枣疯病发生过程中差异表达NAC转录因子筛选及功能初步鉴定

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河南农业大学专业硕士学位论文题目枣疯病发生过程中差异表达ＮＡＣ转录因子筛选及功能初步鉴定学位申请人姓名顾理媛导师姓名李继东专业学位类别硕士领域林业研究方向经济林良种选育与栽培中国郑州２０１８年６月 分类号密级河南农业大学专业硕士学位论文论文题目：枣疯病发生过程中差异表达ＮＡＣ转录因子筛选及功能初步鉴定英文题目：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄｊｕｊｕｂｅＮＡＣｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｄｕｒｉｎｇ＾ｊｕｊｕｂｅｗｉｔｃｈｅｓｂｒｏｏｍａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｃｅｓｓｐｐ学位申请人：顾理緩导师：李继东：硕士学位类别领域：ｆｔｉｋ研究方向：经济林良种选育与栽培论文提交学位授予日期：２０１８年６月日期：２０１８年７月 河南农业学学位论文独创性声明、使用授权及识产归属承诺书＋￥ｙ学位论枣疯病发生过程中差异表达ＮＡＣ转录因子学位硕士｜｜｜文题目筛选及功能步鉴ｆｆ学生Ｉ＃＃Ｌ导师？顾理媛林业李继东姓名专业姓名学位论文如需保密，解密时间年月日是否保密独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得研宄成果，除了文中特别加以，标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包括进为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此行了审定。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研特此声明。．．究生签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日＂－＿■学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业一大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则，承担相注应的法律责任。：保密学位论文在解密后适用于本授权书。研究生签名导师签学院领导签名：日期：年月日日期：年月日日期：年月日 致谢六月，总是阳光灿烂。六月，总要曲终人散。六月，我们拒绝伤感。花儿谢了芬芳，迎来硕果飘香。毕业带来别离，我们走向辉煌。在论文完稿之际，谨对在本论文的撰写过程中，给予我帮忙的导师、同学们和亲爱的家人，表示深深的感谢!首先，也是最主要感谢的是李继东老师。在整个过程中他给了我很大的帮忙，在研究生的两年时间里，李老师给予了我很多实验上及生活上的的帮助。在论文提纲制定时，我的思路不是很清晰，经过老师的帮忙，让我具体写作时思路顿时清晰。在完成初稿后，老师认真查看了我的文章，指出了我存在的很多问题。在此十分感谢李老师的细心指导，才能让我顺利完成毕业论文。特别感谢课题组冯建灿教授、郑先波教授、叶霞博士、谭彬博士、王伟博士、程均博士和李志谦博士，在我研究生学习期间，对我在学习上的指导以及在试验设计和操作过程中给予的宝贵意见，在此向课题组的各位老师以及林学院各位老师致以衷心的感谢和诚挚的祝福。其次诚挚感谢师兄（姐）连晓东、王会鱼、陈鹏、蒋亚君、付冰、张燕征、李敏、刘蒙蒙、邓丽、刘煜、郝彭博、李明、等在学习、生活和科研中对我的指导和帮助；感谢同窗好友张梦洋、王婷、付濛濛、陈谭星、余银梅等对我的支持和鼓励；感谢师妹葛宏、张蒙蒙等以及实习生陈立川对我试验过程中的无私帮助。特别感谢一直关心、支持我的父母和家人，感谢他们对我的理解和鼓励。最后，再次向所有关心和帮助过我的老师、同学、朋友和家人以及参与论文审阅和答辩工作的各位老师表达我最诚挚的谢意！iii 目录缩略词表Abbreviation.......................................................................................................................vi摘要....................................................................................................................................................vii1文献综述....................................................................................................................................１1.1枣疯病概述....................................................................................................................１1.1.1枣疯病的主要症状...............................................................................................１1.1.2枣疯病的致病机理...............................................................................................１1.1.3枣疯病的防治.......................................................................................................２1.2NAC转录因子家族的硏究进展...................................................................................２1.2.1NAC转录因子的特征...........................................................................................２1.2.2NAC转录因子的作用与调控...............................................................................３2枣NAC转录因子的鉴定和生物信息学分析..........................................................................６2.1材料与方法....................................................................................................................６2.1.1枣NAC转录因子家族成员鉴定.........................................................................６2.1.2枣NAC转录因子染色体定位.............................................................................６2.1.3枣NAC蛋白质系统发生分析.............................................................................６2.1.4保守基序鉴定和保守序列分析...........................................................................７2.2结果与分析....................................................................................................................７2.2.1枣全基因组NAC转录因子的鉴定.....................................................................７2.2.2ZjNAC的染色体定位分析....................................................................................９2.2.3枣NAC蛋白质基序分析.................................................................................１０2.2.4枣NAC蛋白结构域氨基酸序列多重比对.....................................................１１2.2.5枣NAC蛋白质系统进化分析.........................................................................１２2.3小结与讨论................................................................................................................１３3枣疯病转录因子的差异表达................................................................................................１５3.1材料与方法................................................................................................................１５3.1.1植物材料...........................................................................................................１５3.1.2方法...................................................................................................................１５3.2结果与分析................................................................................................................１９3.2.1枣NAC转录因子基因在植原体侵染过程中的差异表达分析.....................１９3.2.26个时期荧光定量PCR分析............................................................................２０3.2.3时空动态表达分析...........................................................................................２４3.3小结与讨论................................................................................................................２８4ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因转化烟草....................................................................３１4.1材料与方法................................................................................................................３１iv 4.1.1材料...................................................................................................................３１4.1.2方法...................................................................................................................３２4.2结果与分析................................................................................................................３３4.2.1表达载体及转化农杆菌鉴定...........................................................................３３4.2.2烟草遗传转化...................................................................................................３５4.2.3PCR检测...........................................................................................................３５4.3小结与讨论................................................................................................................３６5ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因的拟南芥转化............................................................３９5.1材料与方法................................................................................................................３９5.1.1材料...................................................................................................................３９5.1.2方法...................................................................................................................４０5.2结果与分析................................................................................................................４２5.2.1拟南芥遗传转化和PCR检测..........................................................................４２5.2.2CAT，SOD酶活性测定...................................................................................４４5.3小结与讨论................................................................................................................４６6结论与展望............................................................................................................................４９参考文献........................................................................................................................................５０v 缩略词表Abbreviation英文缩写英文全称中文全称NACNAM/ATAF/CUCNAC转录因子6BA6-Benzylaminopurine6-苄氨基腺嘌呤ABAabscisicacid脱落酸CATCatalase过氧化氢酶CTABHexadecyltrimethylammoniumBromid十六烷基三甲基溴化铵JWBJujubewitches’broom枣疯病MDAmalondialdehyde丙二醇MeJAMethylJasmonate茉莉酸甲酯NAA1-naphthylaceticacid萘乙酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PODPeroxidase过氧化物酶RT-PCRreversetranscriptionPCR反转录PCRSAsalicylicacid水杨酸SODSuperoxideDismutase超氧化物歧化酶vi 摘要枣（ZiziphusjujubaMill.）是鼠李科（Rhamnaceae）植物，是我国第一大干果树种。枣树的栽培过程中常伴随着病虫害的发生，其中最为严重的是植原体侵染引起的枣疯病，堪称枣树的癌症。为研究与发病相关的基因，本文进行了枣NAC转录因子家族的生物信息学分析，并通过对感病后不同时期健康和发表枣苗的转录组分析和RT-PCR检测，筛选出了枣疯病发生过程中差异表达的3个NAC基因，通过转化拟南芥和烟草，初步验证了其基因功能。论文主要结论如下：(1)从枣基因组中鉴定出了84个NAC转录因子，对其进行了生物信息学分析，结果表明84个枣NAC转录因子都含有保守NAM结构域，其中62个不均匀地分布在枣的12条染色体上，其余22个未能定位到染色体上，根据枣NAC蛋白的系统进化树、保守序列分析以及保守基序分析，将84个NAC转录因子分成了6组。(2)对植原体侵染后6个时期的感病枣苗和健康对照进行转录组分析，检测到了36个NAC转录因子表达，根据表达动态变化将其分为6组，除了第五组的2个基因，其余34个基因在发病中后期的病苗中均显著上调表达，挑选了6个NAC基因进行RT-PCR验证，表达变化趋势与转录组分析相同。(3)对植原体侵染后枣NAC转录因子表达时空动态进行了分析，利用RT-PCR测定了4个时期感病枣苗和健康对照韧皮部和叶片的6个NAC转录因子表达动态，筛选出ZjNAC3、ZjNAC54和ZjNAC73等3个在发病中后期在韧皮部显著上调表达的NAC转录因子。(4)构建了ZjNAC3、ZjNAC54和ZjNAC73等3个基因的植物表达载体，通过农杆菌介导转化拟南芥和烟草，获得了拟南芥转化植株和烟草抗性芽。(5)用100mMH2O2分别处理转基因拟南芥叶片和对照，结果显示ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73过表达的转基因拟南芥叶片中CAT和SOD活性在0~18d都比对照高，表明了这3个基因可能是潜在的对生物胁迫有重要作用的功能基因。我们在研究枣NAC转录因子功能的基础上，明确其在枣疯病发生过程中的作用机理，为植原体病害发生的分子机理研究和枣疯病的防治做参考。关键词：枣；枣疯病；NAC转录因子；遗传转化vii 1文献综述1.1枣疯病概述枣（Zizyphusjujube）在北半球温带广泛种植，作为一种果树作物，在经济上有重要的商业价值。枣疯病（JWB）在中国、韩国普遍常见，而且在产业上造成严重的问题。枣疯病普遍存在于中国的河北，河南，山东，山西和陕西等枣区，并有增加的趋势（张彩琴等,2015）。另外，枣疯病在韩国（Lee,1988）和日本（Ohashietal,1996）均有报道。该病是一种普遍存在的问题，存在于不同栽培地点、不同栽培品种，以及不同管理方式的枣园中。1.1.1枣疯病的主要症状(1)丛枝。这些症状是由患病后芽的异常萌发引起的。病枝出现叶子变细长、节间缩短的症状，叶腋间萌发细短的小枝，小枝丛生。(2)叶片黄化。叶片小而黄枯，边缘上卷，严重时呈褐色并有脱落现象。(3)花器返祖。果实不能由花正常的发育而成，花将化作花梗，有了明显伸长，小叶由花萼、花瓣儿及雄蕊转变，雌蕊则转变为小枝。(4)枯亡。发病的枣树根畸形、稠密，并围绕树干萌发形成细小的短枝。枣疯病一般是在枝条和根蘖上出现病症，然后慢慢扩展到全树。发病后期因为根皮层腐烂，最终导致整个植物的凋亡。（由淑贞等,2014;张彩琴等,2015;王红梅等,2016;郭建民等，2017）1.1.2枣疯病的致病机理由于枣疯病植原体基因组序列尚未可知，目前对枣疯病发病机制的研究主要集中在生理指标变化及相关路径中关键基因的表达变化。植原体是一类没有细胞壁，具有细胞膜，只能在活细胞中寄生的病原体，靠飞虱、叶蝉等刺吸式昆虫传播，并在植物韧皮部专性寄生（Oshimaetal,2013）。植物感染了植原体会出现疾病症状，如丛枝病植原体表现为叶子变为黄色或者红色，花变叶，节间缩短并且生长发育迟缓，根畸形最后致死（Nambaetal,2002）。如葡萄被黑木病（‘Boisnoir’）植原体感染后，其与光合作用相关的基因表达量下调，而与类黄酮代谢及其他与发病机制相关基因的表达量上调（Hrenetal,2009）。黄化是枣疯病的典型症状，同时，Liu等(2014)发现枣被感染后，其与光合作用相关的基因也出现下调现象。植原体侵入寄主植物体内后，释放出致病效应因子，导致植物出现病症发育，植株变得幼嫩，更有利于昆虫取食。与此同时，致病因子也对植物防卫信号转导和诱导寄主抗性起作用（Sugioetal,2011）。有研究表明，植原体侵入植物体内后，其致病因子能够和植物的转录因子发生互作，进而影响其调控的下游基因表达。如翠菊黄化植原体的致病因子SAP54，能和拟南芥的II型MADS域１ 转录因子（MADS-domaintranscriptionfactors,MTFs）起作用，这些MTFs有AGL12，MAF1和SEP3，以及SEP3的同源基因SEP1，SEP2，SEP4等。SAP54和这些转录因子结合后，导致这些转录因子降解失活，进而影响拟南芥花器发育（Allysonetal,2014）。在苹果丛枝病发生时，苹果的TCP转录因子家族的MdTCP24和MdTCP25，能够和SAP11相结合，进而影响茉莉酸合成，提高ABA水平（Janiketal,2016）。将苹果丛枝病植原体的SAP11致病因子转入烟草中，发现了SAP11使TCP转录因子不稳定，导致茉莉酸合成异常的现象。同时也导致了NbOMT1基因沉默，引起烟草香味变化，使腺毛发育和3-异丁-2-甲氧基吡嗪合成受影响（Tanetal,2016）。1.1.3枣疯病的防治发病的枣树是枣疯病的感染源，而主要传播枣疯病的媒介昆虫是叶蝉，不同枣品种对枣树病害有不同的抗性，防治应从以下几个方面着手：（1）及时地将病枝锯断，清除病株：及早锯掉疯树的病枝，可以减少感染源，又能延缓发病或治愈病树。将病树连根清除，并栽植壮苗。（2）选择抗病的砧木、品种并加强枣园管理：选择有枣仁的抗病性枣树为砧木，培育抗病品种。重视加强枣园肥水管理，将杂草及时清除，以促进其健壮生长，提高抗病能力。（3）药物治疗：四环素、土霉素、罗红霉素可防治枣疯病，以及用低毒高效复方药物“祛疯1号”、“祛疯2号”进行输液治疗。（4）病害叶蝉的防治：如果枣园杂草丛生，或者间作小麦、玉米、芝麻等作物，种植松树、柏树、桑树、槐树等，则会有利于叶蝉的繁殖和越冬。因此要远离病原建园，并注意从5月初至8月底在叶蝉寄主植物上喷洒杀虫剂杀死叶蝉并减少病菌传播。植原体病害在生产上一般以预防为主，甄选抗病品种，远离病原近的地方建园并加大肥水管理增强树种抗性，一旦遭受侵害，及时使用试剂防治也不能够完全病除，仍有复发的可能。1.2NAC转录因子家族的硏究进展研究表明，更直接地与植原体致病性相关的因素是其致病效应因子，而植原体致病因子作用的机理是和植物体内的转录因子相结合。转录因子是能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，并能通过识别和结合基因启动子区域的顺式作用元件来启动和调控基因表达。植物中的转录因子分为两类，一类是非特异性转录因子，另一类称为特异型转录因子。现有研究表明，转录因子本身也存在着复杂的活性调控机制。作为转录因子大家族之一的植物特异性NAC转录因子在植物的生长发育，以及胁迫应答过程中起到发挥着重要作用。1.2.1NAC转录因子的特征这个转录因子家族的共同特征是其N端为保守的大约150个氨基酸的NAC结构域，C端２ 为高度变异的转录调控区。在NAC保守结构域中包括5个亚结构域(A、B、C、D、E),其中亚结构域A、C和D高度保守,B和E保守性较低。1.2.2NAC转录因子的作用与调控转录因子抑制或增强基因的表达并调节植物生理活动。研究表明，NAC转录因子不仅在植物的生长发育阶段，对植物的生根、长叶、开花、结实等过程起调控作用，而且在抵抗外来伤害时也起着不可或缺的作用。1.2.1.1NAC转录因子在植物的生长发育过程中起作用（1）植株形态研究表示，植物的NAC转录因子对基因的调控，影响植株形态，并决定了其形成，不仅包括植物的外部形状，同时还有内部结构的起源、发育和建成等。闫朝辉等（2016）将“粉红亚都蜜”葡萄NAC转录因子VvDRL1基因导入烟草，对比野生型烟草，转基因植株呈现植株矮化、叶面卷曲等现象；Kim等研究发现，拟南芥植株生长，可以被NTL8、ANAC036、XND1等基因减缓（Kimetal,2007），而ANAC036基因可引起转基因植株细胞面积减少，这可能是导致植株矮化的直接原因。（2）开花诱导与花器官的形成在植物的成花过程中,需要两个过程即花诱导和花器官形成。开花是植物生长的核心，是植物从营养生长到生殖生长的生理发育过程。水稻NTL8基因可通过抑制FLOWERINGLOCUST基因的表达来延迟植株的开花过程（Kimetal,2007）；在VvNAC1转基因拟南芥的发育后期阶段，植物的生物量可以显著增加，而且开花可提早4~8d（LeHenanffetal,2013）；在对番茄的SINAM2转录因子的研究中，发现它也可以参与番茄花器官轮数及萼片的形态建成（Hendelmanetal,2013）。（3）果实形成当植物界进化到一定阶段时，才有了包含种子的果实。果实孕育种子，且成熟后有助于种子的散布；反过来种子又对果实的生长发育起着极为重要的作用。NAC转录因子在果实形成的过程中起重要作用。Kunieda等（2008）发现，拟南芥NARS1和NARS2可以调节胚珠表皮的发育并影响植株胚胎形成；VvNAC26基因与果实大小的变异有关（Telloetal,2015）。（4）次生生长植物的初生生长结束之后，由于维管形成层和木栓形成层等次生分生组织具有很强的分裂能力和分裂活动，尤其是维管形成层的活动，不断产生新的细胞组织所导致的生长，称为次生生长。由它们产生的次生维管组织和周皮共同组成的结构称为次生结构。Hussey等（2011）发现，拟南芥SND2基因对次级细胞壁的发育起正向调节作用，不仅如此还可以增强参与纤维素、木聚糖、甘露聚糖和木质素聚合过程的基因的表达，从而导致纤维次级细３ 胞壁增厚；在茎的维管束间纤维和木质部纤维中特异表达的拟南芥SND1基因，其过表达促进了非厚壁细胞中的次生壁的沉积，然而当抑制其表达时，纤维的次生壁出现缺失（Koetal,2007）。（5）叶片衰老叶片衰老是植物叶片生长发育过程中衰变的重要信号，所以研究与其表达的相关基因对于延缓、加速叶片衰老有重要作用。拟南芥中约20％的NA转录因子与叶片衰老有关（位正玉,2015）；通过分析番茄NAC基因序列，可以预测有8个与渗透胁迫和衰老有关的基因，通过了解这些基因的信息，可以改良番茄品种（Guoetal,2006）；atnap突变体可延迟衰老，AtNAP过表达则导致植株提前衰老（Xieetal,2000）。（6）根的形成和发育根的发育是极其复杂的过程，存在着复杂的基因网络调控。有研究发现，在根尖和生长原基特异表达的NAC1基因，受生长素诱导并可以激活生长素下游促进侧根形成的两个基因DBP和AIR3（Xieetal,2000）；NAC1过量表达会促进根系的发生，反义NAC1的表达会显著抑制侧根的发生（Heetal,2005）；拟南芥中的AtNAC2基因被生长素诱导后表达量上调，并且侧根数量显著增加（Haoetal,2011）。（7）改良品质基因可通过改变遗传性能，故而改变植物本身的品质和质量。NST系列基因由于其可能提高木材的产量和品质，因此具有重要的应用价值（Mitsudaetal,2007）；NAM-B1基因，Uauy（2006）等研究表明，可显著改善小麦的营养品质。1.2.1.2NAC转录因子参与生物及非生物胁迫相关过程当植物处于不利于自身发育的逆境环境中，如高温、寒冷、干旱、高盐等，植物细胞会进行感知，通过一系列复杂的信号传导途径如ABA信号途径以及Ga2+信号途径等，将胁迫信号传递给胁迫应答的转录因子，这些转录因子将会通过直接参与或间接参与调控胁迫应答基因的表达，从而激活抗逆的反应，降低或消除因逆境反应引起自身的伤害。NAC转录因子也参与植物的胁迫应答，对于减少因外界不适而造成的伤害起到积极作用。全基因组转录分析结果表明，有20％～25％的NAC基因至少对一种胁迫有响应（Fujitaetal,2004;Nuruzzamanetal,2010）。