与参考品的稀释度进行对比则可求出各自活性单元。IL-6免疫学检测主要常用的是酶联免疫试验双抗体夹心法。该法有较好的特异性和敏感性。中国已有数家公司提供商品化的试剂盒检测IL-6。ELISA双抗体夹心法的原理是将特异性抗体包被到酶标微孔板上形成固相抗体，而后与待测样品中的IL-6连接形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，在酶标板上形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，以颜色深浅来判别抗原含量。抗人IL-6单克隆抗体（aBSF2-166），用包被缓冲液稀释成0.1μg/ml，加入96孔酶标板，每孔100μ1，放置4℃冰箱过夜。洗去游离多余的包被抗体，每孔加100μl浓度为10g/L小牛血清，放置在室温下2h进行封闭抗体。洗板3次，加入待测样本和不同浓度的人IL-6参考品，放置4℃冰箱12h。洗板3次，滴入兔抗人IL-6多价抗体（0.1μg/ml），放置室温下作用2h。洗板3次，每孔滴入1∶2500稀释的磷34 综述酸酶标识的羊抗兔IgG，室温反应2h。洗板3次，每一孔加入100μl对硝基苯磷酸酯（1mg/ml），室温反应10min，用3mol/LNaOH中止反应。用酶联免疫检测仪在405nm波长测定A值。以人IL-6参考品的浓度为横坐标，以A值为纵坐标，绘制参考曲线。并求得待测样品中IL-6的含量。（2）白介素-6与糖尿病糖尿病是一种低级的、亚临床状态的炎症性疾病。英国Pickup等[37]首次将2型糖尿病和亚临床炎症联系起来，研究发现，糖尿病病人血浆白介素-6浓度显明高于对照组，而且认为2型糖尿病患者血清中高浓度的白介素-6非由血细胞释放的。Pradhan等[38]为了探讨炎症标记物（IL-6、CRP等）可否单独地预示T2DM的发病，采用前瞻性病例对照研究，认为IL-6、CRP水平升高能够预示T2DM的发病。这两项研究揭示：炎症事件产生在T2DM的临床表现以前，而且伴同T2DM的病程而发展。IL-6与肥胖及胰岛素抵制明显有关。Jens等[39]研究发现，肥胖患者比体瘦者血浆IL-6含量高30%-40%；而且在体重降低后，血浆IL-6浓度也随之显明降低，同时IL-6的改变与胰岛素敏感性相关。Vozarova等[40]发现，胰岛素敏感性与血浆IL-6水平存在负相关，而且体重指数与血浆IL-6水平呈正相关，认为胰岛素敏感性与血浆IL-6之间的关系类似是经过肥胖介导的。Kopp等[41]报道，胰岛素抵制与血浆IL-6含量明显相关；IL-6在患者体重下降后也显著下降，体重降低后，测定糖耐量情况，结果正常者从23%升至64%，而糖耐量下降者由40%降至30%，糖尿病的发生更是由原来的37%降至3%，胰岛素抵抗的降低与IL-6的降低呈显著正相关。Kern等[42]报道，低胰岛素敏感性者与高敏感性者比较，其血浆IL-6相差的2.3倍，脂肪组织IL-6mRNA表达丰富，认为肥胖有关的胰岛素抵抗的主要原因是白介素-6。Bastard等[43]研究了胰岛素抵制与IL-6的关系，发现胰岛素刺激的葡萄糖代谢与血清IL-6水平之间呈负相关，脂肪细胞内葡萄糖转运与血清IL-6水平呈负相关。国内张敏等[44]研究认为，葡萄糖转运和脂质代谢都受血清肿瘤坏死因子α、IL-6调理，与胰岛素抵抗密切相关。陈招进[45]和王汉青等[46,47]也有类似的研究结果。白介素-6作为活化的促炎性细胞因子，可刺激肝细胞合成大批的hs-CRP，形成级联反应，引发或加剧炎症[48]。炎症反应可以激活蛋白β抗体，导致胰岛素信号转导受阻，从而引起胰岛素抵抗。在一般状况下，肝脏合成CRP和纤维蛋白原受到胰岛素调控，但当机体胰岛素敏感性下降或胰岛素抵制时，则变成胰岛素的生物调控功能下降，导致CRP合成增多。当糖尿病发病后，因为高血糖的存在，致使脂质过氧化加快，氧自由基生成增多，抗氧化系统清除能力消弱，进一步加剧炎症35 青岛大学硕士学位论文反映，使IL-6产生更多。超敏C反应蛋白可与脂蛋白结合从而激活补体体系，引起血管内膜损伤、释放大量炎症因子，引发血管痉挛及不牢固的斑块破碎和脱落，进而加剧动脉粥样硬化。