栽培烟草原生质体培养再生植株的研究和烟草抗病相关基因NtEIF4E与NtTOM3的敲除和鉴定

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单位代码：106355学号：112013408002240硕士学位论文栽培烟草原生质体培养再生植株的研究和烟草抗病相关基因NtEIF4E与NtTOM3的敲除和鉴定论文作者：熊海军指导教师：王根洪副研究员学科专业：生物化学与分子生物学研究方向：植物细胞工程提交论文日期：2016年4月20日论文答辩日期：2016年6月03日学位授予单位：西南大学中国重庆2016年5月 西南大学二零一六届硕士学位论文栽培烟草原生质体培养再生植株的研究和烟草抗病相关基因NtEIF4E与NtTOM3的敲除和鉴定学科专业：生物化学与分子生物学研究方向：植物细胞工程指导教师：王根洪副研究员研究生：熊海军中国重庆2016年5月 DissertationforMaster’sDegreeofSouthwestUniversityStudyonconstructionofprotoplastisolation,purificationandregenerationsystemandknockoutofdiseaserelatedgenes（NtEIF4EandNtTOM3）inNicotianatabacumMajor:BiochemistryandmolecularbiologyField:PlantcellengineeringSupervisor:AssociateProf.GenhongWangCandidate:HaijunXiongChongqing,ChinaMay,2016 目录目录摘要...........................................................................................................................IAbstract..................................................................................................................III第一章文献综述......................................................................................................11.1植物原生质体的研究进展.......................................................................11.1.1植物原生质体分离...........................................................................11.1.2植物原生质体培养...........................................................................21.1.3原生质体的应用...............................................................................31.2植物原生质体遗传转化方法的研究概况...............................................41.3抗病相关基因的研究概况.......................................................................61.3.1正义链RNA病毒浸染植物宿主细胞流程.....................................61.3.2病毒与植物宿主基因相互作用的研究概况...................................71.4基因编辑技术研究概况...........................................................................9第二章引言............................................................................................................132.1研究背景及目的意义.............................................................................132.2研究内容.................................................................................................132.3技术路线.................................................................................................142.3.1原生质体分离和再生......................................................................142.3.2NtEIF4E和NtTOM3敲除载体的构建和转基因检测....................14第三章栽培烟草原生质体的分离和纯化............................................................153.1实验材料与试剂仪器.............................................................................153.1.1实验材料.........................................................................................153.1.2主要仪器.........................................................................................153.1.3主要试剂.........................................................................................163.1.4主要溶液的配制.............................................................................163.2实验方法和步骤.....................................................................................173.2.1原生质体的分离和纯化.................................................................173.2.2原生质体产量测定.........................................................................183.2.3原生质体活力检测.........................................................................183.3结果和分析.............................................................................................193.3.1栽培烟草原生质体分离和纯化.....................................................193.3.2烟草原生质体产量测定.................................................................19 西南大学硕士学位论文3.3.3烟草原生质体活性检测..................................................................203.4讨论.........................................................................................................21第四章栽培烟草原生质体再生体系的构建.........................................................234.1实验材料与试剂仪器.............................................................................234.1.1实验材料...........................................................................................234.1.2主要仪器..........................................................................................234.1.3主要试剂..........................................................................................234.1.4主要溶液的配制..............................................................................234.2实验方法和步骤.....................................................................................254.2.1pH对栽培烟草原生质体分裂的影响.............................................254.2.2甘露醇浓度对栽培烟草原生质体分裂的影响..............................254.2.3栽培烟草原生质体再生体系的构建..............................................254.3结果和分析.............................................................................................264.3.1pH对栽培烟草原生质体分裂的影响.............................................264.3.2甘露醇浓度对栽培烟草原生质体分裂的影响..............................264.3.3栽培烟草原生质体再生体系的构建...............................................274.4讨论.........................................................................................................28第五章原生质体转化初探.....................................................................................315.1实验材料与试剂仪器.............................................................................315.1.1实验材料..........................................................................................315.1.2主要仪器..........................................................................................315.1.3主要试剂..........................................................................................315.1.4主要溶液的配制