（1）NAC转录因子在生物胁迫中的调控作用植物与生物型病菌的接触模式可以分为两类：与亲和性病菌相互作用和与非亲和性病菌的相互作用。在植物与非亲和性病菌的相互作用中，病菌无毒菌株的侵染常常会导致寄主植物感染部位细胞的快速死亡，导致局部坏死斑，称为过敏反应(Hypersensitiveresponse,HR)。与亲和性病菌的相互作用过程中的病菌又分为活体寄生真菌和坏死性病菌：活体寄生真菌只能从活的植物细胞和组织中获得所需营养，属活体营养型，通常通过SA途径来调节疾病抗性反应；坏死性病菌一般在死亡的植物组织上生活并获得所需要的营养，营死体营养型寄生方式，其反应通常由JA、ET等途径所调控。研究表明，NAC转录因子在抵抗生物胁迫中发挥作用（孙利军等,2012）。拟南芥的ATAF2４ 基因降低对病原真菌Fusariumoxysporum的抗性，ATAF1提高了对Botrytiscinerea的敏感性（Delessertetal,2005;Wuetal,2009）；欧洲葡萄VvNAC1对干旱、高盐和病原菌有抵抗作用（Leetal,2013）；Zhu等（2012）研究表明，中国野生华东葡萄VpNAC1基因增强了烟草对白粉病和疫霉病的抗性；在大麦中过量表达ATAF1基因，可提高其对白粉病的抗性,而突变体ataf1植株则降低了对白粉病的抗性（Jensenetal,2008）；在拟南芥中，用灰霉病菌侵染或使用JA处理后能诱导ATAF1的表达，而且ATAF1的过表达植株降低了对灰霉病的抗性，然而抑制内源ATAF1蛋白活性后，则会增加其对灰霉病的抗病性，表明ATAF1负向调控对灰霉病的抗性（Wangetal,2009）。（2）NAC转录因子在非生物胁迫中的调控作用由于自身的脆弱，植物极易受到外界因子如高温寒冷、干旱、高盐等非生物因素的影响，呈现出不利于自身生长的状态。又因为其本身的防御功能，使得植物受害时会产生一系列的反应来消除或减少这种影响所带来的危害。因此研究植物在对抗非生物胁迫的反应极为重要，可以减少不利环境对植物的危害。研究表明，转录因子在植物抵抗非生物胁迫过程中有重要作用，NAC转录因子作为大家族，同样对植物盐旱胁迫的防御有关。Mao等（2014）将小麦TaNAC2基因转到烟草中，TaNAC2、TaNAC67基因导入到拟南芥中，过表达烟草和拟南芥均表现出抗旱抗盐抗高温等多种非生物逆境胁迫的抗性。有研究表明，在拟南芥中过量表达南荻的MlNAC2和MlNAC5基因能增加转基因的抗逆性（Jietal,2014;Yangetal,2015）。过表达水稻OsNAC5能提高转基因植株的抗旱性（Jeongetal,2013）。Yoo等（2007）研究发现,拟南芥lov1突变体对冻害表现出高度得敏感性,LOV1基因可以调控一些与抗冻相关基因的表达，过量表达LOV1的转基因植株在冻害条件下，其存活率高达88%，这些表明LOV1正向调控拟南芥抗冻能力。（3）NAC转录因子通过植物激素信号途径参与调控作用研究显示，很多转录因子都参与植物激素信号途径。NTL8基因不仅通过在盐胁迫下通过GA途径促进种子发芽，并且还证实该过程不依赖于ABA信号传导（Kimetal,2008）。OsNAC6的表达可由ABA及非生物胁迫，包括冷、干旱和高盐胁迫的诱导（Nakashimaetal,2007）。拟南芥中的ANAC019、ANAC055和ANAC072能被干旱、高盐和ABA诱导表达，过表达这3个基因可以提高植株的抗盐和抗旱能力（Tranetal,2004）。５ 2枣NAC转录因子的鉴定和生物信息学分析NAC转录因子作为植物特有的转录因子大家族之一，在植物的生长发育、胁迫应答过程中起到重要作用。NAC转录因子因为其适应性和特异性，成为作物遗传工程和育种的重要目标。许多研究已经证实了NAC蛋白在植物植物整个生长发育过程，及响应生物和非生物胁迫中的重要性。姜秀明等（2016）鉴定出番茄中有104个NAC转录因子，黎帮勇等（2015）发现在毛竹中有125个NAC转录因子，拟南芥中至少包含107个NAC基因（Riechmannetal,2000），而水稻中含有140个（Fangetal,2008）。Rushton等（2008）将拟南芥、水稻、大豆(Glycinemax)和番茄(Lycopersiconesculentum)等多种植物的NAC基因汇集到一起,发现NAC基因家族包含7个亚族,其中6个亚家族为这些植物所共有,而另一个家族为茄科独有的,命名为TNACS(tobaccoNACgenes)。然而，使用不同的聚类方法所得到的分类也可能出现不一样的情况。枣是我国重要的干果和经济树种之一，随着枣转录组测序的完成，将会有对其生物遗传方向更多的研究。本研究拟对枣的NAC转录因子进行鉴定汇总，并对其进行染色体定位、进行保守序列分析和保守结构域分析等生物信息学分析，为枣NAC转录因子家族的功能分析提供基础，从而找到参与枣疯病胁迫的基因。2.1材料与方法2.1.1枣NAC转录因子家族成员鉴定从拟南芥信息资源（TheArabidopsisInformationResource,TAIR）网站（http://www.arabidopsis.org）下载拟南芥NAC蛋白序列，在NCBI枣基因组数据中进行blastp搜索，得到的枣NAC候选蛋白，与植物转录因子数据库中（PlantTranscriptionFactorDatabase，PlantTFDB）下载的枣NAC蛋白一起，用DNAMAN软件进行序列比对，去除重复序列，并在SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）查找其结构域，删除不含有或严重缺失NAC结构域的基因，鉴定出枣NAC基因。2.1.2枣NAC转录因子染色体定位从NCBI枣基因组数据库中下载基因定位和基因注释信息，基因在染色体的位置绘图用MapInspect软件进行。2.1.3枣NAC蛋白质系统发生分析从TAIR拟南芥数据库中下载拟南芥NAC蛋白序列，将枣的候选NAC蛋白序列与拟南芥NAC蛋白序列用CLUSTAL软件进行多重序列比对，并利用MEGA6.0进行进化树构建，６ 2.1.4保守基序鉴定和保守序列分析枣NAC蛋白的保守基序分析用在线MEME平台进行（http://meme-suite.org/tools/meme），最大检索数值定为15。保守序列比对用DNAMAN进行。2.2结果与分析2.2.1枣全基因组NAC转录因子的鉴定在TAIR网站下载了96个拟南芥NAC蛋白序列，以此为探针，在NCBI枣基因组数据中搜索到79个枣NAC候选蛋白，从PlantTFDB数据库中下载到101个枣NAC蛋白，利用DNAMAN软件对这些蛋白序列进行比对，去除重复的序列，共鉴定出84个枣NAC基因家族成员。根据其在枣染色体上的定位信息，依次命名为ZjNAC1~ZjNAC84。84个ZjNAC的蛋白长度在119~806个氨基酸之间，等电点的酸碱性差异较大，在4.43（ZjNAC40）~9.77(ZjNAC32)之间。表2-1枣NAC转录因子家族成员Table2-1FamilymembersofjujubeNACtranscriptionfactorCDS区氨基酸分子量基因编号基因ID染色体定位等电点外显子数长度（bp）数目（aa）（D）ZjNAC1LOC107411428chr1:545021..54737311973986.0745938.483ZjNAC2LOC107411970chr1:4818747..48263959693227.7636736.196ZjNAC3LOC107416163chr1:8816360..881918810323435.5139226.274ZjNAC4LOC107423224chr1:18275477..182768248612879.2731826.83ZjNAC5LOC107424128chr1:20030705..2004218110713567.1540878.695ZjNAC6LOC107409987chr2:318611..3200767862615.4229791.983ZjNAC7LOC107409729chr2:380933..38434311943978.344691.164ZjNAC8LOC107411332chr2:13896264..138987559693228.3236887.944ZjNAC9LOC107411336chr2:13903082..139062319693228.3136937.024ZjNAC10LOC107412447chr2:25856662..2585815210713565.2141712.183ZjNAC11LOC107412448chr2:25858991..2586044710203395.1839064.653ZjNAC12LOC107412449chr2:25862880..258642969543176.2837257.393ZjNAC13LOC107412450chr2:25866103..258667894921634.5717948.283ZjNAC14LOC107412762chr3:551562..55457510473485.1539241.84ZjNAC15LOC107413278chr3:6464311..647328415995326.1459490.254ZjNAC16LOC107413259chr3:6476173..648102214914964.4955149.885ZjNAC17LOC107413596chr3:9919555..99200804171385.11164932ZjNAC18LOC107414322chr3:21405262..2141008010583526.4740538.554ZjNAC19LOC107414828chr3:25961428..2596306216355444.4562172.61ZjNAC20LOC107414992chr3:26397290..2640129917495825.2365100.147７ ZjNAC21LOC107415239chr4:1868595..187225511853945.6643787.867ZjNAC22LOC107415579chr4:4425111..442708812064016.6745306.993ZjNAC23LOC107415997chr4:8845288..885006920676885.7578798.157ZjNAC24LOC107416328chr4:12792152..127938567772585.29295433ZjNAC25LOC107416405chr4:13477782..134784326512168.4424665.631ZjNAC26LOC107416584chr4:15966736..159735759573188.7836717.523ZjNAC27LOC107417198chr4:25333299..253358618342779.1431215.314ZjNAC28LOC107417668chr5:3086382..30879517682558.9929160.773ZjNAC29LOC107417970chr5:6625413..66277509903298.1838032.533ZjNAC30LOC107418094chr5:7326046..73272267772588.6829482.253ZjNAC31LOC107418780chr5:15283311..152854439723238.3236145.83ZjNAC32LOC107419222chr5:24766298..247673839513169.7735672.192ZjNAC33LOC107419534chr5:28312059..283154917262414.8927689.883ZjNAC34LOC107419813chr6:203398..20606913054346.1548112.283ZjNAC35LOC107419962chr6:1749227..17528348252746.5330623.544ZjNAC36LOC107420683chr6:7295528..729859810983658.7440318.225ZjNAC37LOC107421097chr6:11757519..117598308972988.0933873.483ZjNAC38LOC107421385chr6:18715820..1872038718426134.7368883.275ZjNAC39LOC107422350chr7:11326925..113280693601194.5114353.793ZjNAC40LOC107422339chr7:11546188..115466853601194.4314183.552ZjNAC41LOC107423302chr7:23664631..2367068910713567.2140628.83ZjNAC42LOC107423780chr8:1601956..160374512394125.7746726.413ZjNAC43LOC107423833chr8:1755255..175908915935305.860210.936ZjNAC44LOC107424388chr8:5996429..600074010833605.1741256.784ZjNAC45LOC107425600chr8:19706111..1971076414404794.8952664.715ZjNAC46LOC107425614chr8:20586768..205878136182055.4923484.83ZjNAC47LOC107425691chr8:22041681..2204449112514166.4747727.873ZjNAC48LOC107425748chr9:140114..1477735791928.8722610.14ZjNAC49LOC107427314chr9:17729144..177310798072696.9830742.413ZjNAC50LOC107427302chr9:17733108..177339243871286.4214962.053ZjNAC51LOC107427600chr9:21035185..2103619210083355.3838431.221ZjNAC52LOC107427761chr9:22922292..229241496482159.4524506.833ZjNAC53LOC107427800chr9:23178860..231798469873274.9537142.711ZjNAC54LOC107428022chr9:25140458..251420657442479.5328772.854ZjNAC55LOC107428947chr10:11065376..110669755162848.5432816.023ZjNAC56LOC107428980chr10:12525392..1252726712304097.4945863.753ZjNAC57LOC107429480chr10:18915437..1892079913294425.3149899.466ZjNAC58LOC107429481chr10:18924435..1893013813294425.3149899.466８ ZjNAC59LOC107430472chr11:9751998..975652710143376.0539078.424ZjNAC60LOC107432467chr12:7884211..788912411223735.7941588.184ZjNAC61LOC107432797chr12:11279390..1128436714314766.6753760.66ZjNAC62LOC107433097chr12:17358821..1736017910713568.6441094.112ZjNAC63LOC107408642Un:30..397010863614.7839942.515ZjNAC64LOC107409894Un:182..1623774257629605.052ZjNAC65LOC107407729Un:321..543610863614.8639812.416ZjNAC66LOC107408172Un:371..431410863614.7839942.515ZjNAC67LOC107407948Un:372..432110863614.7839942.515ZjNAC68LOC107409348Un:373..26247892634.5529219.124ZjNAC69LOC107408594Un:547..449510863614.7839942.515ZjNAC70LOC107408540Un:1072..475910863845.1242379.75ZjNAC71LOC107408455Un:1247..519410863614.7839942.515ZjNAC72LOC107408300Un:1890..583410863614.7839942.515ZjNAC73LOC107406551Un:2910..472010653548.5240042.823ZjNAC74LOC107407618Un:3296..720624218064.9989657.178ZjNAC75LOC107407727Un:4033..911310863614.7839942.516ZjNAC76LOC107407847Un:4041..798910863614.7839942.515ZjNAC77LOC107434027Un:11827..1332510713568.7641081.072ZjNAC78LOC107435239Un:16881..187267682558.9929160.773ZjNAC79LOC107404041Un:19955..2252713984656.3152031.023ZjNAC80LOC107406103Un:32257..3480710083356.1438842.173ZjNAC81LOC107404509Un:51993..531737772588.6829482.253ZjNAC82LOC107405051Un:64005..6854410833606.1541848.714ZjNAC83LOC107404081Un:106696..1072655701895.6122124.211ZjNAC84LOC107435293Un:176047..17861513984656.3152031.0232.2.2ZjNAC的染色体定位分析根据鉴定得到的84个ZjNAC基因在染色体上的位置信息，利用MapInspect工具作染色体定位图，结果表明，有63条ZjNAC基因定位在了12条枣染色体上，ZjTCP64~74等11个基因未能在染色体上定位。定位的62个ZjNAC基因主要分布在2、3、4、5、8和9号等6条染色体上，其中以2号染色体上分布了10个ZjNAC基因，为最多，而11号染色体上ZjNAC分布较少，只有1条。９ 图2-1枣NAC转录因子染色体定位注：染色体数目标在每条染色体的上边，基因在染色体上的位置用基因名称指出Fig.2-1ChromosomelocalizationofjujubeNACtranscriptionfactorNote:Thenumberofchromosomesisonthetopofeachchromosome,andthepositionofthegeneonthechromosomeisindicatedbythegenename2.2.3枣NAC蛋白质基序分析根据枣NAC蛋白的氨基酸序列，用MEGA5.0绘制了蛋白质进化图。为了进一步验证枣NAC蛋白的多样性，用MEME在线工具（http://meme-suite.org/tools/meme）对其进行了保守基序分析，聚集在一起的蛋白质有相似的motif组成（图2-2）。其中，motif3、7、2、5、1分别代表NAC转录因子的A、B、C、D、E亚结构域。根据枣NAC蛋白的系统进化树与保守基序分析，我们可以将84个枣NAC转录因子分为6组（图2-2），第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别有11、57、2、7、1、7个转录因子。其中第二组（57个）最多，第五组（1个）最少。１０ 图2-2枣NAC转录因子基序分析Fig.2-2AnalysisoftranscriptionfactormotifofNACinjujube2.2.4枣NAC蛋白结构域氨基酸序列多重比对为了进一步验证枣NAC蛋白的保守结构域，用DNAMAN软件对所有成员的N端结构域进行多重比对，含有相同结构域的序列被聚到了一起。而同组的枣NAC转录因子正好被聚到了一起，根据2.2.3节的分组情况，将每一组NAC蛋白的保守结构域剪切出来，制成图2-3。图中A、B、C、D、E、F分别表示第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组，每一组的序列结构类似。１１ ABCDEF图2-3枣NAC转录因子保守序列分析注：A、B、C、D、E、F分别为第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的保守序列分析Fig.2-3AnalysisoftranscriptionfactordomainofNACinjujubeNote:A、B、C、D、E、FmeantranscriptionfactordomainofⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵgrouprespectively2.2.5枣NAC蛋白质系统进化分析为了进一步验证枣NAC转录因子的进化关系，对枣（84）和拟南芥（94）的NAC蛋白质序列进行系统进化分析。其中枣第Ⅰ组的11个NAC蛋白（ZjNAC70、ZjNAC68、ZjNAC65、ZjNAC76、ZjNAC75、ZjNAC72、ZjNAC71、ZjNAC69、ZjNAC67、ZjNAC66、ZjNAC63）并没有和其他拟南芥NAC蛋白聚在一起；第Ⅳ组中的ZjNAC53、ZjNAC51、ZjNAC25、ZjNAC83、ZjNAC17、ZjNAC19这6个也没和其他拟南芥NAC蛋白聚在一起；第Ⅱ组中的的5个（ZjNAC11、ZjNAC10、ZjNAC12、ZjNAC80、ZjNAC22）、第Ⅲ的ZjNAC30、ZjNAC40，以及第Ⅴ组的ZjNAC13也没有和其他的拟南芥蛋白聚在一起。这说明枣中这25个NAC蛋白是枣特有的，可能和木本植物更复杂的功能相关，其相对于拟南芥就是进化。拟南芥也有一组没有和枣聚在一起，AT1G60340、AT1G60300、ANAC024、AT1G60380、ANAC023、ANAC093、ANAC064、AT5G39540、ANAC063这9个NAC蛋白，说明这也是拟南芥所特有的。这些说明在枣和拟南芥NAC基因中存在着进化现象。１２ 6285278046013Z147ZCC00190jC05ZNCC1530ZjNAAAC1j0ZNAAACC7jA03ZNANjNjNACC0jNACNNAAC532ZjACANAC007AjNNAC7ZZANNAACC012ZjNAC7ZAj03ZjNC76ANANAAC44A75ZNC6ZjNjNC62ANNAC06AAC1AjA09TZAC690AZNAC223jNAC670ANNAC4G6310AjAC06AC760ZNA2990C5C6001AN06900AC04AANAP57T5650010AjNNAC9TNC78101Z02AT1GACU01AZjNNAACC261611AA51AG0069NC4AN63500AjNAC21TA04019ZjNA01GC3009C8A01ZjN44N60200ZAC7AA0340NA0NC8981AjNC34AANAC0208900ZNAC1T5AC09399991AjNAC03G0639799ZA36AN3941NC8AC54991000AjNAC03ZjNAC0600010ZA31ZjNA533100ANNAC058ZjNC510ZAjNAC60ZjNAC2511000100AC054ZjNAC83100ZjNAC098ACANACZjNAC119799AZNjNAC794ZjNAC310098100ZjNAC87ANAC0995100ANAC08ZjNAC6199ANAC059ANAC07397ANAC092ANAC0109995ZjNAC32ZjNAC2710095AANNAACC010790ZjNAC2100ZjNAC2110907ZjNAC39ZjNAC40ZjNAC58100ZjNAC13ZjNAC57100ZjNAC1ZjNAC54ZjNAC80ZjNAC52ZjNAC12ZjNAC46100ZZjNAC10G044101009510995jNAC11AT3AC0030ZjNACANAC0484AANNAC0307ANAC00598ZjNAC032ANAC0000110098ANAC2ANAC39992ANAC64ANNAC4310ZjAC081ZjC102100ANNAC102ANAC084510000ANAC73NAAC16000ANAC07AjNC781101009ZA02ZjNA031AjNAC019ZAC0500ANAC55NC04710991ZNAC55AAC00AjN0NCA9910NAC2AA8900990AC09ANjN0707019991ANA447ZC06019209ZNACAC75901jNC0N01103ZA2AACC01ZjNAAC05NA501009ZjN01ANA0590030019AjNAC58jNC0L41090900AAC86AA710110NZCT491ZC90010ANANAC10jCN0090ZNA6A02110NC2NA9209AjAC7AC611ZANNA07jNAAC01ANAC0700ZjACZC0483AANN391NjNC38AjNAAC0C06AC880NAACC7NAC1ZA2N1066NA54746387AC1AAC4901AC04NC31A2ANCC3496131CC3ANjNAC0C0C020jAA00CAZACC2A000C02538NA0ZjCCNNCAACCAC0837jNC4ZjNAA4AjAjNA6ZNAAA5ZjNNj6ZNZNNZZjNNNZNAAAAAAA图2-4枣、拟南芥NAC系统进化树Fig.2-4PhylogenetictreeofjujubeandArabidopsisthalianaNAC2.3小结与讨论(1)从枣基因组中鉴定到84个NAC转录因子比拟南芥少（94个），将其命名为ZjNAC1-ZjNAC84，其中有62个基因定位在了12条染色体上。(2)根据枣的进化树以及保守基序分析，将ZjNAC转录因子分为6组，每一组分别有11、57、2、7、1、7个转录因子。根据分组情况进行了其N端的保守结构域分析，发现每组的保守序列是相近的，进一步验证了分组情况。(3)在枣和拟南芥蛋白的进化关系中，有25个枣NAC蛋白没有和拟南芥的聚集在一起，有9个拟南芥蛋白没有和枣的聚在一起，这可能和木本植物更复杂的功能相关。植物转录因子大部分以基因家族形式存在，在植物生长发育、信号传导及逆境胁迫等方面具有重要作用。而NAC转录因子作为重要的转录因子家族之一，近年来被人们广泛关注。由于NAC１３ 家族成员众多，因此分类也各异。Ooka等(2003)根据NAC保守结构与分析将NAC转录因子家族分成两组,其中I组分为14个亚组,包括TERN、ONAC022、SENU5、NAP、AtNAC3、ATAF2、OsNAC3、NAC2、ANACO11、TIP、OsNAC8、OsNAC7、NAC1和NAM,而II组分为ANAC001、OsNAC003、ONAC001和ANAC063这4个亚组,II组成员的ANAC001和ANAC063完全由拟南芥NAC转录因子构成，OsNAC003和ONAC001亚组由水稻和小麦的NAC转录因子组成。本研究首次从基因组范围对枣NAC转录因子家族进行系统分析，在枣中找到了84个NAC转录因子，通过进化树分析，以及保守基序、保守序列分析，将这84个NAC转录因子分为6组。无论是Ooka等(2003)将NAC家族分为18个亚家族，还是本试验将其分为6个亚家族，都是由于算法不同而导致的，或者是由于主观的分类想法有所差异，并不影响对其后续的分析。当然，随着其他物种的基因组测序成功，会出现更多不同的分类方法，也会出现更为全面的分析方法。保守序列分析表明预测得到的84个NAC转录因子均具有转录因子活性，并且证明了枣NAC转录因子家族在调控植物生长发育、响应生物和非生物胁迫中均具有—定作用。枣NAC转录因子成员具体行使何种功能，需要进一步试验验证。本研究为枣NAC转录因子的生物学功能分析及其调控提供了重要依据。１４ 3枣疯病转录因子的差异表达NAC转录因子是植物在进化过程中，产生的一类新的转录因子大家族，广泛存在于植物界，为植物所特有。这些NAC调节蛋白参与调控初级和次级代谢，生长发育过程以及响应生物和非生物胁迫。NAC转录因子因为其适应性和特异性，成为植物遗传工程和育种的重要目标。许多研究已经证实了NAC蛋白在植物响应生物胁迫中的重要性。AFAF2的过表达植株表现对土源病菌的抗性减弱，以及相关抗性基因表达量的减少(Delessertetal.,2005)。Selth等（2005）发现，番茄SlNAC1基因参与卷叶病毒(tomatoleafcurlvirus,TLCV)的调控。然而NAC转录因子在枣树的生长发育过程及抗病过程中的作用研究还不多。本研究拟根据对枣的NAC转录因的汇总信息与家族生物信息学分析等结果，进行转录组差异表达分析及RT-PCR试验验证，并进行基因功能预测，以期进行下一步转化验证。为研究NAC基因在枣树抵抗植原体侵染过程中的作用，本试验对枣树嫁接感病植原体的不同时期进行了转录组测序，研究了NAC基因的表达量，并用荧光定量PCR验证这一结果，以期发现NAC转录因子家族中在植原体侵染枣树过程中起调控作用的基因。3.1材料与方法3.1.1植物材料2年大的枣（ZiziphusjujubeMill.“Huizao”）种植在河南农业大学防虫网房的花盆中。每棵枣树在春夏季采集三次叶片，用CTAB法提取DNA，使用植原体特异性引物P1/P7(Dengetal,1991)andR16F2n/R16R2(Gundersenetal,1996)通过巢式聚合酶链反应（PCR）诊断其是否受植原体感染。选择经三轮PCR检测后植物植原体均为阴性的植株，作为嫁接试验嫁接的健康材料。