IL-6在冠心病的发病机制上也扮演着重要的作用[49]。冠心病是发生在冠状动脉的动脉粥样硬化，长期的炎症介入并贯串了动脉粥样硬化的各个阶段。IL-6基因是冠心病发病的重要候选基因之一，IL-6是其重要的血液标志物，在冠心病产生中拥有比CRP重要的作用。多种心血管疾病的病理活动过程中都有IL-6家族成员在起核心作用。研究证明充血性心力衰竭患者血液及组织中IL-6升高，连续过度的IL-6升高会破坏细胞因子体系，而加剧心肌损伤。心脏病的严重程度与血浆IL-6水平密切相关，IL-6是预测严重临床并发症的重要指标。心脏手术后心肌缺血IL-6常常反应性增加，且IL-6的升高与手术类型有关。急性脑梗死常见的最重要病理变化为脑内或颈部血管发生了动脉粥样硬化，斑块不牢固性如斑块破碎出血、堵塞是急性脑梗死形成的重要原因。杨靖等研究认为[50]：IL-6是脑组织受到损伤时，重要的生物标志物。据VilaN等[51,52]研究发现，急性脑梗死患者血清IL-6水平不但与神经功能受损水平关联，还与初期临床严重程度有关。Weaver等研究[53]结果提示，老年人认知能力的下降与血浆IL-6水平的升高有关。国内沈晓明等研究[54]发现，急性脑梗死病人在起病后一周内血清IL-6浓度明显高于对照组，第1天到达高峰值，之后渐渐降低，至第7天则近似于一般比较水平；还发现，患者影像学上病灶体积与血清IL-6浓度的增高也有紧密的正向关系，梗死体积越大，血清IL-6浓度越高。可通过测定血清中IL-6浓度，用作初期判断脑梗死严重程度的一项指标。2.2C反应蛋白（CRP）（1）超敏C反应蛋白（hs-CRP）的生物学特性及检测CRP分子是一种由5个相同的亚单位聚集构成环状蛋白，各个亚单位之间以非共价键相结合。CRP的耐热能力明显，抗蛋白酶降解的实力也非常突出。CRP是由肝脏合成的一种急性时相蛋白，白细胞介素-6是CRP合成的主要刺激因子。C反应蛋白能够与多糖物质结合，也能够与卵磷脂和核酸结合，结合后的复合体通过作用于C1q，来激活补体系统，引起对侵入细胞的免疫调节功能和吞噬功能，而呈现炎症反应，是急性炎症反应的非特异性标记物。hs-CRP现在最低检出量为0.01mg/L，有些生产公司的最低检出极限更低，它与CRP是同一种蛋白质，只是分析灵敏度上更高、测定结果更准确。36 综述当前临床上经常使用免疫胶乳增强比浊法来测定超敏C反应蛋白[55]。其原理是：用抗体致敏的粗细适中、均匀一致的胶乳颗粒（正常直径为0.2um），在碰到样本中的相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与样本中的CRP特异性反应，引起胶乳颗粒凝集。分开的单个胶乳颗粒直径处在入射光波长内，不能阻挡光线通过，当两个或两个以上胶乳颗粒凝集时，透射光和散射光即出现明显改变。采用透射比浊法或散射比浊法测定抗原抗体反应后的吸光度或散射光强度，光强度与待测抗原浓度呈正相关。（2）超敏C反应蛋白与糖尿病及其并发症随着科技的进步，生化检测技术的大幅度提高，超敏C反应蛋白的测定现已成为现实。许多研究资料表明[56,57,58]，很多CRP正常的血清，后来却发生了心脑血管疾病，在初期评价动脉粥样硬化性心脑血管疾病过程中，检测超敏C反应蛋白较旧方法检测的CRP更敏感，检测hs-CRP浓度对心脑血管疾病的预防及治疗有十分重要作用，已经广泛被临床重视。早在2003年，欧洲高血压防治指南已经进行正式推荐，高血压患者需要检测超敏C反应蛋白水平。hs-CRP参与动脉粥样硬化的机制多是CRP与脂蛋白配基结合激活补体系统，造成血管内膜损伤、血管痉挛及不牢固的斑块破碎和掉落，然后加剧动脉粥样硬化。有研究[59-64]发现，hs-CRP能促进糖尿病合并动脉粥样硬化的发展，可用于2型糖尿病亚临床动脉粥样硬化的预测因子。近年来许多研究[65,66,67]证实，2型糖尿病及其并发症的产生发展与炎症紧密相关，认为炎症因子如白介素-6、超敏C反应蛋白等经过远分泌和/或旁分泌能干扰胰岛素敏感细胞内胰岛素讯号下传（INR/IRS/PI3K通路），使糖、脂代谢受阻。主要表现为白介素-6、超敏C反应蛋白等炎症因子通过激活蛋白激酶β抗体，引起胰岛素信号不能正常转导，同时通过激活核因子-B，而上调炎症因子，从而引起胰岛素抵抗。