..............................................................................325.2实验方法和步骤.....................................................................................325.2.1PEG转化法转化烟草原生质体步骤..............................................325.3结果和分析.............................................................................................335.3.11246-GFP载体转化烟草原生质体.................................................335.3.21258-GFP载体转化烟草原生质体.................................................335.4讨论.........................................................................................................34第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定........................356.1实验材料.................................................................................................356.1.1植物材料..........................................................................................356.1.2载体及菌珠......................................................................................356.1.3主要仪器设备..................................................................................35 目录6.1.4主要试剂.........................................................................................366.1.5主要试剂及缓冲液配方.................................................................366.2实验方法与步骤.....................................................................................376.2.1CRISPR/Cas9敲除载体构建..........................................................376.2.2农杆菌化学感受的制备.................................................................386.2.3重组表达载体转化农杆菌LBA4404............................................396.2.4农杆菌阳性转化子筛选.................................................................396.2.5烟草叶片遗传转化.........................................................................396.2.6转基因植株的鉴定.........................................................................406.3结果和分析.............................................................................................406.3.1栽培烟草K326NtEIF4E敲除载体靶位点设计和检测...............406.3.2栽培烟草K326NtEIF4E敲除载体T0代靶位点突变检测........416.3.3栽培烟草红花大金元NtTOM3敲除载体靶位点设计和构建....426.3.4栽培烟草红花大金元NtTOM3敲除载体T1代靶位点突变检测436.4讨论.........................................................................................................44第七章综合与结论................................................................................................45参考文献................................................................................................................49致谢........................................................................................................................57在读期间发表论文及参研课题............................................................................59 摘要栽培烟草原生质体培养再生植株的研究和烟草抗病相关基因NtEIF4E与NtTOM3的敲除和鉴定生物化学与分子生物学硕士研究生：熊海军指导教师：王根洪副教授摘要植物原生质体是除去细胞壁仅由细胞膜包裹的裸露细胞。烟草原生质体遗传表达系统作为研究基因网络调控、基因瞬时表达和信号通路的一种重要工具广泛应用，也是在细胞水平上研究植物分子机制和植物病毒感染的理想实验材料；此外，原生质体再生植株体系，也是实现单细胞遗传操作以及加快分子育种进程的重要基础。烟草是一种重要的模式植物和经济作物。烟草抗病相关基因的研究有助于了解植物对病虫害的防御机制，并且减少病虫害对烟草产量造成的损失。马铃薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）和烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）是危害国内烟草种植业的优势病毒，对烟草的产量造成严重的经济损失。病毒浸染植株时，病毒需要依赖宿主细胞提供复制和翻译的场所以及能量的供应，其感染过程即是病毒与植物的互作的产物。下调这类宿主基因即可有效的抑制相关病毒的感染和传播。已有研究结果显示，EIF4E和TOM3基因分别是协助PVY和TMV病毒复制和转运的关键基因。本研究以栽培烟草作为原生质体分离、纯化和再生体系构建的材料，对相关的影响因素进行了研究，获得了产量较高、质量较好的原生质体，并获得了栽培烟草再生植株。另一方面，使用Crispr/Cas9敲除系统敲除NtEIF4E和NtTOM3基因，获得了转基因植株，为研究栽培烟草抵抗PVY和TMV病毒的感染奠定了基础。本研究的主要结果如下：1.栽培烟草原生质体的分离和纯化构建了栽培烟草红花大金元原生质体分离纯化系统。使用纤维素酶和离析酶酶解八周左右烟草无菌幼苗的细胞壁，去除叶尖和叶脉组织后将叶片切成1-2厘米的丝状，与酶液混合恒温培养12小时。去除残余物质后多次离心后即可得到纯净的原生质体。I 西南大学硕士学位论文2.栽培烟草原生质体再生体系的构建成功构建了红花大金元原生质体再生体系。主要探究了pH值和甘露醇浓度对烟草原生质体分裂的影响，发现在pH5.8和0.5M甘露醇条件下，烟草原生质体分裂效果最佳。从原生质体到完整植株所需培养时间为200天左右。3.栽培烟草原生质体转化和检测使用PEG介导的转化方法转化烟草原生质体。我们发现Sigma公司生产的PEG4000最适合用于栽培烟草红花大金元的转化。同时，我们也发现小片段的质粒转化效率高于大片段的质粒，转化所需时间也低于大片段质粒。4.烟草NtEIF4E和NtTOM3敲除载体构建和突变检测由于实验室已建立成熟的CRISPR/CAS9基因敲除系统，我们成功的构建了红花大金元抗烟草花叶病毒相关基因NtTOM3和K326抗马铃薯Y病毒相关基因NtEIF4E的CRISPR/CAS9敲除载体9个，经检测，基因敲除呈阳性，并最终获得了转基因植株7株。NtEIF4E敲除植株中发现三个靶位点产生突变，三个靶位点检测的突变形式各有差异，靶位点1主要为增加一个碱基A，靶位点2主要为单个碱基的突变，靶位点3则主要为删除一个碱基G；NtTOM3敲除植株仅检测到一个靶位点产生突变，主要形式为碱基的删除，检测到的删除形式主要为在距离PAM前面6个碱基中删除一个至三个碱基，基因组编辑的比例约为12.5%。关键词：栽培烟草；原生质体；分离和培养；抗病；基因组编辑II AbstractStudyonconstructionofprotoplastisolation,purificationandregenerationsystemandknockoutofdiseaserelatedgenes（NtEIF4EandNtTOM3）inNicotianatabacumCandidate:HaijunXiongSupervisor:AssociateProf.GenhongWangAbstractPlantprotoplastisacellwithcellwallremoved.Tobaccoprotoplastisagoodtooltostudygenefunctionatcelllevel.Itisanidealexperimentalmaterialtostudyplant–virusinteractionatthecellularlevel.Whatismore,theprocessofmolecularbreedingthroughgeneticmanipulationwouldbelargelyacceleratedbyregenerationplantsfromasingleprotoplastcell.Tobaccoisanimportantmodelplantandeconomicplant.Studyingontobaccodisease-relatedgenesishelpfultounderstandplantdefensemechanismsandbreeddisease-resistanceplants..PotatovirusY(PVY)andtobaccomosaicvirus(TMV)aretwodominantviruseswhichcauseseriouseconomiclossesinseveralkindsofeconomicplants.Virusreliesonhostcellstoobtainenergyandcomponentsofreplicationandtranslation.Down-regulationofhostgenesrelatedtovirusreplicationandtransportation,suchasEIF4EandTOM3,couldeffectivelyinhibittheproliferationofvirus.Inthisstudy,protoplastisolation,purificationandregenerationsystemhavebeenconstructedincultivatedtobacco.Inordertoobtainahigheryieldandbetterqualityprotoplastcells,differenteffectfactorsonisolationandregenerationoftobaccoprotoplasthavebeeninvestigated.Ontheotherhand,Crispr/Cas9geneeditingsystemhasbeenusedtoknockoutdiseaserelatedgenesNtEIF4EandNtTOM3andplantswithtargetedmutagenesishavebeenobtained.1、IsolationandpurificationofthecultivatedtobaccoprotoplastsProtoplastisolationandpurificationsystemshavebeenconstructedinNicotianatabacumHonghuadajinyuan.Cellulaseenzymesandmacerasewereusedtobreakdownthecellwall.Eightweekoldseedingwereselectedtoisolateprotoplastcells.Tiptissueswithveinsremovedwerecutinto1-2cmfilaments,thenmixedwiththeenzymeIII 