《牛口蹄疫合成肽疫苗的研制及口蹄疫病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
■■．■．．论文编号：：密级，：中国农业科学院学位论文牛口蹄疫合成肽疫苗的研制及口蹄疫病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的研究．ｏｆ－ＥｆｆｉｃａｃｙＳｎｔｈｅｔｉｃＰｅｔｉｄｅＣａｎｄｉｄａｔｅＶａｃｃｉｎｅｓＡｇａｉｎｓｔｙｐｅ－ｉｎＣａｔｔｎｒａｃｎＳｅｒｏｔＡＦＭＤＶｌｅａｎｄＡｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅＩｔｅｔｉｏｙｐｙｂｅｔｗｅｅｎＦＭＤＶＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＨｏｓｔＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｔｅｉｎｓ？－－．．．．、．．博士研究生：张中旺－一．．．指导教师：王永录研究员申请学位类别：农学博士专业：兽医学研究方向：动物及分子疫学培养单位：兰州兽医研究所研究生院２０１５年５月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文牛口蹄疫合成肽疫苗的研制及口蹄疫病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的研究EfficacyofSynthetic-PeptideCandidateVaccinesAgainstSerotype-AFMDVinCattleandAnalysisoftheInteractionbetweenFMDVProteinsandHostCellularProteins博士研究生：张中旺指导教师：王永录研究员申请学位类别：农学博士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗及分子免疫学培养单位：兰州兽医研究所研究生院2015年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationEfficacyofSynthetic-PeptideCandidateVaccinesAgainstSerotype-AFMDVinCattleandAnalysisoftheInteractionbetweenFMDVProteinsandHostCellularProteinsPh.D.Candidate：ZhangZhongwangSupervisor：ProfessorWangYongluMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:AnimalVaccinesandMolecularImmunologyMay2015 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成。果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名、：派故时间：年５月％日ｆ关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留，§、使用学位论文的规定卩：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。｜研宄生签名：沿二时间：年Ｓ月如日导师签名：时间ｊ年曰 中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表牛口蹄疫合成肽疫苗的研制及口蹄疫病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互论又忒目作用的研究￣￣＿７ＴＴＴＴ预防兽医动物疫苗与分子免疫业＋肛｜本、丨丨，｜｜｜论又作者张中旺专业研九万向＃＿指导教师王永录培养单位（研究所、中心）兰州兽医研究所姓名职称单位专业签名硕导口评博导口硕导口阅博导口人硕导口１ｆ￣答＾＼余四九教授甘肃农业大学临床兽医学｜＾丨业十杨孝朴教授甘肃农大学基础兽医学魏彦明教授甘肃农业大学临麵床兽医学常惠芸石开究员兽医学ｔｍｍＺｔＩ张杰職员麵兽医学ｎ，员ＨＤｉｌｉｒｎ＾〇硕导中国农业科学院■ＯＡＷ）／？／ｌＰ）孙跃峰开九贝ｈ防〇？医子博导口兰州兽医研究所硕＇导口博导口会议记录（秘书）周鹏地论文答辩时间点２０１６－５－１６兰州兽医研究所科研楼四楼会议室 摘要口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是一种具有高度传染性和极具经济破坏性的病毒性疾病，主要感染牛、羊等反刍动物、猪以及某些野生类偶蹄动物。口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)是引发该病的病原体，隶属小RNA病毒科口蹄疫病毒属。虽然针对FMD采取了严格的检疫制度以及疫苗接种等防控措施，但在我国及世界其它地区仍时有发生。研制更加安全有效的FMD新型疫苗具有重要性和紧迫性。VP1是FMDV最重要的结构蛋白和免疫原性蛋白，常被广泛应用于各种新型基因工程疫苗的研究。VP1蛋白通过与病毒自身编码蛋白或宿主细胞蛋白相互作用而在病毒感染和抗宿主免疫等方面发挥多种功能。2B蛋白是FMDV的一个非结构蛋白，具有多种活性，在FMDV感染和释放以及诱导自噬等过程中发挥重要作用。只有彻底了解FMDV蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用关系及其发挥作用的各种机制，才能研制出更加安全有效的疫苗来预防该病。本研究初步研制了牛FMD合成肽疫苗，探索了作为新型疫苗主要候选元件的VP1蛋白与宿主的相互作用，并研究了非结构蛋白2B的宿主互作蛋白及其功能，为深入了解FMDV致病的分子机理以及研制新型疫苗提供了新思路和理论依据。本研究所获得的主要结果如下：1．以FMDVA/HuBWH/CHA/2009流行毒株结构蛋白VP1上129～169位氨基酸、非结构蛋白3A上21～35位氨基酸、3D上346～370位氨基酸为基础表位片段，设计并构建了三组A型FMD合成肽疫苗，分别在豚鼠和牛体内进行了免疫效力评价。结果显示以PB组，即3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(T→C)～156(Q→C)～169)，免疫动物产生的中和抗体滴度最高，攻毒保护效力最强。用其以50µg/只的剂量免疫豚鼠2次，可100%的抵抗同型病毒的攻击；以100µg/头份的剂量免疫牛1次，可达到60%的保护率。因此PB合成肽，有希望发展成为生产实践中有效的牛FMD合成肽疫苗。本研究为进一步发展和完善FMD合成肽疫苗奠定了一定的基础。2．采集经FMDV感染七天后的长白猪敏感组织，构建了高质量的cDNA表达文库。利用分裂-泛素酵母双杂交系统，以FMDVVP1为诱饵蛋白筛选猪组织cDNA文库，结果发现宿主细胞蛋白zyxin的C末端第329~572位氨基酸能够与FMDVVP1蛋白发生相互作用。利用免疫共沉淀技术以及激光共聚焦技术，进一步验证了FMDVVP1蛋白与宿主细胞蛋白zyxin确实存在相互作用且在细胞中存在共定位。在研究zyxin蛋白对FMDV增殖的作用中发现，BHK-21细胞中zyxin蛋白的表达量随FMDV感染时间上调。之后，利用靶向zyxin基因的特异性干扰小RNA分子沉默细胞内源性zyxin蛋白的表达，经TaqMan荧光定量PCR检测和细胞毒价检测，发现下调zyxin蛋白的表达可抑制FMDV在细胞中的增殖，相反，过表达zyxin蛋白时可促进FMDV的增殖。3．以FMDV2B为诱饵蛋白筛选猪组织cDNA文库，发现宿主细胞蛋白eEF1G的第208~437位氨基酸能够与FMDV2B蛋白相结合。通过免疫共沉淀技术以及激光共聚焦技术，进一步证实FMDV2B蛋白与eEF1G蛋白确实存在相互作用且在细胞中存在共定位。在研究eEF1G蛋白对FMDV增殖的作用中发现，细胞eEF1G表达的上调促进FMDV的增殖，而eEF1G表达的敲低则抑制FMDV的增殖。这一发现与eEF1G的表达量随FMDV感染上调的试验结果一致。关键词：口蹄疫病毒，合成肽疫苗，病毒-宿主相互作用，VP1，2BI AbstractFoot-and-mouthdisease(FMD)isoneofthemostcontagiousandeconomicallyimportantviraldiseasesaffectingcloven-hoofedanimals,includingruminants,swine,andcertainwildungulates.Theetiologicalagent,foot-and-mouthdiseasevirus(FMDV),belongstothegenusAphthovirusofthefamilyPicornaviridae.Althoughacomprehensivecontrolstrategyincludingquarantine,surveillance,andvaccinationhasbeenproperlyused,FMDstilloccurredinchinaandotherpartsoftheworld.AnurgentneedexistsfordevelopingasafeandeffectivevaccinethatpreventsanimalsfrombecominginfectedorprogressingtoFMD.VP1isthemajorstructuralandmostimmunogenicproteinofFMDV.Itcanelicittheneutralizingantibodiesastherearemanycriticaldeterminantsonitandhasaroleinvirusattachment.ThisindicatesthatVP1isanattractivetargetfortheproductionofnewgeneticallyengineeredvaccinesagainstFMD.VP1isrecognizedasakeyfactoroftheFMDVlifecycle,andexhibiteditsmultiplefunctionsviainteractionswithvarioushostandviralproteins.ThenonstructuralproteinsareinvolvedinFMDVreplication,andinhibitthehostimmuneresponse.The2BproteinhasbeenimplicatedresponsibleforcellmembranerearrangementsandfunctioninFMDVinfection,releaseandautophagy.DespitearecentincreaseinstudiesoftheproteinsofFMDV,knowledgeoftheircellulartargetsandthefunctionsofvirus-hostinteractionsremainlimited,thisknowledgegapsignificantlylimitsfurtherunderstandingofFMDVbiologyandtherationaldevelopmentofmoresafeandeffectivevaccines.Inthisstudy,weconstructedanefficacioussynthetic-peptidevaccineagainstserotypeAFMDVforuseincattle.WeexploredtheinteractingpartnersofVP1inhostcellsandtheeffectsoftheinteractionontheFMDVlifecycle.Andweinvestigatedtherolesof2Binvirus-hostinteractions.TheresultsofourstudyprovideempiricaldataforfacilitatingthedevelopmentofnovelvaccineagainstFMD,andfurtherourunderstandingofthepossiblecellularmechanismsinvolvedinFMDVinfection.Theresultswereshownasfollows:1.Wedesignedthreesynthetic-peptidevaccines,59to87aainsize,basedonimmunogenicepitopesintheVP1,3A,and3DproteinsoftheA/HuBWH/CHA/2009strainoftheFMDV,correspondingtoaminoacidpositions129to169ofVP1,21to35of3A,and346to370of3D.Theefficaciesofthevaccineswereevaluatedincattleandguineapigschallengedwithserotype-AFMDV.Allofthevaccineselicitedtheproductionofvirus-neutralizingantibodies.ThePBpeptide,whichcontainedsequencescorrespondingtopositions129to169ofVP1and346to370of3D,demonstratedthehighestlevelsofimmunogenicityandimmunoprotectionagainstFMDV.Twodosesof50µgofthesyntheticPBpeptidevaccineprovided100%protectionagainstFMDVinfectioninguineapigs,andasingledoseof100µgprovided60%protectionincattle.Thesefindingsprovideempiricaldataforfacilitatingthedevelopmentofsynthetic-peptidevaccinesagainstFMD.2.WeinvestigatedtherolesofVP1invirus-hostinteractionsbyconstructingacDNAlibraryobtainedfromFMDV-infectedswinetissues,andusedasplit-ubiquitinbasedyeasttwo-hybridsystemtoidentifyhostproteinsthatinteractedwithVP1.WefoundthatVP1interactedwithaminoacids329~572intheC-terminalregionofthezyxin,whichcontainingthreeLIM-domains.TheVP1-zyxinII interactionwasconfirmedbythecoimmunoprecipitationofVP1andzyxinandthecolocalizationofVP1andzyxininHEK293Tcells.WealsofoundthattheexpressionofzyxinwasupregulatedinFMDV-infectedBHK-21cells,andthattheoverexpressionofzyxinpromotedFMDVreplication,whereasthesmallinterferingRNA-mediatedknockdownofzyxinexpressionsuppressedtheproductionofinfectiousvirions.ThisisthefirstreportoftheroleofcellularzyxininFMDVreplication.OurfindingsprovideimportantinsightintomechanismsofFMDV-hostinteractionsandtheirrolesinvirusreplication.3.Togaininsightintotheroleofthe2BproteinintheFMDVlifecycle,weperformedtheyeasttwo-hybridassayusingFMDVprotein2BasthebaitandtheconstructedswinecDNAlibraryasthepreytoscreenthe2B-interactingproteins.Theaminoacids208~437intheC-terminalregionoftheeEF1Gsubunitofeukaryoticelongationfactor1,whichisessentialforproteinsynthesis,wasidentifiedtobeaspecifichostbindingpartnerofFMDV2B.Theinteractionbetween2BandeEF1Gwasconfirmedbyco-immunoprecipitaionandconfocalassays.TodeterminewhethereEF1GmodulatesFMDVreplication,weevaluatedthereplicationofFMDVincellsinwhicheEF1Gexpressionwasupregulatedordownregulated.TheresultsoftheqRT-PCRanalysisandthevirustiterassayshowedthattheoverexpressionofeEF1GpromotedFMDVreplication,whereastheknockdownofeEF1GexpressionsuppressedthereplicationofFMDV.ThisfindingisconsistentwiththeupregulationofeEF1GexpressionafterFMDVinfection.TheresultsofourstudyprovidedimportantinformationregardingthemechanismsofFMDVreplicationandtheinteractionsbetweenthevirusandeEF1G.Keywords:Foot-and-mouthdiseasevirus,Synthetic-peptidevaccines,Virus-hostinteractions,VP1,2BIII 