机体在正常状况下，胰岛素能阻断肝脏合成CRP和血纤蛋白原，但当发生胰岛素抵制时，则造成胰岛素的生物作用降低，致使CRP合成增多。糖尿病发生后，由于高血糖的作用，导致脂质过氧化加强，抗氧化系统清除能力消弱，使hs-CRP合成更多。大量hs-CRP可导致过量IgG产生，引起胰岛β细胞分泌功能受损，诱导胰岛β细胞凋亡。说明白介素-6、超敏C反应蛋白可能参与了糖尿病合并大血病变的发生、发展过程。国内朱成勤[68]等报道认为，超敏C反应蛋白不仅是反映炎症反应产生的重要实验室标准，还可显著促进动脉粥样硬化，促进血栓形成进程。大批研究[69-71]认为，超敏C反应蛋白与脑梗死颈动脉粥样硬化的形成产生有很大的关联性，在颈动脉粥37 青岛大学硕士学位论文样硬化斑块形成、斑块破碎及血管内血栓形成等多个环节中发挥重要作用，是脑梗死颈动脉动脉粥样硬化斑块产生发展的危险因素。此外，在判断急性脑梗死疾病严重程度和患者预后情况方面，超敏C反应蛋白也是一项可靠指标[72]。2.3P-选择素（P-selectin）（1）生物学特性和检测P-选择素属于选择素家族的一种，是一个富含半胱氨酸，高度糖化的整合蛋白质，分子量14万。P-选择素大部分存在于巨核细胞、内皮细胞棒状小体内和静止血小板α颗粒膜上。P-选择素分子支架由一条多肽链构成，C末端24个氨基酸构成跨膜区，35个氨基酸构成胞浆短尾，N末端730个氨基酸组成胞外区，共由789个氨基酸残基构成。胞外区具有一个表皮生长因子样区、一个凝集素样区和九个补体调节蛋白反应单元。在遇到炎症因子、组织胺、凝血酶和钙离子载体的刺激后，P-选择素迅速在质膜上表达，氧自由基刺激、缺氧/再氧化也可诱导表达[73,74]。P-选择素凝集素样区是配体结合部位的中枢序列，其配体是唾液酸化路易斯（S-Lewisx），存在于很多细胞外表面。P-选择素高亲和力的配体是糖蛋白配体1，最多存在于中性粒细胞和单核细胞。P-选择素经过介导白细胞与内皮细胞的辨认和连接，介入白细胞跨越血管壁进入炎症区域及淋细胞归巢和再循环的进程。因此P-选择素在急性炎症早期，在介导或参与炎细胞向受损部位趋集过程中起重要的作用，主要介导粒细胞和单核细胞在内皮细胞表面的滚动、粒细胞和单核细胞与血小板的黏附[75,76]。P-选择素分子有2种构成形式，其中一种是存在于血小板和内皮细胞膜上的跨膜P-选择素分子，有介导血小板与内皮细胞的黏附功用，称为血小板膜P-选择素分子；另外一种是存在于血清中的可溶性P-选择素分子，是由内皮细胞损伤或血小板活化时释放到血液中形成的，称为血清可溶性P-选择素分子。可溶性P-选择素分子较膜表面存在的跨膜P-选择素分子量要小3000KD，主要是缺少跨膜功效区。当前P选择素的测定，通常采用方法有两种。其中一种测定的是血清中的可溶性P-选择素（sP-selectin）分子，多采用酶联免疫吸附试验；另外一种是测定血小板颗粒上的跨膜P-选择素分子，普遍采用流式细胞技术。下面简要介绍可溶性P-选择素分子的测定。血清中sP-selectin含量常用ELISA-双抗体夹心法检测。将具有免疫学活性的特异性抗体固相化包被在微孔板上，样品中的可溶性P-选择素分子与固相载体表面的抗体特异性结合。通过洗涤去除液体中的未反应的游离物质。加入酶标记的抗体后，38 综述通过孵育，能够固相载体表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物。然后加入底物，酶催化底物显色，并且颜色深浅与酶结合复合物含量相关，以此判断抗原含量。将稀释后的参考品和样本各自加入标记的板孔中，各加入100μl。酶标板上贴覆膜，37℃孵育1h。弃上清，每孔加300μl洗涤液洗涤，1min后甩弃洗液。重复3次。将板子倒扣于吸水纸，吸净孔内液体。每孔加入酶标试剂100μl，贴覆膜，37℃孵育30min。弃上清液，每孔加300μl洗液，洗涤5次，弃洗液，将酶标板倒扣到吸水纸上，吸干孔内液体。每孔分别滴入50μl底物A液、B液，贴上覆膜，放置37℃水浴箱中孵育30min，每孔滴入50μl终止液，液体由蓝色或浅蓝色变为黄色。轻轻震动酶标板，让板孔内液体充分混匀。酶标仪测定OD450读数。各孔读数减去空白孔读数。