BRAF~(V600E)未突变的高频微卫星不稳定与散发性结直肠癌临床病理特征的关系

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分类号：R656密级：公开学校代码：11065学号：2015021310专业硕士学位论文V600EBRAF未突变的高频微卫星不稳定与散发性结直肠癌临床病理特征的关系作者姓名王明建指导教师林惠忠教授学科外科学（普外科）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月19日 V600EBRAF未突变的高频微卫星不稳定与散发性结直肠癌临床病理特征的关系摘要目的结直肠癌（CRC）是目前严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。研究发现，结直肠癌的发生发展存在不同的分子学机制，其中微卫星不稳定性（MSI）机制扮演着重要角色。本文主要探讨BRAFV600E未突变的高频微卫星不稳定（MSI-H）与散发性结直肠癌（SCRC）临床病理特征的关系。方法收集青岛大学附属青岛市市立医院2016年6月至2017年10月份具有完整病历资料且术前未行新辅助化疗的散发性结直肠癌患者的肿瘤组织标本。首先将符合纳入标准的结直肠癌患者的肿瘤组织标本制作成石蜡切片，然后用免疫组织化学(IHC)的方法测定4种错配修复蛋白（MLH1,PMS2,MSH2,MSH6）的表达情况。按照目前通用标准：一种及以上错配修复（MMR）蛋白表达缺失则认为微卫星不稳定（MSI），其中有一种MMR蛋白表达缺失为低频微卫星不稳定（MSI-L)，如果有2种或2种以上的MMR蛋白表达缺失为高频微卫星不稳定（MSI-H）。无MMR蛋白表达缺失为微卫星稳定（MSS）。然后，继续用免疫组织化学(IHC)的方法检测MSS/MSI-L及MSI-H散发性结直肠癌标本的BRAFV600E的突变情况并用统计学方法分析其相关性。进一步筛选出BRAFV600E未突变的SCRC标本，BRAFV600E未突变的散发性结直肠癌患者中表现为MSI-H的结直肠癌患者43例（9.7%）表现为MSS/MSI-L的结直肠癌患者401例（90.3%）。收集并整理患者的临床及相关病理资料，用统计学方法分析BRAFV600E未突变的MSI-H与SCRC临床病理特征的相关性及意义。结果本文BRAFV600E突变阳性的患者为29例，总突变率为6.1%，其中MSS/MSI-L组结直肠癌BRAFV600E突变阳性标本为16例（3.8%），而MSI-H结直肠癌BRAFV600E突变阳性标本为13例（23.2%），MSI-H组散发性结直肠癌的BRAFV600E突变率要明显高于MSS/MSI-L组结直肠癌BRAFV600E突变率，两组之间有显著统计学差异（P＜0.05）。BRAFV600E未突变的MSI-H的MMR蛋白的联合缺失状态如下：MLH1、PMS2联合缺失为21例，约占MSI-H患者的48.8%，MLH1、MSH2联合缺失为7例(16.3%)，MSH2和MSH6联合缺失为6例（13.9%），PMS2和MSH2联合缺失为2例（4.7%），PMS2和MSH6联合缺失3例（7%），PMS2、MSH2及MSH6联合缺失为4例（9.3%）。BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌与BRAFV600E未突变的MSS/MSI-L散发性结直肠癌相比，在发病年龄、肿瘤部位、肿瘤的分化Ⅰ 程度、临床分期、P53表达等方面存在统计学差异，主要表现在BRAFV600E突变阴性MSI-H散发性结直肠癌患者的发病年龄较低，分化程度较低，多见于升结肠，临床分期较早，p53突变率相对较低。但是在肿瘤的大体分型、组织学分型、浸润深度、神经侵犯、脉管浸润，瘤结节存在方面无统计学差异（P＞0.05）。结论MSI-H组与MSS/MSI-L组相比，BRAFV600E突变方面有显著的统计学差异；BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌患者的发病年龄较早，临床分期较早，肿瘤的分化程度以低分化癌相对常见，P53突变率相对较低，发病部位以升结肠相对较常见。硕士研究生：王明建（外科学普外科）指导教师：林惠忠主任医师关键词：结直肠癌；BRAFV600E；微卫星不稳定；临床病理Ⅱ Therelationshipbetweenthehigh-frequencymicrosatelliteinstabilityofV600EunmutatedBRAFandtheclinicopathologicalfeaturesofsporadiccolorectalcancerObjectivePurposeColorectalcancer(CRC)isoneofthemostmalignanttumorsthatcurrentlythreatenthehealthofhumanbeings.Thestudyfoundthattherearedifferentmolecularmechanismsoftheoccurrenceanddevelopmentofcolorectalcancer,inwhichthemechanismofmicrosatellite-instabilitystatus(MSI)playsanimportantrole.Thisarticlefocusesontherelationshipbetweenthehigh-frequencymicrosatellite-instability(MSI-H)ofunmutatedBRAFV600Eandtheclinicopathologicalfeaturesofsporadiccolorectalcancer(SCRC)。MaterialsandMethodsWecollectionoftumortissuespecimensofpatientswithsporadiccolorectalcancerwithoutcompleteneoadjuvantchemotherapypreoperativelyfromJune2016toOctober2017inQingdaoMunicipalHospitalAffiliatedtoQingdaoUniversity.First,thetumortissuesamplesofcolorectalcancerpatientsmeetingtheinclusioncriteriaweremadeintoparaffinsections.Theexpressionoffourmismatchrepairproteins(MLH1,PMS2,MSH2,MSH6)isdeterminedbyimmunohistochemistry(IHC).Accordingtothecurrentgeneralstandard：Oneormoremismatchrepairproteins(MMRs)lackinginexpressionarethoughttobemicrosatelliteinstability(MSI).TherearetwoormoreMMRproteinexpressiondeletioniscalledhighfrequencymicrosatelliteinstability（MSI–H）.ThereisalackofMMRproteinexpressioncalledlowfrequencymicrosatelliteinstability(MSI-L)andonlacksofMMRproteinexpressionwasmicrosatellitestable(MSS).ThemutationofBRAFV600EincolorectalcancersamplesofMSS/MSI-LandMSI-Hwasdetectedbyimmunohistochemistry(IHC)andanalyzethecorrelationbystatisticalmethods.Wescreenthenon-mutatedBRAFV600Erectalcancerspecimensandtheclinicalandcollectethepathologicaldataofcolorectalcancerpatients.ThemutationsofBRAFV600EinsporadiccolorectalcancerspecimensofMSS/MSI-LandMSI-Hweredetectedbyimmunohistochemistry(IHC)andtheircorrelationswereanalyzed.Amongthenon-mutantsporadiccolorectalcancerpatientsinBRAFV600E,43patients(9.7%)showedcolorectalcancerwithMSI-H,andthecolorectalcancerpatientswithMSS/MSI-Laccountedfor401cases(90.3%).ThecorrelationbetweentheMSI-Hofnon-mutatedBRAFV600Eandclinicopathologicalfeatureswasanalyzedbystatisticalmethods.ResultsThenumberofpatientswithBRAFV600Emutationwas29.ThemutationrateofⅢ BRAFV600Ewas6.1%.ThepositivesamplesofBRAFV600EmutationsincolorectalcancerofMSS/MSI-Lgroupwere16cases(3.8%),whilethepositivesamplesofBRAFV600EmutationinMSI-Hcolorectalcancerwere13patients(23.2%).TheBRAFV600EmutationrateofsporadiccolorectalcancerinMSI-HgroupwassignificantlyhigherthanthatofMSS/MSI-LcolorectalcancerBRAFV600Egroup,andtherewasasignificantdifferencebetweenthetwogroups(P<0.05).ThecombineddeletionstatusofMMRproteininMSI-HofunmutatedBRAFV600Eisasfollows:ThecombineddeletionofMLH1andPMS2was21cases（48.4%）；ThecombineddeletionofMLH1andMSH2was7cases(16.3%)；ThecombineddeletionofMSH2andMSH6was6(13.9%)；ThecombineddeletionofPMS2andMSH2was2(4.7%)；ThecombineddeletionofPMS2andMSH6was3cases(7%)；andthecombineddeletionofPMS2,MSH2andMSH6was4cases(9.3%).Wedidn'tfindthejointdeletionofMLH1,PMS2,MSH2andMSH6inthisstudy.ThecomparetionbetweenMSS/MSI-LsporadiccolorectalcancerofunmutatedBRAFV600EandMSI-HsporadiccolorectalcancerofunmutatedBRAFV600Eweresignificantdifferencesinageofonset,tumorlocation,degreeofdifferentiation,clinicalstageandP53expression，mainlymanifestedinpatientswithsporadiccolorectalcancerwithnegativeBRAFV600EmutationMSI-H,lowerageofonset,lowerdegreeofdifferentiation,morecommonintheascendingcolon,earlierclinicalstage,relativelylowP53mutationrate.However,therewasnosignificantdifferenceinthedepthofinvasion,grosstumorclassification,histologicaltype,nerveinvasion,vascularinvasion,tumornodules.ConclusionsTherewasastatisticallysignificantdifferenceinBRAFV600EmutationsbetweenMSI-HandMSS/MSI-Lgroups；BRAFV600EunmutatedMSI-Hsporadiccolorectalcancerpatientshaveanearlierageofonset,earlierclinicalstage,tumordifferentiation,relativelypoorlydifferentiatedcancerisrelativelycommon,P53mutationrateisrelativelylow,thesiteofdiseaseriseThecolonisrelativelycommon.Graduatestudent：Ming-JianWang(Generalsurgery)DirectedbyProf.：Hui-ZhongLinKeywords：colorectalcancer;BRAFV600E;microsatelliteinstability;clinicopathologyⅣ 目录引言...........................................................................................................................................1第1章研究对象与方法.......................................................................................................31.1研究对象......................................................................................................................31.1.1纳入标准..................................................................................................................31.1.2排除标准..................................................................................................................31.2石蜡切片的制作..........................................................................................................31.3免疫组织化学实验.....................................................................................................41.3.1主要的仪器设备及试剂...................................................................................41.3.2免疫组织化学步骤...........................................................................................41.3.3免疫组化结果判读............................................................................................51.4统计学方法.................................................................................................................6第2章结果.............................................................................................................................72.1BRAFV600E突变分析....................................................................................................72.2BRAFV600E未突变患者的一般资料............................................................................82.3MIS-H组结直肠癌MMR蛋白联合缺失情况..........................................................92.4MS状态与散发性结直肠癌临床病理特征的关系.................................................12第3章讨论...........................................................................................................................14第4章结论...........................................................................................................................18参考文献.................................................................................................................................19综述.........................................................................................................................................23综述参考文献.........................................................................................................................33学位期间攻读成果.................................................................................................................39附录.........................................................................................................................................40致谢.........................................................................................................................................41声明.........................................................................................................................................421 引言引言结直肠癌（colorectalcancer，CRC）是威胁人类生命健康的主要问题，具有高发病率。