西南大学硕士学位论文solution,digestedfor12hoursindarkconditionsat25℃.Mesophylltissueswereremovedattheendofhydrolysis.Thepurifiedtobaccoprotoplastswereobtainedaftermultiplecentrifugation.2、ConstructionofprotoplastregenerationsystemforcultivatedtobaccoPlantregenerationfromsingleprotoplastcellwasachievedinthisstudy.Themainimpactfactorsforplantregeneration,PHandmannitolconcentrationwereinvestigated.CulturemediumwithpH5.8andsupplementwith0.5Mmannitolwerefoundtobethebestconditionforprotoplastsgrowthanddifferentiationbycomparison.Entireplantcouldberegeneratedfromasingleprotoplastcellaftercultivatingforabout200days.3、ProtoplasttransformationanddetectionforcultivatedtobaccoPEG-mediatedtransformationwasusedtotransformtobaccoprotoplasts.PEG4000producedbySigmawasfoundtobethemostsuitablePEGfortheHonghuadajinyuanprotoplasttransformation.Resultsshowedthatplasmidwithsmallsizehadahightransformingefficiencythanthatwithlargersize.4、Crispr/Cas9geneeditingvectorsconstructionandmutationdetectionoftobaccoNtEIF4EandNtTOM3GeneeditingvectorsCRISPR/Cas9-NtEIF4EandCRISPR/Cas9-NtTOM3wereconstructedsuccessfully,totally9targets.Andwedetectedthepositivereaction,andfinallygot7transgenicplants.InCRISPR/Cas9-NtEIF4Etransgenicplants,wefound3targetsitesmutated,target1showedaadenineredundant,target2mainlyintheformofsingle-basemutation,target3showedaguaninedeleted.InCRISPR/Cas9-NtTOM3transgenicplants,weonlydetectedamutatedtargetsite,mainlyintheformofdeleted1to3basesinfrontofthePAM,ratioofmutationwasabout12.5%.Keywords:Nicotianatabacum;Protoplast；Isolationandculture;Resistance;GenomeeditingIV 第一章文献综述第一章文献综述1.1植物原生质体的研究进展植物原生质体指的是去掉细胞壁后仅由原生质膜包裹的裸露细胞，其具有完[1]整的生命特性以及植物细胞所特有的全能型。原生质体因为去除了细胞与外界[2]环境接触的屏障细胞壁，使其成为细胞水平上研究植物分子机理的理想材料。原生质体不仅广泛应用于亚细胞定位、启动子活性研究、细胞融合转化和瞬时表达检测，还可用于细胞器移植、细胞突变体筛选和基因组编辑。原生质体的分离[3]和培养作为研究植物生理的一种基础技术而广受关注。1.1.1植物原生质体分离植物原生质体最早是在1892年由Klercker等利用机械破碎的方法获得，但得到的原生质体产量极低，并不适合后续的研究工作，故而没有受到广泛关注。当纤维素酶和果胶酶等商品酶市场化后，植物原生质体的分离和纯化才开始广泛的[4]受到青睐，大量的植物原生质体在之后被成功分离。酶解法较之前物理破碎的方法具有以下优点：（1）接触面更广促使酶解过程更彻底；（2）原生质体产量更高；（3）原生质体活性更好；（4）不再受限于植物的组织和种类。目前最常应用于植物细胞壁溶解的酶类主要包括纤维素酶类、半纤维素酶类以及果胶酶类[5-7]。植物原生质体的分离材料来源非常广泛，不仅包括叶片、根系、杆茎和果实等营养或生殖器官，还包含愈伤组织和细胞悬浮培养物等外植体。其中叶片是分离和纯化过程中最常用的材料。首先，叶片为植物营养器官，来源广泛，并且取材极为方便；其次，叶片叶肉细胞排列并不紧凑，松散的结构使其与酶液相互作用时，使工作酶液更容易与细胞壁接触，使酶解过程更加彻底；另外，叶肉细胞的生长和发育状态相似，因此获得的原生质体大小基本一致，并且其遗传特性也[8]较为相似，有利于后续的研究。Shahi等以番茄为实验材料，分别使用番茄叶肉和根来分离原生质体，结果发现叶肉原生质体更容易分裂形成细胞团。外植体是继代培养的产物，受到的外界环境影响较小，同时拥有良好的重复性，故而也是[9]原生质体分离的理想材料。Wilson等以橡胶的外植体材料分离原生质体，获得[10]质量较好的原生质体。Zafar等则首次利用愈伤组织成功的分离得到原生质体。[11-13]其他的植物材料还包括胚芽鞘、胚轴、花粉粒等，然而它们均具有明显的物种局限性和时期性，使用的频率较低。1 西南大学硕士学位论文影响原生质体分离和得率的因素很多。有文献报道，酶解前将叶片暗培养一[14]段时间后，可以纯化出得到更多的原生质体，暗示着适当的预处理有利于提高产量。由于不同物种间细胞壁组成差别较大，通常同时使用多种酶进行酶解，混合酶液中酶的种类和比例则根据细胞壁成分相应的调整，酶解过程中的时间和温度则需要根据酶的反应活性来进行调节。另外，有文献报道溶液中的渗透压以及[11,15,16]盐离子浓度和种类等对于维持原生质体的稳定有重要作用。1.1.2植物原生质体培养由于植物原生质体具有动物细胞所不具备的细胞全能性，从单个的原生质体再培养出完整植株成为了一种可能。原生质体培养再生植株的方法主要有三种：固液双层培养、琼脂糖平板法和液体浅层培养法。液体浅层培养是将分离纯化的原生质体用巴斯德吸管缓慢的加入培养皿中，再加入合适的营养液混合，液体厚度不超过2mm，然后使用封口膜封口后放入恒温培养箱中进行暗培养，温度设置为27℃。多种常见的牧草类（紫[17,花苜蓿和黄花苜蓿等）的原生质体培养被报道使用液体浅层培养法效果最佳18]。琼脂糖平板法则是指将纯化的原生质体用液体培养基重悬，加入的液体培养基使原生质体的密度为培养时所需密度的两倍，然后加入等体积的未凝固的固体培养基，混合后冷却至室温，在使用封口膜封口避免污染，放入27℃的恒温培养箱中进行暗培养。茄科植物原生质体再生植株培养被报道使用琼脂糖培养法效果[17-21]最好。原生质体的固液双层培养法则是先在培养皿内加入固体培养基，待冷却凝固后，将原生质体溶液注入固体培养基表面，恒温培养。液体浅层培养法操作简单，但容易使原生质体聚集以及次生代谢产物的积累；琼脂糖平板法在重悬过程中使原生质体分布均，利于后期的观察，但是渗透压不好控制。固液双层培养法则具有维持渗透压稳定和避免次生代谢产物积累的优点，但也保留液体培养方法的一些其它弊端。从单个的原生质体培养成为完整再生植株，培养方式显得尤为重要。培养方法对于原生质体的分裂，愈伤组织的形成尤为重要，根据植物的类别应当选取不同的培养方式，即便是同种植物的原生质体由于培养方法的不同，也会得到迥然不同的结果，甚至根本无法获得愈伤组织。故而在原生质体培养中，如何选择合适的培养方法直接关系到实验的成功与否。另外，原生质体并非正常的植物细胞，其本身合成和分泌的激素水平必定会受到影响，因此原生质体在培养过程中需要额外加入激素促使愈伤组织的形成，常见的植物原生质体再生体系中使用的激素有NAA，IAA，KT，2,4-D，BA等，2 第一章文献综述不同物种不同组织器官所需要的激素浓度和配比都需要适当的调整，才能促使细[5,22,23]胞的快速分裂，进而形成愈伤组织。当形成肉眼可见的愈伤组织是应当去除激素，诱导愈伤组织产生新生芽。由于刚提取的原生质体比较脆弱，所需要的营养元素不能一概而论，通常使用的培养基有MS改良培养基，B5常规培养基以及一些特殊的培养基，从而保证营养物质的持续供应，保证植物原生质体正常的生长和分裂。培养过程中应当注意适时的更换培养基，为生长和分裂提供持续的[24-26]能量，同时还能避免代谢废物的积累。1.1.3原生质体的应用[27]自Takebe等首次利用烟草叶片原生质体培育再生植株以来，已有多种植物通过原生质体再生的方式获得完整植株。迄今至少已有46个科160多个属的360多种植物的原生质体再生植株问世。原生质体作为一种基础实验材料，拥有许多优异的功能。作为一个单独的细胞，原生质体可用于植物细胞的分裂和分化、离子转运通道、细胞壁的再生、融合转化、亚细胞定位、瞬时表达、基因组编辑、启动子活性等基础性的研究，同时也是再生植株培养的基础。[28]YangZhang等比较水稻绿色组织和黄化组织原生质体摄入外源基因的差异，将构建的pUC-GFP载体分别转化进入两种组织的原生质体中，使用荧光显微镜观察时，发现水稻绿色组织的原生质体能够清楚检测到荧光信号，然而黄化[29]组织却比较模糊(图1.1)。Knight.M.R等在研究细胞内钙离子信号传递和转导以[30]及体内的调节机制时，发现原生质体是一种理想的载体材料。Kovtun.Y等将绿色荧光素酶基因和启动子连接在一起，并将构建的载体转入原生质体中，用以研究启动子的活性。[28]图1.1水稻原生质体的亚细胞定位Figure1.1Subcellularlocalizationofriceprotoplasts3 西南大学硕士学位论文原生质体在插入外源基因的时候，并没有种间细胞不亲和性的问题，而且脱壁的原生质体更容易进行转化操作。Fromm等最先使用电击穿孔法来转化植物原生质体，他们分别成功的对玉米、烟草以及胡萝卜的原生质体进行了遗传转化。[31]Eimert等使用电击法转化花椰菜叶肉细胞，最终得到具有抗性的生殖芽。[32]Yukichi等提取并纯化出拟南芥叶片原生质体，将外源基因转化进入原生质体细[33]胞内，使用荧光补偿实验来验证蛋白间的结合。Mukhopadhyal等通过PEG介导的方式转化甘蓝原生质体，虽转化率较低，但最终获得了转化的再生植株。[34]Masaki等构建了GFP荧光载体，将其分别转入烟草和拟南芥的原生质体中，经过亚细胞定位实验，发现一种GTP酶在蛋白质运输过程中起着关键作用。Zhang[35]Y等构建了TALEN载体转化原生质体，暗培养后提取原生质体的基因组并进行测序，能够快速的检测到突变形式以及初略的估计转化效率（图1.2）。多篇文[16,36-39]献报道利用植物原生质体转化技术顺利获得遗传改良的转基因品系，其高效性和方便检测的特性使其在植物遗传育种研究过程中越发受到关注。[35]图1.2原生质体用于基因组编辑检测Figure1.2TALENmutationdetectedbyprotoplasts1.2植物原生质体遗传转化方法的研究概况随着多种植物原生质体的分离纯化和大量再生植株的问世，使跨物种细胞融[1,28,40]合成为可能。进一步查找文献发现直接使用体细胞杂交的手段并不能解决传遗传不亲和的问题。当跨物种细胞融合后经常会出现遗传物质丢失，导致融合后细胞无法生长和分裂，或者在培养的过程中形成的愈伤组织无法成功诱导出芽，即使获得了再生植株，可能由于染色体数数目异常的情况导致成为不育植株，亲缘较近的细胞融合可能得到可育的后代，然而想得到的目标性状却往往难以表现或稳定的遗传。