大豆原生质体融合与植株再生的方法研究-论文.pdf

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1、学21术固．cadermct．1eldn◎■doi：10．3969／j．issn．1000-8071．2012．02．012大豆原生质体融合与植株再生的方法研究王继安杨明亮黄珊珊杨继学(东北农业大学大豆研究所一教育部大豆生物学重点实验室哈尔滨150030)大豆是重要的粮食作物和油料作物，常规的育种的组成为：CaC12·2H2O10mol／L，KH2PO40．2mmol／L，方法越来越受到基因狭窄的限制，使得单产水平提高缓KN031．0mmol／L，M。gS04。7H201．0mmol／L，CuSO4。5H2O慢。而转基因

2、育种虽然可以打破物种的界限，有目的导0．1mol／L，KI10mol／L(Srinivasaneta1．，1986)将原人某个基因育成新品种，但对多基因控制的性状的改进生质体混合液用双层滤网(100~tm和38．51Xm)去掉没有降难度很大，而且转基因安全性方面受到人们的关注。我解的细胞及组织，收集滤液，~13mLCPW9mol／L[附加了们利用植物间的原生质体融合克服远缘杂交，为大豆育9％(w／v)甘露醇的CPW溶液，pH5．81。80×g离L,5min，弃种另辟途径，既打破了物种界限又确保安全性。通过原上清，再将沉淀

3、的原生质体与1．5mL的CPW9mol／L混合，生质体的不对称融合，可保持大豆的有利基因，又可引然后轻轻加到3mL的CPW25S溶液【附加了25％(w／v)蔗糖入其他作物和植物的部分有利性状，为大幅度提高大豆的CPW溶液，pH5．81顶部，形成一个界面，在100×下单产提供新的育种途径和方法，从而育成突出优良的大离心6—8min，原生质体会在蔗糖溶液和甘露醇溶液之间豆新品种。形成一条原生质体带。这时用吸管小心的将原生质体吸出，分别用CPW9mol／L溶液和培养基离心，然后在显微1植物材料镜下检查原生质体纯化情况并进行活性

4、检测，再用培养基悬浮进行培养。由诱导野生大~_{Glyeinesoja)和普通大~fGlyeinemax)纯化好的原生质体的活性检测是通过在荧光显微镜胚性愈伤组织，分别建立各融合亲本的胚性细胞悬浮下观察FDAfFluoresceinDiacetate)染色的原生质体。取系。以普通大豆和野生大豆的胚性细胞悬浮系和体细胞0．5mL悬浮于液体培养基的原生质体到1．5mL离心管，添幼胚为材料分离原生质体。JJIFDA(2mg／mL，用丙酮配制)溶液到离心管使其终浓度为0．01％(w／v)。混合液轻轻混合后在室温条件下静止2原生质

5、体分离、纯化和培养5min，取少许于载玻片成薄层，然后在荧光显微镜下检测，发出绿色或黄绿色荧光的原生质体具有活性，不能约2g新鲜的颗粒状胚性愈伤组织转移~1]40mLMS液发出荧光的是死细胞，统计原生质体的活力(在同一个体培养基的100mL=角瓶中，在回旋摇床120r／min上暗视野里在暗场里发荧光的原生质体数占明场里所有原生培养。每隔7d，用小口吸管吸取细小悬浮颗粒，弃除大质体数的百分率)。颗粒愈伤，并加入新鲜培养液继代，这样连续继代培养纯化好活性高的原生质体悬浮于KM8P培养基(Kao3060d，得到生长期均匀一致的

6、细小颗粒悬浮物。吸取andMichayluk，1975)，不同的渗透压调节剂和激素组合1g左右继代23d的胚性细胞悬浮物置于直径为60mm培养(表1)，设置不同的培养密度(0．5X10610．0X106]mL)来皿中，并将调整好浓度的酶液添加2～3mL于培养皿中，筛选大豆原生质体培养的最适密度。培养方法采用液体然后用Parafilm封口在28±1℃遮光的黑暗条件下，放浅层培养、固液双层培养和琼脂糖包埋培养。液体浅置在回旋摇床上40r／min酶解。酶解时间为14～16h。酶液层培养操作方法是把4mL悬浮于培养基的原生质体滴

7、加的组成为1．5％的纤维素酶R一10(YakuhHonshaCo．Ltd．，到直径60mm的培养皿中，Parafilm封口，在28％黑暗培Tokyo，Japan)、2％的半纤维素酶(Sigma，St．Louis，US)养。20d后，添加新鲜的渗透压和激素减半的KM8P液和1．5％果胶酶Serva，Heidelberg，Germany)或者l％的离析体培养基于培养皿中，以稀释再生细胞团的密度和降低酶R—lO(YakuhHonshaCo．Ltd．，Tokyo，Japan)溶于CPW溶渗透压促进细胞分裂和细胞团的形成。双层培养

8、是先液，附~13mmol／LMES，9％(w／v)甘露醇，pH调整到5．6，将5mLMSB固体培养基融化后在培养皿里铺成薄层，固用孔径为0．22m的微孔滤膜进行抽滤灭菌。CPW溶液化后将4mL悬浮于液体培养基中的原生质体添加到培2012．2#．~tttM@◎同处理的原生质体植板率进行统计。以对照能正常分裂，养基中培养