世界范围内结直肠癌的发病率表现出地区差异性。在西方发达国家结直肠癌发病率较高，男、女发病率分别位居男、女恶性肿瘤发病率的第二位和第三位[1,2]。特别是新西兰，男性发病率高达44.8/10万，女性发病率高达32.2/10万。而非洲地区的发病率相对较低，男性发病率为4.5/10万，女性发病率为3.8/10万。我国2005年CRC的发病率为26.89/10万，位居恶性肿瘤发病率的第4位。结直肠癌死亡率较高，5年生存率大约为60%。世界范围内每年约有70万人死于结直肠癌或其相关并发症[3]。以往对于CRC的认识比较局限，但随着分子生物学技术的不断发展，逐渐认识到结直肠癌的分子分型与结直肠癌的临床病理特征、生物学行为、治疗及预后等有着重要的相关性，所以对CRC进行分子学研究尤为重要。CRC的发生发展是一个多步骤、多阶段及多基因参与的的演变过程，其中85%的CRC通过染色体不稳定途径（chromosomalinstability，CIN）发生，该途径为结直肠癌发生发展的主要途径。但随着对CRC研究的不断深入，以及科学技术的不断更新，研究者发现大约有15%的CRC是通过卫星不稳定途径（microsatelliteinstability，MSI）发生的，且该途径在CRC的发生发展中扮演着重要角色[2,4]。研究显示10～15%散发性结直肠癌（sporadiccolorectalcarcinoma，SCRC）和90%以上的遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynonpolyposiscolorectalcancerHNPCC）的发生与MSI相关[5]。虽然两种结直肠癌都存在MSI，但其发生机制有所不同，在HNPCC中MSI的发生是由错配修复基因种系突变所致，而在SCRC中，MSI的发生主要与错配修复基因启动子CpG岛甲基化表型（CpGislandmethylatorphenotype，CIMP）高表达致使基因沉默相关[6,7]。目前研究显示MSI-H散发性结直肠癌的临床病理学及分子生物学特征与MSS/MSI-L散发性结直肠癌不同，其预后及治疗方式也有差异。此外研究发现BRAFV600E突变是可以影响CRC的临床病理特征和预后的重要因素之一，BRAFV600E突变的MSI结直肠癌与BRAFV600E未突变的MSI结直肠癌相比，其预后较差，死亡率也相对较高[8-11]。近些年来研究还显示BRAFV600E突变与MSI结直肠癌的发生存在相关关系，结直肠上皮细胞BARFV600E基因发生突变，可以使细胞对凋亡刺激产生抵抗，使得MLH1基因启动子CpG岛（CpGislandmethylatorphenotype，CIMP）发生甲基化，而使细胞发生MSI[12,13]。相关研究也显示微卫星不稳定结直肠癌与微卫星稳定结直肠癌相比，BRAFV600E的突变率更高[14,15-17]。所以在研究具有MSI-H状态与SCRC的相关关系时，将BRAFV600E是否突变区别开来，1 青岛大学硕士学位论文具有重要意义。本文通过对BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌的研究将更为确切的了解此类SCRC的独特临床病理学特征，为后续治疗方案及预后的研究提供相关理论依据。2 研究对象与方法第1章研究对象与方法1.1研究对象2016年6月至2017年10月在青岛大学附属青岛市市立医院行结直肠癌根治术且术前未行新辅助化疗的具有完整病历资料的散发性结直肠癌患者。1.1.1纳入标准1.临床资料完整，主要包括患者的年龄、性别、肿瘤部位，肿瘤大体分型、病理分型，分化程度、瘤结节、TNM分期（参照第八版结直肠癌TNM分期）、神经侵犯，脉管浸润，P53等相关肿瘤指标。2.术前未行新辅助化疗。1.1.2排除标准1.病例资料不完整者。2.术前行新辅助化疗的结直肠癌患者。3.家族性腺瘤样息肉病以及遗传性非息肉病性结直肠癌（Lynch综合征）的患者。4.多原发癌患者。1.2石蜡切片的制作1.取材和固定：将手术切除的结直肠癌标本放入已经配置好的10%福尔马林固定液中。使细胞、组织的蛋白质成分变性凝固。以防止细胞死亡后发生自溶或细菌分解影响细胞本来的结构与形态。2.脱水透明：将结直肠癌组织标本依次经75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇以及无水乙醇处理，从而使组织标本充分脱水。再将结直肠癌组织放置于既溶于石蜡又溶于乙醇的二甲苯（透明剂）中，从而使二甲苯将组织中的乙醇置换，使组织透明。3.浸蜡包埋：将已经过透明处理完全的组织块放置于已经溶化的石蜡中，然后放入溶蜡箱中进行保温。等待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，而后将溶化的石蜡倒入已制备好的器皿中，快速将已被液体石蜡浸入完全的组织块放入该器皿中。等待其冷却凝固成块，既完成石蜡包埋。3 青岛大学硕士学位论文4.切片与贴片：将已经包埋好的蜡块固定于切片机上，切成3-4μm的薄片。将切下来的薄片放入45℃的温水中使其充分展平，其后将其贴到载玻片上放入75℃的恒温箱中烘烤15分钟。5.脱蜡染色：将烘干后的组织切片放入二甲苯中浸泡，从而脱去其中的石蜡。然后依次经从高到低浓度的酒精处理，最后将其放入蒸馏水中，即可行HE染色。1.3免疫组织化学实验1.3.1主要的仪器设备及试剂MLH1抗体罗氏诊断产品（上海）有限公司PMS2抗体迈新，福州MSH2抗体迈新，福州MSH6抗体罗氏诊断产品（上海）有限公司抗BRAFV600E鼠单克隆抗体（VE1）即用型罗氏诊断产品（上海）有限公司DAB染色液罗氏诊断产品（上海）有限公司PBS盐酸缓冲液北京金杉中乔抗体稀释液福州迈新试剂公司EDTA抗原修复液福州迈新试剂公司真空脱水机英国shandonEecelsio石蜡包埋机BX-50电光源德国MicromEc350-2多头显微镜DP-10全自动日本OLYMPUS公司纤维照相系统烤片机日本OLYMPUS公司1.3.2免疫组织化学步骤1.脱蜡：将制备好的石蜡切片放置于65℃的烤箱中，烤片至蜡化后将切片先后置于二甲苯I→二甲苯II→二甲苯III中进行浸泡，每次需浸泡5分钟。2.脱二甲苯：将切片置于先后置于100%酒精→95酒精→85%酒精中，脱掉切片上的二甲苯，每个步骤各需要5分钟。3.水化：用自来水冲洗切片5至10分钟，清洗掉切片上残留的酒精，然后将切片放入蒸馏水中。4.高压修复抗原：EDTA溶液16mL加入800mL蒸馏水中配制EDTA缓冲液，将制备好的修复液倒入高压锅内将其充分混匀，置于电磁炉上进行加热，使其沸腾（有小水泡冒出），然后组织切片放入修复液中，调整温度至最高，待高压锅大气阀开始放气，将温度调至130℃，等待2分钟30秒后将电源关闭，等待高压锅内气体排尽，方可打开高压锅盖使其自然冷却至室温。4 研究对象与方法5.将组织切片置于PBS溶液中浸泡5分钟，重复3三次后将组织切片周围液体擦拭干净后滴加3％的过氧化氢，使其在室温下孵育10分钟，封闭内源性过氧化酶，再次将组织切片置于PBS溶液中浸泡5分钟，连续重复三次。6.血清封闭：将组织切片放置于湿盒内，每张组织切片滴加5-10μL动物非免疫血清，在室温下静止15分钟，甩去多余的液体。7.一抗孵育：滴加一抗工作液（hMLH1/hPMS2/hMSH2/hMSH6/抗BRAFV600E鼠单克隆抗体（VE1）即用型），在37℃的温箱中孵育1小时后取出组织切片，用PBS缓冲液浸泡5分钟，连续浸泡3次。8.二抗孵育：在温湿盒中向每张组织切片滴加二抗工作液（羊抗小鼠IgG聚合物），为防止边缘效应，二抗工作液应充分覆盖组织。37℃孵育10分种后取出组织切片，用PBS缓冲液浸泡5分钟，连续浸泡3次。9.DAB显色：将DAB缓冲液、色原液、底物各一滴加入1mL蒸馏水中配制显色液，将组织切片上的PBS缓冲液清除，加入50μLLDAB显色试剂，然后在显微镜下观察切片染色情况，随后用自来水冲洗切片，使显色终止。10.复染：将组织切片放置于苏木素染色液中，大约20秒。如果复染时间过长使染色较深，则可用酒精使其分化。复染和分化都需要充分的水洗。11.脱水：将组织切片依次置于85%酒精、95%酒精以及无水酒精梯度内，进行脱水处理。12.透明：将组织切片依次浸入三缸二甲苯溶液中进行透明处理，每缸浸泡时间为5分钟。13.封片：将切片上组织周围的二甲苯充分擦干，然后使用中性树胶进行封片。14.实验中相应抗均有阳性对照以及阴性对照切片，阴性对照切片利用PBS缓冲液代替一抗试剂，阳性对照切片采用试剂说明书的已知阳性染色组织。试验步骤和上述步骤相同。1.3.3免疫组化结果判读1.MMR蛋白的判读：由两名经验丰富的病理科医生通过双盲法进行结果判读。具体操作如下：首先在高倍镜（40*10）下将结直肠癌细胞找出，镜下观察的肿瘤细胞核出现黄色或黄褐色颗粒则为相应MMR蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）表达阳性。每张切片应尽量选择代表性强的区域以免出现结果错误的判读，继续光镜下随机选择5个高倍镜（40*10）视野。切片的的染色程度应仔细与背景色对比后得出判读结果。参照Friedric的免疫组化评判标准。分别对染色的强度以及阳性5 青岛大学硕士学位论文细胞占有的百分比进行计分。染色强度计分：无色，0分；浅黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。阳性细胞所占百分比计分：未见阳性细胞为0分，阳性细胞≤10%，1分；阳性细胞占11%-50%记，2分；阳性细胞占51%-80%，3分；阳性细胞≥80%，4分。