由于不稳定因素太多，利用原生质体融合的技术来改良分子育种4 第一章文献综述有很大的难度。将外源基因直接转入原生质体，则能有效地回避细胞融合过程中的大量不利因素，从根本上解决种间不亲和的问题。常见应用于植物原生质体转化的方法主要有三种，PEG介导的转化法、电击穿孔转化法以及生物介质介导的转化法。PEG介导法由Davey等建立，PEG主要作用于细胞膜的磷脂双分子层，使其构象发生变化的同时还会使膜上电荷紊乱，使外源DNA能够顺利的进入细胞内，并没有种间特异性，理论上任何基因都可通过这种方式转化进入原生质体，转化成功率一般在15%左右。这种方法的主要5流程是将纯净的原生质体稀释至一定浓度，通常转化的浓度设定为为1×10个每6毫升到1×10个每毫升，再向其中加构建的目标DNA载体，然后加入PEG工作液共孵育，转化结束后使用清洗液终止反应，之后经过离心再次纯化原生质体，然后进行检测或是再培养。其中原生质体的初始浓度、载体的结构和大小、PEG的种类和浓度、转化反应时间、反应环境的pH、操作等都对转化的效率有较大的影响。例如在一定范围内，PEG介导法的转化成功率随着目标载体的浓度增加而变高，载体的大小也影响着转化效率，同时有文献报道环状的载体DNA的转化效率显著地低于线性的载体DNA。PEG的种类和浓度选择对于转化结果尤为重要，PEG对原生质体结构是有损害作用的，PEG的浓度必须同时兼顾对原生质体造成的化学损伤小及外源DNA顺利进入原生质体膜。同样，转化反应时间过长会使原生质破碎，反应时间过短则无法保证转化效率，故而反应时间也需要仔细摸索。电击穿孔转化法则是通过高压电脉冲作用，在原生质体质膜上形成小孔通道，而这些小的通道是可修复的，这些通道打开的同时可以让外源的遗传物质进入细胞质中。这种转化方式操作简单，并且转化过程不会有有害物质的参与。常用的生物介质主要有两种：发根农杆菌和根癌农杆菌。这种方式主要通过使农杆菌中Ri质粒和Ti质粒的病毒区基因（Vir）活化，进而让T-DNA插入原生质体细胞核内。这种转化方法的一般操作如下：首先将外源基因插入Ti或者Ri质粒内，并转化进入农杆菌；重组的农杆菌与原生质体共培养一段时间，利用农杆菌的特性是目标基因进入原生质体，进而插入细胞核内；然后将原生质体转移到具有羧苄青霉素抗性（抑制农杆菌的生长）和能够筛选转化细胞的抗生素（通常使用卡那霉素和氨苄青霉素钠）含激素的基本培养基内，选择转化后的原生质体进行培养，诱导其分裂继而形成肉眼可见的愈伤组织；最后将愈伤组织转入不含激素的培养基内诱导愈伤长出生殖芽，诱导形成完整的转基因植株。利用农杆菌共转染原生质体通常只能转化一个基因，但是效率较高，由于外源基因随机插入原生质体核基因组内，故而在筛选稳定遗传后代的过程中较为繁琐。5 西南大学硕士学位论文通常来说，植物传统的转基因方法农杆菌转染组织形成愈伤组织进而分化出生殖芽形成的转基因植株，一般筛选出纯合植株的周期较长，比如常见的经济作物烟草、水稻、番茄等，加上Ti质粒插入细胞核内基因组的位置是随机的，所需要的性状常常难以遗传。利用单个的原生质培养再生植株，一定程度上可以减少T0代植株出现嵌合体的形式，进而致使纯合植株获得的周期变短。1.3抗病相关基因的研究概况1.3.1正义链RNA病毒浸染植物宿主细胞流程植物病毒主要分为RNA病毒和DNA病毒。其中DNA病毒根据其结构可分为单链DNA病毒及双链DNA病毒，RNA病毒则主要分为正义链RNA病毒、反[41]义链RNA病毒以及双链RNA病毒。植物易感的病毒中正义链RNA病毒占了[42]不少于80%，比如对农业生产造成巨大损害的最常见的马铃薯Y病毒科和番茄丛矮病毒科和雀麦花叶病毒科等。病毒通常无法直接进入植物表皮感染植株，主要的手段是通过昆虫的叮咬或者寄生真菌进入植物细胞，其次则是通过植物表皮机械创伤口感染植株。由于病毒本身不具备自我复制和繁殖的能力，病毒浸入植物细胞后，需要依赖宿主细胞本身的酶、核糖体及其他相关复制元件来完成病毒的扩增。虽然不同病毒的结构和宿主类型各不相同，但病毒的复制大同小异。以往的研究表明，正义链RNA[43,44]病毒的复制流程最为透彻。正义链RNA病毒的扩增过程如下（图1.3）：病毒通过昆虫口器和表皮创伤等方式进入宿主体内，首先病毒结合在宿主细胞膜上，仅将RNA注入细胞质中，特异的识别宿主细胞内的复制元件，进而形成病毒复制复合体（viralreplicationcomplexes，VRCs），利用宿主RNA依赖的RNA聚合酶，以正义链病毒RNA为模板，按照碱基互补原则合成反义链RNA，再以反义链RNA为模板大量的产生病毒正义链RNA，之后进一步借助宿主翻译元件合成病毒的衣壳蛋白，进而重新组装为完整的病毒。大量新的病毒产生后通过细胞间胞间连丝或者细胞质膜的[45]外排作用排出细胞，进而感染其他宿主细胞。病毒的复制和翻译需要依赖宿主体内的转录翻译系统，病毒的RNA能够识别和特异的结合宿主体内的某些蛋白。如果宿主复制和翻译系统相关的蛋白质功能丧失或者无法再被病毒识别，那么病毒将无法再宿主体内繁殖，进而使植株获[46]得对这些病毒抗性。6 第一章文献综述[46]图1.3正义链RNA病毒的复制流程Figure1.3Schematicinfectioncycleofpositive-senseRNAvirus1.3.2病毒与植物宿主基因相互作用的研究概况由于病毒的复制依赖宿主体内的某些元件，那么下调这些宿主本身的基因则可能使植株获得对这种病毒的抗性，进而降低病毒的传播，从而减少其对农业生产造成的损失。研究发现不同的病毒在植物体内特异的识别的基因是有所差别的，[47]目前已经发现多种植物抗病毒相关的基因（图1.4）。真核翻译起始因子EIF4E家族蛋白能够特异的与mRNA的5’端结合，进而[48]起始蛋白的合成。研究发现，马铃薯Y病毒属中的芫菁花叶病毒TuMV在感染宿主的过程中，由于基因突变导致病毒的VPg蛋白失活后，就不能再感染植株[49]。后续的研究表明，病毒的VPg蛋白需要与宿主体内的EIF4E起始因子相结合来起始病毒的翻译。同样的，突变或者下调宿主EIF4E基因，则可有效的抑制PVY病毒的感染。FlorencePiron等通过随机突变的方法破坏番茄的EIF4E基因，突变[48]株能够有效地抑制两种马铃薯Y病毒。本生烟与辣椒中突变或者下调EIF4E[50]基因，均能使植株对PVY产生一定的抗性。另外，除了EIF4E基因，下调或[51]者突变多种EIF4E的同源基因也能得到相似的抗性植株。当然，其他种类的病7 西南大学硕士学位论文毒在宿主中也存在翻译起始因子，下调大麦rym4基因能够有效抑制大麦黄化花[52][53]叶病毒的感染。甜瓜nsv基因能够抑制MNSV病毒的感染。拟南芥tom1突变体能够有效地抑制烟草花叶病毒的感染，进一步研究发现TOM1基因能够编码一种跨膜蛋白，而这种蛋白能够与TMV病毒特异的结合，[54]进而将病毒复制复合体整合到质膜之上，保证病毒的复制。SunilKumar等通过构建TOM1和TOM3的siRNA载体，进而下调烟草中的这两个基因，发现转基因[55]植株对TMV的抗性明显增强。MomokoAsano等同时干扰沙姆逊烟草的TOM1[56]和TOM3基因后，发现转基因烟草能够有效地抑制TMV的生长和扩散。除此之外，青枯病、烟草蚀叶病毒、番茄花叶病毒、黄瓜花叶病毒等均在对应的植株体内均有相关的抗性基因，通过类似的下调或者突变这些宿主因子，均[57-65]可使植物获得一定的抗性。[54]图1.4抗病相关基因以及对应的病毒Figure1.4Resistancegenesconferringresistancetoviruses8 第一章文献综述1.4基因编辑技术研究概况基因组编辑技术作为一种高效而特异的遗传操作技术受到广泛的关注。在多[66]种动植物的功能基因研究和疾病的检测及治愈有长足的发展。它能对特定的基因进行编辑，实现对目标DNA片段的删除和插入，进而导致目标基因的敲除，无法行使其原有的功能。基因组编辑技术由于具有靶位点设计简单、敲除效率较高以及特异性好等特点，这些是其他传统转基因手段所不具备的独特优势，具有[67-70]广阔的应用前景。近年来，基于人工核酸内切酶（engineeredendonuclease，EEN）技术的发展使得基因编辑变得简单可行，目前常用的三种人工核酸内切酶系统分别包括锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases，TALENs)和CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cassystem)。这些核酸内切酶能够特异的识别和切割靶位点并导致DNA双链的断裂（Doublestrandbreaks,DSBs），然而刺激机体对这些断裂的DNA进行修复，其中最主要的DNA修复手段有两种，分别是基于核酸双链的同源重组（Homologousrecombination，HR）和非同源末端连接（Non-homologousending-joining，NHEJ）[71]。非同源末端连接途径修复断裂的DNA双链会导致靶位点序列发生碱基的缺失和插入，若是双链的断裂发生在基因编码区，碱基的缺失和插入能够导致基因的移码突变，进而使目标基因编码的蛋白质失去原有的功能。当存在与靶基因同源的序列时，通过同源重组的修复途径发挥作用，实现基因的替代和突变位点的修复。在这些序列特异核酸酶中，ZFNs是第一个被用来实现基因组编辑的核酸酶，每个锌指蛋白（Zincfingerprotein，ZFP）能够特异的识别和结合到3个连续的碱基上，故而3到4个串联的ZFP能够特异的识别DNA序列。典型的ZFN结构上包含串联的锌指结构和一个具有非特异切割结构域的FokI蛋白酶，它可以特异的识别和结合到9个或者12个靶序列上。FokI切割结构域来源于一种IIS型限制性内切酶，能够与锌指蛋白结构域的C末端结合。其中要使FokI酶具有活性，必须使其形成二聚体结构，因此设计ZFN载体时通常使其与ZFPs间隔5-7bp的位置。载体N末端的锌指蛋白能够特异的识别和结合到靶位点，然后具有活性的9 西南大学硕士学位论文FokI结构表现出的切割活性从而实现对双链DNA的切割进而形成DSBs。截止到目前，ZFNs作为一种有效的基因组编辑工具已经成功的用于多种植物基因组的[72-74]修饰，包括拟南芥、烟草和棉花等。TALEN结构主要包含一个TALE（transcriptionactivator-likeeffector）结构域和FokI核酸内切酶结构域。其中TALE结构域的N末端是一个具有分泌信号功能的易位结构域（translocationdomain，TD），中间部分则是一个DNA结合结构域（DNA-bindingdomain）,是数个33~35氨基酸残基片段串联而成，C末端则是重复序列，由20个氨基酸残基构成的半重复片段串联而成。每个重复片段除了12和13位置处的氨基酸不同外，其他的氨基酸相同，这两个位置的氨基酸能够识别不同的碱基，其中NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。同样的TALE蛋白结构域通过末端核定位信号进入细胞核，识别和结合到靶位点上，FokI蛋白形成的二聚体切割靶位点。目前TALENs已经被广泛用于植物基因组的编辑，[75,76]包括拟南芥、烟草、水稻和玉米等。CRISPR/Cas9系统是一种最近兴起的基因编辑系统，相较于前面的两种技术其提供了更灵活高效的基因组编辑能力。CRISPR/Cas系统最先发现是被作为一种防御机制用来抵制病毒和外源质粒对细菌或古细菌的侵入。根据结构和作用机制的不同，在细菌和古细菌中至今共鉴定了三种不同的CRISPR/Cas系统。链球菌种的CRISPR/Cas9系统包含CRISPRRNA（crRNA）区域、反式激活CRISPRRNA（tracrRNA）区域以及Cas9基因家族区域。当外源的质粒和病毒入侵细菌时，CRISPR位点上的crRNA和tracrRNA转录并形成复合体引导Cas9蛋白识别和切割外源DNA。crRNA和tracrRNA可以连接行成一个嵌合RNA，称做引导RNA（guideRNA，gRNA），20个gRNA可以结合到靶序列上。在靶序列的3’端有个保守基序（NGG），被称为保守间隔相邻基序（proto-spaceradjacentmotif，PAM），这个基序是gRNA引导Cas9蛋白识别和切割靶位点所必须的。CRISPR/Cas9系[77]统已经被用来多种植物基因组的编辑，包括拟南芥、水稻、玉米和小麦等。本实验室高军平等构建了适用于栽培烟草基因敲除的CRISPR/Cas9系统，特异的敲除独脚金内酯转运蛋白基因NtPDR基因和八氢番茄红素脱氢酶基因NtPDS基因，检测对应靶位点的突变时发现阳性株系的比例分别为81.8%和87.5%，在T0代株[78]系中也检测到等位基因突变的个体，获得明显的白化和多分支表型得植株（图10 第一章文献综述1.5）。