描绘参考曲线：用读取的OD值作为横坐标，用全部参考品的浓度作为纵坐标，描绘参考曲线，得出计算公式。根据计算公式计算各样品孔的可溶性P-选择素的含量。（2）P-选择素与糖尿病及其并发症P-选择素在一般血小板表面仅有700个分子，而在凝血酶活化后可迅速增至11000个分子，反映血小板活化程度及血栓形成倾向。血清中的可溶性P-选择素一部分来源于受损的血管内皮细胞，另外一部分是活化的血小板α颗粒上脱落进入血液，在正常时，血清中可溶性P-选择素表达程度极低，可作为机体内血栓形成的诊断靶标。大量研究[77,78,79]证实，P-选择素作为选择素家族成员之一，不仅介导血小板与中性粒细胞及内皮细胞的黏附作用，并且反应血小板活化水平，参与血栓形成。同时血清中高水平P-选择素被视为血栓前状态，脑组织缺血后细胞内钙离子增多，激活磷脂酶A2，使磷脂降解为花生四烯酸，花生四烯酸在环氧酶催化下产生血栓素A2等物质，纤维蛋白原生成增多，促进血小板聚集，明显地促进和放大血栓形成进程。P-选择素与糖尿病及其并发症关系的文章已有少许报道，张安兴[80]探讨了可溶性P-选择素分子与糖尿病患者产生脑梗死的关系，发现P-选择素分子表达水平与脑梗死的发生具有明显的相关性，糖尿病的规范治疗，有效的血糖控制可以改善脑组织血管内皮细胞功能状态，P-选择素表达显著降低，部分P-选择素分子代谢清除，故P-选择素水平显著下降；P-选择素分子的表达减落从而更有效的抑止炎症因子汇集和抑止巨噬细胞转移，起到了牢固大脑动脉硬化斑块，减小斑块破碎的作用，防止和减少了脑梗死复发的作用。田爱荣等[81]探讨了P-选择素及瘦素与2型糖尿病及大血管病变的相关性，认为P-选择素与2型糖尿病的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗有关，但与2型糖尿病大血管并发症之间无相关性。39 青岛大学硕士学位论文P-选择素与急性脑梗死之间有大量的临床研究[82-92]，证实当发生急性脑梗死时，各种炎性介质激活活化血小板和血管内皮细胞，使得血清可溶性P-选择素表达水平明显升高，P-选择素具有炎症介质的调控能力，继而介导血管内皮细胞或血小板与单核细胞、中性粒细胞互相黏附作用，升高局部的血液黏稠度，致使机体处于高凝状况，最后促进血管内血栓的形成。中性粒细胞在损伤的神经细胞周围聚集、黏附及浸润，引发脑血流的改变，此时炎性介质释放进一步增多、血脑屏障破损、脑水肿加剧，所以P-选择素参与神经细胞的继发性损伤。在急性脑梗死患者中，P-选择素的水平与急性脑梗死的病情严重程度密切相关，随着病情的加重，P-选择素水平逐步提高。畅慧君[93]、陈曦[94]、朱海英[95]等观察了血浆P选择素在急性脑梗死患者中的动态变化，发现P-选择素在缺血再灌注2小时即开始表达，8~12小时达到高峰，并持续3~5天随后开始下降。林盛[96]认为，在急性脑梗死患者初期，血小板功能处于活跃状态，因此在急性脑梗死的治疗中使用抗血小板药物对于患者的预后具有重要意义。综上所述，2型糖尿病及其并发症患者血栓弹力图改变显明，R值、K值明显缩小，Angle角、MA值明显增大，提示2型糖尿病及其并发症患者，其血液高凝状态更加突出。炎症因子IL-6、hs-CRP、sP-selectin在2型糖尿病及其并发症中有重要作用，并介入了动脉粥样硬化斑块的发生、发展，是2型糖尿病合并心脑血管疾病的重要危险因子。40 综述参考文献综述参考文献[1]YangW,LuJ,WengJ,etal.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina[J].NEnglJMed,2010,362:1090-1101.[2]XuY,WangL,HeJ,etal.PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadults[J].JAMA,2013,310:948-959.[3]ChanJC,ZhangY,NingG.Diabetesinchina:asocietalsolutionforapersonalchallenge[J].LancetDiabetesEndocrinol,2014,2:969-979.