用染色细胞所占百分比计分与染色强度的计分的乘积来判断蛋白表达情况：乘积≥2则判定蛋白表达阳性，乘积＝1则判定蛋白低表达。乘积为0则判定蛋白表达缺失。其中蛋白低表达以及缺失表达都按照蛋白表达缺失统计。其中四种MMR蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）无表达缺失则为微卫星稳定（MSS），有一种蛋白表达缺失则称为低频微卫星不稳定（MSI-L），如果有两种或两种以上蛋白表达缺失则为高频微卫星不稳定（MSI-H）。2.BRAFV600E蛋白的判读：BRAFV600E蛋白表达为细胞质着色，将至70％的肿瘤细胞中具有中等强度（棕黄色）及以上的细胞质染色时，判读为阳性染色。不着色或个别细胞的浅着色、只有散在分布的胞核着色，均判读为阴性染色[24]。1.4统计学方法统计学软件选取SPSS20分析包，计量资料定性资料用χ2检验或Fisher确切概率法以及多因素Logistic分析，双尾检验P值小于0.05（P<0.05）表示差异具有统计学意义。6 结果第2章结果V600E2.1BRAF突变分析本研究收集2016年6月至2017年9月青岛大学附属青岛市市立医院的有完整病历资料的未行术前新辅助放化疗的散发性结直肠癌标本473例。用免疫组化的方法检测473例散发性结直肠癌的微卫星状态以及BRAFV600E的突变情况。473例散发性结直肠癌中有444例表现为BRAFV600E未发生突变，有29例BRAFV600E发生突变，BRAFV600E的突变率为6.13%。BRAFV600E表达阴性（发生突变）和BRAFV600E表达阳性（未发生突变）的免疫组织化学结果见图1-2。473例散发性结直肠癌中，表现为MSI-H结直肠癌56例（11.8%），表现为MSS/MSI-L结直肠癌为417例（88.2%），分析比较MSI-H散发性结直肠癌与MSS/MSI-L散发性结直肠癌的BRAFV600E突变情况，结果示：MSS/MSI-L组BRAFV600E突变阳性为16例（3.8%），而MSI-H结直肠癌BRAFV600E突变为13例（23.2%），两组差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。筛选出BRAFV600E未突变的散发性结直肠癌共444例，行相关临床病理资料的分析。图1-2BRAFV600E蛋白表达情况注：图1BRAFV600E蛋白表达阴性；图2BRAFV600E蛋白表达阳性。阴性表达为肿瘤细胞质呈蓝色，阳性表达为肿瘤细胞质呈棕黄色7 青岛大学硕士学位论文表1微卫星状态与BRAFV600E的突变的关系BRAFV600E微卫星状态χ2P－＋MSS/MSI-L4011632.21＜0.001MSI-H4313V600E2.2BRAF未突变患者的一般资料444例BRAFV600E未突变的散发性结直肠癌患者的一般临床病理资料见表（2），其中表现为MSI-H的结直肠癌患者占9.7%（43例），表现为MSS/MSI-L的结直肠癌占90.3%（401例）。表2BRAFV600E未突变的444例散发性结直肠癌患者的一般资料特征例数（%）性别男272(61.3)女172(38.7)年龄＜5039（8.8）50-6086（19.4）＞60319(71.8)肿瘤部位升结肠100（22.5）横结肠7（1.6）降结肠20（4.5）乙状结肠109(24.5)直肠208(46.9)大体分型溃疡性365（82.2）隆起型66（14.9）浸润型13（2.9）组织学类型腺癌370（83.4）粘液腺癌29（6.5）混合癌45（10.1）分化程度低分化76（17.1）中分化363（81.8）高分化5（1.1）浸润深度8 结果T1-T278（17.6）T3-T4366（82.4）临床分期I+II220（49.5）III+IV224（50.5）神经侵犯无317（71.4）有127（28.6）脉管浸润无303（68.2）有141（31.8）瘤结节无358（80.6）有86（19.4）P53阴性164（36.9）阳性280（63.1）2.3MSI-H组结直肠癌MMR蛋白联合缺失情况MSI-H结直肠癌由两种或两种以上的MMR蛋白表达缺失。其联合缺失状态如下：MLH1、PMS2联合缺失为21例，约占MSI-H患者的48.8%，MLH1、MSH2联合缺失为6例(13.9%),MSH2和MSH6联合缺失为7例（16.3%），PMS2和MSH2联合缺失为2例（4.7%），PMS2和MSH6联合缺失3例（7%），PMS2、MSH2及MSH6联合缺失为4例（9.3%）。本研究中未见MLH1、PMS2、MSH2及MSH6四中错配修复蛋白联合缺失以及其他方式的联合缺失。各个MMR蛋白表达缺失的免免疫织化学表见图2-10。9 青岛大学硕士学位论文10 结果图3-10MMR蛋白的表达情况注：图3MLH1阴性；图4：MLH1阳性；图5：PMS2阴性；图6：PMS2阳性；图7：MSH2阴性；图8：MSH2阳性；图9：MSH6阴性；图10：MSH6阳性。阴性表达为肿瘤细胞核呈蓝色，阳性表达为肿瘤细胞核呈棕黄色；周围浸润淋巴细胞或间质细胞呈棕黄色。11 青岛大学硕士学位论文2.4MS状态与散发性结直肠癌临床病理特征的关系MSS/MSI-L组SCRC患者与MSI-H组SCRC患者相比，在发病年龄、肿瘤部位、肿瘤大体分型、组织学分型、分化程度、临床分期、P53表达方面存在统计学差异（p＜0.05）。主要表现在BRAFV600E突变阴性MSI-H散发性结直肠癌患者的发病年龄较低，分化程度较低，多见于升结肠，粘液腺癌及混合癌多见，大体分型中隆起型比例较高，临床分期较早，p53突变率相对较低。但是在浸润深度、神经侵犯、脉管浸润，瘤结节存在等方面无显著差异（P＞0.05），见表3表3BRAFV600E未突变的MSI-H组与MSS/MSI-L组临床病理资料比较特征BRAFV600E未突变χ2PMSS/MSI-L（%）MSI-H（%）性别男250(62.3)22(51.5)2.0460.153女151(37.7)21(48.5)年龄＜5028（7）11（25.6）50-6076（19）10（23.2）23.161＜0.001＞60297(74)22（51.2）肿瘤部位升结肠78（19.5）22（51.2）横结肠7（1.7）0（0）降结肠18（4.5）2（4.6）19.489＜0.001乙状结肠101(25.2)8(18.6)直肠197(49.1)11(25.6)大体分型溃疡性337（84.0）28（65.1）隆起型54（13.5）12（27.9）9.3580.007浸润型10（2.5）3（7）组织学类型腺癌344（85.8）26（60.5）粘液腺癌20（5.0）9（20.9）17.38＜0.001混合癌37（9.2）8（18.6）分化程度低分化55（13.7）21（48.8）中分化341（85）22（51.2）26.289＜0.001高分化5（1.3）0（0）浸润深度T1-T270（17.5）8（18.6）0.0350.85112 结果T3-T4331（82.5）35（81.4）临床分期I+II190（47.4）30（69.8）7.7850.005III+IV211（52.6）13（30.2）神经侵犯无281（70.1）36（83.7）3.5410.06有120（29.9）7（16.3）脉管浸润无269（67.1）34（79.1）2.5750.109有132（32.9）9（20.9）瘤结节无321（80）37（86）0.8940.344有80（20）6（14）P53阴性138（34.4）26（55.8）11.3150.001阳性263（65.6）17（44.2）将MSS/MSI-L及MSI-H两组SCRC患者的发病年龄、肿瘤部位、肿瘤大体分型、组织学分型、分化程度、临床分期、P53表达进行Logistic多因素回归分析，结果显示发病年龄、肿瘤部位、肿瘤大体分型、分化程度、P53表达方面仍具有统计学差异(P<0．05)见表4。由此得出发病年龄、肿瘤部位、分化程度、P53表达为BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌的独立相关因素。表4BRAFV600E未突变的MS状态与散发性结直肠癌临床病理关系的Logistic分析临床病理特征OR（95%CI）P年龄0.489（0.313-0.762）0.002肿瘤部位0.612（0.448-0.861）0.004大体分型1.142（0.512-2.545）0.746组织学类型0.736（0.363-1.493）0.395分化程度0.393（0.269-0.574）＜0.001分期0.387（0.181-0.828）0.015P530.426（0.10-0.864）0.01813 青岛大学硕士学位论文第3章讨论结直肠（CRC）是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一，具有较高的发病率及死亡率。根据2018年国家癌症中心公布的最新癌症排名结果显示：结直肠癌新发病例在全世界男性中排名第3位，在女性中排名第2位，死亡病例在全世界男性中排名第4位，在女性中排名第3位。CRC的发生发展是多基因、多步骤、多种机制共同参与的复杂过程。目前研究发现其主要的发病机制为：染色体不定性以及微卫星不稳定性（MSI），前者约占整个结直肠癌发病机制的85%，后者约占15%[19]。结直肠癌的发病机制的不同，其临床病理学及生物学特征以及治疗和预后都存在着差异性。微卫星（microsatellite，MS）是具有高度多态性的简单重复序列。当MS发生复制错误时，错配修复（MMR）系统将会发挥作用修复发生复制错误的MS。但是当MMR系统发生基因突变或者甲基化而使错配修复功能下降从而不能修复发生复制错误的微卫星时，将会产生微卫星不稳定（MSI）。微卫星的选择与测定方法经历了复杂的过程，目前临床上最常用的是免疫组织化学的方法测定MMR蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）的表达。其中一种MMR蛋白的表达阴性则为低频微卫星不稳定（MSI），两种以上MMR蛋白表达缺失则为高频微卫星不稳定性（MSI-H），无表达缺失则为微卫星稳定（MSS）。根据国内外众多的研究证实这种方法测定微卫星不稳定状态其灵敏性达92%，特异性近100%[14]，而且简单快捷，适合在相关临床及研究中推广。