采集被枣疯病感染的成年枣树的芽（ZiziphusjujubeMill.“Huizao”），并在2014年8月13日嫁接到网室种2年大的健康枣植株上。为了分析寄主枣树内的枣疯病植原体的迁移情况，对其叶片进行采样，采样时间为：嫁接后第一个月的每3天，以及嫁接第二个月后的每个星期，直到枣疯病症状在2015年10月出现在嫁接的枣中（Yeetal,2017）。3.1.2方法3.1.2.1CTAB法提取DNA（1）取0.2g样品，在预冷的研钵中快速研磨成粉状，装入预冷灭菌的2ml离心管中。（2）加入500μl提前预热混匀的CTAB裂解液，裂解液（100mmol/LTris-HClpH8.0、20mmol/L（3）EDTApH8.0、1.4mol/LNaCl、2%CTABM/V、2%PVPM/V、2%巯基乙醇（v/v）现加现用。１５ （4）65℃水浴45~60min，期间混匀3次，10000rpm，离心10min。（5）取上清，加入与上清等体积的氯仿：异戊醇（24:1），摇匀，10000rpm，离心10min。（6）取上清，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），轻摇5~10min，10000rpm，离心10min。（7）取上清，加入2倍体积-20℃预先冷却的无水乙醇，混匀，-20℃静置30min。（8）10000rpm，离心10min，弃上清。（9）75%乙醇冲洗沉淀，2~3次，室内风干。（10）向沉淀中加30μL灭菌双蒸水溶解，测定浓度并保存在-20℃下备用。3.1.2.2RNA的提取各时期枣叶片的RNA提取采用生工柱式植物总RNA提取试剂盒（SpinColumnPlanttotalRNAPurificationKit）。步骤如下：（1）提前在冰上遇冷的离心管中加入550μLBufferRlysis-PG。（2）取适量枣叶片，用液氮研磨成粉末状，加到上述离心管中，震荡混匀，室温放置5min。（3）4℃，12000rpm，离心3min。（4）取上清，加入1/2体积无水乙醇，充分混匀。（5）将所有溶液加至吸附柱中，将吸附柱置于收集管，静置1min，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液。（6）将吸附柱放回收集管中，加入500µlGTSolution，静置1min，10000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液。（7）将吸附柱放回收集管中，加入500µlNTSolution，静置1min，10000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液。（8）将吸附柱放回收集管中，12000rpm，离心2min。（9）将吸附柱放入RNase-free的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30~50µlDEPC-treatedddH2O，（10）静置2min，12000rpm离心2min，将所得到的RNA溶液于-80℃保存或直接用于后续试验。3.1.2.3cDNA第一条链的合成RNA模板为测序样品RNA，使用Takara反转录试剂盒执行cDNA的合成，步骤如下：（1）去除基因组DNA反应１６ 表3-1去除基因组DNATable3-1eliminatetheDNA试剂使用量gDNAEraser1.0μl5×gDNAEraserBuffer2.0μlTotalRNA5.0μl（1μg）RNaseFreeddH2O2.0μl总体系10μl42℃，2min；4℃，保存。（2）反转录反应表3-2反转录反应Table3-2reversetranscription试剂使用量5×PrimeScriptBuffer24μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1μlRTPrimerMix1μlRNaseFreeddH2O4μlTotal10μl加入步骤1的反应液37℃，15min；85℃，5sec；4℃，保存。3.1.2.4PCR鉴定表3-3PCR反应体系Table3-3PCRreactionsystemTotalVolume50μl2×TaqPlusMasterMix25μlPrimerF2μlPrimerR2μlDNAtemplate2μl（0.1~10ng）Nuclease-freeddH2O19μlPCR扩增反应程序为：94˚C预变性6min→（94˚C变性45s，56˚C退火45s，72˚C延伸1min30s），35个循环，72˚C延伸10min。反应结束后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在凝胶成像系统下观测。１７ 3.1.2.5样品的收集和转录组分析根据PCR结果和嫁接植株的症状观察，采集了嫁接后六个阶段和同时期健康植株的叶片样品进行RNA提取和转录组分析。感染的六个阶段分别为0个周（2014年8月13日）、2个周（2014年8月23日）、37个周（2015年5月27日）、39个周（2015年6月10日）、48个周（2015年8月13日）和52个周（2015年9月16日）。这6个时期分别变现为芽片嫁接愈合后、PCR在叶片内检测到植原体但表型未发病、表型出现枣疯病症状、植株部分发病、整株发病、濒临死亡等，并以同时期健康枣苗的叶片作对照。每个阶段收集三或四个叶，在液氮中冷冻，然后储存在−80°C。总RNA的提取采用上海生工柱式植物总RNA提取纯化试剂盒。转录组测序委托北京源泉宜科生物科技有限公司利用IlluminaHiSeqTM2500高通量测序平台进行，测序读长为PE100。测序结果利用TopHat2与参考基因组进行序列对比，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息，使用cufflinks计算基因表达的丰度值并筛选差异表达基因，使用heml软件绘制在发病枣苗和健康对照间差异表达的NAC基因热图。3.1.2.6实时荧光定量PCR分析挑选转录组分析中在2个以上时期显著差异表达的NAC转录因子，根据其基因序列，用PRIMER5软件设计RT-PCR引物。使用Takara反转录试剂盒进行cDNA第一条链的合成，实时定量PCR采用ABI公司的SYBR®SelectMasterMix试剂盒于ABI7500fast型PCR仪上进行，内参基因选用枣Actin蛋白基因。试验中ZjNAC3、ZjNAC44、ZjNAC52、ZjNAC57、ZjNAC58、ZjNAC77基因的克隆引物以及RT-PCR引物设计用PRIMER5软件进行，由上海生物工程技术有限公司合成。表3-4实时荧光定量引物Table3-4PrimersofquantitativeRT-PCR基因名称正向引物序列反向引物序列内参ActinCTTGCATCCCTCAGCACCTTTCCTGTGGACAATGGATGGAZjNAC3CCTGCAAGCTTCTGGGTTTCCATTGTCTCTCGTAATTGTGGGTAGTZjNAC44GTATGAGCAAGTGCCCTGCTTTTGAGAATTGGGTCATTGATGATTZjNAC52GGCAGCAATGGAGGAAGAGACCGTTAATGGAGATGGAGTTGACZjNAC57GTCCACCATCACCCTGTTTGTTGATCATCTACTACTCCATCGAAAGAGZjNAC58GGGTCCATGAGGTTGGATGAAAAGTTTGCCCATTTGCTTCTTZjNAC77GGGTGGTTCGGGTAATTTCGGGTTTGGTTATTGTTCCCAGGAA3.1.2.7时空动态表达分析有研究表明，植原体集中在韧皮部。因此本次试验，对4年大的盆栽枣幼树进行嫁接枣疯病枝１８ 条，每周检测韧皮部中是否含有植原体。取嫁接后的0，4，13，20周叶片和韧皮部的样（4周是刚检测到植原体，13出现植原体感染症状，20周是发病明显），做实时荧光定量PCR检测。3.2结果与分析3.2.1枣NAC转录因子基因在植原体侵染过程中的差异表达分析植物受到病原菌的侵染，可以诱导相关抗性基因的表达。为研究枣NAC基因在植原体侵染过程中的表达量变化，本试验从感病过程中的枣树叶片的转录组数据中检测到了36个NAC转录因子基因的表达水平，公式=Log(感病/健康,2)处理数据，将其做成基因表达热图，直观展示了NAC基因的表达量数据差异变化情况。热图（图3-1）将基因表达趋势做了聚类，表达趋势相似的被聚到了一起。36个ZjNAC转录因子被分成了6组，每一组的变化趋势都是不同的。ZjNAC21、ZjNAC82、ZjNAC7、ZjNAC54为第一组，这4个转录因子的表达量在B、C、D时期，患病高于健康对照。ZjNAC43、ZjNAC79、ZjNAC84、ZjNAC73、ZjNAC37、ZjNAC64这6个转录因子为第二组，其在患病枣中的表达量在A、B、C、E、F时期低于健康对照。在D时期远远高于对照。ZjNAC38、ZjNAC8、ZjNAC9、ZjNAC22、ZjNAC35、ZjNAC6、ZjNAC49、ZjNAC50、ZjNAC2、ZjNAC20、ZjNAC55转录因子为第三组，这11个转录因子的表达量在D、E时期患病高于健康。ZjNAC39、ZjNAC40、ZjNAC41、ZjNAC45、ZjNAC16、ZjNAC24这6个为第四组，其在A、D、E时期患病的表达量高于健康对照，其他时期低于对照。ZjNAC47、ZjNAC61为第五组，这两个转录因子的表达量在A、B、C时期患病高于对照，后期低于对照。ZjNAC26、ZjNAC29、ZjNAC32、ZjNAC33、ZjNAC15、ZjNAC3、ZjNAC74这7个转录因子为第六组，其表达量在E时期患病远远高于健康植株。研究表明，在枣疯病发生过程中，与抗病相关的基因的表达量在C、D、E时期患病是高于健康的。因此可以推测，除了第五组，其他5组的转录因子都可能直接或者间接地参与了枣疯病的发生过程中，并起积极作用。我们从其余5组中各筛选了一个或两个转录因子（ZjNAC3、ZjNAC41、ZjNAC49、ZjNAC54、ZjNAC55、ZjNAC73共6个）在3.2.2节中进行RT-PCR验证。１９ 图3-1植原体侵染不同时期NAC转录因子基因表达热图注：图中每个小方格标识每个基因，其颜色表示该基因表达量大小，表达量越大颜色越深（绿色表示下调，红色表示上调），每行表示每个基因在不同时期，不同样品中的表达量情况，每列表示每个样品中所有基因的表达量情况，每行的右侧标注基因名称，每列的下方标注嫁接时期。Fig.3-1ExpressionofNACgeneindifferentperiodsofPhytoplasmainfectionNote:Eachsmallsquareinthefiguremarkseachgene,itscolorindicatesthesizeofthegeneexpression,thegreaterthegeneexpressionis,thedeeperthecolorbecomes(greenisdown,redisup),eachlinemeanstheexpressionofeachgeneindifferentperiodsanddifferentsample,eachcolumnshowstheexpressionofallthegenesineachsample.Thenameofthegeneislabeledontherightsideofeachrow,andtheperiodofgraftsismarkedatthebottomofeachcolumn.3.2.26个时期荧光定量PCR分析以测序样品RNA反转录后的cDNA为模板，荧光定量PCR检测目标基因ZjNAC3、ZjNAC41、ZjNAC49、ZjNAC54、ZjNAC55、ZjNAC73的表达量变化。荧光定量检测了6个基因在植原体侵染枣树过程中的表达量变化，设定6个转录因子在患病枣中A时期的表达量为1，绘制柱形图。结果显示（图3-2、图3-3、图3-4、图3-5、图3-6、图3-7）２０ 图3-2植原体侵染过程中ZjNAC3基因表达量分析Fig.3-2AnalysisofZjNAC3geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess图3-2是ZjNAC3转录因子的定量PCR结果。结果显示，其在6个时期患病中的表达量都高于其在健康时期的表达量。ZjNAC3转录因子在患病枣树中，A、B、C时期的表达量逐渐增高，但在D时期表达量下降，在E时期达到最高，在F时期其表达量又有所下降，但总体都高于A时期的表达量。图3-3植原体侵染过程中ZjNAC41基因表达量分析Fig.3-3AnalysisofZjNAC41geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess２１ 图3-3是ZjNAC41转录因子的定量PCR结果。结果显示，其在6个时期患病中的表达量都高于其在健康时期的表达量。ZjNAC41转录因子在患病枣树中，B时期表达量相对A时期有所降低，接着在C时期相对表达量达到最高点（约是A时期的1.4倍），之后在D时期表达量急剧下降与同时期健康枣树持平，在E、F时期表达量又有所增加。图3-4植原体侵染过程中ZjNAC49基因表达量分析Fig.3-4AnalysisofZjNAC49geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess图3-4是ZjNAC49转录因子的定量PCR结果。结果显示，其在6个时期患病中的表达量都高于其在健康时期的表达量。ZjNAC49转录因子的表达量在患病枣树中，在A、B、C时期相似，在D时期降到最低，接着在EF阶段逐渐升高直至F时期的最高点（约为A时期的2.3倍）。２２ 图3-5植原体侵染过程中ZjNAC54基因表达量分析Fig.3-5AnalysisofZjNAC54geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess图3-5是ZjNAC54转录因子的定量PCR结果。结果显示，其在6个时期患病中的表达量都高于其在健康时期的表达量。ZjNAC54转录因子在患病枣树中，A、B时期表达量相似，C时期表达量达到最高（为A时期的9倍左右）。D时期又降到和A时期相似的水平，之后E、F时期逐渐升高。图3-6植原体侵染过程中ZjNAC55基因表达量分析Fig.3-6AnalysisofZjNAC55geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess２３ 图3-6是ZjNAC55转录因子的定量PCR结果。结果显示，其在6个时期患病中的表达量都高于其在健康时期的表达量。ZjNAC55转录因子的表达量在患病枣树中，A到E时期逐渐降低，随后在F时期突然达到最高点（约为A时期的1.5倍）。图3-7植原体侵染过程中ZjNAC73基因表达量分析Fig.3-7AnalysisofZjNAC73geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess图3-7是ZjNAC73转录因子的定量PCR结果。