目录第一章引言...................................................................................................................11.1口蹄疫与口蹄疫病毒..........................................................................................11.2口蹄疫病毒蛋白及其功能...................................................................................11.2.1结构蛋白及其功能.....................................................................................11.2.2非结构蛋白及其功能..................................................................................21.3FMD合成肽疫苗的研究进展..............................................................................41.4酵母双杂交技术的研究进展................................................................................61.4.1酵母双杂交技术的基本原理.....................................................................71.4.2酵母双杂交技术的优越性与局限性..........................................................71.4.3酵母双杂交技术的改进与发展.................................................................81.4.4酵母双杂交技术的应用.............................................................................91.5FMDV与宿主相互作用的研究进展..................................................................101.6本研究的目的和意义........................................................................................10第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价........................................122.1材料....................................................................................................................122.1.1动物试验的伦理准则................................................................................122.1.2试验动物...................................................................................................132.1.3毒株与细胞..............................................................................................132.1.4主要试剂耗材和仪器................................................................................132.1.5实验所用溶液及其配制...........................................................................132.2方法....................................................................................................................132.2.1FMDVA/HuBWH/CHA/2009TCID50的测定..........................................142.2.2FMDVA/HuBWH/CHA/2009对豚鼠ID50的测定..................................142.2.3抗原表位基因的选择、组合以及合成....................................................142.2.4PA、PB、PC三组合成肽疫苗免疫豚鼠效力试验..................................15IV 2.2.5PB合成肽疫苗免疫豚鼠最小有效剂量的测定.......................................162.2.6PA、PB、PC三组合成肽疫苗牛体免疫保护效力试验..........................172.2.7统计分析..................................................................................................182.3结果...................................................................................................................182.3.1FMDVA/HuBWH/CHA/2009株TCID50的测定结果..............................182.3.2FMDVA/HuBWH/CHA/2009株对豚鼠ID50的测定结果.......................182.3.3PA、PB、PC三组合成肽疫苗免疫豚鼠试验结果..................................192.3.4PB合成肽疫苗最小有效免疫剂量的测定结果.......................................212.3.5牛免疫效力试验结果...............................................................................222.4讨论...................................................................................................................23第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究..........................................................263.1材料...................................................................................................................263.1.1试剂与试剂盒...........................................................................................263.1.2毒株与细胞..............................................................................................283.1.3主要仪器、耗材.......................................................................................283.1.4实验所用溶液及其配制...........................................................................283.2方法...................................................................................................................303.2.1引物设计与合成......................................................................................303.2.2猪组织cDNA表达文库的构建...............................................................313.2.3O型FMDVVP1基因的扩增与克隆.......................................................313.2.4O型FMDVVP1诱饵表达载体的构建...................................................353.2.5重组诱饵表达载体转化酵母菌NMY51.................................................363.2.6DUALhunter系统功能验证以及诱饵载体自激活检测...........................383.2.7利用酵母双杂交方法以VP1为诱饵蛋白筛选猪组织cDNA文库........383.2.8免疫共沉淀技术验证VP1蛋白与zyxin蛋白的相互作用.....................413.2.9激光共聚焦技术检测VP1与zyxin在细胞中的共定位.........................43V 3.2.10FMDV感染对细胞zyxin表达的影响...................................................433.2.11干扰zyxin的表达对FMDV增殖的影响..............................................443.2.12宿主细胞zyxin过表达对FMDV增殖的影响.......................................453.2.13统计分析................................................................................................453.3结果...................................................................................................................463.3.1猪组织总RNA的提取和鉴定..................................................................463.3.2猪组织cDNA表达文库的质量鉴定.......................................................463.3.3重组克隆载体pMD18T-VP1的构建.......................................................473.3.4诱饵表达载体pDHB1-VP1的构建..........................................................483.3.5酵母菌株NMY51基因型的检测.............................................................493.3.6诱饵载体pDHB1-VP1转入酵母菌NMY51及其毒性检测....................493.3.7DUALhunter系统功能验证以及诱饵载体自激活检测...........................503.3.8以VP1为诱饵蛋白利用酵母双杂交方法筛选猪组织cDNA文库.........513.3.9免疫共沉淀技术验证VP1蛋白与zyxin蛋白的相互作用.....................533.3.10激光共聚焦技术检测VP1与zyxin在细胞中的定位...........................553.3.11FMDV感染诱导zyxin表达量上调.......................................................563.3.12干扰zyxin的表达抑制FMDV的增殖..................................................573.3.13上调zyxin表达促进FMDV的增殖.....................................................583.4讨论....................................................................................................................58第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究............................................................604.1材料...................................................................................................................604.2方法....................................................................................................................614.2.1引物设计与合成.......................................................................................614.2.2FMDV2B诱饵表达载体的构建..............................................................614.2.3FMDV2B诱饵表达载体的毒性和自激活效应检测...............................624.2.4诱饵载体pBT3-N-2B筛选猪组织cDNA文库......................................62VI 4.2.5免疫共沉淀技术验证2B蛋白与eEF1G蛋白的相互作用......................624.2.6激光共聚焦技术检测2B与eEF1G在细胞中的共定位..........................634.2.7FMDV感染对细胞eEF1G表达的影响...................................................634.2.8干扰eEF1G的表达对FMDV增殖的影响.............................................634.2.9宿主细胞eEF1G过表达对FMDV增殖的影响......................................634.2.10统计分析................................................................................................644.3结果...................................................................................................................644.3.1诱饵表达载体pBT3-N-2B的构建...........................................................644.3.2诱饵表达载体pBT3-N-2B的毒性和自激活效应检测............................644.3.3诱饵载体pBT3-N-2B筛选猪组织cDNA文库.......................................664.3.4免疫共沉淀技术验证2B蛋白与eEF1G蛋白的相互作用......................684.3.5激光共聚焦技术检测2B与eEF1G在细胞中的共定位..........................694.3.6FMDV感染诱导宿主细胞蛋白eEF1G表达量上调................................704.3.7干扰eEF1G的表达抑制FMDV的增殖..................................................704.3.8过表达eEF1G促进FMDV的增殖.........................................................714.4讨论....................................................................................................................72第五章全文结论...........................................................................................................74参考文献.........................................................................................................................75致谢...............................................................................................................................86作者简历.........................................................................................................................87VII 图表目录图1-1FMDV基因组及结构............................................................................................2图1-2分裂-泛素化酵母双杂交系统................................................................................9图2-1豚鼠血清FMDV特异性抗体水平动态变化结果...............................................20图3-1DUALhuntersystem载体信息图........................................................................27图3-2总RNA定量结果................................................................................................46图3-3总RNA电泳结果................................................................................................46图3-4cDNA表达文库的库容量鉴定............................................................................47图3-5cDNA表达文库的PCR鉴定..............................................................................47图3-6重组克隆载体pMD18T-VP1的构建...................................................................48图3-7诱饵表达载体pDHB1-VP1的构建.....................................................................48图3-8酵母菌株NMY51基因型的检测........................................................................49图3-9诱饵载体pDHB1-VP1毒性检测.........................................................................49图3-10诱饵载体pDHB1-VP1转入酵母菌株的PCR鉴定..........................................50图3-11DUALhunter系统功能验证以及诱饵载体pDHB1-VP1自激活检测...............51图3-12诱饵载体pDHB1-VP1筛选猪组织cDNA文库...............................................52图3-13以pDHB1-VP1为诱饵筛选到的阳性克隆PCR结果......................................52图3-14pPR3N-zyxin与pDHB1-VP1酵母共转化验证阳性克隆.................................53图3-15真核表达载体pMyc-VP1的构建......................................................................54图3-16真核表达载体pFLAG-zyxin的构建.................................................................54图3-17免疫共沉淀验证VP1与zyxin的相互作用......................................................55图3-18激光共聚焦技术检测VP1蛋白与zyxin蛋白在细胞中的共定位....................56图3-19FMDV感染诱导zyxin表达量上调..................................................................56图3-20干扰zyxin的表达抑制FMDV的增殖..............................................................57图3-21上调zyxin表达促进FMDV的增殖.................................................................58图4-1诱饵载体pBT3-N信息图....................................................................................61VIII 