BRAF基因，全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1（v-rafmurinesarcomaviraloncogenehomologB1），其编码的BRAF蛋白是调节细胞生命活动的重要物质。BRAF基因一旦发生突变，其中绝大多数为BRAFV600E突变（90%以上）[21,22]，即600号密码子缬氨酸被谷氨酸取代，细胞将无法完成正常的凋亡过程，从而为肿瘤的发生提供条件[23]。关于BRAFV600E突变检测的方法较多，以往检测BRAFV600E突变基于特异性PCR技术，例如焦磷酸测序、real-timePCR以及直接测序法等[24,25]。但分子学检测过程相对复杂，耗时，花费较大，要求较高。免疫组织化学方法检测相对简单，价格较低。目前的多数文献报道免疫组织化学方法检测结直肠癌的BRAFV600E的突变，敏感性可达100%，特异性为95%-100%[18,26,27]。IHC检测方法敏感性以及特异性都非常高，通过免疫组织化学检测结直肠癌中的BRAFV600E突变是分子方法的可行替代方案[18]。该方法可作为简单有效快捷的方法应用于临床病理科开展。最初的研究CRC微卫星状态，多是对MSI研究，后续的研究发现MSI结直肠14 讨论癌独特的临床病学特征且预后较好特征主要是MSI-H的结直肠癌，而MSI-L与MSS临床病理学之间并没有统计学差异[28,29]。近来关于MSI结直肠癌临床病理学的研究更倾向于将其分为MSI-H组与MSS/MSI-L组进行研究。但以往研究中并没有考虑到BRAFV600E的突变情况，但在散发性结直肠癌中BRAFV600E突变与MSI之间存在相关关系。一些研究发现BARFV600E基因发生突变，可以使细胞对凋亡刺激产生抵抗，使得MLH1基因启动子CpG岛（CpGislandmethylatorphenotype，CIMP）发生甲基化，而使细胞发生MSI[12,13]。相关研究还显示微卫星不稳定结直肠癌与微卫星稳定结直肠癌相比，BRAFV600E的突变率更高[14,15-17]。本文的研究也发现在MSI-H组BRAFV600E突变率为23.2%（13/56）要明显高于MSS/MSI-L组的BRAFV600E的突变率3.8%（16/417），两者之间有显著的统计学差异。相关研究还发现BRAFV600E突变的MSI结直肠癌与BRAFV600E未突变的MSI结直肠癌相比，其预后较差，死亡率也相对较高[8-11]。所以以往关于MSI结直肠癌临床病理学特征的研究也就忽视了BRAFV600E突变对CRC临床病理特征的影响。所以研究BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌的临床病理学特征非常有必要。目前研究认为MSI-H结直肠癌患者的年龄偏低[30]。本文研究发现BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌发病年龄偏低，且50岁以下的患者所占比率(25.6%)明显高于MSS组(7.0%)。这一结果与上述研究基本一致。关于MSI状态与性别之间的关系目前还存在争议。本文研究发现BRAFV600E未突变的MSI-H与患者性别并不具有明显的相关关系（P＞0.05）。BenattiP[31]等对1236例SCRC行MSI检测，发现MSI-H结直肠癌具有以右半结肠以及粘液腺癌多见、分化程度低、预后较好等特点。本组研究显示BRAFV600E未突变的MSI-H结直肠癌多见于右半结肠（回盲部至结肠脾曲），提示左右半结肠和直肠之间在可能存在基因水平的差异，右半结肠癌发生主要是由于错配蛋白表达缺失引起的相关基因的突变，而作左半结肠以及直肠癌主要是通过LOH引起相关抑癌基因以及癌基因的突变而产生。进一步提示MSI-H主要参与右半结肠恶性肿瘤的发生发展过程[32]。但值得注意的是本研究中BRAFV600E未突变的MSI-H发生在右半结肠的比率（51.2%）明显高于直肠（25.6%）和乙状结肠（18.6%）所占比率，这可能是排除BRAFV600E突变因素后MSI-H对肿瘤部位的影响更加明显。本研究发现在低分化SCRS中，BRAFV600E未突变的MSI-H发生率较中、高分化的结直肠高，且统计学有显著意义，这一结果与上述研究相一致。同时和大多数国内外研究MSI-H结直肠癌结果一致的是BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌分期相对较早。这可能是患者此类患者预后较好的原因之一。此外本研究中BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌与MSS/MSI-L散发性结直肠癌相比，在组织学类型中并不存在明显差异性，这与以往研究发现MSI-H15 青岛大学硕士学位论文散发性结直肠癌组织学类型以粘液腺癌较常见的结论不相同。考虑BRAFV600E突变可能会对结直肠癌的组织学类型产生相关影响，但该推测还需要进一步的进行BRAFV600E突变与未突变的结直肠癌病理学特征比较以及相关分子学研究进一步证实。肿瘤沉积（TD），是指原发恶性肿瘤淋巴引流区域内（大肠系膜的脂肪组织内）的孤立肿瘤结节，其内没有可辨认的血管、淋巴管以及神经结构。UICC(国际抗癌联盟)制定的第八版结直肠癌TNM分期系统认为肿瘤结节是预后差的因素之一。Tateishi[33]等的研究结果显示，TD与淋巴结转移对患者预后的影响是相同的。相关文献也显示，对于无淋巴结转移的CRC患者一旦出现TD，其5年生存率将会明显下降，提示TD是独立的预后不良因素[34]。以往并没有关于MS状态与TD之间相关关系的研究，本研究中发现在BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌中肿瘤结节的发生率14%（6/43）低于MSS/MSI组的20%（80/401），但两者并没有统计学差异（P＞0.05）。P53基因是一种非常重要的抑癌基因，P53的突变广泛存在于各种恶性肿瘤[35,36]。突变型P53基因可以通过控制凋亡的方式扮演者癌基因的角色从而诱发恶性肿瘤的发生。目前研究发现P53的突变率在各种恶性肿瘤中高达50%以上[37]，而在结直肠癌方面的报道有所差别，一般为40-75%[38]。本文中P53的突变率为63.6%（282/444），与上述研究结果一致。但是关于散发性结直肠癌P53突变情况与MSI之间的关系一直存在争议。有些观点认为在MSI结直肠癌中，由于错配修复蛋白的缺失，可能会导致发生突变的P53无法正常修复，从而加快了肿瘤的发生。张艳红[39]等研究MSI结直肠癌中P53突变率明显高于MSS组。而另一种观点认为P53突变和MSI是结直肠癌发生发展的两种不同的分子机制。Cottu[40]等的研究发现MSI结直肠癌P53突变率明显低于MSS结直肠癌的P53的突变率，MSI与P53突变存在负相关。本文研究中BRAFV600E未突变的MSI-H组P53突变率为44.2%（19/43）低于MSS/MSI-L组的65.6%（263/401），有统计学意义（P＜0.01）。推测二者可能通过不同致癌机制参与了此类结直肠癌的发生及发展过程。P53表达与BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌之间的关系还需更大样本的多中心研究证实。综上所述，MSI-H散发性结直肠癌BRAFV600E突变率较高，两者之间存在相关关系，对于MSI-H散发性结直肠癌的研究，若不排除BRAFV600E的突变将会对MSI-H散发性结直肠癌的临床病理学特征以及治疗和预后产生影响。本研究中BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌有其独特的临床病理学特征，主要表现在BRAFV600E未突变的MSI-H散发性结直肠癌患者的发病年龄和肿瘤的分化程度、临床分期以及P53突变率相对较低，发病部位以升结肠相对较常见。本研究为进一步16 讨论研究此类型结直肠癌提供相关理论依据。由于随访时间较短，本文未进行术后相关辅助化疗效果以及5年生存率的研究，关于术后治疗辅助化疗方案以及预后情况还需要进一步研究去证实。17 青岛大学硕士学位论文第4章结论在散发性结直肠癌中MSI-H组的BRAFV600E突变率显著高于MSS/MSI-L组BRAFV600E的突变率，两组之间的差异有统计学差（P＜0.005）。BRAFV600E未突变的MSS/MSI-L散发性结直肠癌与BRAFV600E未突变MSI-H散发性结直肠癌相比，在发病年龄、肿瘤部位、分化程度、临床分期、P53表达方面存在统计学差异（p＜0.05）。主要表现在MSI-H组的发病年龄较低，分化程度较低，多见于升结肠，临床分期较早，p53突变率相对较低。而两组在浸润深度、神经侵犯、脉管浸润、肿瘤的大体分型和组织学类型以及瘤结节存在等方面差异不具有统计学意义（P＞0.05）。18 参考文献参考文献[1]PopatS,HubnerR,HoulstonRS.PopatS,HubnerR,HoulstonRSSystematicreviewofmicrosatlliteinstabilityandcolorectalcancerprognosis.JClinOncol23:609-618[J].2005,23(3):609-618.[2]GuastadisegniC,ColafranceschiM,OttiniL,etal.Microsatelliteinstabilityasamarkerofprognosisandresponsetotherapy:Ameta-analysisofcolorectalcancersurvivaldata[J].EuropeanJournalofCancer,2010,46(15):2788-98.[3]张思维,雷正龙,李光琳,等.中国肿瘤登记地区2006年肿瘤发病和死亡资料分析[J].中国肿瘤,2010,19(6):356-365.[4]LynchHT,delaChapelleA.Hereditarycolorectalcancer.NEnglJMed.2003;348:919–32[5]VogelsangM,WangY,VeberN,etal.ThecumulativeeffectsofpolymorphismsintheDNAmismatchrepairgenesandtobaccosmokinginoesophagealcancerrisk.