[78]图1.5栽培烟草CRISPR/Cas9敲出载体的构建Figure1.5CRISPR/Cas9-mediatedtargetedmutagenesisincultivatedrobacco综上所述，本文首先摸索了栽培烟草红花大金元原生质体的分离和纯化流程，纯化出高质量的烟草原生质体；然后以原生质体为基础，培养形成完整的再生植株；其次建立栽培烟草原生质体瞬时表达系统；其次选取栽培烟草中几个抗病毒相关的基因，NtEIF4E和NtTOM3，使用CRISPR/Cas9敲出系统构建敲除载体，并对敲除株系进行了鉴定。11 西南大学硕士学位论文12 第二章引言第二章引言2.1研究背景及目的意义烟草作为一种茄科植物，不仅是一种重要的模式生物，同时也具有重大的经济价值。烟草原生质体具有多种功能，不仅可以用来研究细胞水平的分子调节机制，也是遗传转化的绝佳受体。本部分研究的主要目的在于以栽培烟草红花大金元（HD）和K326叶片为材料分离和纯化原生质体，并建立稳定的瞬时表达系统，初步探索栽培烟草原生质体的转化，构建栽培烟草原生质体到完整植株的再生体系。另一方面，烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）在烟草种植过程中极易爆发，常会造成烟草品质下降以及产量降低。烟草NtEIF4E和NtTOM3基因分别协助PVY复制或者帮助TMV病毒的转运，我们利用Crispr/Cas9系统构建了NtEIF4E和NtTOM3三个敲除载体，获得了转基因植株，为研究栽培烟草抵抗PVY和TMV病毒的感染奠定了基础。2.2研究内容1、利用酶解法分离和纯化栽培烟草原生质体。2、栽培烟草原生质体再生体系的构建。3、栽培烟草原生质体的转化。4、利用Crispr/Cas9系统构建NtEIF4E和NtTOM3两个基因的敲除载体，并对转基因植株进行了鉴定。13 西南大学硕士学位论文2.3技术路线2.3.1原生质体分离和再生2.3.2NtEIF4E和NtTOM3敲除载体的构建和转基因检测14 第三章栽培烟草原生质体的分离和纯化第三章栽培烟草原生质体的分离和纯化植物原生质体时是去除细胞壁的裸露细胞，但是其具有动物细胞所不具备的全能型，故而是细胞理论研究的极佳材料，可用于细胞壁的再生过程、植物细胞质膜的结构和功能等研究。原生质体通常具有生长发育周期几乎一致、外源DNA分子容易被摄入细胞、单体数量大等特点，是一种理想的研究遗传转化的受体材料，外源核酸、质粒、病毒、细胞器等很容易注入细胞进行遗传操作。在培养的植株可以用作改良作物育种，增加其抗病虫害能力，达到高产、高质量的目的。烟草作为一种重要的模式植物和重要的经济农作物，原生质体的研究显得极为重要。栽培烟草红花大金元的原生质体分离和纯化至今尚未报道。本研究以红花大金元和K326两种栽培烟草作为材料，建立它们最佳的酶解条件，分离到高产量高活性的原生质体，为常用的栽培烟草品种提供细胞操作平台，为再生体系提供基础。3.1实验材料与试剂仪器3.1.1实验材料栽培烟草红花大金元和K326烟草种子由家蚕基因组生物学国家重点实验室保存。烟草种子置于75%酒精浸泡30秒，次氯酸钠溶液中消毒7分30秒，无菌水冲洗5次，播种于MS固体培养基中，培养条件为光照16h，黑暗8h，培养环境温度设置为25℃。待无菌幼苗长至5-6真叶期后待用。3.1.2主要仪器实验仪器生产厂家实验仪器生产厂家-20℃冰箱海尔高压灭菌锅TOMYRXZ型人工气候箱宁波东南仪器电子天平上海奥豪仪器pH酸度计成都方舟水平摇床北京仪器厂SW-CJ-IF超净工作台苏净安泰低温离心机Beckman0.22μm过滤膜Millipore普通光学显微镜重庆光学仪器厂3mL塑料吸管北京鼎国18cm不锈钢剪刀上海生工镊子上海生工50mL离心管架上海生工50mL离心管三医大辛创20mL注射器渝北新亚200目滤网北京鼎国倒置荧光显微镜OLYMPUS15 西南大学硕士学位论文3.1.3主要试剂试剂名称生产成家试剂名称生产厂家MES上海生工二水合氯化钙Sigma氯化钾成都科龙化工七水合硫酸镁上海生工氯化镁成都科龙化工碘化钾上海生工无水合硫酸铜上海生工磷酸二氢钾成都科龙化工纤维素酶R10YakultPharmaceutical离析酶R10YakultPharmaceuticalD-甘露醇上海生工蔗糖上海生工牛血清蛋白Sigma3.1.4主要溶液的配制1、W5清洗液MES0.196g氯化钠4.55g氯化钙6.935g氯化钾0.186g加入灭菌水后定容至500mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。2、WI溶液MES0.156g甘露醇18.22g氯化钾0.298g加入灭菌水后定容至200mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。3、MMG溶液MES0.156g甘露醇14.574g氯化镁0.61g加入灭菌水后定容至200mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。4、CPW21溶液磷酸二氢钾13.6mg16 第三章栽培烟草原生质体的分离和纯化硝酸钾50.5mg氯化钙740mg硫酸镁123mg碘化钾0.08mg硫酸铜0.0125mg蔗糖105g加入灭菌水后定容至500mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。5、NP母液MES1.952g氯化钾0.7455氯化钙0.5549g甘露醇41.25g加入灭菌水后定容至500mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。6、荧光素双醋酸酯储存液荧光素双醋酸酯5mg丙酮20mL终浓度2mg/L的FDA丙酮储存液放置4℃保存3.2实验方法和步骤3.2.1原生质体的分离和纯化1、酶液配置：称取纤维素酶0.45g和离析酶0.12g加入30毫升NP母液，混匀后，放置于55℃恒温水浴10分钟；2、待酶液冷却至室温后，加入0.03g牛血清蛋白，使牛血清蛋白完全溶解后，吸入20毫升注射器，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌；3、取3到4株8周左右烟草无菌幼苗，除去主叶脉和叶尖组织，在超净工作台用剪刀剪成1至2cm均匀细丝，然后将其放入酶液，轻微混合使烟草叶丝与酶液充分接触，放置于水平恒温摇床，45转每分钟，设置环境温度为26℃，一共酶解10至12小时；4、取两只50毫升离心管分别在开口处放置200目滤网，使用5毫升移液枪向滤网中央加入10毫升W5溶液，然后吸取酶解完毕的叶肉溶液，缓慢注入滤网中央区域进行过滤，去除尚未完全酶解的叶片组织，贝克曼低温离心机离心，离17 西南大学硕士学位论文心条件设置为：转速100g，离心时长7min，离心加速度4；5、向10毫升灭菌离心管中加入6毫升CPW21溶液，将第四步离心完毕的溶液去除上清，用塑料吸管小心吸取酶解后细胞并注入CPW21溶液顶部，配平后使用离心，600转每分钟，离心5分钟，离心加速度4；6、塑料吸管小心吸取离心后CPW21溶液的上部绿色溶液部分，注入50毫升离心管，然后向离心管中加入10毫升W5清洗液，100g离心5分钟；7、尽量弃去上清，加入适当MMG储存溶液保存；8、光学显微镜观察纯化后原生质体形态3.2.2原生质体产量测定红花大金云或者K326的产量使用血球计数板计数法测定。将1毫升枪头剪去尖端（防止机械挤压导致原生质体损伤），1毫升移液枪吸取少量纯化后的原生质体悬浮液，滴入血球计数板上并使悬浮液充满计数板，光学显微镜下观察计数，重复计数三次，按照以下公式计算原生质体产量：4原生质体密度（个每毫升）=（N/80）×400×10（N表示大方格内随机选择5个小方格里的原生质体数量）3.2.3原生质体活力检测原生质体活性的测定使用常规的荧光素双醋酸酯（Fluoresceindiacetate，FDA）染色法。荧光素双醋酸酯本身不能自发荧光，没有极性，因此能随意的通过原生质体细胞膜。荧光素双醋酸酯进入原生质体细胞质中之后，活性的原生质体细胞质中的醋酸酯酶能够分解FDA，使其成为具有极性的荧光素。荧光素则不能自由的透过原生质体质膜。在紫外光的照射下，会产生绿色荧光，而不具备活性的细胞则不会激发绿色荧光。向纯化后的1mL原生质体里加入20μLFDA丙酮储存液，静置5分钟，使用荧光显微镜下观察计数。其中在紫外光下激发绿光的为有活性的原生质体。原生质体活性检测的公式如下：原生质体活性（%）=（紫外光下激发绿色荧光的细胞数÷白光下完整细胞总数）*100%18 第三章栽培烟草原生质体的分离和纯化3.3结果和分析3.3.1栽培烟草原生质体分离和纯化以红花大金元烟草嫩叶为起始材料，纤维素酶和离析酶酶解处理10至12小时后，离心纯化得到纯净的原生质体（图3.1），在显微镜10倍和40倍物镜观测下均得到数量较多、球状绿色圆润的原生质体，表明原生质体去壁分离成功。图3.1烟草原生质体的纯化Figure3.1PurifiedprotoplastoftobaccoA：10倍物镜B：40倍物镜A:10×B:40×3.3.2烟草原生质体产量测定得到纯净的原生质体使用血球计数板粗略计数（图3.2）。按照原生质体计数5方法，将所得的原生质体使用MMG溶液稀释至2*10个每毫升保存待用。然后根据不同实验目的进一步稀释为不同浓度的原生质体悬浮液。图3.2烟草原生质体计数Figure3.2Countingoftobaccoprotoplast19 西南大学硕士学位论文3.3.3烟草原生质体活性检测荧光素双醋酸酯（Fluoresceindiacetate，FDA）染色法测定原生质体活性的原理是荧光素双醋酸酯本身不能自发荧光，没有极性且能随意的通过原生质体细胞膜。荧光素双醋酸酯进入原生质体细胞质中之后，活性的原生质体细胞质中的醋酸酯酶能够分解FDA，使其成为具有极性的荧光素，在紫外光的照射下，会产生绿色荧光。在优化的酶解条件下，实验结果显示（图3.3），视野1（A，B）原生质体的活率为83.3%，视野2（C，D）和视野3（E，F）原生质体的活率均高达100%。在单位视野下，分离纯化的原生质体活性细胞数量较多，只有极少数细胞死亡，符合下一步实验要求。图3.3FDA法测定细胞活性Figure3.3Viabilitydetectionoftobaccoprotoplast图A、C、E分别表示三个视野在白光下的原生质体图B、D、F分别表示三个视野在紫外光激发荧光A,C,EvisionsshowedprotoplastsinthewhitelightB,D,Fvisionsshowedprotoplastsintheultravioletlight20 第三章栽培烟草原生质体的分离和纯化3.4讨论成功分离和纯化出数量大、活性高的栽培烟草原生质体，为后续实验奠定了基础。影响栽培烟草原生质体分离和纯化的因素较多，主要包含实验材料的选择、酶解时间的调整、酶解环境的控制以及实验细节操作等。实验材料的选择主要包含材料部位和叶龄的选择，实验表明去除嫩叶叶尖以及主叶脉所得到的细胞大小较为均一，并且皆为较为成熟的叶肉细胞，避免了叶尖分生组织细胞分裂旺盛以及叶脉细胞对实验造成的影响；对于叶龄的选择，通常选择5至6叶真叶期的无菌幼苗，可保证其细胞的分裂活性，纯化过程中碎片较少；另外，将叶片切为1至2厘米的丝状物，既可使酶解效率提高（叶片组织与酶液接触面积更大），也能较大程度的缩短酶解时间。原生质体分离的时间最好控制在13小时内，否则随着时间的推移，细胞碎片增多，活细胞数量下降。酶解环境的控制主要体现为在黑暗恒温低速震荡的条件下会对酶解过程有一定的促进作用。最后，注意实验细节操作对获取高质量的原生质体有较大的帮助，原生质体分离和纯化的过程需严格无菌条件操作，否则影响后续实验的进行；原生质体在转移的时候若需用到枪头需要剪去枪头尖端，防止细胞破碎，最好使用巴斯德吸管进行原生质体液体的转移；离心后尽量避免震荡，因为离心时离心力较低，原生质体贴壁不牢靠，去除上清也尽量避免吸出过多沉淀。获得的原生质体最好是现提现用，经观察其活性会随着时间推移而下降。21 西南大学硕士学位论文22 第四章栽培烟草原生质体再生体系的构建第四章栽培烟草原生质体再生体系的构建由于植物原生质体具有动物细胞所不具备的细胞全能性，因此植物原生质体可以再培养出完整植株。目前已有多种植物通过原生质体培育出再生植株。烟草原生质体作为一种优异的遗传操作受体，通过培养再生成为完整植株，不仅能缩短转基因植株获得的时间，还可能更快的筛选得到纯合转基因植株。栽培烟草作为一种重要的经济作物，目前鲜有其再生植株体系构建成功的报道。本研究以红花大金元原生质体为材料，摸索最优化的栽培烟草原生质体培养条件，初步构建红花大金元原生质体再生体系。4.1实验材料与试剂仪器4.1.1实验材料高质量高活性的红花大金元原生质体由上一步分离纯化得到。