图4-2诱饵表达载体pBT3-N-2B的构建......................................................................64图4-3诱饵表达载体pBT3-N-2B毒性检测..................................................................65图4-4诱饵表达载体pBT3-N-2B自激活效应检测.......................................................65图4-5诱饵载体pBT3-N-2B筛选猪组织cDNA文库...................................................66图4-6以pBT3-N-2B为诱饵筛选到的阳性克隆PCR结果..........................................67图4-7pBT3-N-2B与pPR3-N-eEF1G酵母共转化验证阳性克隆.................................67图4-8真核表达载体pMyc-2B的构建..........................................................................68图4-9真核表达载体pFLAG-eEF1G的构建.................................................................68图4-10免疫共沉淀验证2B与eEF1G的相互作用......................................................69图4-11激光共聚焦技术检测2B蛋白与eEF1G蛋白在细胞中的共定位....................69图4-12FMDV感染诱导eEF1G表达量上调................................................................70图4-13干扰eEF1G的表达抑制FMDV的增殖...........................................................71图4-14过表达eEF1G促进FMDV的增殖...................................................................72表2-1合成肽的设计、组合及具体氨基酸序列............................................................15表2-2FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株TCID50的测定.............................................18表2-3FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株对豚鼠ID50的测定......................................19表2-4合成肽疫苗豚鼠免疫及攻毒保护效力................................................................20表2-5PB合成肽疫苗最小有效免疫剂量的测定..........................................................21表2-6合成肽疫苗免疫牛保护效力试验结果................................................................23表3-1酵母双杂交方法筛选出的VP1的互作蛋白.......................................................53表4-1酵母双杂交方法筛选出的2B的互作蛋白.........................................................67IX 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称aaaminoacid氨基酸+AmpAmpicillin氨苄青霉素ATPAdenosine-triphosphate三磷酸腺苷BHK-21Babyhamsterkidneycells幼仓鼠肾细胞bpBasepair碱基对cDNAComplementaryDNA互补DNACo-IPCoimmunoprecipitation免疫共沉淀CPEcytopathiceffect细胞病变dDay天DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAB3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride3,3’-二氨基联苯胺DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸eEFIGeukaiyotictranslationelongationfactor1G真核翻译延伸因子1GELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验E.coliEscherichiaColi（拉）大肠埃希杆菌FBSfetalbovineserum胎牛血清FITCFluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素FMDFoot-and-mouthdisease口蹄疫FMDVFoot-and-mouthdiseasevirus口蹄疫病毒ggramorunitofgravityforce克或离心力单位GAPDHglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶hHour小时HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IFNinterferon干扰素IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GKanKanamycin卡那霉素KbKilobase千碱基kDakilodalton千道尔顿LLiter升LBLyriabrothLB培养基minMinute分钟mLMilliliter毫升X 英文缩略表（续）英文缩写英文全称中文名称mmolMillimole毫摩尔molmole摩尔MOImultiplicityofinfection感染复数mRNAmessengerRNA信使RNANCnitrocellulose硝酸纤维素ODOpticaldensity光密度PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应pHHydrogenionexponentpH值(氢离子当量浓度指数)RNaseRibonuclease核糖核酸酶RT-PCRReversetranscriptionPCR反转录PCRsSecond秒SDSyntheticdropoutmedia酵母选择性营养缺陷培养基SDS-PAGEsodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelSDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳electrophoresissiRNASmallinterferingRNA小干扰RNAY2Hyeasttwo-hybridsystem酵母双杂交系统TCID50Mediumtissuecultureinfectivedose半数组织细胞感染量TRITCTetramethylrhodamineisothiocyanate四甲基异硫氰酸罗丹明Uunit单位UTRUntranslatedregion非翻译区ZYXZyxin斑连蛋白µgMilligram微克µLmicrolitre微升β-MEβ-mercaptoethanolβ-巯基乙醇XI 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言1.1口蹄疫与口蹄疫病毒口蹄疫(Foot-and-MouthDisease,FMD)是一种具有高度传染性的病毒性动物疫病。猪、牛、山羊和绵羊等主要畜种是该病的易感动物，其它家养和野生偶蹄动物如鹿、骆驼、羚羊、非洲水牛等都可感染此病，据报道，人和其他非偶蹄动物偶尔也可被感染，但病例很少，表现轻微(Alexandersenetal.,2005)。不同种动物的临床症状不尽相同，大多数患病动物表现为发热、精神沉郁、厌食、流涎、跛行和卧地，以口、舌、齿龈、口腔黏膜、唇、鼻、蹄和母畜乳头等部位发生水泡和溃烂为特征。FMD的发病率为100％，当一头动物被感染，将很快传遍整个畜群或饲舍。大多数成年动物虽可以康复，但会造成生产能力和体重下降。幼畜则常因合并发生肠炎或心肌炎而突然死亡，病死率达80%以上，严重时可达100％。FMD作为目前国内外最具影响的动物疫病之一，在世界范围内广泛存在，该病的暴发和流行，不仅对畜牧业的健康发展造成严重的危害，而且还造成巨大的经济损失，影响国家声誉，成为发达国家限制发展中国家畜产品出口的一项技术壁垒(Abdul-Hamidetal.,2011;Kleinetal.,2009;PerryandRich2007)。被联合国粮农组织和国际兽疫局列为法定必报病，被我国农业部列为一类传染病，是各国严格防控和检疫的关键对象。口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseasevirus,FMDV)是感染偶蹄动物引发FMD的病原因子。该病毒在分类上属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属。FMDV由基因组和衣壳组成，病毒基因组为单股正链RNA，具有感染性，全长约8.5kb，包括一个长的开放读码框(openreadingframe，ORF)，以及5’端和3’端的非翻译区(untranslatedregion，UTR)。5’UTR长约1300nt，与VPg共价结合。包括S-片段、poly(C)、3~4个假结节、顺式复制元件以及内部核糖体进入位点（IRES）。起着稳定RNA、调控病毒蛋白翻译和RNA复制的作用。３’端链接一个poly(A)尾巴。ORF编码4种结构蛋白，分别是VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）和VP1（1D）；并编码9种非结构蛋白，分别是Lab,Lb,2A,2B,2C,3A,3B,3C和3D(Domingoetal.,2002)。衣壳由各60个拷贝的4种结构蛋白VP4、VP2，VP3和VP1组成。衣壳包裹一个分子的RNA形成一个完整的病毒粒子（图1-1）。FMDV的抗原结构十分复杂，存在广泛的抗原变异，目前已知七个型，包括A型、O型、C型、亚洲1型（Asia1）、南非1型（SAT1）、南非2型（SAT2）和南非3型（SAT3），每个型又包括很多亚型(Racanielloetal.,2001)。不同型之间不能产生交叉免疫，但临床症状相同，无法以此来鉴别FMDV的型，从而加剧了该病疫苗免疫、诊断和防控的困难(GrubmanandBaxt2004；Kitchingetal.,1989;Knowlesetal.,2003)。1.2口蹄疫病毒蛋白及其功能1.2.1结构蛋白及其功能FMDV结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各一分子组成一个原粒，每五个原粒形成一个五聚体，十二个五聚体聚合成病毒衣壳，呈正二十面体对称结构，保护RNA免遭核酸酶降解，指导选择、包装RNA以及释放和传递RNA进入宿主细胞内。结构蛋白VP1、VP2、VP3裸露于病1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言毒衣壳表面，具有相似的核心结构，由反向平行的8股肽链β-桶折叠组成，呈楔型。肽链折转时从N端依次形成4个环，即：B-C、C-D、E-F和G-H环。环和C端位于衣壳表面，而N端则位于衣壳内部，这些环结构和C端是FMDV的主要抗原位点的集聚区，决定着病毒的抗原性。不同血清型FMDV的结构蛋白氨基酸组成数不同。其中，差异最大的是VP1。其次是VP3和VP2。图1-1FMDV基因组及结构Fig.1-1GenomeorganizationofFMDVandthestructureofvirus(JamalandBelsham2013)O型FMDVVP1蛋白由213个氨基酸组成，包含两个高变异区段，一个位于G-H环的141~160残基，含有高度保守的整联蛋白细胞粘附位点Arg-Gly-Asp(RGD)基序，即145-146-147残基，是病毒与整联蛋白作用的关键结构域，决定宿主范围和组织嗜性。RGD三肽基序侧翼的+1和+4位是两个高度保守的亮氨酸，能促进细胞识别。此区段是FMDV诱导宿主产生中和抗体的主要抗原位点。另一个是位于200~213位氨基酸组成的C-端区段，是FMDV的次要抗原位点。O型FMDVVP2蛋白由218个氨基酸组成，较为保守，具有抗原性。O型FMDVVP3蛋白由220个氨基酸组成，是小RNA病毒结构蛋白中最为保守的，其N端形成五股β-桶，在五重轴周围使原聚体紧密结合成五聚体。O型FMDVVP4蛋白由85氨基酸组成，与VP1、VP2、VP3完全不同，VP4蛋白是位于内部的，它的N端靠近五重轴，含有一个共价链接的十四烷基，参与五聚体的装配以及VP4的释放，可能与受体封闭、脱壳或衣壳形成有关。1.2.2非结构蛋白及其功能2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言proFMDV非结构蛋白是指由病毒基因编码但不参与衣壳组成的蛋白。包括前导蛋白酶(L)、propol2A、2B、2C、3A、3B、3C蛋白酶(3C)和3D聚合酶(3D)及它们的前体。与结构蛋白相比，FMDV非结构蛋白的氨基酸变异率低，较为保守。它们参与病毒的复制、结构蛋白的折叠与装配propro以及抑制宿主的免疫反应。L、3C具有蛋白酶活性，参与病毒多聚蛋白的裂解和某些宿主细胞蛋白的剪切(Ryanetal.,2004)。pro（一）前导蛋白酶(L)proL是一种木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，具有自身裂解活性，能将自身从延伸的多聚蛋白pro的N端催化分离(Hintonetal.,2002;Kleinaetal.,1992;Skernetal.,1998;Strebeletal.,1986)。L也具有分子间裂解活性，能裂解宿主翻译起始因子eIF4G，从而阻断有帽结构的mRNA的翻译，而这对于翻译mRNA是利用核糖体进入位点（IRES）的非依赖加帽机制的FMDV是不受影响的。这样就阻断了宿主细胞的翻译而达到合成子代病毒的目的(Belshametal.,1990;Devaneyetal.,1988;proproGlaseretal.,2001;Kuhnetal.,1990)。研究表明L是FMDV的一个毒力决定因子，缺失L的病毒对细胞的致病性低于野生型病毒，接种牛不引起发病，在猪体内的致病性也大大减弱((Brownetal.,pro1996;Chinsangarametal.,1998;Chinsangarametal.,1999)。大量研究发现L采用多种机制抵抗宿pro主细胞的天然免疫应答：通过L诱导的宿主蛋白合成的关闭抑制感染细胞内IFN的表达(Steinbergeretal.,2014)；通过降解细胞核内活化的NF-ĸB或抑制干扰素调节因子3/7(IRF-3/7)的表达，从而抑制IFN-β的转录(Santosetal.,2006)；作为一种去泛素化酶，通过切割Ⅰ型IFN信号通路中关键信号分子，如维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、TNF受体相关因子3(TRAF3)和TRAF6的泛素化标签，从而抑制Ⅰ型IFN信号通路的活化(Wangetal.,2011;Zhaoetal.,2013)；以及通过激活某些小RNA病毒IRES元件的活性等机制以降低细胞对抗病毒应答的能力。（二）2A、2B和2C2A序列阻碍2A/2B链接处的肽键的构成，使FMDV在2A的C末端发生初级裂解，形成P1-2A前体。2B基因有462个核苷酸，编码154个氨基酸。研究表明，2B蛋白包含两个疏水区域，主要定位于细胞的内质网。2B蛋白具有类似孔道蛋白的特性，在宿主细胞中可形成一个跨膜孔径，破坏宿主细胞稳态，有助于病毒的感染和释放(Aoetal.,2015;Madanetal.,2010;Martinez-Giletal.,2011;Santosetal.,2005)。2B蛋白能够增加细胞膜的通透性，并阻止蛋白质的分泌(Bienzetal.,1987;2+Moffatetal.,2007)。2B蛋白可以增加病毒感染细胞中Ca的水平，并诱导细胞自噬(Aldabeetal.,1997;VanKuppeveldetal.,2005)。FMDV2B蛋白的其他活性还有待于进一步的研究。2C蛋白位于感染细胞胞浆内膜的周围，能与膜结合，具有多种活性，但具体功能目前还不完全清楚(Tesaretal.,1989)。2C含有解旋酶和核苷酸结合序列，虽然没有证据表明2C蛋白具有解旋酶活性，但已经证实其具有ATPase和GTPase活性(Chengetal.,2013)。还有研究发现2C参与诱导细胞凋亡(Wangetal.,2012)。（三）3A和3B3A和3AB蛋白含疏水序列，能如锚那样使它固定于胞膜上，在正链RNA合成起始时，3A蛋白能将3B锚定到RNA复制位点。研究发现在缺失了3A编码序列的FMDV对牛的致病力减弱，但对猪仍保有致病力，说明3A蛋白中的氨基酸缺失与FMDV致病性和宿主嗜性有关(Beardetal.,2000)。同时研究证明3A能增强细胞膜的通透性，阻断蛋白分泌途径(Doedensetal.,1995)。3B又称VPg。FMDV是小RNA病毒科中唯一一个编码3种相似但可分开的3B肽拷贝，即3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言VPg1(3B1)、VPg2(3B2)和VPg3(3B3)，它们的编码序列在基因组中呈串联式排列，可能与FMDV潜在的致病性和宿主谱有关(Falketal.,1992)。VPg是启动RNA合成的必要元件，以酯键共价链接正链和负链RNA的5’端，可能具有RNA合成引物的作用。在病毒RNA复制起始时，polRNA聚合酶3D将VPg修饰成VPg-pU或VPg-pU-pU，随后引导病毒RNA从3’poly（A）处开始复制(Pauletal.,2000)。此外，VPg能自我催化结合到新生的正链RNA上，这可能是一个包装信号(谢庆阁2004)。pro（四）3C蛋白酶(3C)pro3C长213个氨基酸，是一种蛋白酶，参与病毒多聚蛋白裂解及多种宿主蛋白的切割，具有pro丝氨酸蛋白酶样结构和功能((Masonetal.,2003)。研究发现3C参与宿主组蛋白H3的切割(Capozzoetal.,2002;Falketal.,1990;Tesaretal.,1990)；在FMDVRNA翻译开始减弱时部分切割翻译起始因子eIF4A，在病毒感染晚期切割转录起始因子eIF4G，阻断宿主细胞的转录以及翻译，从而抑制抗病毒基因如干扰素等的表达，以逃避宿主抗病毒天然免疫(Belshametal.,2000;Duetal.,2014)。pol（五）3D聚合酶(3D)polFMDV3D蛋白是病毒编码的RNA依赖的RNA聚合酶，又称病毒感染相关抗原(FMDvirusinfection-associatedantigen,FMD-VIAA)。