[J].PlosOne,2012,7(5):e36962.[6]WorthleyDL,LeggettBA.Colorectalcancer:molecularfeaturesandclinicalopportunities[J].ClinicalBiochemistReviews,2010,31(2):31.[7]AaltonenL,JohnsL,JärvinenH,etal.ExplainingtheFamilialColorectalCancerRiskAssociatedwithMismatchRepair(MMR)-DeficientandMMR-StableTumors[J].ClinicalCancerResearchAnOfficialJournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch,2007,13(1):356.[8]RibicCM,SargentDJ,MooreMJ,etal.Tumormicrosatellite-instabilitystatusasapredictorofbenefitfromfluorouracil-basedadjuvantchemotherapyforcoloncancer.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2003,349(3):247.[9]DelCA,HampelH.Clinicalrelevanceofmicrosatelliteinstabilityincolorectalcancer[J].JournalofClinicalOncologyOfficialJournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology,2010,28(20):3380.[10]AdackaparaCA,ShollLM,BarlettaJA,etal.ImmunohistochemistryusingtheBRAFV600Emutation-specificmonoclonalantibodyVE1isnotausefulsurrogateforgenotypingincolorectaladenocarcinoma[J].Histopathology,2013,63(2):187.[11]KawazoeA,ShitaraK,FukuokaS,etal.AretrospectiveobservationalstudyofclinicopathologicalfeaturesofKRAS,NRAS,BRAF,andPIK3CA,mutationsinJapanesepatientswithmetastaticcolorectalcancer[J].BmcCancer,2015,15(1):258.[12]MinooP,MoyerMP,JassJR.RoleofBRAF-V600Eintheserratedpathwayofcolorectal19 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综述综述微卫星不稳定性的研究进展摘要随着分子生物学研究的不断进步，微卫星的状态在结直肠癌等相关恶性肿瘤中所起的作用也越来越受到重视。具有微卫星不稳定的恶性肿瘤具有独特的分子学特征，其临床表现以及预后也有别于一般的散发性结直肠癌，此外一些相关研究表明微卫星状态与一些蛋白的表达相关，这将有可能为具有微卫星不稳定状态的恶性肿瘤提供更新的治疗方案，从而使患者更加受益。ResearchProgressofMicrosatelliteInstabilityObjective：Withtheprogressofmolecularbiologyresearch,theroleofmicrosatelliteincolorectalcancer（CRC）andothermalignanttumorhasalsobeenpaidmoreandmoreattention.Colorectalcancerwithmicrosatelliteinstablity（MSI）hasitsuniquemolecularcharacteristicswhichclinicalmanifestationsandprognosisarealsodifferentfromthegeneralmalignanttumor.Inaddition,somerecentstudiesshowthatmicrosatellitestatusisrelatedtotheexpressionofsomeproteins,whichmayprovidemorebenefitfromprovidingnewtreatmentoptionsforpatientswithMSI-basedcolorectalcancer.微卫星（microsatellite，MS）是指基因组少于10个核苷酸的简单重复序列，又称短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)，其中以二核苷酸序列即（CA/GT）最为丰富，重复次数一般为10-15次。从基因结构的角度分析，重复序列可以位于基因的重要非编码区，例如：启动子，也可以位于基因的编码区。MS的改变将会影响基因表达调控以及基因组的稳定。由于DNA发生改变造成简单重复序列的增加或丢失即被称为微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)[1]。1.微卫星不稳定与MMR系统错配修复系统（MMR系统）的主要作用是用于校正复制期间发生错配的核苷酸及插入缺失环，从而避免基因组改变，也间接的降低了肿瘤发生的可能性。微卫星序列在DNA复制中极易发生错配、插入/缺失，此改变一旦产生则需要错配系统进行修复，以保证基因组的稳定。例如：hMSH2与hMSH6组合形成的异源二聚体hMutSc，其后hMutSc识别并与单个碱基错配的位置结合，然后继续招募hPMS1和MLHl结合所形成的异源二聚体hMutLd组成复合物，其后在错配修复相关酶23 青岛大学硕士学位论文（例如外切酶）的作用下启动错配修复，使发生配对错误或插入/缺失错误的碱基两侧形成切口，随后在复制因子、DNA聚合酶和DNA连接酶的共同作用下填充间隙，从而完成发生错配DNA链的修复[2]。但当MMR系统发生功能缺陷时，此修复无法正常完成，错配的微卫星序列不能正常修复，从而出现微卫星重复序列的广泛不稳定。目前研究认为微卫星不稳定性的发生主要是由于DNA在复制过程中DNA多聚酶产生错误配对以及错配修复系统未能及时察觉并修复错误所致。2.微卫星的选择与检测微卫星在肿瘤的发生发展阶段有着重要的作用。但在整个基因组中存在许多微卫星片段，如何在卫星不稳定导致的肿瘤中，选取合适的微卫星做为标记基因，则成为研究微卫星不稳定与肿瘤发生机制关系的首要问题。以往一般选择经过核型分析发现片段丢失的邻近区域，相关研究表明在染色体丢失片段附近区域也确实更容易检出相关微卫星的改变，但这种方法样本量及工作量都较大。后期经过研究人员的不断研究以及美国国立癌症研究院（NCI）广泛讨论，推荐以2个单核苷酸重复序列（BTA-25和BTA-25）以及3个二核苷酸重复序列（D17S25015、D2S123和D5S346）5位点作为判断微卫星不稳定的标准[3]。后扩展到十个位点即除去原来五个位点又加入D10S179、D18S58、D13S153、BAT-40以及MYCL1。最新研究表明，单核苷酸标记其特异性以及敏感性更高，而且单核苷酸几近单态性，所以可以完全显示MSI的病例。所以目前相关一些研究采用PCR对5个MSI单核苷酸位点，即：BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27作为筛选MSI结直肠癌的方法和手段，同时规定如果其中有2个或者2个以上的位点出现不稳定，则称为高频微卫星不稳定（MSI-H），只有一个位点出现不稳定，则称为低频微卫星不稳定（MSI-L）。如果检测结果发现没有位点出现不稳定则是微卫星稳定（MSS）。该微卫星检测位点的确立，很大程度上提高了对具有MSI肿瘤判断的效率。但是用上述PCR的方法检测微卫星位点不稳定性虽然比较精确，但其过程相对复杂，花费也较高。随着学者们对微卫星不稳定与错配修复蛋白之间关系的不断研究，发现用免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）的方法检测MMR蛋白是否表达缺失来判断微卫星的稳定性具有较高的应用价值。大量的对比实验证实：错配修复免疫组化检测结果与微卫星的聚合酶链反应（PCR）的检测结果具有高度关联性，灵敏性达92%，特异性能达100%[5]。错配修复免疫组化检测主要是测定MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的蛋白表达情况，其中有一种表达缺失则称为MSI-L，如果有2种或2种以上蛋白表达失则为MSI-H，无表达缺失则为MSS[4]。由于此种方法测定微卫星状态较简单，花费也相对减低，敏感性及特异性都很高。所以，此种方法已成为测定微卫星状态的首选方法。24 综述3.MSI与恶性肿瘤3.1消化系统恶性肿瘤3.1.1MSI与LS遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC），又称林奇综合征（Lynchsyndrome，LS），是一种成家族聚集倾向的常染色体显性遗传性疾病，约占所有CRC的2%-5%。LS家族与正常人群相比，其结直肠癌的发病年龄偏早，但预后较好，多发生在右半结肠。LS的临床表现不仅仅局限于结直肠癌，还表现出其他肠外癌症，例如：生殖系统的子宫内膜癌、乳腺癌，消化系统的胃癌以及小肠癌，呼吸系统的非小细胞肺癌等[6]。