4.1.2主要仪器实验仪器生成厂家实验仪器生产厂家-20℃冰箱海尔高压灭菌锅TOMY微波炉中国美的集团恒温震荡培养箱上海悦丰仪器仪表智能人工气候箱宁波东南仪器电热恒温水浴锅长风仪器仪表公司pH酸度计成都方舟电子天平上海奥豪仪器超净工作台苏净集团安泰公司低温离心机Beckman0.22μm过滤膜Millipore普通光学显微镜重庆光学仪器厂3mL塑料吸管北京鼎国60*15平板北京鼎国4.1.3主要试剂实验试剂生产厂家实验试剂生产厂家MES上海生工七水合硫酸镁上海生工D-甘露醇上海生工磷酸二氢钾成都科龙化工蔗糖上海生工牛血清蛋白Sigma低熔点琼脂糖invitrogenMS基本培养基PhytoTechnologyLaboratories1/2MS基本培养基PhytoTechnologyLaboratoriesNAAPhytoTechnologyLaboratories6-BAPhytoTechnologyLaboratories琼脂粉Oxoid4.1.4主要溶液的配制23 西南大学硕士学位论文1、ⅢB型固体培养1/2MS0.217g硫酸镁0.1g磷酸二氢钾0.06g蔗糖2g甘露醇8.2gNAA300μL6-BA100μL低熔点琼脂糖1g加入灭菌水后定容至100mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至40℃，倒板待用。2、ⅢB型液体培养1/2MS0.217g硫酸镁0.1g磷酸二氢钾0.06g蔗糖2g甘露醇8.2gNAA300μL6-BA100μL加入灭菌水后定容至100mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。3、MSC培养基MS4.33g蔗糖30g低温琼脂糖8.4gNAA3mL6-BA1mL加入灭菌水后定容至1L，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至40℃，倒板待用。4、MS培养基MS4.33g蔗糖30g琼脂粉8.4g24 第四章栽培烟草原生质体再生体系的构建加入灭菌水后定容至1L，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至40℃，倒板待用。4.2实验方法和步骤4.2.1pH对栽培烟草原生质体分裂的影响不同物种原生质体培养的最佳pH值有所不同，根据不同需求pH值得变动范围在5至6间。烟草原生质体分裂的过程中，由于品种不同会出现pH值得变动。分别在pH5.5和pH5.8的条件下研究pH值对红花大金元原生质体分裂的影响。4.2.2甘露醇浓度对栽培烟草原生质体分裂的影响甘露醇能够维持细胞正常的渗透压，防止细胞破碎。为了探索最佳的甘露醇浓度，我们分别设定了三个甘露醇浓度梯度，分别为不加甘露醇，0.5M甘露醇，0.7M甘露醇，通过观察原生质体分裂情况，来确定红花大金元原生质体的最优甘露醇浓度。4.2.3栽培烟草原生质体再生体系的构建1、烟草原生质体ⅢB型固体培养基使用微波炉加热，溶化后放置于42℃水浴锅内防止凝固待用；42、使用ⅢB型液体培养基将将原生质体稀释至3*10个每毫升，然后加入等体积ⅢB型固体培养基，混合均匀；3、混合后的溶液倒入60*15mm平板内，封口膜封口后遮光培养，时常记录细胞分裂情况；4、当原生质体分化成肉眼可见愈伤组织，将其转移出新ⅢB培养基使愈伤组织继续生长；5、待愈伤组织长大后，转移至MSC培养基诱导生殖芽的产生；6、将生殖芽剪下，转移至新的无激素的MS培养基中诱导生根，最终获得完整植株。25 西南大学硕士学位论文4.3结果和分析4.3.1pH对栽培烟草原生质体分裂的影响在原生质体的培养过程中，我们探索了不同pH条件下对烟草原生质体分裂状况的影响。实验结果表明（图4.1），pH5.5的培养基中原生质体培养8天以后，完整细胞数量较少，并且细胞碎片较多，几乎没有观察到细胞的分裂（图4.1A），并且培养基凝固性较差；pH5.8的培养基中原生质体培养8天以后，完整细胞较多，大多数细胞均出现了分裂，并且细胞内部能观察到绿色组织，细胞碎片较少（图4.1B）。pH5.8条件下的原生质体分裂状况明显好于pH5.5。图4.1pH对原生质体分裂的影响Figure4.1DivisionofprotoplastsindifferentPhA：pH5.5条件下培养8天细胞的分裂状况B：pH5.8条件下培养8天细胞的分裂状况A:Protoplastsdivisionstatusafter8daysculturedinpH5.5B:Protoplastsdivisionstatusafter8daysculturedinpH5.84.3.2甘露醇浓度对栽培烟草原生质体分裂的影响在原生质体的培养过程中，我们探索了不同甘露醇浓度对烟草原生质体分裂状况的影响。实验结果显示，培养5天后观察原生质体的分裂情况，甘露醇0M时(图4.2A)，细胞膨大，细胞不显绿色，碎片较多，细胞无分裂；甘露醇0.7M时（图4.2C），细胞显示绿色，碎片少，但是没有观察到细胞分离；只有在甘露醇为0.5M时（图4.2B），细胞显示绿色，碎片较少，并且观察到若干细胞分裂。表明最佳的甘露醇浓度为0.5M。26 第四章栽培烟草原生质体再生体系的构建图4.2甘露醇浓度对细胞分裂的影响Figure4.2DivisionofprotoplastsindifferentmannitolconcentrationA：0M甘露醇B：0.5M甘露醇C：0.7M甘露醇A:0MmannitolB:0.5MmannitolC:0.7Mmannitol4.3.3栽培烟草原生质体再生体系的构建4将获得的原生质体稀释为1.5*10个每毫升进行培养。使用普通光学显微镜观察，细胞在第4天后开始第一次分裂，形成两个细胞（图4.3A）；8天后进行第二次分裂，形成四个细胞（图4.3B）；12天完成第三次细胞分裂，生成8个细胞（图4.3C）；26天后形成细胞团（图4.3D）。图4.3烟草原生质体的分裂Figure4.2DivisionprocessoftobaccoprotoplastsA：4天后B：8天后C：12天后D：26天后A:4daysaftercultivatedB:8daysaftercultivatedC:12daysaftercultivatedD:26daysaftercultivated27 西南大学硕士学位论文培养45天以后（图4.4A）形成肉眼可见的小愈伤组织；转移至新的培养基上继续生长至90天后（图4.4B）即可形成体积较大的愈伤组织；将较大的愈伤组织单独的转移至MSC培养基继续生长（图4.4C），进一步诱导其长出不定芽；160天后（图4.4D）将形成的不定芽移栽至不含激素的MS培养基中诱导生根；200天后（图4.4E）即可获得完整再生植株。图4.4烟草原生质体诱导愈伤和完整植株的获得Figure4.4CallusformationandregenerationplantsfromtobaccoprotocolsA：45天后B：90天后C：120天后D：160天后E：200天后A:45daysaftercultivatedB:90daysaftercultivatedC:120daysaftercultivatedD:160daysaftercultivatedE:200daysaftercultivated4.4讨论培养基的种类直接影响到原生质体的分裂频率、植板率以及愈伤组织的形成。以往烟草叶肉原生质体培养成功的先例大多是采用NT基本培养基或者KM8P基本培养基。我们在对烟草叶肉原生质培养的过程中首先使用MS基本培养基培养的原生质体，发现细胞分裂频率低并且无法形成肉眼可见的愈伤组织，故而我们使用的ⅢB型固体培养基（将琼脂粉换为低熔点琼脂糖）进行培养，实验证明ⅢB培养基形成的愈伤组织较多、效果较好，这可能是由于低熔点琼脂糖形成的凝胶较于琼脂粉形成的凝胶更温和，利于烟草原生质体的分裂。在烟草原生质体培28 第四章栽培烟草原生质体再生体系的构建养过程中尝试了液体浅层培养法、固体平板培养法和固液双层平板培养法，发现固体平板培养法培养的原生质体更容易观察，并且能够顺利形成愈伤组织，故而选择固体平板培养法作为烟草原生质体培养的基本方法。激素是植物组织培养的关键因素，调节激素水平和配比已成为提高组织分化频率的有效手段，直接使用普通烟草组培过程中诱导不定芽的激素配比即可得到较为理想的结果。另外，所使用的ⅢB固体培养基中的琼脂糖对于实验的影响也十分明显，前期使用普通的琼脂粉发现原生质体分裂较慢且无法形成愈伤组织，而选择低温琼脂糖才得以解决。主要探究了pH和甘露醇浓度对烟草原生质体分裂的影响，发现在pH5.8和0.5M甘露醇条件下，烟草原生质体分裂效果最佳。成功的将原生质体再培养为完整的再生植物，初步构建了栽培烟草原生质体再生体系。29 西南大学硕士学位论文30 第五章原生质体转化初探第五章原生质体转化初探烟草原生质体是一种常用的遗传转化受体。由于成功的构建了红花大金元原生质体再生体系，那么转化原生质体后再培养形成完整植株成为了可能。传统的农杆菌介导转化愈伤组织，从而获得转基因植株周期较长，并且在筛选纯合植株是难度较大。如果直接转化原生质体，再由单个的细胞再培养成为完整的转基因植株，不仅缩短了育种时间，还可能更容易筛选到稳定遗传的纯合株系。本章使用GFP载体转化烟草原生质体，探索不同大小的载体转化原生质体的效果，初步摸索烟草原生质体转化条件。5.1实验材料与试剂仪器5.1.1实验材料红花大金元原生质体由本实验分离纯化。1246-GFP和1258-GFP载体由本实验室张兴坦师兄惠赠。5.1.2主要仪器实验仪器生产厂家实验仪器生产厂家-20℃冰箱海尔高压灭菌锅TOMY智能人工气候箱宁波东南仪器电热恒温水浴锅长风仪器仪表公司电子天平上海奥豪仪器pH酸度计成都方舟超净工作台苏净集团安泰公司低温离心机Beckman0.22μm过滤膜Millipore六孔细胞培养皿北京鼎国倒置荧光显微镜OLYMPUS5.1.3主要试剂实验试剂生产厂家实验试剂生产厂家MES上海生工七水合硫酸镁上海生工磷酸二氢钾成都科龙化工D-甘露醇上海生工蔗糖上海生工牛血清蛋白SigmaPEG4000Sigma氯化钙Sigma31 西南大学硕士学位论文5.1.4主要溶液的配制1、W5溶液MES0.196g氯化钠4.551g氯化钙6.935g氯化钾0.186g加入灭菌水后定容至500mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。2、WI溶液MES0.156g甘露醇18.22g氯化钾0.298g加入灭菌水后定容至200mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。3、MMG溶液MES0.156g甘露醇14.574g氯化镁0.61g加入灭菌水后定容至200mL，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，放置4℃保存。4、PEG转化液PEG40004g甘露醇0.364g氯化钙0.111g配制时应待PEG溶解后（55℃），加入无菌水补足10mL5.2实验方法和步骤5.2.1PEG转化法转化烟草原生质体步骤51、将纯化后的红花大金元原生质体使用MMG溶液重新悬浮，终浓度为2*10个每毫升；2、使用超纯质粒提取试剂盒提取无菌的1246-GFP和1258-GFP载体待用；3、首先向2mL离心管内加入200μL的烟草原生质体，然后加入20μL的载体，最后加入220μL40%PEG溶液，加入的顺序不可颠倒，且加液过程中避免剧烈32 第五章原生质体转化初探震荡，传化时间10至30分钟；4、转化完成后，加入900μLW5溶液终止反应，离心两分钟，除去上清；5、加入1mLWI溶液重悬浮待用；6、5%BSA溶液润洗6孔细胞板，将上述重悬的原生质体溶液注入六孔板内，封口膜密封；7、遮光培养12小时后，观察转化效率。载体转化原生质体效率（%）=（紫外光下激发绿色荧光的细胞数÷白光下完整细胞总数）*100%5.3结果和分析5.3.11246-GFP载体转化烟草原生质体1246-GFP质粒大小约为6kb，转染时长10分钟。转化后培养12小时后检测结果显示（图5.1），四个视野下原生质体状态良好，细胞破碎较少。第1个视野到第4个视野下的转化率分别为59%、62.5%、84.3%和45.5%。其中转化效率最低为45.5%，最高达到84.3%。图5.11246-GFP转化原生质体检测Figure5.1Detectionofprotoplasttransformationefficiencywith1246-GFP5.3.21258-GFP载体转化烟草原生质体1258-GFP质粒大小约为12kb，转染时长30分钟。转化后培养12小时后检测结果显示（图5.2），三个视野下原生质体状态较差，单位视野下细胞数量较少，细胞破碎程度严重。第1个视野到第3个视野下的转化率分别为61.5%、54.5%和42%。其中转化效率最低为42%，最高为61.5%。