长约470个氨基酸，在不同血清型与亚型中高度保守。具有蛋白酶、聚合酶等多种催化活性。以VPg-pU-pU为引物参与病毒RNA的合成；其抗体能抑制FMDVRNA的降解，故兼具核酸酶活性；是非常重要的抗病毒靶标。研究显示，FMDV非结构蛋polpol白，如3ABC和3D上分布着很多Ｔ细胞表位(Fosteretal.,1998;Yangetal.,2007)。用FMDV3D蛋白刺激经不同血清型FMDV感染的牛外周血淋巴细胞，均能引起有效增殖(Collenetal.1998)。pol用表达FMDV3D蛋白的痘苗病毒免疫猪，能够在无中和抗体的条件下使动物获得部分保护、推pol迟发病时间(Garcia-Brionesetal.,2004)。3D蛋白的免疫原性在FMDV所有非结构蛋白中是最好的，而且没有型特异性，极有可能存在保守的病毒Ｔ细胞表位，能够被不同宿主的MHC所识别。polGerner等发现位于FMDV3D蛋白上346-370位氨基酸是能被c/c和d/d单体型微型猪SLA特异识别pol的Ｔ细胞表位(Gerneretal.,2006)。以上研究提示我们3D蛋白在抗病毒药物靶标或新型疫苗的研究中很可能具有潜在价值。1.3FMD合成肽疫苗的研究进展随着世界各国交流的日益广泛和经济全球化进程的持久深入，各国政府和国际学术机构不断加强FMD研究和FMD控制计划来推进全球FMD净化和根除进程。欧洲和南美一些发达国家采取扑杀等策略相继消灭了FMD。在我国及世界大部分地区，预防和控制FMD的首要方法依然是用灭活疫苗免疫易感动物而获得保护(RodriguezandGrubman2009;Sobrinoetal.,2001)。然而FMDV具有准种特性，型多易变，宿主广泛，传播方法和感染途径多样，致病性强而免疫原性弱，无论有无免疫压力病毒均可适应机体而持续存在。目前使用的传统FMD疫苗并不理想，保护力差、保护期短（通常只有6~8个月）、不能产生交叉保护、无法区分免疫动物和自然感染动物、有免疫副反应、无法阻断宿主持续带毒现象，而且在疫苗生产过程中还存在不安全因素，如灭活不彻底、活病毒逃逸加工厂以及毒力返强等可能(Doel2003;RodriguezandGay2011;Rodriguez4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言andGrubman2009)。在这种情况下，探索和研制一种不依赖于活病毒的更加安全、高效、广谱的FMD疫苗就显得非常有必要和有吸引力。近年来，随着生物技术的不断发展和应用，FMD新型疫苗不断涌现，如基因缺失标记疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、空衣壳亚单位疫苗、可饲疫苗、合成肽疫苗等均被不断研究和尝试并取得了一些可喜的进展(Chanetal.,2001;Chinsangarametal.,1998;Masonetal.,1997;Qianetal.,2004;Lietal.,2008;Wigdorovitzetal.,1999)。自20世纪70年代以来，化学合成肽技术取得了重大进步，可以通过人工化学合成的方法获得大量高纯度高特异性的肽段，这为探索研究这些新获得分子的免疫特性继而解析病毒的结构和功能以及利用化学合成法人工合成抗原表位氨基酸制备而成具有保护性的合成肽疫苗提供了非常有用的手段。合成肽疫苗的研制为开发新型、安全的FMD疫苗提供了一条别具潜力的途径。近年来，获悉了大量有关FMDV抗原结构尤其是VP1G-H环的结构和功能方面的知识，这为研制合成肽疫苗提供了理论依据(Bittleetal.,1982;Pfaffetal.,1982)。FMDV结构蛋白和非结构蛋白上都存在着许多抗原表位，主要位于衣壳蛋白的环结构上，如VP1的B-C环，VP2的B-C、E-F环，以及VP3的B-B结节等，以形态表位居多(Collenetal.,1991;Crowtheretal.,1993;Kitsonetal.,1990)。VP1蛋白上存在两个最重要的FMDV抗原位点，分别是位于G-H环的140～160和C末端200～213位氨基酸残基组成的线型表位，它们高度易变，能够刺激机体产生抗体，140～160位肽段更是能产生与获得性免疫保护程度具有明显相关性的中和抗体。他们是早期大多数合成肽疫苗研制首选的抗原表位。早在1982年，Bittle等化学合成了O型FMDV位于VP1上第141～160位氨基酸肽段，免疫豚鼠后诱导产生了中和抗体，且保护豚鼠免受同型毒株攻击(Bittleeta1.,1982)。随后，为克服抗原表位肽单独存在时免疫原性较低的现象，学者们通过多种方法不断改进着FMD合成肽疫苗的免疫保护效率，如将多个表位串联起来形成多表位线性肽、加入内源性或外源性的T细胞表位、将合成肽与载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或霍乱毒素等连接、构建含多个分支的复合抗原肽、以及用具有佐剂活性的脂质分子共价连接于多肽链制成脂肽等等。Dimarch等合成了FMDVVP1141～158和200～213位氨基酸片段，中间以“脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸”为间隔相连，N-末端以“半胱氨酸-半胱氨酸”相连，C-末端以“脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸”相连，以此肽段免疫豚鼠后能产生相较于VP1(141～158)-ProProGly单肽段更高的抗体水平，使免疫动物获得保护，并提出了N-末端氨基酸在提高保护应答的重要性(Dimarchetal.,1986)。Zamorano等用FMDVO1CamposVP1135～160位短肽、135～144位短肽单体、串联二聚体或三聚体、以及短肽-BSA研究对小鼠的免疫反应及保护性，结果发现无论是否与载体蛋白BSA连接，p135～160短肽、135～144位短肽二聚体以及三聚体均可诱发小鼠产生高效价的中和抗体，并获得抗病毒攻击保护性，而10mer短肽135～144只有与BSA连接后才能产生免疫原性(Zamoranoetal.,1995)。1998年，Zamorano等在前期研究基础上将FMDVVP1135～144位串联二聚体合成肽对牛体进行了免疫试验，结果可诱发牛体产生强烈的T细胞反应以及持续存在至少310天的中和抗体(Zamoranoetal.,1998)。Kuprianova等研究了FMDVA22亚型基于VP1蛋白的多肽疫苗，发现Palm-135-l58-GAA-170-l98(ACM)合成肽能诱发有效的抗病毒免疫，可以保护猪抵抗FMDV的攻击(Kuprianovaetal.,2000)。Taboga等设计并合成了FMDVC3Arg85四种肽疫苗A，AT，AC，ATC(A:VP1上138～156aa;C:VP1上196～209aa;T:VP121～40aa)，并对138头牛进行了免疫效果评价，结果发现各组合成肽疫苗均可刺激牛体产生高水平的中和抗体以及淋巴细胞增殖的免疫反应，但却没有一组对免疫动物产生40%以上的攻毒保护效率(Tabogaetal.,1997)。2002年，Wang等以VP15 中国农业科学院博士学位论文第一章引言G-H环及其两侧序列为框架（129～169aa），将不同变异株病毒的高变区位点整合入VP1，并加入外源Th位点构成合成肽疫苗，以12.5μg剂量免疫猪，可以保护20/21的猪抵抗O1Taiwan株FMDV的攻击。该设计通过增加毗邻序列、模拟中和表位空间结构、覆盖尽可能多的变异株病毒表位序列以及引入外源Th表位等增加了肽疫苗的免疫原性，扩展了对不同毒株的交叉反应性(Wangetal.,2002)。2008年，Cubillos等以VP1(136～154aa)为B细胞表位，3A(21～35)为T细胞表位，合成了四分支的树形肽，通过肌肉内注射免疫猪，成功保护猪体免受病毒攻击，肠胃外给肽时更可刺激有效的IgA分泌，加强了固有免疫(Cubillosetal.,2008)。Greenwood等合成了FMDVO1KVP1蛋白上126～150、141～165、189～213肽段，为增强树突状细胞对合成肽的免疫反应，加入惰性纳米磁珠为载体，刺激绵羊后能产生有效的细胞和体液免疫反应(Greenwoodetal.,2008)。近年来通过对FMD合成肽疫苗的不断研究和探索，已使其在我国FMD的防控工作中一度发挥了重要作用。中牧股份有限公司与申联生物医药(上海)有限公司联合，研制成功了猪口蹄疫O型合成肽疫苗，于2004年获国家一类新兽药注册证书，并用于我国猪O型FMD防控实践。由于其副反应小、免疫抗体滴度高且稳定，一直深受青睐。但该疫苗的有效肽段仅来源于某一历史毒株，抗原谱覆盖面较窄。自2009年以来，随着猪O型FMD病毒变异株的出现，该疫苗免疫猪不能很好抵御流行毒的侵袭，因此其应用受到了极大限制。除此之外，我国牛羊FMDVO-Asia1型二价合成肽疫苗的研制工作也取得了一定的进展。FMD合成肽疫苗与传统疫苗相比具有很多优势，它不含核酸，直接锁定抗原表位氨基酸序列，可以用化学方法快速合成并可以模拟表位的空间结构(Oldstoneetal.,1995)；可以通过综合不同变异株或血清型病毒的表位肽序列以扩展其交叉免疫保护作用，使其更具广谱性；可以随流行毒株的变化调整抗原肽序列使其更具特异性；可以通过鼻内、口腔和皮肤等途径进行免疫接种使免疫应答更为有效而且操作更加便捷；可以利用非疫苗用抗原肽建立诊断方法以区分免疫动物和自然感染动物。此外，FMD合成肽疫苗质量可控、适宜生产，便于长期贮存、更加安全可靠，作为一种新型基因工程疫苗，弥补了目前传统FMD疫苗所存在的诸多不足，具有广阔的开发前景，值得更加深入持续的研究。虽然对FMD合成肽疫苗的研究已经取得了一些令人瞩目的进展，但在实际应用中仍未达到免疫防控FMD的理想状态，还不能与传统灭活疫苗相媲美，合成肽的免疫效果仍需进一步提高。相信随着合成肽诱导机体产生中和抗体的免疫机制以及病毒与宿主相互作用的机制被不断阐明、FMDV表位被不断鉴定以及疫苗免疫技术被不断革新，FMD合成肽疫苗的研制必将会克服现有不足而最终取得突破，为FMD的防控和根除提供有效保障。1.4酵母双杂交技术的研究进展蛋白质是生物体最重要的组成成分之一，是细胞活性及生物功能的主要体现者和最终执行者，具有时空性和调节性。蛋白质的表达水平、存在方式及蛋白质间相互作用是实现蛋白质功能的基础。在生命体每个细胞的生理活动过程中，都存在着蛋白质相互作用及其相互交叉形成的网络，它们负责调节基因的表达、细胞的代谢、介导细胞的信号传导、调控遗传物质的复制、维持生物体的形态等等几乎所有的细胞过程(Twyman,2004)。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系是了解蛋白质的结构和功能、理解细胞生命活动的基6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言础，也是后基因组时代的重要任务之一(Auerbachetal.,2002)。目前用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法有很多，有基于生物物理学的研究方法：包括荧光共振能量转移技术(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)、表面等离子体共振检测技术(surfacePlasmonresonance,SPR)和原子作用力显微技术(atomicforcemicroscopy,AFM)；有基于计算机分析和构建相互作用模型的方法：包括全基因组计算分析法和构建相互作用模型法。有基于分子生物学的方法：包括酵母双杂交技术、噬菌体展示技术、免疫共沉淀技术、亲和印记技术和GSTpull-down技术等。每种技术都有其各自的适用范围和优缺点，在实际应用中要根据具体的实验目的而采用不同的研究方法。其中，酵母双杂交技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用的经典方法，该技术由Fields和Song于1989年在研究真核生物基因转录调控时首次建立的一种遗传学方法，用于在酵母体内研究蛋白质-蛋白质间的相互作用(Fieldsetal.,1989)。该方法自建立以来，经过不断的改进和发展，技术逐步成熟，成为研究蛋白质间相互作用的有力方法。1.4.1酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术是以真核生物转录调控系统为基础、利用转录激活因子，如GAL4和LexA的双功能特性研发的一种用于在真核细胞中检测蛋白质-蛋白质间相互作用的技术。一个完整的真核转录因子，包括能识别并结合上游激活序列的DNA结合结构域(DNA-bindingdomain，BD)，以及能激活并启动下游基因进行转录的转录激活结构域(transcription-activatingdomain，AD)。这两个结构域独立存在时无法完成激活功能，但当它们在空间上充分接近时即可呈现完整的激活转录功能(Keeganetal.,1986)。基于此原理，Fields等将“诱饵”蛋白X和“猎物”蛋白Y的核酸序列分别与BD和AD结构域的核酸序列相融合，共同转化酵母菌，如果测试蛋白X和Y在酵母细胞中相互作用，那么就能拉近转录激活因子BD和AD两结构域在空间上的距离，从而使激活转录功能完全恢复，下游报告基因被启动表达。反之，如果测试蛋白间不存在相互作用，那么就不能使得BD与AD在空间上彼此靠近，报告基因就不能得到表达。通过测定报告基因的产物及活性，来实现研究蛋白质间相互作用的目的。常用的报告基因除有颜色反应的LacZ之外，还有各种营养缺陷标记如HIS3、LEU2等等。目前，为了更灵敏、特异、严谨地筛选阳性克隆，两种或两种以上的报告基因常被同时使用(Durfeeetal.,1993)。1.4.2酵母双杂交技术的优越性与局限性酵母双杂交技术之所以成为研究蛋白质相互作用的经典方法，被广泛应用于蛋白质组学研究中，与它的优越性密不可分。1)、简洁高效：该方法操作简单且高效，不需要进行蛋白质的抽提纯化，也不需要制备抗体；2）灵敏：能够检测蛋白之间结合常数低至1mmol/L的弱相互作用和瞬时作用。3）真实：检测的蛋白相互作用是在真核细胞内进行的，接近天然状态，代表其在细胞内的真实情况。4）适用于核蛋白、膜蛋白、转录活性蛋白以及不同亚细胞部位和功能的蛋白等几乎所有的细胞蛋白质相互作用的筛选。虽然酵母双杂交技术在研究蛋白质-蛋白质相互作用方面有着很多优越性，但也存在一些局限性。1）假阳性。假阳性率高是酵母双杂交技术的一个重要缺点。某些蛋白的自激活效应或对7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言其他蛋白的低亲和力等都会造成非特异性互作。此外，还有一些蛋白本身存在于不同的组织中或时空中却被筛选到互作也是一种假阳性。需用其他方法进行验证。2）假阴性。对于胞质蛋白和膜蛋白等在经典的酵母双杂交系统中检测不到；一些蛋白在酵母中表达时不能形成其天然构象，从而影响蛋白互作；瞬时发生的蛋白质互作目前很难检测到；某些蛋白在酵母菌株中产生毒性，抑制报告基因的表达和菌株的生长。某些蛋白缺乏转录后修饰，从而影响蛋白互作；有些弱相互作用或低丰度的基因可能检测不到。此外，报告基因的缺陷等等也会导致假阴性结果(Rajagopalaetal.,2002)。为确保通过酵母双杂交系统筛选到真实可靠的相互作用，还需采用其他策略进行验证，如1）采用两轮或多轮杂交以提高准确性；2）pull-down免疫共沉淀试验验证；3）利用生物信息学方法测序、比对、分析。综合以上方法来排除假阳性，提高可信度。1.4.3酵母双杂交技术的改进与发展随着科技的不断进步，酵母双杂交技术也得到了改进和发展，产生了一些酵母双杂交衍生系统，如逆向双杂交系统、二元诱饵系统、单杂交或三杂交系统、非转录读出特性的酵母双杂交系统(例如SOS和RAS蛋白招募系统、PI3K介导的靶蛋白识别系统、SCINEX-P系统以及分裂泛素系统)以及基于DNA微阵列技术的酵母双杂交系统等(Grosseletal.,1999;Isakoffetal.,1998;Stagljaretal.,1998;Suteretal.,2013;Urechetal.,2003)。这些衍生系统的建立克服了经典酵母双杂交系统的局限性，扩展了其应用，提高了其效率。分裂-泛素酵母双杂交系统是由Johnsson和Varshavsky于1994年构建的，该系统不仅可用于细胞质中蛋白相互作用的检测，也可用于研究膜蛋白之间的相互作用。泛素蛋白是一种由76个氨基酸组成的广泛存在于真核生物细胞内的保守小分子。通常用于标记需要分解掉的蛋白质，使其被26S蛋白酶体降解。泛素分子由N末端(Nub)和C末端(Cub)两部分组成，野生型的泛素N端和C端具有高度亲和力，可在空间上无限接近，形成完整的泛素分子，被泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specificprotease,UBP)识别并降解。而将泛素Nub第三位的亮氨酸(NubI)突变为甘氨酸(NubG)后，就大大降低了它们之间的亲和力，在同一细胞共表达时不能重组，Cub只能部分折叠，从而无法被UBPs识别和剪切。基于这一原理，分别将目的蛋白X与Cub融合，将另一目的蛋白Y与NubG融合，X蛋白与Y蛋白的相互作用会迫使NubG和Cub在空间上充分靠近，从而重组为完整的泛素分子，被UBPs识别并切割，从而释放转录因子(LexA-VP16)，LexA-VP16进入细胞核后能够启动报告基因的表达，通过检测报告基因的表达情况来判断测试蛋白是否发生相互作用(JohnssonandVarshavsky1994)(图1-2)。分裂-泛素酵母双杂交系统具有很多优势，它巧妙的解决了膜蛋白之间的相互作用与核报告基因的激活二者在空间上的矛盾；而且Nub和Cub均为小分子肽，只有40个氨基酸，不会对目的蛋白的相互作用造成空间上的障碍。该系统已经广泛应用于蛋白质相互作用的研究领域中。8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言图1-2分裂-泛素化酵母双杂交系统Fig.1-2Thesplit-ubiquitinbasedyeasttwo-hybrid(Mocklietal.,2007)1.4.4酵母双杂交技术的应用（1）寻找并鉴定与靶蛋白相互作用的新蛋白质利用酵母双杂交技术，将已知基因作为诱饵，对特定cDNA文库进行筛选即可获得大量与其相互作用的蛋白。此方法已经成为发现新基因的主要途径。例如：Erdtmann等应用酵母双杂交方法筛选人肝cDNA文库，发现HCVNS2蛋白可与CIDE-B的凋亡结构域相互作用，从而抑制CIDE-B诱导的细胞凋亡(Erdtmannetal.,2003)。此方法还可用于研究两个蛋白发生相互作用的关键位点，例如Engelender等应用酵母双杂交方法筛选到与神经末端蛋白alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1后，Michael等又利用酵母双杂交技术验证了它们互作的关键位点，分别为位于α-synuclein的1-65位氨基酸和位于Synphilin-1中心区段的349-555位氨基酸(Engelenderetal.,1999;Michaeletal.,2002)。（2）利用酵母双杂交技术在细胞内研究抗原和抗体的相互作用细胞内的抗原和抗体相互作用可以通过酵母双杂交方法进行检测。Geert等以矮牵牛黄烷酮醇还原酶(DFR)为诱饵蛋白，以其抗体单链的三个可变区(A4、G4、H3)为捕获蛋白，分别进行酵母双杂交验证，成功对矮牵牛DFR与其三个抗体单链可变区的反应强弱进行了差异分析(Geertetal.,2000)。（3）利用酵母双杂交技术建立基因组蛋白质连锁图谱蛋白质之间通过彼此协调和控制参与生命活动。而编码这些蛋白质的基因之间也存在着功能上的联系。例如：Waaijers等利用酵母双杂交技术，以几种蛋白质作为诱饵筛选人类基因组文库从而建立了人基因组蛋白质连锁图谱(Waaijersetal.,2013)。（4）利用酵母双杂交技术筛选药物的作用位点9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言利用酵母双杂交方法找到蛋白相互作用的氨基酸序列，采用药物干扰等方法阻断能够引发疾病反应的蛋白互作，从而达到治疗疾病的目的。例如：Freitas等利用酵母双杂交技术发现曲古抑菌素N可通过与磷酸酶3形成复合物，因此该复合物可作为治疗癌症的靶标(Freitasetal.,2012)。1.5FMDV与宿主相互作用的研究进展病毒与宿主细胞的相互作用对双方均具有重要意义，病毒入侵宿主细胞后便会通过蛋白相互作用影响宿主基因的转录翻译、调控宿主细胞的免疫应答、诱导细胞凋亡和自噬，并干扰细胞信号转导等等。而病毒作为专性细胞内寄生物，其实现侵染、复制以及释放的整个生命过程都离不开病毒与宿主蛋白形成的蛋白质网络。因此研究病毒与宿主相互作用可为开发安全高效的疫苗、提高宿主免疫力以及设计针对靶标性治疗等预防控制措施提供理论依据。入侵宿主细胞是FMDV致病的首要步骤，病毒通过识别细胞表面的受体而进入宿主细胞。