由于LS缺乏特异性的临床表现和病理特征，临床诊断相对困难,为了规范世界范围内对于LS的诊断，从1991年起，HNPCC国际合作组织及许多国家发布了多个HNPCC的临床筛检标准[7]，如AmsterdamCriteriaI（AC-I）、Bethesda标准、AmsterdamCriteriaII（AC-II）标准等，在2003年中国抗癌协会结直肠癌专业委员也发布符合中国人遗传性结直肠癌的筛检标准[8]。但随着现代家庭小型化的发展，仅仅依靠临床诊断标准诊断LS，很难将敏感性和特异性完全兼顾。所以在符合筛选标准的家系有必要进一步完相关免疫组化检测，但通过免疫组化的方法检测MMR基因的表达情况也无法百分之百明确患者是否属于LS。因为LS的发病是由MMR基因(MLH1、MSH2、MSH6及PMS2基因）发生突变所致，而并不是广义的基因表达缺失。在MMR基因突变中以MLH1、MSH2基因发生突变为主，约占MMR基因突变的85%-90%，而MSH6及PMS2只占10%-15%[9]。MSI是LS的一种特征性分子，约有90%以上的LS表现出MSI，正如前面提到的并不是所有的MSI均是林奇综合征，因为在散发性结直肠癌中有约10%-15%也存在MSI。但两者的差别在于：散发性结直肠癌的MSI是由MMR基因甲基化引起，而LS是由于MMR基因发生种系突变所致。所以目前为止MMR基因突变检测仍是诊断LS的“金标准”。3.1.2MSI与胃癌近年来，国内外关于MSI对胃癌的影响的研究越来越注重，研究发现具有MSI-H的胃癌患者具有其独特的病理学及临床特征。An等[10]通过对1990例胃癌患者的研究，发现MSI-H胃癌患者与MSS/MSI-L胃癌患者相比，其发病年龄以老年为主，性别则以女性居多，病灶则多分布于胃窦部，组织学则多为肠型。此外Jahng等[11]通过对219例胃癌患者的研究，也得出了上述部分结论。关于MSI-H的胃癌预后情况目前还存在较大争议，Fang等[12]的研究显示MSI-H患者相对于MSS-LMSS患者具有更高的5年生存率。但是由于两类患者对相关化疗药物的敏25 青岛大学硕士学位论文感性不同，一些研究得出与上述结论相反的结果[13]，An等[10]的相关研究则认为MSI-H胃癌患者与MSSMSH-L的胃癌患者相比，其总生存期差异并不具有统计学意义。现阶段，关于微卫星状态在胃癌中的所起的作用还未完全明确，关于其预后还有需要大规模的临床试验研究证实。3.1.3MSI与食管癌目前阶段，一些关于MSI与食管癌的研究发现，在食管癌的病理类型中，MSI主要发生在小细胞癌（检查率达100%）以及鳞状细胞癌（检查率为13.8%-64.0%）[14]。YanK[15]研究发现MSI与食管癌的浸润深度，淋巴结转移等临床病理参数并没有明显的相关关系。3.2MSI与女性恶性肿瘤3.2.1MSI与卵巢癌目前关卵巢与MSI的研究相对较少。Dellas[16]等关于这方面的研究发现，MSI-H与卵巢癌的分期分化程度低具有相关性，且具有统计学意义。与MSI-H和MSS卵巢癌患者相比，MSS卵巢癌患者具有更好而预后，但卵巢癌组织学类型与MS状态并无相关性。卵巢癌的发生发展以及治疗预后涉及多种因素的共同影响，MSI只是其中因素之一，检测卵巢癌的MS状态可以了解肿瘤进展以及预后情况。MS状态对卵巢癌的意义还需要进一步深入探究。3.2.2MSI与乳腺癌乳腺癌（breastcancer，BG）是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，但目前研究者们仍未完全搞清楚BG发病的分子学机制。随着对MS的研究进展，研究者们开始研究MSI与BG的临床病理之间的关系。Yee等[17]在对乳腺癌与MSI之间的研究中发现，MSI阳性率达20%。吕丽琼等[18]研究发现MSI在乳腺癌中检出率较高，并且该研究还发现在HER-2表达阳性、腋窝淋巴结转移阳性以及分期较晚、预后较差的乳腺癌患者中有着更高的检出率，MSI可作为乳腺癌的评估预后的分子学标志。3.3MSI与重复癌重复癌（muliiplicitycarcinoma），又名多原发癌，是指同一个体单个或多个器官或组织，同时或先后发生2个或者2个以上相互独立的原发恶性肿瘤，多发生在消化系统。随着对重复癌的关注加重，一些学者开始研究重复癌与微卫星之间的相关关系。Sengupta[19]等对15例结直肠肠内重复癌的24处癌灶进行微卫星状态的检测，其中17处表现为MSI，阳性率达78%。而对照组14例单发大肠癌中只有1例26 综述表现出了微卫星不稳定。Masubuchi[20]等对19例异时结直肠肠内重复癌做微卫星的检测，其中有17例表现出MSI，其阳性率高达89%，而对照组的阳性率只有14%（4/28）。上述研究结果都表明MSI在结直肠重复癌的发生发展中发挥着重要作用，MSI结直肠癌患者发生重复癌的可能性更大，所以存在MSI的结直肠癌患者应当更加注意重复癌的发生。3.4MSI与子宫内膜癌子宫内膜癌是威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤之一，约占女性恶性肿瘤的20%-30%[21]。近年来其发病率还在不断上升。目前观点认为。子宫内膜癌分两种类型。I型是雌激素依赖型的子宫内膜样子宫内膜癌（EEC），约占子宫内膜癌的70%-80%。II型为约占子宫内膜癌的15%，为非激素依赖型的非子宫内膜样子宫内膜癌(NEEC)。研究发现MS的状态与EEC的发生有着密切关系，在HNPCC家族的子宫内膜癌中，约75%表现为MSI状态，在散发性子宫内膜癌中，MSI状态也占有25％～30％。研究还发现在MSI的散发性子宫内膜癌中主要是因为hMLHI的缺失表达[22]。目前多数观点认为MSI为MSI是EEC发生的分子事件，但是国内外关于MSI状态与ECC预后的报道结果并不一致[23]。4.MSI与结直肠癌的临床病理学特征MSI结直肠癌具有其独特特征：发病的平均年龄较早为45岁，明显早于普人群。肿瘤多发生在近端结肠（右半结肠）。MSI结直肠癌发生重复癌的概率要明显高于无MSI结直肠癌。病理以低分化癌，粘液腺癌、印戒细胞癌为主，存在克罗恩样反应。MSI患者无法从传统的5-fU化疗中获益。4MSI与CRC的治疗4.1辅助化疗氟尿嘧啶（5-FU）被认为是II期结直肠癌患者术后的重要辅助化疗药物。但很多数据表明，基于5-FU的辅助化疗对具有MSI-H的II期结直肠癌患者无效[24]。鉴于5-FU辅助化疗并不能使具有MSI-H的II期结直肠癌获益，2012版NCCN关于对结直肠癌的治疗指南中就指出：5-FU辅助化疗对于II期结直肠癌患者的应用，应排除MSI-H结直肠癌。大量的回顾性研究发现5-FU联合奥沙利铂（FOLFOX）的化疗方案对具有MSI-H的III期结直肠癌患者是有效的，可以明显提高此类患者的无病生存期（DFS）。因此，对于不论是否存在微卫星不稳定，Ⅲ期CRC患者都可以使用FOLFOX方案辅助化疗。然而，迄今很多数据只是局限于回顾性分析，27 青岛大学硕士学位论文只有很少的数据来自前瞻性的临床试验研究。FOLFOX方案对于具有MSI状态的III期结直肠癌的意义还有待于大规模的前瞻性研究验证。目前关于FOLFOX方案用于IV期结直肠癌的治疗效果的结论仍不统一，Brueckl等[25]研究发现FOLFOX方案辅助化疗可以明显延长MSI-H的IV期结直肠癌患者生存期，而Muller等[26]研究发现FOLFOX方案辅助化疗并不能使存在MSI-H的IV结直肠癌患者获益。关于FOLFOX方案辅助化疗对IV期结直肠癌作用还需要大量前瞻性临床试验进一步证实。但进一步了解患者的MSI状态将会助于医生最大限度地为患者制定最适当的个性化治疗方案是明确的。4.2免疫治疗根据最新研究表明，具有MSI-H的晚期结直肠癌患者对一些免疫检查点抑制剂治疗的反应较好。MSI-H结直肠癌通常具有PD-1以及PD-L1等一些免疫检查点的高表达，高表达的PD-1以及PD-L1会干扰人体的抗肿瘤T细胞的应答，从而使此类肿瘤细胞逃过T细胞的杀伤作用，为肿瘤细胞的生长提供了条件。但免疫抑制剂的应用可以使PD-1以及PD-L1无法正常表达，从而为T细胞能够攻击和杀死肿瘤细胞提供条件，使免疫系统更有效的完成其工作[27]。Le等[28]分别对具有和不具有MMR缺陷的转移性结直肠癌进行了II期试验。以评估PD-L1受体抗体pembrolizumab(Keytruda）的临床活性。该实验发现：具有MSI-H结直肠癌和其他具有MSI-H的恶性肿瘤患者，包括胃癌、小肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌或以及胆管癌都具有很高的免疫应答率，分别为40%和71%，其无进展生存期达到20周的分别为78%和67%。而微卫星稳定的结直肠癌对该免疫治疗则未表现出相关反应，其无进展生存期达到20周的也只有11%。以上结果都表明，MSI状态对选择治疗方案可能有着较大的作用。2017年胃肠癌研讨会上，另外一种抗PD-1单克隆抗体nivolumab(Opdivo)对具有MSI-H的转移性结直肠癌的治疗效果也在II期CheckMate-142的试验中得到了肯定[29]。上述的结果都表明MSI状态在对CRC的治疗选择中可能具有重要意义。免疫抑制治疗比化学治疗毒性小，特别对身体条件较差，无法耐受化疗的晚期癌症患者，其应用价值更高。如果微卫星稳定性被验证为免疫检查点抑制作用的生物标记物。将会为可以选择此种疗法的患者带来巨大获益。理论上，免疫检查点抑制疗法对早期MSI-H患者也应有效，但其作用需要大量试验去证实。5.MSI与BRAFBRAF基因，全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1（v-rafmurinesarcomaviraloncogenehomologB1），可以编码67kD～99kD的丝/苏氨酸蛋白28 综述激酶（BRAF蛋白），从而参与MAPK/ERK途径调节细胞生命活动。BRAF蛋白属于为MAPK激酶的激酶MAPKKK，位于MAPK通路入口处，通过MEK和ERK使细胞表面的受体和RAS蛋白与核内转录因子相连接，从而调节细胞的增殖、分化和凋亡。而BRAF基因一旦发生突变，其中90%以上为BARFV600E突变，细胞将无法完成正常的凋亡过程，而进一步引发肿瘤的发生[30]。BARFV600E基因突变主要存在于恶性黑色素瘤、散发性MSI结直肠癌中以及甲状腺乳头状癌中。一些研究显示我国结直肠癌的BARFV600E突变率约为1.7%-25.4%[31]，而散发性MSI结直肠癌BARFV600E突变率更高。