33 西南大学硕士学位论文图5.21258-GFP转化原生质体检测Figure5.2Detectionofprotoplasttransformationefficiencywith1258-GFP5.4讨论使用PEG工作液共转质粒和原生质体的过程中，发现Sigma公司生产的PEG4000对红花大金元原生质体转化成功率最高。转化过程中，依次向反应容器中加入原生质体、质粒和PEG工作液，对转化效率有一定幅度的提高。可能是由于这种加入方式使三者更好的接触，进而提高转化效率。实验中发现小片段的质粒转化效率高于大片段的质粒，这种情况可能是小片段的质粒更容易进入原生质体中。转化后原生质体活性细胞数量会一定程度上的减少，这是因为PEG本身对细胞是有损害作用的，长时间接触会导致细胞的破碎。在转化过程中，大片段的质粒转化所需的时间也需要相应的延长，否则转化效率极低。然而，延长反应时间则使PEG对原生质体的损伤加大，致使转化后的活细胞数量进一步降低。对转化后细胞进行培养，发现转化后细胞几乎不会分裂。可能是由于转化条件会对细胞造成了不可逆的损伤，尤其是大片段的质粒提取的活性细胞更少。本章初步构建了烟草原生质体转化系统，发现小片段的质粒更加适合用来转化原生质体。34 第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒在我国烟叶种植区广泛的传播，病害大规模爆发时往往对烟叶的产量造成极大的损害。马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒都属于正义链单链病毒，其复制依赖宿主体内的转录翻译元件，那么敲除这些宿主本身的基因则可能使植株获得对这种病毒的抗性，进而降低病毒的传播，从而减少其对农业生产造成的损失。本研究选取栽培烟草中两个抗病毒相关的基因，NtEIF4E和NtTOM3，使用CRISPR/Cas9敲除系统构建敲除载体，并对敲除株系进行了鉴定。6.1实验材料6.1.1植物材料烟草品种红花大金元种子和K326由本实验室保存。6.1.2载体及菌珠pEASY-T5ZeroCloning载体和大肠杆菌Trans5ɑChemicallyCompetentCell购自北京全式金生物技术有限公司；pORE-CRISPR/Cas9敲除载体由本实验室保存；根瘤农杆菌LBA4404由本实验室保存。6.1.3主要仪器设备实验仪器生产厂家实验仪器生产厂家PCR仪Eppendorf台式离心机Eppendorf微量加样器Eppendorf涡旋混合仪Eppendorf超低温冰箱SANYO制冰机SANYONanoDrop2000cThermo高压灭菌锅TOMYDYY-6C型电泳槽北京六一仪器厂紫外凝胶成像系统BIO-RAD超纯水整流器Millipore电热恒温水浴锅长风仪器仪表公司超净工作台苏州安泰空气技术TCYQDDH型摇床太仓市实验设备厂电子天平上海奥豪仪器微波炉中国美的集团恒温震荡培养箱上海悦丰仪器仪表智能人工气候箱宁波东南仪器0.22μm过滤膜Millipore35 西南大学硕士学位论文6.1.4主要试剂实验试剂生产厂家实验试剂生产厂家胰蛋白胨Oxid牛肉膏Oxid酵母粉OxidRNA提取试剂盒北京全式金TransTaqDNAPolymeraseHighFidelity北京全式金反转录试剂盒北京全式金胶回收试剂盒北京全式金质粒提取试剂盒北京全式金GoTaqGreenMasterMixPromegaDNAMarkerPromega氯化钠成都科龙化工无水乙醇成都科龙化工冰乙酸成都科龙化工Na2EDTA·2H2O成都科龙化工β-巯基乙醇上海生工抗生素上海生工Oligo（dT）上海生工琼脂糖BBI利福平（Rif）上海生工Tris碱BBI链霉素（Str）上海生工基因组提取试剂盒北京全式金羧苄青霉素（Cb）上海生工MS基本培养基PHytoTechnologyLaboratories蔗糖北京鼎国6.1.5主要试剂及缓冲液配方1、MS液体培养基MS培养基4.33g蔗糖30g加入灭菌水后定容至1L，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。2、MS固体培养基MS4.33g蔗糖30g琼脂粉8.4g加入灭菌水后定容至1L，调节pH至5.8，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。待冷却至40℃左右，加入相应抗生素，摇匀，倒平板，待冷却后，5℃保存备用（如需加入激素，则按一定比例加入之后调节pH）。3、YEB液体培养基牛肉膏5g蛋白胨5g36 第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定酵母粉1g蔗糖5g硫酸镁0.5g加去离子水溶解定容至1L，121℃高压灭菌20min，室温冷却，加入相应抗生素，4℃保存备用。4、YEB固体培养基牛肉膏5g蛋白胨5g酵母粉1g蔗糖5g硫酸镁0.5g琼脂粉15g加去离子水溶解定容至1L，121℃高压灭菌20min，待冷却至40℃左右，加入相应抗生素，摇匀，倒平板，冷却凝固后，4℃保存备用。5、20mg/mL利福平（Rif）利福平0.2g甲醇10mL溶解后，-20℃保存备用。6、50mg/mL链霉素（Str）链霉素1g溶于20mL去离子水中，溶解后，过0.22μm滤膜过滤，分装-20℃保存备用。7、250mg/mL羧苄青霉素（Cb）羧苄青霉素2.5g溶于10mL去离子水，过0.22μm滤膜过滤，分装-20℃保存备用。6.2实验方法与步骤6.2.1CRISPR/Cas9敲除载体构建1、敲除靶位点设计NCBI搜索得到的烟草NtTOM3和NtEIF4E基因，分别比对烟草基因组数据库，得到红花大金元抗TMV病毒的NtTOM3基因序列和K326中抗PVY病毒的NtEIF4E基因预测序列，利用在线软件ZiFiTTargeterVersion5.2（http://zifit.partners.org/ZiFiT/Introduction.aspx）自动生成候选靶位点。靶位点设计原则如下：①靶位点主要是位于NGG（前间区邻近基序，PAM）三个碱基的前37 西南大学硕士学位论文20个碱基；②靶位点一般位于编码区的前段。2、敲除载体构建根据设计的靶位点序列合成敲除位点引物Target-F、Target-R，并添加BsaI的酶切位点，其中合成正向靶位点引物时需要在5’端添加GATT四个碱基，在反向引物5’端加上CAAA碱基。敲除引物通过退火PCR步骤，获得含有BsaI酶切位点的双链，然后将双链与经过BsaI酶切的pORE-CRISPR/Cas9线性载体进行连接，转化，PCR检测等步骤。具体步骤如下：（1）单链DNA合成双链DNA：5×AnnealingBufferforDNAOligos5μL，上下游引物各5μL（50μmol/μL），Nuclease-freewater补至20μL。PCR反应程序：95℃5min，每8s下降0.1℃，直至25℃；5℃保存；（2）pORE-CRISPR/Cas9载体酶切：pORE-CRISPR/Cas9载体10μL，BsaI1μL，Buffer5μL，加水补足50μL。37℃酶切1小时，产物回收试剂盒回收酶切质粒；（3）载体与靶位点的连接：T4连接酶Buffer2μL，载体2μL，T4连接酶1μL，加水补足20μL。25℃连接10分钟。6.2.2农杆菌化学感受的制备1、用接种环接种LBA4404永久菌于YEB固体培养基（利福平终浓度50ng/μL，链霉素终浓度50ng/μL）上，置于28℃，倒置培养2-3天；2、挑取固体培养基上生长的农杆菌LBA4404单克隆，接种于5mLYEB液体培养基（利福平终浓度50ng/μL，链霉素终浓度50ng/μL），28℃，200rpm震荡黑暗过夜培养；3、接种1mL菌液于50mLYEB液体培养基（利福平终浓度50ng/μL，链霉素终浓度100ng/μL），28℃，200rpm震荡黑暗过夜培养至OD600在0.5-0.6之间；4、在超净工作台中将菌体转移至50mL的离心管，冰浴30min，5℃、3500rpm离心15min，弃上清，收集菌体；5、加入10mL20mmol/L预冷的CaCl2轻轻悬浮菌体，冰上静置20min，5℃、3500rpm离心15min，弃上清，收集菌体；6、加入5mL含有20%甘油的20mmol/L预冷的CaCl2轻轻悬浮菌体，冰上静置10min；7、将悬浮的菌体200μL/管分装于无菌离心管中，入液氮速冻1min，-80℃永久保存。38 第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定6.2.3重组表达载体转化农杆菌LBA44041、吸取1μg构建的敲除载体质粒，加入到200μL农杆菌感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min，入液氮速冻1min；2、然后37℃热激5min，冰上静置2min；3、加入800μLYEB液体培养基，28℃，200rpm黑暗震荡培养5-6h；4、3000rpm离心1min，弃部分上清液，混匀剩下菌液，涂板于含有利福平、链霉素、卡那霉素的YEB固体培养基（利福平终浓度50ng/μL，链霉素终浓度50ng/μL，卡那霉素浓度50ng/μL）上，28℃，倒置黑暗培养2-3天。6.2.4农杆菌阳性转化子筛选利用U26-F、Target-R这对引物对构建的敲除载体进行菌液PCR检测，将检测阳性的菌液送华大基因测序。菌液2μL，引物各1μL，Taq酶7.5μL，加水补足15μL。PCR反应程序：94℃4min，94℃30s，56℃30s，72℃2min，28个循环，72℃保温10min。引物详见表6.1。6.2.5烟草叶片遗传转化1、农杆菌准备将测序成功的敲除阳性农杆菌转化菌按照1：50的比例接种于50mL的YEB液体培养基（利福平、链霉素、卡那霉素的终浓度均为50mg/L）中，28℃、220rpm、黑暗震荡培养25-36小时，待菌液OD值达到0.5-0.6，使用50mL无菌离心管收集菌液，3500rpm，5℃离心15min，弃上清，用30mLMS液体培养液（含有终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮）重悬菌体，28℃静置1-2小时。2、叶盘预培养以生长两个月红花大金元和K326叶片组织为实验材料，用直径约0.5cm的打孔器获取植物叶盘，于预培养培养基MS1（MS+0.1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）上，28℃黑暗培养3天。3、农杆菌浸染将预培养3天的烟草叶盘侵染于重悬的农杆菌液体中，充分浸染10分钟，然后将叶盘置于灭菌的滤纸上，吸干表面的菌液，将叶盘置于MS1（MS+0.1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）培养基上，28℃黑暗培养3天。4、抗性筛选将共培养3天的烟草叶盘，用含有500mg/L的羧苄青霉素洗涤3-5次，再用滤纸吸干叶盘表面的水，将叶盘置于筛选培养基（MS+0.1mg/LNAA+1.0mg/L39 西南大学硕士学位论文6-BA+250mg/L羧苄青霉素+20mg/L卡那霉素）上，28℃光照16小时，黑暗8小时筛选培养，10-15天更换一次培养基。5、生根培养待筛选培养的愈伤组织长出小芽1厘米左右时，将其剪下，转移至含抗生素的生根培养基MS上培养，待小芽生根并根系发育完全之后，洗去根部培养基，将植株置于自来水炼苗3-5天，直至长出新的根后，将植株移至土壤中，温室中生长。6.2.6转基因植株的鉴定将获得转基因植株叶片剪下，使用植物DNA提取试剂盒提取DNA，根据靶位点设计相关引物进行检测。阳性结果送至华大测序。检测程序与前面一致。引物详见表6.1。表6.1本研究设计的引物Tab6.1Primersinvolvedinthisarticle引物名称序列TOM3-FCCCCTGAATAACACCATCACATOM3-RCGATACATGTGTGTATGCGTGEIF4E-F1ATGGCAGAGGAATCTGAGAAAEIF4E-R1ACAACCAAGAACACAACAACTEIF4E-F2AAATAAAGAGGTTTGGCTCTCEIF4E-R2CGCCCTAACATTAAGAACTGAEIF4E-F3GAAGTGGACAATGAGCTTTAGEIF4E-R3GAAGGGTATCACTCTTTTTGTEIF4E-F4ACACGGTATGCTAAAGATATTEIF4E-R4AAATAAAAAGTACTCCCTCCAU26-FTTAGGTTTACCCGCCAATAU26-RGAGTAGACAAGTGTGTCGTGCT6.3结果和分析6.3.1栽培烟草K326NtEIF4E敲除载体靶位点设计和检测根据NtEIF4E基因组序列一共设计了四个特异的靶位点（表6.2），将其连接到pORE-CRISPR/Cas9敲除载体上，检测发现阳性克隆（图6.1），选择阳性载体送至华大测序。