目前已知的FMDV受体包括四种整联蛋白受体αvβ3、αvβ6、αvβ1和αvβ8(Burmanetal.,2006；Duetal.,2010;Jacksonetal.,2000;Jacksonetal.,2002;Ruiz-Saenzetal.,2009)。他们均可与FMDV结构蛋白VP1的RGD基序结合。整联蛋白是Ⅰ型膜蛋白，包含α和β两个亚单位，他们以非共价键结合在细胞表面，参与细胞粘附、细胞迁移或者作为细胞信号分子等等。其中，αvβ3主要表达于上皮细胞中，是第一个被确认的FMDV整联蛋白受体。A型病毒可高效利用αvβ3和αvβ6，而O型病毒利用αvβ6可获得更高的感染率。Jackson等于1996年提出O1型FMDV可利用硫酸乙酰肝素(HS)作为一种病毒入侵的辅助受体分子，后来大量试验发现其他型如A、C、Asia1和SAT2等也以其为受体(Jacksonetal.,1996)。硫酸乙酰肝素是一种普遍存在于细胞表面的有硫酸脂多糖组成并共价结合于蛋白核心的氨基多糖，它与FMDV结构蛋白VP3上56位精氨酸相互作用(Baietal.,2014;Wangetal.,2015)。此外，还存在一种仍未被鉴定的第三受体，如巨噬细胞的Fc受体等(Berrymanetal.,2013;Mohapatraetal.,2015)。FMDV通过识别并结合一种或多种受体分子吸附到宿主细胞上，然后通过受体介导的內吞路径进入细胞从而起始感染。FMDV的复制不仅依赖于自身编码的蛋白，而且依赖于许多宿主蛋白以及它们之间的相互作用。在感染过程中，FMDV利用多种策略来逃避宿主的免疫机制，抑制宿主蛋白的表达，改变细胞蛋白-蛋白之间的相互作用，并导致细胞内的膜结构重排以获得有利于自身复制、组装和释放的条件。郑世军等证实FMDVVP1蛋白与sorcin蛋白相互作用影响宿主细胞表达Ⅰ型干扰素(Lietal.,2013)；2C与N-myc和STAT蛋白相互作用诱导细胞凋亡(Wangetal.,2012)。Gladue等发现FMDV2C蛋白与Beclin1蛋白相互作用调节宿主的自噬途径，与波形蛋白相互作用促进FMDV的复制(Gladueetal.,2012;Gladueetal.,2013)；3A蛋白与DCTN3蛋白的相互作用对牛FMDV复制有重要作用(Gladueetal.,2014)。L和3C蛋白诱导宿主真核翻译起始因子eIF4G的降解，抑制宿主蛋白质包括干扰素的表达，间接促进病毒的复制(Belshametal.,2000;Glaseretal.,2001)。目前，FMDV编码产生的多种蛋白在病毒感染和免疫逃逸中的作用及机理还需要进行深入的研究。1.6本研究的目的和意义FMD作为目前国内外最具影响的动物疫病之一，在世界范围内广泛存在，该病的暴发和流10 中国农业科学院博士学位论文第一章引言行，不仅对畜牧业的健康发展造成严重的危害，而且还造成巨大的经济损失，影响国家声誉。虽然针对FMD的发生采取了严格的检疫制度以及疫苗接种等防控措施，但在我国及世界其他地区仍时有发生。我们还需在FMDV致病的分子机理以及高效疫苗的研制方面进行更加深入的研究。目前，国内外常用的FMD疫苗为灭活疫苗，虽然该疫苗在FMD的防控中起到了关键性的作用，但由于其存在很多不足，并不能完全满足预防控制乃至最终消灭FMD的目标。而合成肽疫苗作为一种新型基因工程疫苗有着其独特的优势，在FMD疫苗的研制方面具有广阔前景。本研究旨在通过精确定位FMDV上的主要抗原位点，选择特异性或具有广谱性的T细胞表位，将两种或两种以上表位序列通过科学合理的组合连接，以化学合成方法将其合成，通过动物试验评价其诱导的免疫水平以及攻毒保护效力，以期研制出一种安全、有效的牛FMD合成肽疫苗。从而对FMD的防控发挥重要的作用，也为其它疫苗的研制提供一种新的思路。FMDV的整个生命过程不仅依赖于自身编码的蛋白，而且依赖于许多宿主蛋白以及它们之间发生的各种相互作用。开展病毒与宿主相互作用的研究可以更深入地了解病毒致病的分子机理，从而为开发安全高效的疫苗、提高宿主免疫力以及设计针对靶标性治疗等预防控制措施提供理论依据。本研究通过构建高质量的猪组织cDNA文库，分别以FMDVVP1、FMDV2B蛋白为诱饵，利用基于分裂泛素系统的酵母双杂交技术，筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白，并进一步研究其功能，深入揭示FMDV引起疾病的本质，为FMDV的致病与抗感染分子机制提供新的理论依据，为发展新的抗病毒策略以及研制新型疫苗奠定基础。11 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价摘要：设计并合成由A型FMDV结构蛋白上的抗原位点序列VP1：129～169位氨基酸、非结构蛋白上的抗原位点序列3A：21～35位氨基酸、3D：346～370位氨基酸组合成的三种不同肽链，与免疫佐剂乳化后分别接种豚鼠和牛，通过ELISA试验检测血清抗体，微量细胞中和试验检测中和抗体，攻毒试验检测不同组合肽疫苗分别对豚鼠和牛的保护效果。结果显示，三种不同组合的肽疫苗均表现出一定的免疫原性，其中以PB组，即3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(T→C)～156(Q→C)～169)，中和抗体滴度最高，攻毒保护效力最强。用其以50µg/只的剂量免疫豚鼠2次，可100%的抵抗同型病毒的攻击；以100µg/头份的剂量免疫牛1次，可达到60%的保护率。因此PB合成肽有希望发展成为生产实践中有效的牛A型FMD合成肽疫苗。本研究为进一步完善FMDA型合成肽疫苗的构建以及FMD其他亚型合成肽疫苗的构建奠定了一定的基础。关键词：FMD合成肽疫苗免疫保护FMD是一种具有高度传染性和极具破坏性的偶蹄动物疫病，可造成极大的经济损失。在我国及世界大部分地区，疫苗接种依然是预防和控制FMD的首要方法。传统灭活疫苗能够使免疫动物获得高水平的中和抗体并抵御同源病毒的攻击，在口蹄疫的防控乃至消灭的过程中起着非常重要的作用。但是由于FMDV有七个血清型，每个型又含有多个亚型，各型间没有交叉保护性，宿主广泛，传播迅速，可持续带毒，致病性强而免疫原性弱等等原因造成目前使用的传统灭活疫苗并不十分理想，存在诸如灭活不彻底、无法区分免疫动物和自然感染动物、疫苗毒株必须与流行毒株相匹配等问题和不足。所以目前使用的传统灭活疫苗还难以满足完全控制乃至最终消灭FMD的目标。随着对FMDV抗原表位的不断认识，以及对FMD新型疫苗的不断探索，发现合成肽疫苗作为一种基因工程新型疫苗，是一种纯粹抗原性疫苗，在生产和应用方面安全稳定、设计灵活、能够区分免疫动物和自然感染动物，能够通过对不同毒株表位的合理组合发挥其对多种血清型的交叉保护作用，相比于传统灭活疫苗，可以弥补目前传统FMD疫苗所存在的诸多不足。关于FMD合成肽疫苗的研究已经取得了很多重大进展，但在实际应用中仍存在许多问题有待解决。而且对于牛A型FMD合成肽疫苗的研究目前还很少。鉴于2009年以后我国部分地区A型FMD大肆流行的严峻形势，构建具有良好免疫保护效果的牛A型FMD合成肽疫苗具有重要的科研和生产意义。本实验通过精确定位FMDV上的主要抗原位点，选择特异性或具有广谱性的T细胞表位，将两种或两种以上表位序列通过科学合理的组合连接，以化学合成方法将其合成，通过动物试验评价其诱导的免疫水平以及攻毒保护效力，以期研制出一种安全、有效的FMD合成肽疫苗。2.1材料2.1.1动物试验的伦理准则12 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价本论文涉及的所有动物攻毒试验均在中国农业科学院兰州兽医研究所生物安全三级实验室中进行。所有动物试验方案经由中国农业科学院兰州兽医研究所动物使用及护理委员会批准。2.1.2试验动物重约250g~300g清洁级健康豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所试验动物场提供。28头品种、来源相同的健康1岁龄抗FMDV抗体阴性幼牛来自甘肃省定西市的一个规模化养牛场。2.1.3毒株与细胞FMDV流行毒株A/HuBWH/CHA/2009由本实验室分离、鉴定和保存。A型FMDVVP1、3D、3A具体序列参考GenBank上的A/HuBWH/CHA/2009(Genbankaccessionno.JF792355)的相关序列。由化学方法灭活并与206佐剂乳化制备的FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株灭活疫苗在抗体检测和病毒攻击实验中作阳性对照。2.1.4主要试剂耗材和仪器MEM培养基和胎牛血清购自美国GIBCO公司；RPMI1640培养基和0.25%胰酶购自Hyclone公司；青、链霉素购自中国华北制药有限公司；206佐剂购自法国Seppic公司；OPD显色试剂和HRP标记的羊抗豚鼠IgG购自美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为进口分析纯；96孔细胞培2养皿和25cm细胞培养瓶购自美国Corning公司；各型号tip、离心管购自Axygen公司；台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；小型台式离心机购自美国Sigma公司；电热鼓风干燥箱和CO2培养箱购自美国Thermofisher公司；全波长酶标仪购自美国BIOTEK公司；立式自动电热压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂；二级生物安全柜购自上海力申科学仪器有限公司；乳化机购自上海弗鲁克公司。2.1.5实验所用溶液及其配制（1）完全培养基：MEM450mL，胎牛血清50mL，100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素，混匀分装后4℃保存备用。（2）细胞维持液：MEM500mL，100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素，混匀分装后4℃保存备用。（3）包被液（0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液）：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，蒸馏水定容至1L（4）PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）：NaCl8.0g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·12H2O2.83g，KCl0.2g，蒸馏水定容至1L。（5）PBST：999.5mLPBS（0.01mol/L，pH7.4）中加0.5mLTween-20混匀，室温存放。13 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价2.2方法2.2.1FMDVA/HuBWH/CHA/2009TCID50的测定（1）细胞培养：将长满单层的BHK-21细胞用MEM或PBS轻柔冲洗两遍，加入1mL0.25%的胰酶消化，待细胞间出现裂缝立即弃消化液；加入完全培养基21mL，用电动助吸器反复吹吸将细胞从瓶壁上冲下，混匀后平均分装到3个新培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，约3d长成单层。（2）细胞毒传代：取形态正常的单层细胞2～3瓶，倾去旧的培养液，用MEM或PBS轻柔冲洗两遍，接种FMDVA/HuBWH/CHA/2009细胞毒1mL，于37℃、5%CO2培养箱内静置吸附1h，弃掉病毒液，添加不含血清的细胞维持液7mL/瓶，继续于37℃、5%CO2培养箱培养，用倒置显微镜观察细胞病变（CPE）产生情况；当75%的细胞出现CPE时，取出细胞瓶于-20℃反复冻融三次，4℃离心机3,000g离心后取上清继续传代直至CPE出现时间稳定。（3）TCID50测定a)将一瓶长满单层的形态良好的BHK-21细胞用胰酶消化，加入完全培养基调节细胞悬液6浓度至10个/mL。以100µL/孔，将细胞悬液加入到96孔细胞培养板中。37℃、5%CO2培养箱培养约12h至细胞融合度达到80%左右。-1-8b)稀释病毒液：用不含血清的MEM细胞维持液将病毒液从10进行10倍倍比稀释至10。设不加病毒液的细胞维持液为阴性对照。c)将培养的96孔板中细胞培养液吸弃，加入稀释好的病毒液100µL每孔，每个稀释度以及阴性对照设四孔重复。置于37℃、5%CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液，每孔补充细胞维持液100µL。d)用胶布将盖子封好，置于37℃、5%CO2培养箱培养72h。每隔24h用倒置显微镜观察一次，72h判定结果，用Reed-Muench法计算TCID50(ReedandMuench1938)。2.2.2FMDVA/HuBWH/CHA/2009对豚鼠ID50的测定（1）病毒适应与复壮：将FMDVA/HuBWH/CHA/2009乳鼠毒通过豚鼠进行传代适应。取FMDVA/HuBWH/CHA/2009乳鼠毒，于豚鼠（约500g）后肢跖部进行皮下和皮内接种，0.2mL/只。每次接种4只。连续观察5～7天，采集发病后的水疱液以及水疱皮，剪碎称重后在研钵中用液氮研磨，然后用加双抗的MEM培养液1:10(W/V)稀释，4℃过夜浸毒，3,000g离心10min，取上清液继续攻击豚鼠，传约3代至该病毒对豚鼠致病力稳定。采集毒力稳定后的水疱液以及水疱皮用同样方法研磨、稀释、浸毒后储存于-70℃备用。-3-7（2）ID50的测定：取豚鼠适应毒，用MEM培养液作10倍系列稀释，分别用10～10五个稀释度病毒于豚鼠（250～300g）左后跖部皮下和皮内接种，每稀释度接种4只豚鼠，接种量为0.2mL/只，同时设立健康对照组；每隔12h观察豚鼠发病情况，连续观察7d，按Reed-Muench法计算LD50。2.2.3抗原表位基因的选择、组合以及合成14 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价基于先前研究者们对FMDV结构蛋白和非结构蛋白上B-细胞表位和T-细胞表位的鉴定和认识(Blancoetal.,2001;Garcia-Brionesetal.,2004;Kimetal.,2006)，选择FMDVA/HuBWH/CHA/2009株结构蛋白VP1上129~169位氨基酸为B-细胞表位，选择非结构蛋白3A上21~35位氨基酸、非结构蛋白3D上346~370位氨基酸为T-细胞表位，组合成3种肽链PA、PB和PC。各表位间以脯氨酸-脯氨酸-丝氨酸（PPS）间隔序列连接，以避免产生功能性表位或干扰抗原呈递细胞对表位的加工和呈递过程(Livingstonetal.,2002)。通过将VP1序列的134位和156位氨基酸替换成半胱氨酸以形成二硫键使合成肽成环状结构，以模拟FMDVVP1结构蛋白上G-H环的自然构象。送invitrogene公司用Fmoc固相合成法合成，用质谱法检测合成的肽段氨基酸序列正确，用高效液相色谱法测定肽制剂的纯度大于95％。具体序列如表2-1：表2-1合成肽的设计、组合及具体氨基酸序列Table2-1Synthesizedamino-acidsequencescorrespondingtoepitopesinthe3A,3D,andVP1proteinsoftheA/HuBWH/CHA/2009strainofFMDVPeptidenameandamino-acidpositionsAmino-acidsequencePA:59meracetyl-AAIEFFEGMVHDSIKPPSVYNGT＃＊3A(21-35)～PPS～VP1(129-134(T→C)-156(Q→C)-169)CKYSAPATRRGDLGSLAARLAACLPASFNYGAIRAT-amidePB:69meracetyl-YDLDFEALKPHFKSLGQTITPADKS＃＊3D(346-370)～PPS～VP1(129-134(T→C)-156(Q→C)-169)PPSVYNGTCKYSAPATRRGDLGSLAARLAACLPASFNYGAIRAT-amidePC:87meracetyl-AAIEFFEGMVHDSIKPPSVYNGT＃＊3A(21-35)～PPS～VP1(129-134(T→C)-156(Q→C)-169)～CKYSAPATRRGDLGSLAARLAACLPASFNYGAIRATPPSYDLDFEALKPHFKSLGQTITPPS～3D(346-370)PADKS-amide#N134ofthenativeVP1sequenceisreplacedbyC.*Q156ofthenativeVP1sequenceisreplacedbyC.PPSlinkersequenceshowninitalics.2.2.4PA、PB、PC三组合成肽疫苗免疫豚鼠效力试验2.2.4.1豚鼠免疫将合成的多肽以0.1mol/L的PBS溶解，使之浓度为500µg/ml，与等体积油佐剂MONTANIDEISA206均匀混合，研磨至挂壁均匀、静置不分层，使其终浓度为250µg/ml。将体重在250g左右的30只豚鼠随机分成5组（6只/组），每只豚鼠于后肢内侧进行肌肉注射，第一组豚鼠注射等量PBS油乳剂作为阴性对照；第二组豚鼠注射FMDVA/HuBWH/CHA/2009灭活疫苗作为阳性对照（0.3mL/只）；第三组豚鼠注射PA合成肽疫苗0.3mL，即75µg/只；第四组豚鼠注射PB合成肽15 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价疫苗0.3mL，即75µg/只；第五组豚鼠注射PC合成肽疫苗0.3mL，即75µg/只。共免疫两次，分别于0d进行一免，于21d进行二免，剂量相同。所有豚鼠饲养于无FMDV的隔离环境中。2.2.4.2血清抗体动态监测分别在免疫前（0d）、免疫后14d、21d、35d、42d从每组随机抽取三只豚鼠进行心脏采血。采集的血液先放置37℃下1～2h，然后4℃过夜。3,000g离心15min，取上清，转移至无菌Ep管中，-70℃冰箱保存，使用时应防止反复冻融。分离血清后按文献报道的方法应用间接ELISA法测定血清中抗FMDV抗体(Jimenez-Claveroetal.,1998)。即：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）将A型FMDV灭活抗原146S稀释至1µg/mL浓度，以50µL/孔包被96孔ELISA板，4℃过夜，PBST洗3遍后用含3%（w/v）BSA的PBST溶液37℃封闭2h.。封闭后用PBST洗5遍，加入1:100稀释的豚鼠待检血清，37℃孵育1h，PBST洗5遍;加入1:10000稀释的HRP标记的山羊抗豚鼠IgG，37℃孵育1h，PBST洗5遍，加入OPD显色液显色10min。之后，每孔加入50µLH2SO4终止（2mol/L），492nm波长测量吸收值。各组抗体效价由每组随机抽选的三个豚鼠的平均OD值来表示。2.2.4.3中和抗体效价测定通过细胞中和试验对0d及42d采集的豚鼠血清中和抗体效价进行测定。将待检血清置于56℃水浴中灭活30min，在96孔细胞培养板中，用RPMI1640培养基从1:2开始对待检血清作一系列倍比稀释，50µL/孔，每个稀释度设4个复孔，同时设阴性对照孔。用1640培养基将病毒稀释至200TCID50/100µL，以50µL每孔加入细胞板，混匀后置于37℃含5％CO2细胞培养箱中孵育61h，之后将细胞悬液调至大约1×10个/mL，以50µL每孔加入细胞板，封板后重新置于37℃含5％CO2细胞培养箱中培养。每隔24h观察一次，48h初判，72h后终判。按照Reed-Muench法计算中和抗体效价(Goldeetal.,2005)。2.2.4.4豚鼠攻毒保护试验第一次免疫后42天，所有豚鼠用已测知ID50的FMDVA/HUBWH/CHA/2009豚鼠适应毒以100GID50/0.2mL/只的剂量进行攻毒。每只豚鼠均于左后跖部接种，其中皮下穿刺接种0.1mL，皮内注射接种0.1mL。连续7天观察豚鼠脚掌是否出现FMD典型病变，如果只在注射部位出现原发性病变则判定为保护，如果除原发性病变外在任一其他三只脚出现继发性病变则判定为不保护(Terpstraetal.,1976)。2.2.5PB合成肽疫苗免疫豚鼠最小有效剂量的测定2.2.5.1豚鼠免疫16 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价PB组合成肽疫苗以不同剂量免疫豚鼠：将合成的PB多肽以0.1mol/L的PBS溶解，与等体积油佐剂（206）均匀混合，研磨至挂壁均匀、静置不分层，使其终浓度分别为500µg/ml、200µg/ml、100µg/ml和50µg/ml。将体重在250g左右的30只豚鼠随机分成6组，每组5只。所有试验豚鼠均于后肢内侧以肌肉注射的方式进行免疫，第一组豚鼠注射等量PBS油乳剂作为阴性对照；第二组豚鼠注射FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株灭活疫苗作为阳性对照（1mL/只）；第三组豚鼠注射500µg/mlPB疫苗0.5ml，即250µg/只；第四组豚鼠注射200µg/mlPB疫苗0.5ml，即100µg/只；第五组豚鼠注射100µg/mlPB疫苗0.5ml，即50µg/只；第六组豚鼠注射50µg/mlPB疫苗0.5ml，即25µg/只。