近年来的研究发现BRAF蛋白参与的RAS-RAF-MAPK通路可能与散发性MSI结直肠癌相关。Minno[32]等研究发现正常结直肠癌上皮细胞BARFV600E基因发生突变，可以使细胞对凋亡刺激产生抵抗，使MLH1基因启动子CpG岛（CpGislandmethylatorphenotype，CIMP）发生甲基化，而使细胞发生MSI。Preto等[33]使用RNA干扰技术抑制发生BARFV600E的散发性MSI结直肠癌细胞株，发现与细胞增值和凋亡的ERK1/2磷酸化及CyclinD1、Bcl-2表达显著下降。而对照组同为发生K-ras突变的细胞株缺没有出现此种现象，该试验进一步提示BRAF突变在MSI结直肠癌的发生发展中起着重要作用。6MSI与相关蛋白的研究6.1MSI与HGF（肝细胞生长因子）HGF（肝细胞生长因子）可以生成于人体正常细胞，诱导复杂的细胞内信号传导网络，参与细胞的增殖、运动及迁移。正常细胞的HGF通过一种络氨酸激酶受体（c-Met）发挥其生物学效应，从而使细胞维持正常的生命活动。但在肿瘤细胞中，HGF异常激活，HGF-cMet过度表达，可作为致癌的“驱动因素”从而促进肿瘤的发生。此外HGF-cMet过度表达还可以使肿瘤细胞之间的黏附力降低，使肿瘤细胞外基质降解，从而为细胞的运动产生条件，而使肿瘤细胞容易发生转移[34,35]。Seneviratne等[36]研究显示，结直肠癌MSI患者几乎均会发生脱氧腺苷通道元件（deoxyadenosinetractelementDATE）截断，而DATE是HGF基因启动子的元件，当DATE被截短后，HGF启动子发生改变，将会重新激活部分沉默的HGF基因，导致结肠癌细胞中的HGF异常分泌，从而进一步促使肿瘤的发生。MSI已被证明不仅仅存在于结直肠癌中，也存在于子宫内膜、胃、胰胆管、小肠、尿路上皮卵巢和脑（成胶质细胞瘤）中[37,38]，所以有些学者就推测所有具有MSI的癌症类型中DATE也被截短，HGF异常表达，从而促进肿瘤的发生[39,40]。HGF-cMet研究的深入将有希望为CRC的靶向治疗提供新思路，特别是对于具有DATE的微卫星不稳29 青岛大学硕士学位论文定性结直肠癌提供新的治疗方案，使MSI结直肠癌患者带来更大获益。6.2MSI与PCNA(增殖细胞核抗原)增殖细胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen简称PCNA），又称周期蛋白，是一种分子量为36KD的蛋白质，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，其合成于细胞核并在细胞核内发挥作用。目前研究发现PCNA在DNA的合成过程起着不可或缺的作用，主要体现在细胞增殖的启动环节，可以很好的反应出细胞的增殖状态。PCNA只在正常增殖的细胞及肿瘤细胞中表达，特别在G1晚期，其表达迅速升高，到S期可以达到最高峰，G2～M期则会迅速降低，其量的变化与DNA合成一致[41.42]。所以PCNA表达在一定程度上可以反映肿瘤细胞的增殖状态。一些实验研究发现存在MSI状态的结直肠癌比无MSI结直肠癌的PCNA低，进一步提示MSI状态的结直肠癌增殖活性较低[43,44]。在Umar等[45]研究中发现，PCNA是参与MSH2、MLH1错配修复过程中必不可少的蛋白，PCNA的合成减少将会对MMR系统的功能产生影响，使其不能正常的发挥作用，从而使MSI的发生率增加。6.3MSI与JAK1（络氨酸激酶-1)JAK1为JAK（非受体络氨酸激酶）蛋白家族中的成员之一，是一种非跨膜激酶，其主要通过JAK-STAT信号通路调节基因的转录，从而发挥其生物学校应。一项对英国和挪威的MSI结直肠患者的研究中发现其JAK1突变的总体频率达20%，而且通过结直肠癌外显子组测序还发现，除去JAK1突变外，还存在其他3个基因频繁突变。该研究还发现JAK1突变的MSI结直肠癌患者上调了抗PD-1治疗的相关转录特征，对于免疫治疗有更好的应答率[46,47,48,49]。通过对MSI的移码突变（分别是CRTC1、BCL9和PTCH1）的研究，揭示了高水平的肿瘤内异质性，但也发现此类肿瘤内异质性与肿瘤的进展并不存在相关关系，但对于肿瘤的治疗方案选择以及相关治疗反应是有一定的影响，例如JAK1突变的CRC对于免疫治疗的效果较佳，是患者的有利预后因素[50,51]。随着对肿瘤内异质性的研究不断加深，将会对MSI肿瘤带来更深的认识，同时也可以使患者获益。6.4MSI与TGF-β（转化生长因子-β)转化生长因子-β(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β)是一种功能完善的多肽类生长因子，TGF-β可以通过与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合使其激活，然后通过SMAD信号通路和/或DAXX信号通路参与信号的传递，从而参与细胞的生长、分化、细胞凋亡以及免疫调节。TGF-β在肿瘤形成的早期起到抑制肿瘤的作用，但在肿瘤发生的晚期TGF-β反而起到促进作用，使肿瘤生长、浸润和转移更加容易30 综述[52,53,54]。大量的研究已经证实MSI结直肠癌中存在频繁的TGF-β功能缺陷。相关研究还发现，TGF-β功能缺陷主要体现其受体（包括RI、RlI、RIIl受体）的突变，在MSI结直肠癌中以RlI受体（TGF-βRII）突变为主，其突变率达90%[55,56]。该突变可能是MSI结直肠癌的预后较好重要原因之一。黄波等[57]试验证实TGF-β增加肿瘤细胞迁移是通过P13K／AKT途径来完成的，该途径可以使Bim（凋亡蛋白）的表下调，从而影响细胞的凋亡过程。TGF-βRII与MSI结直肠癌的预后紧密相关，关于两者之间的进一步分子学研究将会使人类对MSI结直肠癌有更新的认识，从而使患者更加获益。6.5MSI与Ku70结合蛋白5（Kub5）-Hera（K-H）Ku70结合蛋白5（Kub5）-Hera（K-H）是维持遗传完整性的重要物质。当细胞在电离辐射以及其他外界因素诱导下或因复制压力诱导致使其复制过程形成的双链发生断裂（DSBs），而DSBs则是严重威胁生存及基因组完整的因素之一，如果不能完成修复，一个DSBs可能是会产生致命性的损伤[58]。如果错误修复，DSB可能会导致基因突变和染色体缺失或重排，从而危机整个基因组的完整性[59]。而Kub5-Hera就会发挥作用修复DSBs。此外Kub5-Hera还可以减少细胞DNA复制过程中R环的形成而维持DNA的正常复制[60]。另一方面K-H的过度表达可以促进肿瘤的生长，该过程可能是通过促进转录完成的[61]。正常或癌细胞中K-H消耗会导致遗传不稳定性增加[52]。在Patidar等[62]通过相关技术及一系列试验发现：K-H丢失将会导致半胱氨酸蛋白酶的活性升高，其中最可能特异于半胱天蛋白酶-3，此改变将进一步使核心MMR蛋白（MLH1和PMS2）的稳定性降低，当继续使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂（z-VAD）处理K-H丢失的细胞后，MMR的缺失将被修复。此研究证实K-H参与了DNA错配修复（MMR），细胞内的K-H丢失会导致相应的MMR缺失并使细胞发生微卫星不稳定性。Patidar[54]的试验为研究微卫星不稳定性提供了新型机制，同时也证实了有相当大比例存在MSI的结直肠癌以及其他相关恶性肿瘤都存在K-H的表达或复制缺失，但目前K-H在许多存在MSI的恶性肿瘤研究中大多被忽略，进一步探索K-H丢失在MSI-H相关肿瘤的中所起的作用，将可能证明K-H是具有MSI的结直肠癌的特征性标记物，从而为存MSI的恶性肿瘤患者提供更加合理的治疗方案。7问题与展望随着科学技术的进步，学者们对MSI的研究不断深入，MSI在恶性肿瘤的发生发展和诊断治疗以及预后等方面的重要性也日益凸显，其中关于MSI结直肠癌之间的研究相对较多。但目前的研究大多停留在回顾性分析中，缺少大量的前瞻性研究。31 青岛大学硕士学位论文此外许多MSI影响恶性肿瘤的分子机制仍未完全明确。但随着分子生物学的发展，许多目前存在的问题都将会迎刃而解，同时也将会给患者带来更新的、更个体化、副作用更小的治疗方案。从而使科学技术不仅仅局限于研究，而是可以应用于临床，彻彻底底使患者获益，造福人类。32 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致谢致谢时光飞逝，岁月如梭，转眼间，三年的硕士研究生求学之路即将画上句号。此刻站在毕业的节点回首过往：有成功时的喜悦，也有失意时的沮丧，有努力之后看到成果的欣慰，也有奋斗之后仍旧止步的失意。但是，此刻所有的过往都将成为珍贵记忆的一部分，伴随我继续成长。感谢我的导师林惠忠主任医师在我的课题选择与实施以及论文撰写等方面给予悉心指导，使我能够顺利完成毕业论文。林老师严谨细致的治学态度、专心致志的工作风以及不断提升自我的执着追求对我产生深深远的影响。虽然跟林老师学习只有三年的时间，但从他身上学到的东西必将使我终身受用，使我在未来的道路上能够勇于接受挑战，不断奋发向上。感谢青岛大学附属青岛市市立医院普外科赵鹏老师、李思源老师在我遇到相关困难时给予我临床相关方面的帮助。感谢病理科的黄新刚、姜伟娜老师，你们在病理方面给予我莫大帮助，从病理的取材到相关设备的工作原理，你们给予我悉心讲解与指导。感谢陪伴我、帮助我鼓励我的同学们，愿我们可以共同进步。感谢我的父母，是您们赋予我生命并一直陪伴我成长。你们的悉心照料使我从跌跌撞撞的孩提长大成人。41 青岛大学硕士学位论文学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。论文作者签名：日期：年月日学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛大学。本学位论文属于：保密□，在年解密后适用于本声明。不保密□。（请在以上方框内打“√”）论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日（本声明的版权归青岛大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用）42