结果显示，ZjNAC73转录因子的表达量在患病枣树中，A、C、E、F时期是高于健康枣树，B、D时期与健康对照基本持平。EF时期，患病枣树中ZjNAC73转录因子的表达量开始增加，在F时期达到最高点（约是A时期患病枣树中的40倍）。3.2.3时空动态表达分析为进一步筛选与枣疯病发生过程相关的基因，对6个差异表达的NAC基因进行了枣疯病发生过程的时空动态表达分析。以植原体侵染后的4年生枣盆栽幼树4个时期叶片和韧皮部样品RNA反转录后的cDNA为模板，荧光定量PCR检测目标基因ZjNAC3、ZjNAC41、ZjNAC49、ZjNAC54、ZjNAC55、ZjNAC73的表达量变化。荧光定量检测了6个基因在植原体侵染枣树过程中的表达量变化，设定6个转录因子在健康枣中第一个时期的表达量为1，绘制柱形图。结果显示（图3-8、图3-9、图3-10、图3-11、图3-12、图3-13）。２４ 图3-8植原体侵染过程中ZjNAC3基因表达量分析Fig.3-8AnalysisofZjNAC3geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess图3-9植原体侵染过程中ZjNAC41基因表达量分析Fig.3-9AnalysisofZjNAC41geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess２５ 图3-10植原体侵染过程中ZjNAC49基因表达量分析Fig.3-10AnalysisofZjNAC49geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess图3-11植原体侵染过程中ZjNAC54基因表达量分析Fig.3-11AnalysisofZjNAC54geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess２６ 图3-12植原体侵染过程中ZjNAC55基因表达量分析Fig.3-12AnalysisofZjNAC55geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess图3-13植原体侵染过程中ZjNAC73基因表达量分析Fig.3-13AnalysisofZjNAC73geneexpressioninPhytoplasmainfectionprocess通过四个时期的时空动态表达分析可知，ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73在发病后期的韧皮部中表达量明显上升，我们推测这三个基因可能与枣疯病发生相关。因此，我们选择这三个基因做转基因植株的鉴定，验证其是否参与枣疯病发生过程。２７ 3.3小结与讨论（1）在转录组数据中检测到了36个NAC转录因子基因的表达水平，将其绘制热图后把表达趋势相近的聚在一起，可将36个ZjNAC转录因子分为6组。除了第五组的2个基因，其余34个基因在枣疯病发生后期的表达量在患病叶片中都高于对照，因此推测可能参与枣疯病过程。（2）在除第五组的其他4组中，每组选择1至2个与本组表达趋势相符的差异表达转录因子（ZjNAC3、ZjNAC41、ZjNAC49、ZjNAC54、ZjNAC55、ZjNAC73）进行RT-PCR验证，转录组分析结果和RT-PCR结果总体趋势是一样的。（3）对植原体侵染后枣NAC转录因子表达时空动态进行了分析，利用RT-PCR测定了4个时期感病枣苗和健康对照韧皮部和叶片的6个NAC转录因子表达动态，筛选出ZjNAC3、ZjNAC54和ZjNAC73等3个在发病中后期在韧皮部显著上调表达的NAC转录因子。6个转录因子的RT-PCR结果与转录组分析的不完全相同，其变化趋势有个别差异，这可能是由于RT-PCR原理与转录组分析不一样，且他们的数据处理过程也不尽相同，但是整体上还是一致的。不管是在转录组数据还是在RT-PCR分析中，在发病后期ZjNAC3、ZjNAC41、ZjNAC49、ZjNAC54、ZjNAC55、ZjNAC73这6个转录因子在患病叶片中的表达量远远高于健康叶片中的表达量，这说明这6个转录因子可能参与枣疯病发病过程。ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73这3个基因在RT-PCR验证中的表达量变化趋势与转录组数据分析相似，且在发病后期相对表达量变化很大，因此本研究选取这三个基因做下一步的基因功能预测验证。进行ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73的基因功能验证，将其构建植物表达载体，并转入到模式植物拟南芥和烟草中，探究其功能。在拟南芥和枣的NAC蛋白进化树中，ZjNAC73基因与拟南芥的AtNAC019、AtNAC072（AtRD26）、AtNAC055聚在一起，说明他们有相似的基因结构，基因结构决定功能。因此我们可以预测ZjNAC73与拟南芥的3个基因有相同的基因功能。而拟南芥的3个基因ANAC019、ANAC072（AtRD26）、ANAC055在ABA信号通路中扮演着协同或对抗角色，并且AtRD26转基因和拟南芥都表现出抗盐抗旱的现象（Fujitaetal,2004;Lietal,2012;郭耀,2014）。因此我们可以预测：ZjNAC73基因有抗盐抗旱的功能，并参与ABA信号通路。而与ZjNAC3在进化树中聚在一起的拟南芥基因是ANAC096，有研究表明ANAC096基因调控与ABA相关的基因，anac096的突变体拟南芥表现出对ABA的低敏感性，并且在干旱胁迫下，与ABA相关的气孔关闭情况受损，同时失水率增加（Xuetal,）。因此我们可以预测：ZjNAC3转录因子参与ABA信号通路。但是，与ZjNAC54聚在一起的拟南芥NAC转录因子其功能尚且不知道，所以没有办法进行ZjNAC54的功能预测。植物在感病过程中的早期反应，决定了植物的抗病性。植原体嫁接后2周、37周、39周分别是嫁接后初次检测到植原体DNA，出现发病症状，到枣树表现出丛枝症状的整个过程，属于植原体侵染前期。热图和荧光定量结果显示，ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73在该时期表现出高表达。而ZjNAC41、ZjNAC49、ZjNAC55表现出下降趋势，可能是因为在植原体侵染后期，病害发生严重，基因的表达量降低，可能是枣树的防御系统被破坏。或者是因为这三个基因与枣疯病呈负相关。对２８ 植原体病害的研究表明，植原体进入植物可以抑制或激活植物中调控防御基因和激素合成过程中关键基因的转录因子。因此，可以推断枣树中NAC转录因子家族中ZjNAC3、ZjNAC41、ZjNAC49、ZjNAC54、ZjNAC55、ZjNAC73基因可能参与调控防御植原体病害。２９ ３０ 4ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因转化烟草NAC转录因子参与植物生长发育过程，同时，在生物胁迫、非生物胁迫以及激素信号传导过程中发挥着重要的作用。本试验将枣NAC转录因子分为6组，在植原体侵染枣树过程中表达量升高，而且基因功能预测发现ZjNAC3、ZjNAC73都参与了不同程度的胁迫过程。为了研究基因功能，试验选取了3个不同分组的基因ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73，构建了基因的植物表达载体，在根癌农杆菌的介导下，转化烟草叶片，获得了抗性芽，以期获得转基因烟草植株，进一步研究基因的功能。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1植物材料烟草K326种子由河南农业大学烟草学院提供，K326播种在培养基上，在河南农业大学园艺学院组培室继代保存。4.1.1.2试验仪器、器材光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳仪、凝胶照相分析系统、PCR仪、分光光度计、冰箱、移液枪、离心管、天平、镊子、刀、酒精灯等。4.1.1.3培养基的配制MS培养基，LB液体和固体培养基，YEB液体和固体培养基，各培养基配方参照《分子克隆试验指南》（J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著）。4.1.1.4常用试剂克隆载体pMD19-T、大肠杆菌JM109、农杆菌GV3101、DL2000核酸分子量Marker、卡那霉素、头孢霉素、6-BA、NAA、琼脂粉、MS盐、氯化钙、氯化钠、DAB、牛血清蛋白（BSA)标准品、磷酸盐缓冲液、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒。３１ 4.1.2方法4.1.2.1播种烟草K326种子经75%乙醇1min，10%次氯酸钠8min处理，无菌蒸馏水冲洗5次后，播种在MS培养基上放入28℃光照培养室中，16h光照，8h黑暗培养。4.1.2.2ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73植物表达载体的构建(1)RNA提取采用生工柱式植物总RNA提取试剂盒，方法同第二章2.3.2。(2)试验采用Takara反转录试剂盒执行cDNA第一条链的合成。方法同第二章2.3.3。(3)将枣cDNA送至武汉伯远生物科技有限公司构建植物表达载体。4.1.2.3GV3101感受态细胞的制备(1)取适量农杆菌GV3101菌液，涂布在YEB固体培养基上，28℃，培养24-36h。(2)挑选单菌落于5mlYEB液体培养基中，28℃，过夜振荡培养14-16h，至OD600为0.5-0.6。(3)吸取培养好的菌液于冷却好的1.5ml离心管中，冰浴30min。(4)平衡后，4℃，5000rpm，离心8min。(5)弃上清，在无菌滤纸上倒置10s，用1.5ml冰预冷的20mMNaCl2悬浮。(6)平衡后，5000rpm，离心8min。(7)弃上清，在无菌滤纸上倒置10s，用100μl冰预冷的20mMCaCl2悬浮。(8)迅速在液氮中冷却，置-80℃保存。4.1.2.4重组质粒转化GV3101感受态细胞(1)将感受态农杆菌置于冰上融化。(2)每100μL感受态农杆菌细胞中加入6μL重组质粒，冰浴30min，迅速放入液氮中冷冻1min，然后再37℃水浴5min，再冰浴2min。(3)加入900μL无抗生素的YEB液体培养基，28℃，200rpm，振荡培养4-5h。(4)4℃，10000rpm，离心1min。(5)弃上清，用100μLYEB液体培养基回溶。(6)将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB固体培养基上，28℃，培养48-72h。(7)挑选单菌落于50mlYEB液体培养基中，28℃，200rpm，过夜振荡培养12-16h，至OD600为0.4-0.6。提取菌液，PCR鉴定阳性，可用于烟草侵染。３２ 4.1.2.5农杆菌介导转化烟草叶片(1)取生长30-50d的烟草叶片，切成1cm×1cm的小方块，接种到MS培养基上，28℃，黑暗条件下预培养2d。(2)将叶片放入提前摇好的菌液中，侵染5min。接种到MS培养基上，28℃，黑暗条件下共培养2天。(3)将共培养后的叶片接种到加有1.0mg/L6-BA，0.1mg/LNAA，400mg/LCef，100mg/LKan的MS培养基中筛选培养。(4)当不定芽长出2-3厘米长度时，切下芽子转入至含有0.3mg/LNAA，400mg/LCef，100mg/LKan的MS培养基中生根培养。4.2结果与分析4.2.1表达载体及转化农杆菌鉴定试验使用酶切的方法构建了ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因的植物表达载体，并转化到E.coli中进行扩增。提取大肠杆菌中含有目的基因的质粒DNA，采用冻融法转化到感受态农杆菌GV3101中，提取农杆菌质粒，用克隆引物，PCR检测目的基因。PCR扩增到的目的条带与预测的目的基因片段ZjNAC3（726bp)、ZjNAC54（849bp）、ZjNAC73（742bp）大小符合，表明目的基因成功构建到过量表达载体，并成功转化到农杆菌GV3101菌株中。表4-1载体检测目的片段引物序列Table4-1Primersofvector基因名称正向引物序列反向引物序列pBWA(V)KS-NAC3gctcacagaatgttcaggcaagaccggcaacaggattcaatcpBWA(V)KS-NAC57gctccaactttgtcatcacaagaccggcaacaggattcaatcpBWA(V)KS-NAC67ggcagctcaaagttggatcaagaccggcaacaggattcaatc３３ 图4-1植物表达载体质粒图谱Fig.4-1Overexpressionvectorplasmidmap图4-2阳性菌液检测Fig.4-2Positivebacteriatest注：M是maker2000；N是阴性对照；1、2是ZjNAC3农杆菌菌液；3、4是ZjNAC54；5、6是ZjNAC73农杆菌菌液农杆菌菌液Note:Mmeansmaker2000;Nmeansnegativecontrol;1、2meanZjNAC3Agrobacterium;3、4meanZjNAC54Agrobacterium;5、6meanZjNAC73Agrobacterium３４ 4.2.2烟草遗传转化试验用烟草K326叶片做外植体，将有切口的叶片浸入含植物表达载体的农杆菌GV3101悬浮液中，5min后，将叶片转移到共培养培养基（MS）中，共培养两天。之后将叶片转移到筛选培养基中（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+100mg/LKan+400mg/LCef）。当芽子长到2-3cm时，将其移入生根培养基中（MS+0.3mg/LNAA+100mg/LKan+400mg/LCef）。图4-3烟草遗传转化图注：以CK对照和ZjNAC3转基因烟草为例，A：侵染前预培养；B：筛选培养1d；C：筛选培养10d；D：生根Fig4-3TobaccogenetictransformationNote:A:Culturebeforeinfection;B:1dafterscreeningculture;C:10dafterscreeningculture;D:radicationrootage4.2.3PCR检测当转基因烟草较为健硕时，提取叶片DNA，PCR检测目的基因是否转化到烟草基因组中。结果表明，琼脂糖凝胶电泳检测发现10株ZjNAC3转基因烟草芽子中有7株有目的条带，4株ZjNAC54转基因烟草芽子有3株有目的条带，8株ZjNAC73转基因转基因烟草芽子有6株有目的条带。从烟草DNA中扩增到了与重组质粒相同的的片段基因，说明目的基因成功转化到了烟草基因组中。