共免疫两次，分别于0d进行一免，于21d进行二免，剂量相同。所有豚鼠饲养于无FMDV的隔离环境中。2.2.5.2中和抗体效价测定分别于0d、21d和42d采集并制备豚鼠血清，通过细胞中和试验检测其中和抗体效价。方法同2.2.4.3。2.2.5.3豚鼠攻毒保护试验方法、步骤同2.2.4.4。2.2.6PA、PB、PC三组合成肽疫苗牛体免疫保护效力试验2.2.6.1实验牛免疫及采血取合成肽抗原以PBS溶解，使PA、PC和PB100µg组浓度为200µg/mL，PB50µg组浓度为100µg/mL。PBS溶解的合成肽与等体积油佐剂206均匀混合。取来源相同、品种相同的28头健康1岁龄大小抗FMDV抗体阴性幼牛，随机分为六个组，除未免疫阴性对照组为3头外其余每组5头。以臀部肌肉注射的方式免疫合成肽疫苗。PA、PC和PB100µg组免疫合成肽的剂量为100µg/mL/头；PB50µg组免疫合成肽的剂量为50µg/mL/头。牛注射FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株灭活疫苗作为阳性对照组，未免疫健康牛为阴性对照组。在0天免疫1次。于0d、21d颈静脉采血。采集的血液置于37℃放置15min，4℃放置2h，充分析出血清；3,000g离心10min，1,0000g离心4min，小心吸出血清，-70℃保存。2.2.6.2中和抗体效价测定通过微量细胞中和试验对牛免疫后21d采集的血清进行中和抗体效价测定。方法同2.2.4.3。2.2.6.3牛体攻毒实验17 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价4在免疫后21天对所有试验牛进行攻毒，以10ID50/0.2ml/头的剂量于舌面皮内分两点注射FMDVA/HuBWH/CHA/2009牛体适应毒。连续观察11天，详细记录发病情况。前后四蹄每一蹄出现水疱记1分，除舌面外口、唇、牙龈、颚部任一出现继发性水疱记1分，都出现水疱即发病最严重者记5分，无继发性水疱者记0分。无继发性病变的动物被认为是保护，出现继发性病变的动物被认为是不受保护。阴性对照牛至少三蹄出现典型FMD病变判为试验成立。2.2.7统计分析使用GraphPadPrism3.0软件进行数据分析、处理以及图表绘制。用SEM表示误差值，用单因素方差分析(onewayANOVA)比较各组数据。p<0.05则认为差异显著。2.3结果2.3.1FMDVA/HuBWH/CHA/2009株TCID50的测定结果FMDVA/HuBWH/CHA/2009株TCID50的测定结果如表2-2所示：表2-2FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株TCID50的测定Table2-2IdentificationofTCID50forFMDVA/HuBWH/CHA/2009观察结果累积结果病毒稀释度CPE数无CPE数CPE（%）CPE数无CPE数感染率（%）-5104010050100-61013251325-710040070高于50%感染率-50%100%-50%距离比例0.67高于50%感染率-低于50%感染率100%-25%-510倍系列稀释倍数的对数为-1，高于50%感染率时病毒稀释度（10）的对数值为-5LogTCID50=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系列的对数=-5+0.67×(-1)=-5.67-5.67即，TCID50=10/0.1mL2.3.2FMDVA/HuBWH/CHA/2009株对豚鼠ID50的测定结果FMDVA/HuBWH/CHA/2009株对豚鼠ID50的测定结果如表2-3所示：18 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价表2-3FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株对豚鼠ID50的测定Table2-3IdentificationofID50forFMDVA/HuBWH/CHA/2009积累总计病毒稀释度接种只数未感染数感染数感染比例感染率（%）未感染数感染数-310404077/7100-410422233/560-510431511/617-610440900/90-7104401300/130高于50%感染率-50%60%-50%距离比例0.23高于50%感染率-低于50%感染率60%-17%-510倍系列稀释倍数的对数为-1，高于50%感染率时病毒稀释度（10）的对数值为-4LogID50=高于50%病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系列的对数=-4+0.23×(-1)=-4.23-4.23即，ID50=10/0.2mL2.3.3PA、PB、PC三组合成肽疫苗免疫豚鼠试验结果2.3.3.1血清抗体动态监测将所合成的多肽PA、PB和PC与佐剂乳化后免疫豚鼠，分别在免疫前（0d）、免疫后14d、21d、35d、42d采集并制备豚鼠血清，通过间接ELISA法检测血清抗体IgG。结果表明，三组合成肽疫苗免疫豚鼠后14d内均检测不到显著的抗A型FMDV特异性IgG，到免疫后第21天，PB组动物能够检测到抗A型FMDV抗体，但PA或PC组还是检测不到。二免后，所有合成肽疫苗免疫组抗体水平均显著增高。PC组豚鼠的抗体水平在免疫后35d达到最高值，超过PA组和PB组豚鼠的抗体水平(p<0.05)，随后开始下降。PA组和PB组抗体水平则呈稳定增高的态势，并在第六周达到峰值。但PA组的抗体水平明显低于PB和PC组(p<0.05)。在攻毒前，PB组抗体水平为三组合成肽疫苗中最高(p<0.05)。作为阳性对照的灭活疫苗免疫组豚鼠在初次免疫后就迅速产生了抗A型FMDV特异性IgG，并于免疫后21d至攻毒前持续保持很高的抗体水平，二免未对其产生显著影响。而免疫了PBS油乳佐剂的阴性对照组则在整个实验过程中均未检测到抗A型FMDV特异性IgG（图2-1）。19 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价图2-1豚鼠血清FMDV特异性抗体水平动态变化结果Fig.2-1Timecourseofanti-FMDVantibodyproductioninguineapigsGuineapigswereimmunizedonDay0andDay21withsyntheticpeptidesoraPBS-oiladjuvantmixture.SerumsampleswerecollectedatWeek0,2,3,5,and6.Serumlevelsofanti-FMDVantibodyweremeasuredbyanindirectELISAusinginactivatedserotype-AFMDVastheantigen.Eachdatapointrepresentsthemean±standarderrorofmeasurementsforthreeguineapigsfromeachimmunizationgroup2.3.3.2血清中和抗体效价的测定通过细胞中和试验对0d及42d采集的豚鼠血清中和抗体效价进行测定。结果显示，42d时，三组合成肽疫苗免疫豚鼠后的血清中均能检测到较高效价的中和抗体，PA组平均为1.96±0.33，PB组平均为2.034±0.28，都超过了灭活疫苗免疫组豚鼠的中和抗体水平（1.581±0.13，p<0.05）。其中以PB组中和抗体效价最高，其次为PA组，然后是PC组。阴性对照组在整个实验过程中均未检测到抗FMDV中和抗体(图2-4)。表2-4合成肽疫苗豚鼠免疫及攻毒保护效力Table2-4Immunogenicityandimmunoprotectiveeffectsofpeptidevaccinesinguineapigs组别疫苗分组及剂量中和抗体滴度（-log）原发性继发性保护率#水疱*水疱(%)Day0Day421PBS-oiladjuvantmix<0.3<0.36/66/602Inactivatedvirus/0.3mL/dose<0.31.581±0.135/60/61003PA/75µg/0.3mL/dose<0.31.96±0.336/62/6664PB/75µg/0.3mL/dose<0.32.034±0.285/60/61005PC/75µg/0.3mL/dose<0.31.73±0.45/62/666#出现原发性水疱豚鼠数/试验豚鼠数*出现继发性水疱豚鼠数/试验豚鼠数20 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价2.3.3.3豚鼠攻毒试验用上述测定了豚鼠ID50的FMDVA/HuBWH/CHA/2009对所有免疫豚鼠进行攻击，结果发现PBS阴性对照组和PA组中所有六只豚鼠在进行攻毒的左后脚出现口蹄疫典型病变，如发热、肿胀、注射部位出现水疱等，即原发性水疱。而在其他三组中有五只豚鼠出现原发性水疱。在攻毒后第三天，PBS阴性对照组有四只豚鼠开始出现继发性水疱，PA组有两只开始出现继发性水疱。在攻毒后第七天，用PB合成肽疫苗免疫的6只豚鼠都未出现继发性水疱，这与阳性对照灭活疫苗免疫组结果一致。而作为阴性对照组的用PBS油乳剂免疫的六只豚鼠则四只脚全部发病。PA组和PC组合成肽疫苗免疫豚鼠后保护率均为66%，而PB组为100%，为三组合成肽疫苗免疫豚鼠后保护效果最好的一组（表2-4）。2.3.4PB合成肽疫苗最小有效免疫剂量的测定结果2.3.4.1豚鼠血清中和抗体效价的测定用微量细胞中和试验对各实验组豚鼠在免疫前（0d）、二免前（21d）和攻毒前（42d）所采集血清中抗FMDV中和抗体效价进行测定。结果显示，21d时，中和抗体效价与免疫剂量成正比，250µg组最高，其次是100µg组，并且都高于灭活疫苗阳性对照组，而50µg组和25µg组则没有检测到中和抗体。42d时，各试验组免疫豚鼠的血清中均能检测到较高效价的中和抗体，250µg组为1.8±0.29，100µg组为2.4±0.33，50µg组为1.73±0.31，均高于灭活疫苗组(1.58±0.14,p<0.05)。其中以100µg组中和抗体效价最高(p<0.05)，25µg组最低（1.27±0.45）。而阴性对照PBS组一直未测到口蹄疫中和抗体(表2-5)。表2-5PB合成肽疫苗最小有效免疫剂量的测定Table2-5DosedependenceoftheimmunogenicityandimmunoprotectiveeffectsofthePBvaccineinguineapigs组别疫苗分组及剂量中和抗体滴度（-log）原发性继发性保护率(%)*#水疱水疱Day0Day21Day421PBS<0.3<0.3<0.35/55/502killedvirusvaccine<0.31.389±0.151.58±0.145/50/51003PB/250µg/0.5mL/dose<0.31.73±0.251.8±0.293/50/51004PB/100µg/0.5mL/dose<0.31.5±0.352.4±0.333/50/51005PB/50µg/0.5mL/dose<0.30.6±0.221.73±0.315/50/51006PB/25µg/0.5mL/dose<0.30.381±0.121.27±0.455/52/560#出现原发性水疱豚鼠数/试验豚鼠数*出现继发性水疱豚鼠数/试验豚鼠数2.3.4.2豚鼠攻毒试验21 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价用已测知ID50的FMDVA/HuBWH/CHA/2009对所有免疫豚鼠进行攻击，结果发现除25µg组有三只豚鼠出现继发性水疱外，50µg以上剂量的PB合成肽疫苗免疫组与灭活疫苗免疫组保护率一致，所有豚鼠都未出现继发性水疱，而且100µg以上剂量的两组40%未出现原发性水疱。作为对照组的用PBS油乳剂免疫的豚鼠则四只脚全部发病(表2-5)。表明PB合成肽疫苗以50µg的剂量免疫豚鼠两次即能够给豚鼠提供完全的保护力，使其能够抵御同型FMDV的感染。2.3.5牛免疫效力试验结果PA、PB、PC三组合成肽疫苗分别免疫牛体，21天后攻毒。通过微量细胞中和试验对牛免疫后21d采集的血清进行中和抗体效价测定。结果显示，灭活疫苗阳性对照组细胞中和抗体滴度对数值均高于2.1。其他试验组除PC组的036号、PB100ug组的039、046号牛的细胞中和抗体滴度对数值高于1.2外，其他试验动物的细胞中和抗体滴度对数值均低于0.9，即当1:8稀释血清时，仍不能中和相应FMDV。攻毒保护试验结果也以灭活疫苗阳性对照组最高，达80%，PB100ug组次之，达60%，然后是PA和PC组，为40%，PB50ug组则完全没有达到保护效果，且一头牛在攻毒后第六天死亡。阴性对照组3头牛在攻毒后第二天开始出现口蹄疫临床症状，第三天即能观察到明显的发热、水疱或溃烂，第11天时均有3个蹄子以上发病。说明在所设计合成的三组疫苗中，PB组在剂量为100ug/头时，免疫1次即可使牛达到明显的免疫保护效果（如表2-6所示）。从本实验结果中发现中和抗体水平与攻毒保护率之间的相关性是有限的，一些动物如041号，067号，053号和045号，它们的抗FMDV中和抗体水平均较低（滴度<1.2），但却获得了完全保护。相反，用灭活疫苗免疫的038号动物，其产生了相对较高的中和抗体水平（滴度为2.7），却没有获得完全保护。22 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价表2-6合成肽疫苗免疫牛保护效力试验结果Table2-6ImmunogenicityandimmunoprotectiveeffectsofpeptidevaccinesincattlebVaccineAnimalTiterofvirusneutralizingLesionProtectionProtectionacDose(µg)no.antibodyatDay21post-inoculationscoresRate(%)(log10)(Day11)Inactivatedvirus0312.70-4/5（2mL)0332.30-0372.10-0382.71+0472.10-PA041<0.90-2/5100µg0440.92+052<0.93+054<0.91+067<0.90-PC0361.40-2/5100µg049<0.94+0530.90-057<0.95+070<0.95+PB035<0.92+3/5100µg0391.20-042<0.95+045<0.90-0461.350-PB048<0.92+0/550µg051<0.95+055<0.95+058<0.94+061<0.93+Negativecontrol063<0.94+0/3068<0.93+069<0.95+前后四蹄每一蹄出现水疱记1分，口唇颚部出现继发性水疱记1分，都出现水疱即发病最严重者记5分，无继发性水疱者记0分。无继发性病变的动物被认为是保护（-），出现继发性病变的动物被认为是不受保护（+）。2.4讨论本研究中涉及的FMDV流行毒株A/HuBWH/CHA/2009在我国很多地区都有发生，但目前使用的疫苗对其保护力有限。而合成肽疫苗由于直接锁定B-细胞表位和T-细胞表位从而有望发展为一种更安全，更有效的FMD新型疫苗。研制FMDV合成肽疫苗首先需要对病毒蛋白的抗原表位有清晰的认识，然后寻求一种合理、优化的方式将选定的表位组合起来。有研究表明，O、A和C型FMDV上诱导产生中和抗体的主要表位都位于VP1的G-H环上，从131到159位氨基酸之间(Kimetal.,2006)。所以VP1的G-H环是构建FMD合成肽疫苗的首选位点。研究亦表明，VP1的G-H环两端的侧翼序列在免疫应答中发挥着重要作用，位于其134和158位氨基酸之间形成的半胱氨酸环状二级结构能够诱导免疫动物产生高效价的中和抗体(Brownetal.,1999;Francis23 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价etal.,1987;Valeroetal.,1995;Zamoranoetal.,1995)。根据现代免疫学理论，有效的免疫保护需要一组抗原表位的合理组合与搭配，要产生高效价的中和抗体，还需要有T细胞表位的参与(Collenetal.,1991;Francisetal.,1987)。Glass等设计合成了间隔序列不同的两种O型FMD合成肽疫苗：VP1(200～213)-PPS-VP1(141～158)-PCG和VP1(200～213)-VVS-VP1(l41～158)-PCG，用其免疫牛，结果显示由于受到牛MHCⅡ分子的限制，牛T细胞偏好地识别间隔序列PPS(GlassandMillar1995)。本研究采用FMDVA/HuBWH/CHA/2009毒株VP1、3D、3A序列上的B、T细胞抗原表位为基础材料，组合成3种肽链PA、PB和PC。各表位间以牛T细胞偏好的PPS间隔序列连接，避免产生功能性表位或干扰抗原呈递细胞对表位的加工和呈递。通过将VP1序列的134位和156位氨基酸替换成半胱氨酸形成二硫键使合成肽成环状结构，模拟了FMDVVP1结构蛋白上G-H环的自然构象。选择129~169位氨基酸，大大延伸了G-H环两侧的序列，提高了其免疫保护效力。选择非结构蛋白3D、3A序列上的T细胞抗原表位比选择VP1上的Th表位更有效力。研究表明，豚鼠是用来评价FMD疫苗的可靠模型(BarnettandStatham2002)。我们首先将构建的三种合成肽疫苗在豚鼠体内进行了免疫原性和免疫保护性研究，结果显示三种合成肽疫苗对试验豚鼠均具有一定的免疫保护作用，尤其以PB组的试验结果最好，与用灭活疫苗免疫组结果一致，保护率均为100%。随后，对免疫保护效果最好的PB组合成肽疫苗进行了最小有效免疫剂量的测定，结果表明，免疫剂量不同，动物获得的免疫保护程度有显著差异，这意味着疫苗的免疫剂量可能是影响免疫原性和免疫保护性的一个重要因素。在本试验中，50µg/只的剂量免疫两次即可保护豚鼠100%的抵抗同型病毒的攻击。最后，将三种合成肽疫苗免疫本动物牛体进行保护效力研究，结果显示，灭活疫苗阳性对照组免疫保护效力最高，达80%，PB100ug组次之，达60%，然后是PA和PC组，为40%，PB50ug组则完全没有达到保护效果。所以，以50µg的剂量免疫牛体不能产生有效的抵抗FMDV的抗体反应和保护效力。许多关于FMD合成肽疫苗的研究在试验动物，如小鼠，兔和豚鼠上都取得了很好的试验结果，但是应用到本动物如猪、牛等却不能得到同样完全的免疫保护效果。在本研究中，我们得出的结论也是这样，尽管构建的合成肽疫苗在豚鼠体内可达到100%的免疫保护效力，但是在牛体只取得60%的免疫保护效力。这种差别可能与本动物牛与实验动物对FMDV保护性免疫应答的性质不同有关。FMD灭活疫苗与合成肽疫苗诱导的免疫反应也有差异。在灭活疫苗免疫的动物中，中和抗体水平与攻毒保护率之间有很好的相关性，而在合成肽疫苗免疫的动物中却没建立这种相关性。虽然灭活疫苗与PB合成肽疫苗攻毒保护效力相当，但它们诱导的中和抗体滴度却有差异。这种相关性的缺乏与以前的研究结果相一致：Antoni等发现尽管牛在免疫合成肽疫苗后21天产生了高水平的中和抗体，但是当被10000ID50的同型FMDV攻击时依然出现了广泛的特征病变(Antonietal.,1988)。相比之下，亦有其他研究结果显示，未产生出高水平中和抗体的牛却获得了抵抗同型FMDV攻击的能力(Udenfriendetal.,1972)。我们推测合成肽疫苗免疫牛后产生了高水平中和抗体而没有获得攻毒保护可能是由于它们诱导产生了与灭活疫苗不同的抗体亚型(Mulcahyetal.,1990)或者较低亲和力的抗体(Mulcahyetal.,1992)。而一些不足以产生高抗体滴度的牛却可以获得攻毒保护，可能归功于有效的T细胞反应。总之，这些结果提示除了利用抗FMDV抗体直接中和病毒粒子以外还有其他机制在机体抵抗病毒的过程中起着重要作用(McCulloughetal.,1992)。24 中国农业科学院博士学位论文第二章牛FMDA型合成肽疫苗的构建及其免疫效果评价个体免疫系统的差异也是原因之一，如抗体应答寿命不同、诱导细胞和体液免疫的机制不同等(BarnettandCarabin2002)。FMDV非结构蛋白上的T细胞表位氨基酸序列高度保守，它为拓展宿主防御系统对病毒表位的识别提供了可能，是构建FMD合成肽疫苗的重要选择对象(Collen1994)。研究发现FMDVO1K株3A蛋白上存在两个T细胞表位，分别为11~25位氨基酸以及21~35位氨基酸(Blancoetal.,2001)。3D蛋白是病毒RNA聚合酶，能被牛淋巴细胞有效识别(Collenetal.,1998;Yangetal.,2007)。研究报道，共表达3D蛋白与P1蛋白的DNA疫苗能提高免疫应答(Cedillo-Barronetal.,2001)。本研究所设计的三组合成肽均包含结构蛋白VP1上129~169位氨基酸作为B-细胞表位，且都进行了环化模拟立体结构。