40 第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定表6.2NtEIF4E四个靶位点Tab6.2TargetsforNtEIF4ENo.NtEIF4Etargettarget-1GAAGTAGAAGTAGCCGACGAtarget-2GCATAAAATTGAGCCGAAGTtarget-3GCAGTAGTTAGTGTCCGTGCtarget-4GATCATGGAGATGAAATTTG图6.1NtEIF4E敲除载体的检测Figure6.1DetectionofNtEIF4Etargets6.3.2栽培烟草K326NtEIF4E敲除载体T0代靶位点突变检测获得T0代幼苗，使用植物DNA提取试剂盒提取总DNA，设计引物检测靶位点的突变形式。T0代植株中，其中3个靶位点检测到了突变，分别为terget1，terget2，terget3（图6.2）。靶位点1主要有三种突变形式：突变一个碱基、增加一个碱基和突变一个碱基的同时还增加一个碱基。靶位点1中100个测序结果显示有93个反应检测到了突变。靶位点2仅突变一个碱基，86个测序中发现有5个突变。靶位点3主要的突变形式为删除了一个碱基。41 西南大学硕士学位论文图6.2NtEIF4E敲除突变检测Figure6.2NtEIF4EeditingintobaccoplantsusingtheCRISPR/Cas9system.6.3.3栽培烟草红花大金元NtTOM3敲除载体靶位点设计和构建根据NtTOM3基因组序列一共设计了五个特异的靶位点（表6.3），将其连接到pORE-CRISPR/Cas9敲除载体上，检测发现阳性克隆（图6.3），选择阳性载体送至华大测序。表6.3NtTOM3设计的靶位点Tab6.3TargetsforNtTOM3No.NtTOM3targettarget-1GGACGGGCTGAGATGGTGGTtarget-2GATGGTGGTAGGCCCGTCGGtarget-3GGCGTACCACCTGAAGAATGtarget-4GAATGAGGCAATTAGTTGGTtarget-5GGCAATTAGTTGGTGGGAAG42 第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定图6.3NtTOM3敲除载体的检测Figure6.3DetectionofNtTOM3targets6.3.4栽培烟草红花大金元NtTOM3敲除载体T1代靶位点突变检测获得的T0代收种后，将种子消毒后培育无菌苗。T1代幼苗使用植物DNA提取试剂盒提取总DNA，设计引物检测靶位点的突变形式。T1代幼苗中，仅检测到一个靶位点突变，为target5（图6.4）。靶位点5突变的形式有四种：删除一个碱基、删除两个碱基、删除三个碱基和删除一个碱基的同时还突变一个碱基。图6.4NtTOM3敲除突变检测Figure6.4NtTOM3editingintobaccoplantsusingtheCRISPR/Cas9system.43 西南大学硕士学位论文6.4讨论成功的构建了红花大金元抗烟草花叶病毒相关基因NtTOM3和K326抗马铃薯Y病毒相关基因NtEIF4E的敲除载体，并检测到了阳性。通过农杆菌介导的叶盘转染法分别将两种敲除载体转入红花大金元和K326叶盘中，最终都获得了转基因植株。结果显示，NtEIF4E敲除植株中靶位点1和靶位点3检测到的主要突变形式为突变一个碱基，靶位点3主要为删除一个碱基。通常来说，使用CRISPR/Cas9敲除系统得到的转基因植株其突变形式主要为删除或者增加一个或多个碱基，造成移码突变，致使靶基因不能正常翻译，进而无法行使功能。因此认为靶位点1和靶位点2的突变形式不可靠，需要进一步研究其后代是否具有抗性。而靶位点删除一个碱基的形式比较常见，通常认为其为可靠突变。敲除NtTOM3仅检测到了一个靶位点突变，每株转基因后代提取DNA后只送了10个测序，但是有效测序结果显示均有靶位点删除的情况，并且其突变形式多样，删除1至3个碱基。由于NtTOM3的靶位点突变检测是在T1代检测的，依然检测到突变说明敲除效率比较高。TOM3敲除品系目前已收获了T2代种子，EIF4E敲除品系收获了T1代种子，为后续的抗病研究奠定了基础，为培育抗性烟草品种提供了基础材料。44 第七章综合与结论第七章综合与结论本研究初步构建了栽培烟草红花大金元分离和纯化系统，并在获得高质量、高产量的烟草原生质体之上，成功构建了红花大金元原生质体再生体系。另一方面，选择栽培烟草中两个抗病毒相关基因NtTOM3和NtEIF4E，构建了基于CRISPR/Cas9系统的敲除载体，并且获得了敲除植株。主要研究结果如下：1、栽培烟草红花大金元原生质体的分离和纯化系统构建成功分离和纯化出数量多、活性高的烟草原生质体，初步构建了红花大金元品系烟草原生质体分离和纯化系统。在烟草叶片处理过程中，发现去除叶尖和主叶脉将获得细胞生长周期大致相同的叶肉细胞，避免叶尖分生组织细胞分裂旺盛以及叶脉细胞对实验造成的影响。通常选择5至6叶真叶期的无菌幼苗，这个时期的细胞分裂活性较高，而且纯化结果显示细胞碎片较少。为了提高酶解效率，我们将叶片剪切为1至2厘米的丝状物，使叶肉细胞与酶液有更大的接触面积。酶解过程在黑暗环境下进行，震荡过程中应当调至较低转速，既保证了酶液与叶肉组织的充分接触，也不会使细胞破碎。原生质体分离的时间最好控制在12小时内，过分酶解会导致细胞碎片增多。原生质体在转移的时候最好使用巴斯德吸管，尽量避免使用枪头转移，最大限度的保持细胞完整性。离心时尽量避免震荡，由于离心力较低，原生质体贴壁不牢靠。原生质体最好现提现用，否则活性会随着时间推移而下降。2、栽培烟草原生质体再生体系的构建成功的构建了红花大金元原生质体再生体系。主要探究了pH值和甘露醇浓度对烟草原生质体分裂的影响，发现在pH5.8和0.5M甘露醇条件下，烟草原生质体分裂效果最佳。影响烟草原生质体培养的因素很多：培养基的种类、培养方法的选择、激素的配比等。培养基的种类直接影响原生质体的分裂和愈伤组织的形成。发现使用ⅢB型固体培养基能够促进原生质体的分裂，更容易形成愈伤组织。在烟草原生质体培养过程中尝试了液体浅层培养法、固体平板培养法和固液双层平板培养法，发现固体平板培养法效果最佳。激素是植物组织培养的关键因素，调节激素水平和配比已成为提高组织分化频率的有效手段，幸运的是，我们直接使用烟草组培过程中诱导不定芽的激素配比即得到了理想结果。细胞分裂过程中，培养基若是使用琼脂粉为凝固剂，不能使原生质体分裂，使用低凝琼脂糖时能够有效的促进细胞的分裂和愈伤组织的形成。45 西南大学硕士学位论文3、原生质体转化初探使用PEG介导的转化方法转化烟草原生质体。发现Sigma公司生产的PEG4000最适合用于红花大金元的转化。转化过程中依次加入原生质体、质粒和PEG工作液，对转化效率有一定幅度的提高。实验中发现小片段的质粒转化效率高于大片段的质粒，转化所需时间也低于大片段质粒。PEG本身对细胞有损害作用，长时间接触会导致细胞的破碎。因此使用PEG转化原生质体时，小片段的质粒具有较大优势。对转化后细胞进行培养，发现转化后细胞几乎不会分裂。可能是由于转化条件会对细胞造成了不可逆的损伤，尤其是大片段质粒由于转染时间更长，转化后活性细胞更少。4、烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定成功的构建了红花大金元抗烟草花叶病毒相关基因NtTOM3和K326抗马铃薯Y病毒相关基因NtEIF4E的敲除载体，并检测到了阳性，并最终都获得了转基因植株。NtEIF4E敲除植株中靶位点1和靶位点3检测到的主要突变形式为突变一个碱基，靶位点3主要为删除一个碱基。通常来说，使用CRISPR/Cas9敲除系统得到的转基因植株其突变形式主要为删除或者增加一个或多个碱基，造成移码突变，致使靶基因不能正常翻译，进而无法行使功能。因此认为靶位点1和靶位点2的突变形式不可靠，需要进一步研究其后代是否具有抗性。而靶位点删除一个碱基的形式比较常见，通常认为其为可靠突变。敲除NtTOM3检测的数量较低，并且是在T1代植株中检测，然而其突变形式更为可靠，删除了多个碱基，说明了烟草敲除效率比较高。TOM3敲除品系目前已收获了T2代种子，EIF4E敲除品系收获了T1代种子，为后续的抗病研究奠定了基础，为培育抗性烟草品种提供了基础材料。46 展望展望烟草是一种重要的模式植物和经济作物。烟草原生质体遗传表达系统作为研究基因网络调控、基因瞬时表达和信号通路的一种重要工具广泛应用，也是在细胞水平上研究植物分子机制和病毒感染的理想实验材料。随着栽培烟草红花大金元品系原生质体分离和再生体系的构建成功，为通过原生质体转化外源遗传物质，进一步培养为转基因再生植株提供了基础。烟草抗病相关基因的研究有助于了解植物对病虫害的防御机制，并且减少病虫害对烟草产量造成的损失。马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒是危害国内烟草种植业的优势病毒，对烟草的产量造成严重的经济损失。以往研究发现下调或者干扰NtTOM3和NtEIF4E基因，可以有效的抑制TMV或者PVY的感染和传播。那么我们的敲除株系是否具有PVY或者TMV抗性，还尚待进一步的研究。47 西南大学硕士学位论文48 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西南大学硕士学位论文56 致谢致谢自从二零一三年以来，三年的研究生生活进入了尾声。困惑、迷惘、艰辛、领悟、欣喜、实验、生活，几个极其简单的词汇，完整地表述了研究生这三年的状态，在这最终告别的时刻是浓浓的不舍。回首这几年经历过的众多事情，细数零落的脚步，勤勤恳恳，闪现在脑中的画面中是可亲可敬的导师、相谈甚欢的同学、实验桌面的瓶瓶罐罐、科技楼与蚕学宫之间匆匆的脚步，无数擦肩而过的低头浅笑。在这里，我开阔了视野，锻炼了科研能力，更加的成熟。从此以后，生活也许会翻开未知而赞新的篇章，但这段弥足珍贵的回忆将陪伴我度过接下来的时光。值此毕业之际，向恩师亲友表示衷心感谢。衷心感谢夏庆友教授和王根洪副教授。夏老师严谨治学的态度，开放敏锐的思维，宽厚平和的心态给我们树立了学习的榜样，同时似乎也看到了一位幽默学者背后洒下的汗水、半夜仍开启的灯盏以及世界各地不及一观而匆匆走过的风景。特别感谢恩师王根洪副教授，对我科研和生活上的指导和关心。我们有过如孩童般不听话的时候，有过小小的叛逆，有过懒惰懈怠，有过迷惘失意，也有过小小的得意，但是王老师始终亦师亦友地给予我们包容和鼓励。今后大概再不会遇到这样好的老师，但是这样的一段师生情将伴我终生。在这里请允许我对您们表达最真诚的的谢意和深切的祝福！衷心感谢赵萍老师、林英老师、何华伟老师、侯勇老师、刘春老师、查幸福老师、张毅老师、王菲老师、程道军老师、程廷才老师、刘仕平老师、李志清老师、郭鹏超老师等各位老师对学生实验和论文的指导和帮助！正式进入实验室伊始，张兴坦师兄就成为了我的指路明灯，在课题研究上给与我思路，教与我严谨的实验态度，生活中更是于无形中教会了我很多做人做事的道理，这些东西都将使我一生受益并铭记于心。高军平师兄开阔的学术视野、精准的逻辑能力和总结能力也使我受益良多，在实验走入困境时始终能让我找到正确的方向。感谢我们小组的张兴坦、谢小东、高军平，刘纹杉、吴玉乾、牛维环、闫亚飞、谢敏敏、王峰、杨玲、王佩、吴向伟等师兄师姐的帮助，你们在实验中给我们做出了很好的榜样，并且耐心地教授我们实验技巧。感谢罗培、陈晓乐、曹妮、张晓颍、陈燕飞等师弟师妹的热心帮助，感谢烟草小组所有成员在生活和实验中所给于我的鼓励和关心，即使我们终将散落各方，不能时时相伴，但始终有一线关联让我们彼此牵连。57 西南大学硕士学位论文感谢程庭才老师和刘春老师的无私帮助，感谢彭章川、胡文波、周春燕、高春燕、林平等师兄师姐，聂梦云、易小慧、秦道远等同学在实验上的帮助，感谢、位曙光、董世峰、张建铎、陆卫、赵朋、王日远、张权、刘伟强、郑人文等同窗好友的陪伴，最后感谢宋倩茹同学三年的陪伴，这三年承载着欢笑和泪水的友谊将是我值得铭记一生的财富！最后，感谢西南大学，三年时光，不知不觉间我在这里度过了人生不长不短的充满各种情绪的三年，几乎满足了我对于大学的想象。感谢所有伴随我成长的人们，你们在我人生的不同时段出现，但们的支持和鼓励，我将铭记于心。58 在读期间发表论文及参研课题在读期间发表论文及参研课题发表论文1.熊海军，张兴坦，吴向伟，谢小东，聂梦云，王根洪，夏庆友.栽培烟草抗逆相关WRKY转录因子的表达特征分析.中国烟草学报.2.熊海军，张兴坦，吴向伟，高军平，谢小东，王根洪，夏庆友.烟草NtMAPK基因克隆及激素诱导条件下的表达分析.烟草科技3.吴向伟，王根洪，聂梦云，熊海军，高军平，谢小东，夏庆友.烟草周期蛋白依赖性激酶基因NtCDK8的克隆及生物信息学分析.烟草科技参研课题中国烟草总公司烟草基因组计划重大专项项目“烟草基因组编辑技术的建立与应用”，[110201301011A(JY-11A)]云南省烟草公司科技计划项目“烟草规模化基因功能鉴定及应用”，(2013YN08)59