３５ 图4-4阳性植株检测注：M是maker2000；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10是ZjNAC3转基因烟草芽；11、12、13、14、15、16是ZjNAC54转基因烟草芽；17、18、19、20、21、22、23、24是ZjNAC73转基因烟草芽Fig4-4PositiveplantstestNote:Mmeansmaker2000;1、2、3、4、5、6、7、8、9、10meanZjNAC3transgenictobacco;11、12、13、14、15、16meanZjNAC54transgenictobacco;17、18、19、20、21、22、23、24meanZjNAC73transgenictobacco表4-2转基因烟草数目统计Table4-2thenumberoftransgenictobacco转基因烟草的用于烟草转化外植体个数长愈伤的外植生根培养基上抗性芽目的基因（棵）（个）体（个）的芽（棵）（棵）ZjNAC31012035107ZjNAC548973164ZjNAC73101134086合计2833010624174.3小结与讨论(1)本试验构建了ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因的植物表达载体，并成功进行了农杆菌的转化。(2)本试验一共得到烟草转基因抗性芽17棵，其中7棵ZjNAC3转基因烟草，4棵ZjNAC54转基因烟草以及6棵ZjNAC73转基因烟草，PCR验证其都为阳性。烟草以其组织培养简单，易生长，转化效率高等优点，成为植物基因工程中重要的模式植物（王关林等,2009）。1985年，Horsh首次将外源基因转入烟草，建立了烟草转化体系（Horschetal,1985）。刘轶等（2017）将拟南芥的AtPAP1基因过量表达转入野生型烟草，形态观察显示能显著增强转基因烟草植株花青素的积累,致使转基因烟草的叶片、茎段和花器官等颜色发生不同程度的紫红色变化。黄昊等（2018）将珍珠黄杨中的BsGAI2基因转入到烟草中，转基因植株表现出明显矮化,节间变短,长势较慢,延迟开花等。Liu等（2017）将SlJA2过表达转入烟草中，发现SlJA2通过水杨３６ 酸途径降低了转基因烟草的耐热性。本试验为研究ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因的功能，构建了基因植物表达载体，通过农杆菌GV3101介导，转入烟草K326，本试验载体带有卡那霉素抗性基因，在培养基中加入卡那霉素，初步获得了抗性芽。目前芽子处于生根阶段，下一步等转基因芽子长为健硕的转基因烟草时需进行外源胁迫验证基因功能。如与ABA信号通路有关的，可施加外源ABA处理，检测活性氧（activeoxygen）的含量，以此探究是否氧代谢失调，动态平衡被打破。３７ ３８ 5ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因的拟南芥转化拟南芥作为植物遗传学领域典型的模式生物，它具有以下特点：形态个体小；生长周期快：从播种到收获种子时间短，一般为6周左右；每株每代产生种子多；形态特征简单，且植株矮小易培养：基因组小，重复序列少，只有5对染色体。而且，拟南芥的全部基因组测序已经完成，这为拟南芥在植物学领域的研究奠定了基础。在植物和病原物互作系统中，经常观察到活性氧的产生，如H2O2。这些活性氧不仅对病原物有杀伤或抑制作用，而且H2O2参与植物防卫反应的若干过程（潘瑞炽等,2012）。夏淑春等（2015）研究发现外施过氧化氢（H2O2）能诱发花生过敏性坏死反应，减缓花生叶腐病菌的侵染进程。饶力群等（1999）发现接种白叶枯病菌后，具有抗性水稻悬浮细胞中H2O2含量增加，而CAT、POD和SOD等酶活性低于对照，而接种感病品种则没有明显变化，说明H2O2含量与水稻抗病性有关。Kim等（2012）从甘薯（sweetpotato）中分离了两个ERF基因：IbERF1和IbERF2，表明两个ERF基因作为PR5、ERD10、CuZnSOD和CAT基因的转录调控因子在应激防御信号通路中发挥作用。本试验中，用低浓度的过氧化氢（H2O2）处理转ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因的拟南芥，测定了过表达拟南芥中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，进一步研究目的基因的潜在功能。5.1材料与方法5.1.1材料5.1.1.1植物材料试验中所使用的主要植物材料是野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)的生态型：Columbia(Col)。5.1.1.2植物培养材料蛭石、黑土、塑料花盆。5.1.1.3试验主要仪器、器材离心机、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、微波炉、电子天平、凝胶成像系统；移液枪、镊子、1.5ml离心管（EP管）、枪头、小研磨棒、96孔样板、离心管架、称量纸、三角瓶、量筒。5.1.1.4培养基的配制MS培养基（1L）配方：MS粉4.43g，30g蔗糖，7.5g琼脂，高压灭菌15分钟。３９ 5.1.1.5常用试剂DNA提取：CTAB裂解液（100mmol/LTris-HclpH8.0、20mmol/LEDTApH8.0、1.4mol/LNacl、2%CTABM/V、2%PVPM/V、2%巯基乙醇（v/v）现加现用）；氯仿；异戊醇；酚；无水乙醇；75%酒精琼脂糖凝胶电泳缓冲液５×TBE5)：硼酸27.5g，Tris碱54g，20ml0.5mol/LEDTA，定容1L。5.1.2方法5.1.2.1MS培养基的配制调节pH（用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH计测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8，因高温灭菌时pH会下降）；溶化琼脂；培养基分装，高压灭菌。5.1.2.2拟南芥的种植在1.5ml离心管中取适量的干燥的拟南芥种子，加入1%NaClO消毒液浸泡消毒10分钟。吸出消毒液，用无菌水洗涤2次。再加入75%酒精浸泡消毒5分钟，用无菌水洗涤3-4次。把消毒的种子播在MS培养基上。播种之后，用封口膜密封，放在4℃下春化黑暗处理2～3天后放于培养室培养。生长4～5天后，将幼苗移至塑料小盆中生长。土壤配制：用营养土和蛭石按1：l比例混匀使用。培养条件：长日照条件：16小时光照期，8小时黑暗期；温度：22℃。5.1.2.3农杆菌介导的蘸花法转化拟南芥(1)挑农杆菌单菌落（含重组质粒）接入到YEB液体培养基中（利福平+卡纳），28℃、200rpm、震荡过夜培养，离心10分钟，倒掉上层清液。(2)提前配置好重悬液（不用灭菌，现用现配），½MS+蔗糖，调节PH为5.70-5.80，最后加终浓度为0.05%的Silwet-L77（表面活性剂），震荡混匀。(3)将重悬液倒入离心过的菌体中，震荡混匀，测其OD600处于0.8-1.0之间，即可侵染。(4)将上述侵染液倒入培养皿中，让拟南芥的花絮完全浸泡在液体中2分钟，注意：拟南芥需侵染前一天完全浇透，侵染完用肥料浇透；侵染前需将荚果及带荚果的花序剪掉。(5)将处理过的植物用黑色塑料袋遮光处理24-36h。5.1.2.4ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73植物表达载体的构建具体方法同4.1.2.2。４０ 5.1.2.5GV3101感受态细胞的制备具体步骤同4.1.2.3。5.1.2.6重组质粒转化GV3101感受态细胞前6步4.1.2.3；(1)挑农杆菌单菌落（含重组质粒）接入到YEB液体培养基中（利福平+卡纳），28℃、200rpm、震荡过夜培养，离心10分钟，倒掉上层清液。(2)提前配置好重悬液（不用灭菌，现用现配），½MS+蔗糖，调节PH为5.70-5.80，最后加终浓度为0.05%的Silwet-L77（表面活性剂），震荡混匀。(3)将重悬液倒入离心过的菌体中，震荡混匀，测其OD600处于0.8-1.0之间，即可侵染。(4)将上述侵染液倒入培养皿中，让拟南芥的花絮完全浸泡在液体中2分钟，注意：拟南芥需侵染前一天完全浇透，侵染完用肥料浇透；侵染前需将荚果及带荚果的花序剪掉。将处理过的植物用黑色塑料袋遮光处理24-36h。5.1.2.7种子的收集和保存当拟南芥长角果逐渐成熟时，会由绿变黄，并在最后成褐色。当长角果变黄时，此时种子中含有较多的生长抑制剂。因而，当长角果变褐时采集即可获得成熟又容易发芽的拟南芥种子。收获的种子放入离心管后干燥一星期左右，再密封保存。种子的收集：在桌面上铺几张干净的白纸，戴上手套，将要收种叶荚用镊子将种子搓揉到纸上，再将纸上其他杂质颗粒去除后，小心将种子装到1.5ml离心管中，密封后放入干燥剂，即可储藏。拟南芥种子的贮存一般为短中期贮藏，即将种子贮存在4℃的通风橱中。种子最好不要长期储藏，会使其活性降低，影响实验，最好每次选用新鲜的种子进行栽植。5.1.2.8转基因拟南芥的鉴定侵染拟南芥后待其结果收下T0代种子，将其分开撒到含50mg/LKan的MS培养基上，春化2-3天，将其放置16小时光照期，8小时黑暗期，温度22℃的培养室进行培养。将发芽的拟南芥移入塑料盆中进行培养，PCR检测是否含有重组质粒。5.1.2.9过氧化氢胁迫处理试验用100mMH2O2，光照培养箱中黑暗条件处理注射叶片。在处理0d，10d，18d后测组织中过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。5.1.2.10过氧化氢酶（CAT）活力测定过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（可见光法）购于南京建成生物工程研究所，具体方法步骤参４１ 照试剂盒说明书。5.1.2.11超氧化物歧化酶（SOD）活力测定总超氧化物歧化酶（SOD）测试盒购于南京建成生物工程研究所，具体方法步骤参照试剂盒说明书。5.2结果与分析5.2.1拟南芥遗传转化和PCR检测将构建好的含植物表达载体的农杆菌用浸花法转入拟南芥哥伦比亚野生型，收集T0代种子用含Kan的MS培养基筛选，将发芽的拟南芥移栽到塑料盆中，当其长到5-6cm时，提取叶片DNA进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测发现7株ZjNAC3转基因拟南芥中有6株有目的条带，11株ZjNAC54转基因拟南芥有10株有目的条带，14株ZjNAC73转基因拟南芥有10株有目的条带。说明已经将植物表达载体成功转化到拟南芥中，获得了拟南芥转基因植株。图5-1拟南芥遗传转化注：A：MS培养基上播种拟南芥种子；B:一周左右移入塑料盆中；C:侵染过后的拟南芥；D:在含Kan的MS培养基上筛选T0代种子Fig.5-1ArabidopsisthalianagenetictransformationNote:A:seedsontheMSmedium;B:seedlingsontheplasticbasin;C:plantsafterinfecting;D:T0seedsontheMSmediumwithKan４２ 图5-2阳性植株检测注：M是maker2000；1、2、3、4、5、6、7是ZjNAC3转基因拟南芥；8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18是ZjNAC54转基因拟南芥；19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32是ZjNAC73转基因拟南芥Fig5-2PositiveplantstestNote:Mmeansmaker2000;1、2、3、4、5、6、7meanZjNAC3transgenicArabidopsisthaliana;8、9、1011、12、13、14、15、16、17、18meanZjNAC54transgenicArabidopsisthaliana;17、18、19、20、21、22、23、24meanZjNAC73transgenicArabidopsisthaliana表5-1转基因拟南芥数目统计Table5-1thenumberoftransgenicArabidopsis转基因拟南芥用于拟南芥转化T0代种子T0代发芽T1代拟南芥目的基因（棵）（个）（棵）（棵）ZjNAC3360约1200076ZjNAC54400约100001110ZjNAC73385约108001410合计1145约328003226４３ 5.2.2CAT，SOD酶活性测定试验用100mM的H2O2分别处理注射叶片，在处理0、10、18d测定叶片中过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，结果显示，ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73过表达植株的叶片中CAT和SOD活性在0~18d都比对照的高。说明这3个基因参与了抗氧化胁迫过程，并增强了转基因植株的抗氧化性。４４ 图5-3CAT活性Fig.5-3TheactivityofCAT用100mM的H2O2处理后，与氧化胁迫有关的过氧化氢酶（CAT）含量会增加以抵抗氧化胁迫对自身的迫害。图4-3中，ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73的转基因拟南芥在受到H2O2胁迫后，在10和18d，植株体内CAT的含量虽比0d的少，但都高于同时期健康植株中的含量，说明ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因可以激活过氧化氢酶CAT的活性。４５ 图5-4SOD活性Fig.5-4TheactivityofSOD用100mM的H2O2处理后，与氧化胁迫有关的超氧化物歧化酶（SOD）含量会增加以抵抗氧化胁迫对自身的迫害。图4-4中，ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73的转基因拟南芥在受到H2O2胁迫后，在10和18d，植株体内SOD的含量虽比0d的少，但都高于同时期健康植株中的含量，说明ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因可以激活超氧化物歧化酶（SOD）的活性。5.3小结与讨论(1)本试验一共得到26株转基因拟南芥，其中6株ZjNAC3转基因拟南芥，10株ZjNAC54转基因拟南芥以及10株ZjNAC73转基因拟南芥。(2)本试验用100mM的H2O2处理ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73的转基因拟南芥，发现转基因植株体内SOD和CAT酶的活性都高于同时期对照，说明ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73三个转录因子参与氧化胁迫。４６ 非生物胁迫会导致植物发生氧化胁迫反应和膜脂过氧化反应（Huetal,2012;Wangetal,2012）。氧化胁迫，如超氧化自由基，羟基自由基和过氧化氢会氧化损失生物分子、破坏细胞的新陈代谢。超氧化物歧化酶SOD作为体内重要的抗氧化酶，可以清除机体内天然存在的超氧自由基分子，它通过反应能够把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢对机体来说仍是有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）会立即将其完全分解为安全无害的水。