三组合成肽的不同之处在于T细胞表位的不同，PA组以非结构蛋白3A上21～35位氨基酸作为T细胞表位，PB组以非结构蛋白3D上346～370位氨基酸作为T细胞表位，PC组则共用这两个T细胞表位。结果包含3D上T表位（346～370位氨基酸）的PB组免疫保护效果好于包含3A上T表位（21～35位氨基酸）的PC组，提示3D上346～370位氨基酸之间存在一个有效的Th表位，帮助PB组合成肽疫苗取得相对较好的免疫保护效果。而PC组虽然包含3A和3D上两个T细胞表位，但却只获得了相对更低的免疫保护效力，提示增加更多的表位并不总能提高免疫保护效力，有时甚至起消极的作用。为了研制一种高效的牛FMD合成肽疫苗，科研人员进行了大量的研究(DiMarchietal.,1986;MorganandMoore1990;Tabogaetal.,1997;Volpinaetal.,1999)。但迄今，仍没研制出一种能取代FMD灭活疫苗的高效合成肽疫苗。1997年报道的一株牛FMD合成肽疫苗只提供了40%的保护率(Tabogaetal.,1997)。Rodriguez等在2003报道的研究结果与此类似(Rodriguezetal.,2003)。一般认为FMD灭活疫苗对牛的免疫保护率达到80%以上即可用于田间(BartelingandVreeswijk1991)，本试验中的灭活疫苗阳性对照组保护率为80%，在所构建的三组合成肽疫苗中，免疫保护效果最好的PB组剂量为100µg/头时，免疫牛1次保护率即可达到60%的良好效果。本研究得到的试验结果充分证实了所构建的牛FMD合成肽疫苗的有效性，但对牛体的免疫保护效果还是不能与灭活疫苗相媲美。但如果设计合理，理论上是可以达到完全免疫保护效果的。增加免疫剂量、修饰抗原表位以及使用更加有效的免疫佐剂都有可能提高合成肽疫苗的免疫保护效果(Lofthouseetal.,2002)。合成肽疫苗在FMD的防控中有着巨大的优势和潜力，尽管目前仍有许多不足需要完善，但随着对病毒的抗原表位、病毒与宿主相互作用以及合成肽疫苗的免疫机理等方面深入的研究，利用有限的抗原表位诱导强有力的完全免疫保护成为可能，FMD合成肽疫苗必将具有广阔的前景。本试验的完成为进一步完善A型FMD合成肽疫苗的构建以及其他亚型FMD合成肽疫苗的构建奠定了一定的基础。在合成肽疫苗研究过程中所提出的新思路及其新方法的建立都将为今后合成肽疫苗的开发研究提供理论依据和技术支持。25 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究摘要：为了深入理解FMDV的致病机理和免疫逃逸机制、为研发FMD更好的疫苗和制定有效的防控措施打下基础。本研究首先采集了经FMDVO/CHN/Mya98感染七天后的长白猪敏感组织，构建了高质量的猪组织cDNA表达文库。然后利用分裂-泛素酵母双杂交系统，以FMDVVP1蛋白为诱饵与猪组织cDNA文库进行杂交，通过两轮筛选、β-半乳糖苷酶检测以及菌液PCR检测得到15个阳性克隆，经测序比对分析后，确定了三个互作的宿主蛋白。经回转酵母验证最终确定与FMDVVP1蛋白相互作用的宿主细胞因子zyxin（329–572aa）。利用免疫共沉淀技术在细胞内验证了FMDVVP1蛋白与宿主蛋白zyxin之间确实存在相互作用，利用激光共聚焦技术验证了二者在细胞中存在共定位。利用靶向zyxin基因的特异性干扰小RNA分子沉默细胞内源性zyxin蛋白的表达，通过TaqMan荧光定量PCR检测和细胞毒价测定表明下调zyxin蛋白的表达可抑制FMDV在细胞中的增殖，相反，过表达zyxin蛋白时可促进FMDV的增殖。zyxin的表达随FMDV感染上调。综上结果，我们发现宿主细胞蛋白zyxin能够与FMDVVP1蛋白相互作用且在FMDV增殖过程中起促进作用。关键词：FMDV，cDNA文库，酵母双杂交，VP1，zyxinFMDV在其整个生命周期中以多种方式与宿主细胞蛋白发生相互作用来抵御宿主的天然免疫并完成自身的入侵、复制、组装以及释放等过程。VP1是FMDV最重要的结构蛋白，可参与病毒入侵和免疫逃逸，通过与病毒自身编码蛋白或宿主细胞蛋白相互作用而发挥其多种功能。VP1作为FMDV最重要的免疫原性蛋白，常被广泛应用于各种新型基因工程疫苗的研发。只有彻底了解这些蛋白与宿主的相互作用关系以及其发挥作用的各种机制才能研制出更加有效的疫苗来预防该病。酵母双杂交技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用最经典、最高效的方法。通过构建猪组织cDNA表达文库，利用基于分裂泛素系统的酵母双杂交技术，以FMDVVP1为诱饵蛋白，筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白，并进一步研究其功能，为FMDV的致病与抗感染分子机制提供新的理论依据，为研制FMD新型疫苗奠定基础。3.1材料3.1.1试剂与试剂盒（1）分裂-泛素酵母双杂交筛选试剂盒DUALhunterstarterkits购自瑞士DualsystemsBiotech公司：试剂盒包括酵母报告菌株NMY51、诱饵载体pDHB1、猎物/文库载体pPR3-N、对照诱饵载体pTSU2-APP、对照猎物载体pNubG-Fe65和功能反应对照载体pOst1-NubI（载体信息详见图4-1）。β-半乳糖苷酶检测试剂盒HTXβ-galactosidaseassaykit以及酵母转化试剂盒DSYYeastTransformationkit。26 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究图3-1DUALhuntersystem载体信息图Fig3-1VectormapsofDUALhuntersystemA：诱饵载体pDHB1；B：猎物/文库载体pPR3-N；C：对照诱饵载体pTSU2-APP；D：对照猎物载体pNubG-Fe65；E：功能反应对照载体pOst1-NubIA:biatvectorpDHB1;B:Prey/LibraryvectorpPR3-N;C:ControlbaitpTSU2-APP;D:ControlpreypNubG-Fe65;E:FunctionalcontrolpOst1-NubI27 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究MediaStarterPackage1购自DualsystemsBiotech公司，包含YPADmedia、SD-AHLWmedia、Adenine、L-histidine、L-leucine、L-trptophan和3-AT。（2）其他载体：pMD18-T载体购自大连宝生物公司；真核表达载体pCMV-Myc购自美国Clontech公司；p3×FLAG-CMV-10载体购自美国Sigma–Aldrich公司。（3）抗体：anti-Myc、anti-FLAG、anti-zyxin、anti-GAPDH和anti-βtubulin抗体均购自美国Sigma–Aldrich公司；IRDye680标记山羊抗兔IgG和IRDye800CW标记山羊抗鼠IgG购自美国LiCor公司；DyLight649荧光标记的山羊抗鼠IgG和DyLight488荧光标记的山羊抗兔IgG购自EarthOx公司；HRP标记山羊抗鼠/兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。（4）TRIzol、1kbPlusDNALadder、琼脂糖购自美国Invitrogen公司；三氯甲烷(氯仿)、75%乙醇、异丙醇和DEPC水购自上海生工生物有限公司，宿主菌E.coliDH5α购自北京全世金生物公司。DNA分子质量、限制性内切酶SfiI、EcoRI、XhoI、HindIII和speⅠ、EmeraldAmpPCRMasterMix、OneStepPrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime）、PrimescriptRTreagentKitwithgDNAEraser、PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2、PremixTag（ExTagVersion2.0）均购自大连宝生物公司；T4DNA连接酶、SP6/T7体外转录试剂盒购自Promega公司；RNA小提试剂盒购自QIAGEN公司；AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；酵母质粒小提试剂盒购自Omega公司。X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent、X-tremeGENEsiRNAtransfectionreagent、蛋白酶抑制剂Cocktail、预染彩虹蛋白marker购自Roche公司；DMSO、DAPI、TritonX-100购自美国Sigma–Aldrich公司；NC膜、0.22µm滤器购自美国Millipore公司；RIPAlysisbuffer、Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自美国Thermofisher公司。4%多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司；医用X射线胶片购自美国柯达公司；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、12%SDS-PAGE预制胶、转印缓冲液购自南京金斯瑞公司。其他试剂参照第二章2.1.4。3.1.2毒株与细胞FMDVO/CHN/Mya98毒株、BHK-21细胞、HEK293T细胞均由本实验室保存。3.1.3主要仪器、耗材电泳仪购自北京六一仪器厂；凝胶成像仪购自上海培清科技有限公司；nanodrop2000超微量核酸蛋白测定仪和PCR仪购自美国Thermofisher公司；荧光定量PCR仪购自美国Agilent公司；恒温孵育器购自德国Eppedorf公司；数显恒温水浴锅购自上海谷宁仪器有限公司；磁力搅拌器购自雷磁仪器厂；超声波细胞破碎仪购自美国Sonics公司；蛋白电泳及半干转印系统购自美国Bio-Rad公司；激光共聚焦专用玻底培养皿购自美国MatTek公司；15ml、50ml聚丙烯管购自美国Corning公司；其他仪器耗材参照第二章2.1.4。3.1.4实验所用溶液及其配制28 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究（1）1×YPAD液体培养基和平板培养基将购自DualsystemsBiotech公司的1包YPADmedia定溶于1L去离子水中，在磁力搅拌器上充分溶解后，取500mL至一新的灭菌三角瓶中，121℃高压灭菌15min，室温保存，即为1×YPAD液体培养基。其余500mL培养集，加入10g琼脂粉溶解后121℃高压灭菌15min，待温度降至70℃以下，立即倒入培养皿中（25ml/平板），冷却凝固，4℃密封倒置保存，即为1×YPAD平板培养基。（2）2×YPAD液体培养基将购自DualsystemsBiotech公司的1包YPADmedia定溶于500mL去离子水中，在磁力搅拌器上充分溶解后，121℃高压灭菌15min，室温保存，即为2×YPAD液体培养基。（3）氨基酸储存液每种氨基酸按下表用量充分溶解于适量双蒸水中，0.22µm滤器除菌，分装后4℃保存。用量溶解于储存液浓度工作浓度Adenine（A）200mg100mL2g/L10mg/LL-histidine（H）200mg20mL10g/L20mg/LL-leucine（L）200mg20mL10g/L100mg/LL-tryptophan（W）200mg20mL10g/L20mg/L（4）SD-AHLW液体培养基和平板培养基取购自DualsystemsBiotech公司的SD-AHLWmedia2包定溶于1L去离子水中，在磁力搅拌器上充分溶解后，121℃高压灭菌15min，室温保存，即为SD-AHLW液体培养基。用同样方法配制1LSD-AHLW液体培养基，加入20g琼脂粉溶解后121℃高压灭菌15min，待温度降至70℃以下，立即倒入若干培养皿中（10cm平板/15cm平板），冷却凝固，密封后于4℃倒置保存，即为SD-AHLW平板培养基。（5）SD-HLW、SD-LW、SD-L、SD-W液体培养基按下表分别配制SD-HLW、SD-LW、SD-L、SD-W液体培养基，121℃高压灭菌15min，4℃保存。SD-AHLWAdenine(A)L-histidin(H)L-leucine(L)L-tryptophan(W)液体培养基储存液储存液储存液储存液SD-HLW500mL2.5mL000SD-LW500mL2.5mL1mL00SD-L200mL1mL0.4mL00.4mLSD-W200mL1mL0.4mL0.4mL0（6）SD-HLW、SD-LW、SD-L、SD-W平板培养基按下表分别配制SD-HLW、SD-LW、SD-L、SD-W平板培养基，121℃高压灭菌15min，待温度降至70℃以下，倒入若干10cm培养皿中，冷却凝固，密封后于4℃倒置保存。29 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究SD-AHLWAgarAdenine(A)L-histidin(H)L-leucine(L)L-tryptophan(W)液体培养基储存液储存液储存液储存液SD-HLW500mL10g2.5mL000SD-LW500mL10g2.5mL1mL00SD-L200mL4g1mL0.4mL00.4mLSD-W200mL4g1mL0.4mL0.4mL0（7）0.2%TritonX-100配制取35.9mLPBS与14.1mLTritonX-100混合配置30%TritonX-100母液，4℃保存。使用时，从中取0.33mL母液稀释到50mLPBS里，即为0.2%TritonX-100。（8）DAPI的配制0.01gDAPI溶解于1mL灭菌蒸馏水，即为浓度为10mg/mL的储存液。使用时，从中取10µL稀释到990µLPBS中，即为浓度为100µg/mL的工作液。（9）含抗生素的LB平板培养基的配制950mL去离子水中加入10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，15g琼脂粉，用5mol/LNaOH调pH值至7.0，定容至1L，121℃高压灭菌15分钟。冷却至70℃以下，加入100mg/ml卡那霉素或氨苄青霉素至终浓度50ug/mL，立即将培养基倒入培养皿中（25ml/平板），冷却凝固，4℃密封倒置保存。3.2方法3.2.1引物设计与合成PrimersSequence(5'–3')RestrictionUsageenzymeVP1-FCACAAATGTACAGGGATGGGTpMD18T-VP1VP1-RGACATGTCCTCCTGCATCTpDHB1-VP1-FATTAACAAGGCCATTACGGCCACCACTTCGACGGGCSfiIpDHB1-VP1GAGpDHB1-VP1-RAACTGATTGGCCGAGGCGGCCCCCAAGGACTGCTTTSfiIACpMyc-VP1-FCGGAATTCACCACTTCGACGGGCGAGTCEcoRIpMyc-VP1pMyc-VP1-RATCTCGAGTTACAAGGACTGCTTTACAGGXhoIFLAG-ZYX-FATAAGCTTCAGCACCCAGTGCCCCCACCAGHindIIIpFLAG-zyxinFLAG-ZYX-RCATTCTAGATTAGGTCTGGGCTCTGGTGGTGTGXbaIpPR3-N-FGTCGAAAATTCAAGACAAGGpPR3-N-RAAGCGTGACATAACTAATTAC所有引物均由上海生工生物技术有限公司合成。30 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.2.2猪组织cDNA表达文库的构建3.2.2.1样品采集及保存新鲜采集经FMDVO/CHN/Mya98感染七天后的长白猪敏感组织如鼻、唇、舌、脾以及蹄部软组织等，立即放于液氮灌中保存。本论文涉及的所有动物攻毒试验均在中国农业科学院兰州兽医研究所生物安全三级实验室中进行。所有动物试验方案经由中国农业科学院兰州兽医研究所动物使用及护理委员会批准。3.2.2.2Trizol法提取猪组织样品总RNA（1）将保存于液氮中的经FMDVO/CHN/Mya98感染七天后的长白猪组织样品各取适量，混合后称重。（2）将称重后的猪组织样品放于高压灭菌并预冷的研钵中，边加液氮边迅速研磨，研磨至粉末状后转入无RNA酶的50mL离心管中。（3）按照Trizol与粉末体积比大于4:1的量加入Trizol溶液。剧烈振荡混匀后在室温下静置10min，令其充分裂解。（4）按照氯仿与Trizol体积比为1:5的量加入氯仿，盖上盖子后用手剧烈震荡15s，在室温下静置5min。4℃，12,000g离心15min。（5）小心取上层水相至新的无RNA酶的50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，在室温下放置10min后于4℃离心机，12,000g离心15min。（6）弃上清，按照乙醇与Trizol体积比为1:1的量加入75%乙醇洗涤沉淀，4℃，12,000g离心5min。此步骤重复一次。（7）弃上清，室温下于无菌环境中自然干燥15~20min，最后溶于适量DEPC水中，-70℃保存。（8）用NanoDrop分析仪检测RNA纯度和浓度。（9）用1.2%的变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。3.2.2.3cDNA表达文库的构建用invitrogen公司的FastTrack®MAGmRNAisolationKit分离纯化mRNA。以mRNA为模板，用invitrogen公司的CloneMinerIIcDNA文库构建试剂盒合成三种读码框的双链cDNA，通过BP反应重组到入门载体pDONR222上构建猪组织cDNA初级文库。cDNA初级文库经LR反应重组到酵母表达载体pPR3-N上构建出猪组织样品的cDNA表达文库。取1μL原始文库，1000倍稀释+后取50μL涂布LB/Amp平板，37℃培养过夜，根据平板克隆数计算文库滴度。随机挑取24个克隆子，以菌落PCR方法检测重组率，以及插入片段长度。此文库构建过程交由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。3.2.3O型FMDVVP1基因的扩增与克隆31 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.2.3.1病毒增殖将保存的FMDVO/CHN/Mya98细胞毒按第二章2.2.1所述进行传代增殖。3.2.3.2病毒RNA的提取用QIAGEN公司RNA提取试剂盒提取病毒RNA：（1）取传代稳定的FMDVO/CHN/Mya98细胞毒，3,000g离心10min，去除细胞碎片。（2）取350µL细胞毒液，加入350µLRLT和3.5µLβ-ME，用枪尖轻轻混匀。（3）加入700µL70%乙醇，轻柔混匀。（4）分两次吸取混合物到离心柱中，10,000g离心15s，弃滤液。（5）在离心柱中加入700µL缓冲液RW1，10,000g离心15s，弃滤液。（6）在离心柱中加入500µL缓冲液RPE，10,000g离心15s，弃滤液。（7）在离心柱中加入500µL缓冲液RPE，10,000g离心2min。（8）取出离心柱，放入一支无RNA酶的1.5mL离心管中，加入30µL无RNA酶的水，10,000g离心1min，收集滤液，-20℃保存。3.2.3.3VP1基因的扩增用大连宝生物公司的PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒扩增VP1基因，反应体系如下：PrimeScript1stepEnzymeMix2µL2×1stepbuffer25µL上游引物VP1-F(20µmol/L)1µL下游引物VP1-R(20µmol/L)1µL病毒RNA2µL无RNA酶水19µLTotalvolume50µL将上述液体混合均匀，进行PCR扩增，程序如下：温度时间循环数150℃30min1295℃3min1394℃45s458℃45s30572℃1min672℃8min1扩增结束后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。32 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.2.3.4VP1基因的纯化回收用Axygen公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段：（1）在紫外灯下用手术刀片切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，切碎后放入2mL离心管中，称重。（2）向胶块中加入3倍凝胶体积（按1mg=1µL计算）的BufferDE-A，置于75℃水浴中，每2~3分钟颠倒混合一次，直至胶块充分融化。（3）加入BufferDE-B（BufferDE-A的1/2体积量），混合均匀。