[4]魏衡，余勇飞，尹虹祥，等.hs-CRP联合ABCD2评分预测短暂性脑缺血发作后短期发生脑梗死的风险[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2014,21（1）：28-31；35.[5]凌莉，李小强，张素平，等.急性脑梗死合并2型糖尿病患者大血小板比率和平均血小板体积的变化[J].实用医学杂志，2015,31（13）：2127-2129.[6]JiaQ,ZhaoX,WangC,etal.Diabetesandpooroutcomeswithin6monthsafteracutestroke:theChinaNationalStrokeRegistry[J].Stroke,2011,42(10):2758-2762.[7]WieserV,MoschenAR,TilgH.Inflammation,cytokinesandinsulinresistance:aclinicalperspective[J].ArchImmunolTherExp(Warsz),2013,61（1）:119-125.[8]罗云，李敬伟，王冲，等.糖尿病影响脑梗死的形成与颈动脉斑块相关[J].中华神经医学杂志，2012,11(1):84-86.[9]VazzanaN,RanalliP,CuccurulloC,etal.Diabetesmellitusandthrombosis[J].ThrombRes,2012,129(2):371-377.[10]YaoX,DongQ,SongY,etal.Thrombelastographymaximalclotstrengthcouldpredictone-yearfunctionaloutcomeinpatientswithischemicstroke[J].CerebrovascDis,2014,38(3):182-190.[11]BowryR,FraserS,Archeval-LaoJM,etal.Thrombelastographydetectstheanticoagulanteffectofrivaroxabaninpatientswithstroke[J].Stroke,2014,45(5):880-883.[12]HuangRS,McDonaldMM,WetzelJS,etal.Clotstrengthasmeasuredbythrombelastographycorrelateswithplateletreactivityinstrokepatients[J].AnnClinLabSci,2015,45(2):301-307.[13]LierR,VorwegM,HankeA,etal.Thromblelastometryguiedtherapyofseverebleeding.EssenerRundealgorithm[J].Hamostaseologie,2013,33(1):51-61.[14]ParkJW,PiknovaB,NghiemK,etal.Inhibitoryeffectofnitriteoncoagulationprocesses41 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致谢致谢时光荏苒，在职研究生的学习今天即将结束，回首这段人生最重要的历程的时候，有艰辛也有快乐，但这段时间的学习也使我倍感充实。在论文的最后，我想向我尊敬的导师王静副教授致以最真挚的谢意，感谢您的指导，严格要求，以及无微不至的关怀。在读研期间，老师对我的科研思维、学术思想和实验实践进行了悉心培养与指导，让我开阔了眼界，并深刻体会到了科研的魅力。老师治学态度严谨求实，工作精神热情忘我，这些都是我终身学习的榜样。感谢淄博市第一医院检验科的同事及齐鲁医药学院检验系的老师在实验上帮助，在生活上对我的关心。感谢淄博市第一医院科教科的同事在论文书写格式与统计学方法上的指导与帮助。感谢我的家人对我的支持，谅解与陪伴，是你们给了我前进的动力以及克服困难的勇气。感谢所有曾经给过我帮助和支持的人，我会永远记住这段美好的时光。51 52