这样，一个完整的防氧化链条便由这三个酶组成了。有研究表明，过表达JUB1转基因植物能够减少对H2O2的积累，并增强其抗盐性（Wuetal,2012）。在烟草中过表达玉米CAT2基因，可通过改变植物中过氧化氢酶（CAT）活性影响寄主与病原菌的互作，加强植物的抗氧化胁迫能力（Polidorosetal,2001）。过氧化氢不仅具有损伤生物大分子、产生细胞毒害的能力，而且还被证明可以作为信号分子，在生物和非生物胁迫应答中起重要作用。低浓度的过氧化氢作为外源信号，诱导植物体内氧化爆发。Moschou等（2008）在烟草中过表达多胺氧化酶，可以激活过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性，激活植物的抗氧化活性，但是在外源过氧化氢胁迫下，转基因植物则不能进一步响应过氧化氢引起的氧化爆发。试验为进一步筛选枣树NAC转录因子中可能参与胁迫的基因，用双氧水模拟氧化胁迫处理ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73过表达转基因拟南芥，测定了处理不同时间段叶片中过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果表明，受到H2O2胁迫后，在10和18d植株体内CAT的含量比0d的少，是因为植物受到外界胁迫，体内酶活性会降低。但ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73转基因拟南芥的叶片中处理前后过氧化氢酶活性都高于对照，说明ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73基因可以激活过氧化氢酶的活性，转基因细胞能够更好地应付细胞内增加的活性氧，展现CAT活力不断升高，应对氧化应激。当然本试验仍有需要深入改进的地方，如遭受胁迫后，可增加叶绿素、H2O2、POD、丙二醇MDA（MDA不仅是膜脂过氧化最重要的产物之一，其还能加剧膜的损伤，因此测定MDA的含量在植物衰老和抗性生理研究中常用的指标之一，可以通过探究MDA的含量来了解膜脂过氧化程度，从而间接测定膜系统受损伤的程度）等生理生化改变，以探究野生型对照和转基因植株生理指标的差异，从而更准确地判定该的基因是否参与胁迫响应过程。４７ ４８ 6结论与展望枣（ZiziphusjujubaMill.）是鼠李科（Rhamnaceae）植物，是我国第一大干果树种。枣树的栽培过程中常伴随着病虫害的发生，其中最为严重的是植原体侵染引起的枣疯病，堪称枣树的癌症。为研究与发病相关的基因，本文进行了枣NAC转录因子家族的生物信息学分析，并通过对感病后不同时期健康和发表枣苗的转录组分析和RT-PCR检测，筛选出了枣疯病发生过程中差异表达的3个NAC基因，通过转化拟南芥和烟草，初步验证了其基因功能。论文主要结论如下：(1)从枣基因组中鉴定出了84个NAC转录因子，对其进行了生物信息学分析，结果表明84个枣NAC转录因子都含有保守NAM结构域，其中62个不均匀地分布在枣的12条染色体上，其余22个未能定位到染色体上，根据枣NAC蛋白的系统进化树、保守序列分析以及保守基序分析，将84个NAC转录因子分成了6组。(2)对植原体侵染后6个时期的感病枣苗和健康对照进行转录组分析，检测到了36个NAC转录因子表达，根据表达动态变化将其分为6组，除了第五组的2个基因，其余34个基因在发病中后期的病苗中均显著上调表达，挑选了6个NAC基因进行RT-PCR验证，表达变化趋势与转录组分析相同。(3)对植原体侵染后枣NAC转录因子表达时空动态进行了分析，利用RT-PCR测定了4个时期感病枣苗和健康对照韧皮部和叶片的6个NAC转录因子表达动态，筛选出ZjNAC3、ZjNAC54和ZjNAC73等3个在发病中后期在韧皮部显著上调表达的NAC转录因子。(4)构建了ZjNAC3、ZjNAC54和ZjNAC73等3个基因的植物表达载体，通过农杆菌介导转化拟南芥和烟草，获得了拟南芥转化植株和烟草抗性芽。(5)用100mMH2O2分别处理转基因拟南芥叶片和对照，结果显示ZjNAC3、ZjNAC54、ZjNAC73过表达的转基因拟南芥叶片中CAT和SOD活性在0~18d都比对照高，表明了这3个基因可能是潜在的对生物胁迫有重要作用的功能基因。下一步，我们将进一步验证差异表达的3个NAC基因的功能。通过功能预测我们得出：ZjNAC73基因有抗盐抗旱的功能，并参与ABA信号通路；ZjNAC3转录因子参与ABA信号通路。因此，我们可以设计盐胁迫和干旱胁迫以及进行ABA处理，来探究不同时期转录因子表达量的变化情况，并进行与抗盐抗旱以及ABA信号通路相关基因的表达分析，以及进行相关生理生化分析等。还可以利用枣遗传转化体系，构建3个NAC基因的抑制表达载体，分别实现3个基因在枣体内的加强和抑制表达，明确这3个基因的功能及其在枣疯病发生过程中的作用，为植原体病害发生的分子机理研究和枣疯病的防治做参考。４９ 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IdentificationandfunctionpredictionofdifferentialexpressedjujubeNACtranscriptionfactorsduringjujubewitches’broompathologicalprocessABSTRACTJujubeWitchesBroomisakindofjujubediseasecausedbyphytoplasma.Atthetimeofonset,therewerephenomenasuchasplexusbranching,yellowing,andflowerreturning.Andthen,itgotweakandreductionofoutput,andfinallyitbecametodeath.Thisisthemostseriousjujubedisease.Atpresent,inviewofthegenomesequenceofjujubewitches’-broomphytoplasmaanditspathogenicfactorsareunclear,thereforeourlaboratoryareplanningtofindthegeneswhichareaffectedbythephytoplasmainfectionexpressingconfusedlyandleadtophenotypessuchasplexus,yellowing,lowerreturningandsoon.Somestudieshaveshownthatafterphytoplasmainvadesplants,itspathogenicfactorscaninteractwithtranscriptionfactorsofplants,therebyaffectingexpressionofdownstreamgene.Thisstudystartedwiththeplant-specificNACtranscriptionfactorfamily,identifieditsmembersandperformedbioinformaticsanalysis.Andthenwegraftedthediseasedjujubebranchesontothehealthyjujubeseedlings,makingthephytoplasmatoinfectthehealthyjujubeseedlings.Judgingbythephenotypicobservationoftheprocessofjujubewitches’-broomandthedetectionofthedistributionofphytoplasma,wedeterminedthecriticalperiodofjujubewitches’-broom.Usinghigh-throughputsequencingtechnology,thetranscriptomedataofdiseasedjujubeseedlingsandhealthyseedlingsatdifferentstageswereanalyzedtofindNACtranscriptionfactorsthatweredifferentiallyexpressedduringthejujubedisease.Next,weperformfull-lengthcloningandfunctionpredictionproceedingfromtheNACtranscriptionfactorsinthesedifferentiallyexpressedtranscriptionfactors,andconstructover-expressionvectorswhichwerethentransformedintotobaccoandArabidopsisthalianatoidentifytheirfunctions.Themainresultsareasfollows:(1)Throughgraftingspreadmethod,themobidityextentofphytoplasmawasdetectedbyPCRintheprocessofphytoplasmainfectionofjujube.GenomicRNAwasextractedfromdifferentstagesofphytoplasmainfectioninjujubefortranscriptomesequencing.eighty-fourNACtranscriptionfactorswereidentifiedaccordingtothedataoftranscriptomecombinedwithNCBIdatabase.Thephylogenetictree,chromosomelocalization,domain,andmotifwereanalyzed.WeanalyzedtheexpressionofNACtranscriptionfactorindifferentstagesofphytoplasmainfection.Theresultsshowedthatallofthe84NACtranscriptionfactorsinjujubecontainedtheconservedNAMdomainandwereunevenlydistributedon12chromosomesofjujube.(2)ThegeneexpressionheatmapanalysisofNACtranscriptionfactorgenesinjujubetreesatdifferentstagesofphytoplasmainvasion.Theexpressionlevelsof36NACtranscriptionfactorgenesweredetectedinthetranscriptomedata.Aftermappingtheheatmaps,36ZjNACtranscriptionfactors５５ whichexpressiontrendsweresimilarcouldbedividedinto6groups.Theresultsshowedthatinadditiontothe2genesofthefifthgroup,theremaining34geneswereup-regulatedinthelatestagesofdisease.DifferentiallyexpressedZjNAC3,ZjNAC41,ZjNAC49,ZjNAC54,ZjNAC55andZjNAC73transcriptionfactorswereselectedforRT-PCRidentificationinaccordancewiththeexpressiontrendsofthetranscriptomedata.ThetrendoftheexpressionlevelsofZjNAC3,ZjNAC54,ZjNAC73thesethreegenesinRT-PCRvalidationwassimilartothatoftranscriptomedataanalysis,andtherelativeexpressionlevelsinthelaterstagesofthethreegeneschangedgreatly,indicatingthatthesegenesmayplayaregulatoryroleintheresistanceofjujubetophytoplasmainfection.(3)OverexpressionvectorsofZjNAC3,ZjNAC54,andZjNAC73geneswereconstructedandtransformedintotobaccobyAgrobacterium-mediatedtransformation.7resistantZjNAC3resistantbuds,4resistantZjNAC54resistantbuds,and3ZjNAC73resistanttransgeniclineswereobtained.(4)OverexpressionvectorsofZjNAC3,ZjNAC54,andZjNAC73geneswereconstructedandtransformedintoArabidopsisthalianabyAgrobacterium-mediatedtransformation.6resistantZjNAC3Arabidopsisthalianatransgenicplants,10ZjNAC54transgenicArabidopsisplantsand10ZjNAC73transgenicplantswereobtained.Thetransgenicleavesandthecontrolweretreatedwith100mMH2O2.TheresultsshowedthattheactivityofCATandSODinthetransgenicArabidopsisthalianawerehigherthanthecontrolfrom0to18days,indicatingthatthesethreegenesmaybethefunctionalgenethatplaysanimportantroleinbioticstress.BasedonthestudyofthefunctionofNACtranscriptionfactors,wedefineditsmechanismintheprocessofjujubediseaseandmadereferenceforthemolecularmechanismofJujubeWitchesBroomandpreventionandtreatmentofJujubeWitchesBroom.Keywords:jujube;jujubewitchesbroom;NAC;genetictransformation５６