（4）将DNA制备管安置于2mL离心管中，将步骤3）中的溶液转移至DNA制备管中，12,000g离心1min，弃滤液。（5）加入500µL的BufferW1，12,000g离心30s，弃滤液。（6）加入700µL的BufferW2，12,000g离心30s，弃滤液。重复此步骤一次。（7）不加任何溶液12,000r/min离心2min。（8）取一新的1.5mL离心管，将DNA制备管放入，于膜中央加入25µL的预热到60℃的双蒸水，室温下静置1min。（9）12,000g离心1min，收集洗脱液。3.2.3.5VP1基因连接到克隆载体pMD18-T连接体系如下：pMD18-Tvector1µLPCR回收产物4µLSolution15µLTotalvolume10µL将上述溶液混匀，于16℃水浴锅孵育3h。3.2.3.6连接产物的转化（1）将10µL连接产物加入冰上溶解的感受态细胞E.coliDH5α中，枪尖轻轻转动混匀，续冰上放置30min。（2）于42℃水浴中热激90s，迅速取出放置于冰上孵育3min。（3）取预热的SOC培养基，向每管中加入700µL，在37℃培养箱中以220r/min振荡培养约50min。（4）室温3000g离心2min，弃上清，留约200µL培养液，重悬细胞沉淀。+（5）涂布于一块LB/Amp平板（Amp终浓度100µg/mL），37℃恒温培养箱倒置培养12~16h。+挑4~6个单菌落分别接种至5mLLB/Amp液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜。3.2.3.7重组克隆质粒DNA的提取33 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒说明书提取质粒DNA：（1）取2mL培养过夜的菌液，12,000g离心1min，弃上清。（2）加入250µLBufferS1，涡旋器充分悬浮细菌沉淀。（3）加入250µLBufferS2，温和地上下翻转混合5～6次，直至形成透明溶液（此步骤不超过5min）。（4）加入350µLBufferS2，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成白色絮状沉淀，室温12,000r/min离心10min，取上清。（5）将试剂盒中的制备管安置于2mL离心管中。（6）将步骤（4）中的上清转移到制备管，12,000g离心1min，弃滤液。（7）加入500µL的BufferW1，12,000g离心1min，弃滤液。（8）加入700µL的BufferW2，12,000g离心1min，弃滤液。此步骤重复一次。（9）不加任何溶液，12,000g离心1min。（10）再将制备管安置于一支新的1.5mL离心管，在膜中央加入60℃预热的灭菌水，室温静置1min。（11）12,000g离心1min洗脱DNA。3.2.3.8重组克隆载体的鉴定（1）重组质粒的PCR扩增鉴定用购自大连宝生物公司的PremixTag（ExTagVersion2.0）试剂进行PCR扩增鉴定，体系如下：PremixTag（ExTagVersion2.0）25µL质粒2µL上游引物VP1-F(20µmol/L)1µL上游引物VP1-R(20µmol/L)1µLddH2O21µLTotalvolume50µL扩增程序如下：温度时间循环数198℃10s255℃30s30372℃1min扩增结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。（2）重组载体的测序鉴定将PCR扩增结果为阳性的质粒，送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定。将测得的序列用DNAStar软件分析，并在GeneBank中进行BLAST序列同源性比较分析。选择含有完整而34 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究正确的目的基因的重组质粒pMD18T-VP1进行下步试验。3.2.4O型FMDVVP1诱饵表达载体的构建3.2.4.1扩增带有SfiI酶切位点的VP1基因以pMD18T-VP1质粒作为模板，以pDHB1-VP1-F/pDHB1-VP1-R为上下游引物进行扩增，扩增体系及程序同3.2.3.8。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化，具体步骤同3.2.3.4。3.2.4.2PCR产物的酶切及回收将PCR胶回收产物作SfiI酶切，体系如下PCR胶回收产物25µL10×MBuffer6µLSfiI3µLddH2026µLTotalvolume60µL将上述溶液混匀，37℃水浴3h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化，具体步骤同3.2.3.4。3.2.4.3诱饵载体pDHB1酶切及回收（1）将酵母双杂交试剂盒DUALhunterstarterkits中提供的质粒冻干粉，分别用50uL的双蒸水溶解，使其终浓度为0.1µg/µL，50℃孵育5分钟。涡旋1分钟，瞬时离心于管底，–20℃储存。（2）将诱饵载体pDHB1作SfiI酶切并回收，体系、方法同3.2.4.2。3.2.4.4VP1基因连接到诱饵载体pDHB1将经过SfiI酶切的VP1基因和诱饵载体pDHB1通过T4连接酶连接，体系如下：VP1回收片段3.5µLpDHB1回收片段1µLT4连接酶1µLT4ligeasebuffer1µLddH203.5µLTotalvolume10µL将上述溶液混匀，于16℃水浴锅中孵育6h。35 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.2.4.5连接产物转化大肠杆菌+具体步骤同3.2.3.6。不同之处是pDHB1载体含有卡那霉素抗性，所以此处涂板用LB/Kan+平板（Kan终浓度100µg/mL），摇菌用LB/Kan液体培养基。3.2.4.6重组诱饵载体DNA的提取具体步骤同3.2.3.73.2.4.7重组诱饵载体鉴定（1）重组诱饵载体的PCR鉴定，体系如下PremixTag（ExTagVersion2.0）25µL质粒2µL上游引物pDHB1-VP1-F(20µmol/L)1µL上游引物pDHB1-VP1-R(20µmol/L)1µLddH2O21µLTotalvolume50µL扩增程序同3.2.3.8。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。（2）重组诱饵载体的酶切鉴定，体系如下：连接质粒7µL10×MBuffer3µLSfiI1µLddH2019µLTotalvolume30µL将上述溶液混匀，37℃水浴孵育3h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。（3）重组诱饵载体的测序鉴定将通过PCR鉴定及单酶切鉴定均为阳性的质粒，送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定。将测得的序列用DNAStar软件分析，并在GeneBank中进行BLAST序列同源性比较分析。选择含有完整而正确的目的基因的重组诱饵载体pDHB1-VP1进行下步试验。3.2.5重组诱饵表达载体转化酵母菌NMY513.2.5.1酵母菌株NMY51的储存与活化36 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究用无菌接种环挑取NMY51酵母菌划线涂布于YPAD平板培养基，封口膜密封后置于30℃恒温培养箱培养2～3天，挑取1～2mm的白色菌落接种于20ml1×YPAD液体培养基中，30℃振荡过夜。3,000g离心5min，弃去上清，用10ml2×YPAD培养基/25％甘油重悬沉淀，分装，-70℃保存。划线了酵母菌株的平板可以在4℃存放1个月，但超过两周后的酵母不宜做转化用。3.2.5.2酵母菌株NMY51基因型的检测挑取生长在YPAD培养基上的酵母NMY51单克隆，重悬于1mL0.9％NaCl溶液中，用无菌接种环划线于营养缺陷型培养基SD-L、SD-W平板上，封口膜密封后，置于30℃恒温培养箱培养3天，观察菌落生长情况。3.2.5.3重组诱饵载体转化酵母菌NMY51使用LiAC法将构建好的重组诱饵载体pDHB1-VP1和空载体pDHB1分别转入酵母报告菌株NMY51，具体方法如下：（1）从新鲜的YPAD酵母生长平板上随机挑取NMY51单菌落接种于5mLYPAD液体培养基中，30℃振荡过夜培养后，以1:50转接于50mLYPAD液体培养基中，220r/min，30℃振摇4h至OD546值在在0.6左右，700g离心5min，弃上清，用2.5mL无菌ddH2O重悬备用。（2）用购自DualsystemsBiotech公司的DSYYeastTransformationKit进行酵母转化：（3）准备Single-strandedcarrierDNA，在95℃孵育5min，冰浴5min，重复此步骤一次。（4）按下表配制PEG/LiOAcmastermix（5个反应用量）：组分用量50%PEG1.2mL1mol/LLiOAc180μLSingle-strandedcarrierDNA125μL（5）在1.5mL离心管中按下表分别配制两个反应体系：反应用量质粒11.5μgpDHB1-VP121.5μgpDHB1（6）向上述两个反应体系中分别加入300μLPEG/LiOAcmastermix，轻微涡旋混匀。（7）每管加入100μL步骤（1）中重悬的酵母细胞，涡旋1min，彻底混匀。（8）42℃水浴45min。（9）700g离心5min，弃上清。（10）每管用100μL0.9％NaCl溶液重悬，1:100稀释后各取50μL涂布于SD-L固体培养基。（11）封口膜密封后，置于30℃恒温培养箱培养3天，观察菌落生长情况，比较重组诱饵载体pDHB1-VP1和空载体pDHB1分别转入酵母菌株后菌落生长情况有无变化，从而判断构建的重组诱饵载体pDHB1-VP1对酵母菌株有无毒性。37 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究（12）菌液PCR验证重组诱饵质粒是否已转入酵母菌株。在转化有pDHB1-VP1重组载体的SD-L平板上随机挑取单菌落于5mLSD-L液体培养基中，30℃振摇培养至OD546为0.6～0.8之间，用大连宝生物公司的EmeraldAmpPCRMasterMix试剂进行PCR扩增，体系如下：2×EmeraldAmpPCRMasterMix25µL上游引物pDHB1-VP1-F(20µmol/L)1µL上游引物pDHB1-VP1-R(20µmol/L)1µL菌液2µLddH2O21µLTotalvolume50µL反应程序如下：温度时间循环数198℃10s255℃30s30372℃6minPCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。（13）将已确认转化入重组诱饵质粒pDHB1-VP1的酵母菌培养物与50%无菌甘油1:1混合分装于1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。3.2.6DUALhunter系统功能验证以及诱饵载体自激活检测（1）在1.5mL离心管中按下表分别配制反应体系：反应用量质粒1质粒21各1.5μgpDHB1-VP1pOst1-NubI2各1.5μgpDHB1-VP1pPR3-N3各1.5μgpTSU2-APPpNubG-Fe654各1.5μgpTSU2-APPpPR3-N5各1.5μgpTSU2-APPpPR3-N-L6各1.5μgpDHB1-VP1pPR3-N-L（2）将上述反应体系用LiAC法转化酵母菌，具体步骤同3.2.5.3。（3）转化后的酵母细胞经离心去上清后，每管用150μL0.9％NaCl溶液重悬，各取50μL涂布于SD-LW、SD-HLW和SD-AHLW固体培养基；（4）封口膜密封后，置于30℃恒温培养箱培养3~4天，观察菌落生长情况。（5）计算所有平板菌落生长个数以及生长百分率：生长百分率（%）=选择性平板上克隆的数量（SD-HLW或SD-AHLW）×100%/非选择平板上克隆的数量（SD-LW）。以此判断并选择适当的筛选压力用于后续的文库筛选。3.2.7利用酵母双杂交方法以VP1为诱饵蛋白筛选猪组织cDNA文库38 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.2.7.1以pDHB1-VP1为诱饵质粒筛选猪组织cDNA文库（1）将步骤3.2.5.3中保存的已确认转化入重组诱饵质粒pDHB1-VP1的酵母菌以1:1000转接到10mL的SD-L液体培养基，放于30℃摇床，以220r/min振荡培养8h。（2）将培养8h后的10mL培养物全部转接到100mL新鲜配制的SD-L液体培养基中，继续放于30℃摇床，220r/min振荡培养过夜。（3）取过夜培养物1ml于离心管中，2500g离心5分钟，弃掉上清液，用1mL蒸馏水重悬沉淀，测其OD546值。（4）取30个OD的菌液量，700g离心5min，弃上清，用200mL2×YPAD培养基（提前预热到30℃）分三次重悬沉淀，使悬液最终OD546值为0.15。（5）于30℃摇床220r/min培养3h，至OD546值达到0.6~0.7之间，作为酵母菌感受态细胞。（6）按照DSYYeastTransformationKit说明书步骤进行酵母转化。（7）取试剂盒中提供的Single-strandedcarrierDNA，95℃孵育5min，冰浴5min，重复此步骤一次，备用。（8）配制LiOAc/TEmixLiOAc(1mol/L)1.1mL10×TE（PH7.5）1.1mLddH2O7.8mLTotalvolume10mL（9）配制PEG/LiOAcmix1mol/LLiOAc1.5mL10×TE（PH7.5）1.5mL50%PEG12mLTotalvolume15mL（10）将步骤（5）的培养物分装至4个50mL离心管中，700g离心5min，弃上清。（11）分别用30mLddH2O重悬沉淀，涡旋混匀，700g离心5min，弃掉上清液。（12）分别用1mL配制好的LiOAc/TEmix重悬沉淀，转移至1.5mL离心管中，700g离心5min，弃上清。（13）分别用600µLLiOAc/TEmix重悬沉淀。（14）在4个50mL离心管中分别加入7µg的文库质粒pPR3-N-L，100µL变性后的Single-strandedcarrierDNA，600µL步骤（13）中的悬液，2.5mLPEG/LiOAcmix。涡旋1min，充分混匀。（15）于30℃孵育45min，每隔15min振摇一次。（16）每管加入160µLDMSO，快速振荡混匀。（17）于42℃水浴锅中孵育20min。700g离心5min，弃掉上清。（18）每管中的沉淀用3mL2×YPAD培养基重悬后放于30℃摇床以150r/min低转速振摇90min。700g离心5min，弃上清。39 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究（19）每管沉淀用1.2mL0.9％NaCl重悬，全部转移至一新的离心管中，混匀。（20）涂布于直径15cm的选择性固体培养基，每板300µL。（21）取剩余的细胞悬液10µL加入到90µL0.9％氯化钠溶液中，即为1:10稀释，再梯度稀释至1:100，1:1000和1:10000，分别涂布于直径为10cm的SD-LW平板上，每板100µL。计算转化效率。（22）封口膜密封后，置于30℃恒温培养箱培养3~4天。计算在固体培养基SD-LW上的总转化数，总转化数=SD-LW平板上的菌落数×稀释倍数×10×4.8。（23）挑取所有生长良好的克隆在一新的相同选择性培养基上重新划线,挑取生长良好的单克隆进行β-galactosidase活性检测试验。3.2.7.2β-galactosidase活性检测试验用Dualsystems公司的HTXβ-galactosidaseassaykit，具体操作如下：（1）从上步操作中分别挑单克隆菌落于1mL选择性液体培养基中，于30℃摇床，250r/min振荡培养至OD546值介于0.5～0.8之间。2,000g离心5min，弃上清。（2）配制裂解混合物：取9.95mLOne-StepLysisandAssayReagent，加入50µLDyestocksolution，混合即可。（3）步骤（1）中的每个沉淀用100µL配制好的裂解混合物重悬，涡旋1min后一一移至96孔板中，观察测颜色变化并测定OD615。（4）每个单克隆的颜色深浅取决于表达的诱饵和猎物蛋白之间相互作用的强弱。呈现蓝色的判定为阳性克隆。3.2.7.3酵母菌落PCR鉴定将经过两轮选择性培养基筛选并用β-galactosidase活性检测试验初步验证为阳性的单克隆进行酵母菌落PCR扩增，以去除重复的相同菌落。菌液PCR体系如下：2×EmeraldAmpPCRMasterMix25µL上游引物pPR3-N-F(20µmol/L)1µL上游引物pPR3-N-R(20µmol/L)1µL菌液2µLddH2O21µLTotalvolume50µL扩增程序同3.2.5.3中的第（12）步。1%琼脂糖凝胶电泳检测产物。3.2.7.4酵母质粒的提取、转化与测序将经过以上筛选鉴定确认的阳性克隆应用购自Omega公司的酵母质粒小提试剂盒提取质粒，具体步骤如下：40 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究（1）分别将单克隆菌液以1:1000转接到5mL的YPAD培养基中，30℃摇床培养20~24h。（2）取2mL培养物，室温4,000g离心5min，弃上清。（3）加入480µLBufferSE、10µLβ巯基乙醇和20µLlyticasesolution重悬沉淀，涡旋振荡使重悬彻底后置于30℃孵育30min。（4）室温4,000g离心5min，弃上清。用250µLBufferYPⅠ/RNaseA重悬沉淀。（5）加入50mg玻璃珠，用最大转速涡旋5min。待玻璃珠沉降底部后转移上清至一新的1.5ml离心管中。（6）加入250µLYPⅡ，轻柔颠倒混匀4~6次，液体变澄清，室温静置2min。（7）加入350µLYPⅢ，缓慢颠倒混匀4~6次，直至出现白色絮状沉淀，10,000g室温离心10min。（8）将HiBindDNA柱安装到2ml收集管中。（9）小心吸取上清至HiBindDNA柱，10,000g室温离心1min，弃滤液。（10）加入500µLBufferHB，10,000g室温离心1min，弃滤液。（11）加入700µLDNAWashBuffer(用乙醇稀释)，10,000g室温离心1min，弃滤液。重复此步骤一次。（12）空管13,000g离心2min。（13）将柱子安置在一新的1.5mL离心管中，在柱子中央加入30µL灭菌蒸馏水，10,000g离心1min，洗脱DNA。（14）用提取的酵母质粒转化感受态细胞E.coliDH5α，方法同3.2.3.6，提取高浓度的质粒送华大基因生物技术公司测序。3.2.7.5pDHB1-bait与pPR3-N-prey酵母双杂交共转化验证为了排除假阳性，分别将诱饵质粒与各筛选分离到的捕获质粒共同转化酵母菌NMY51，每种质粒各用1.5μg，同时设阴性对照组pDHB1/pPR3-N-hits和pTSU2-APP/pPR3-N。然后按照3.2.5.3所述方法共转化酵母菌，涂布于选择性平板培养基上，在30℃倒置培养3~4d，观察菌落生长情况，若无酵母菌落生长即判定为假阳性，予以排除。3.2.8免疫共沉淀技术验证VP1蛋白与zyxin蛋白的相互作用3.2.8.1真核表达载体pMyc-VP1及pFLAG-zyxin的构建设计并合成含有EcoRI和XhoI酶切位点的引物pMyc-VP1-F/pMyc-VP1-R，具体序列见3.2.1。以质粒pMD18T-VP1为模板，进行PCR扩增。将扩增产物经纯化回收后进行EcoRI和XhoI双酶切，60µL反应体系：21µL质粒、6µL10×buffer、3µLEcoR1、3µLXhoI、27µLddH2O，37℃酶切3h。切胶回收酶切片段。同时将pCMV-Myc载体进行同样酶切及回收。将酶切PCR产物及载体用T4连接酶连接后转化感受态细胞E.coliDH5α，提取质粒并测序。构建真核表达载体pMyc-VP1。具体构建步骤同3.2.4。41 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究设计并合成含有HindIII和XbaI酶切位点的引物FLAG-zyxin-F/FLAG-zyxin-R，具体序列见3.2.1。以质粒pPR3-N-zyxin为模板，进行PCR，扩增长732bp的编码C末端329~572位氨基酸的zyxin基因。酶切PCR产物及载体p3×FLAG-CMV-10，胶回收后连接并转化大肠杆菌构建真核表达载体pFLAG-zyxin。构建步骤同前。3.2.8.2真核表达载体pMyc-VP1和pFLAG-zyxin的转染（1）HEK293T细胞培养及接种将长满单层的HEK-293T细胞用MEM或PBS轻柔冲洗两遍，加入2mL0.25%的胰酶消化15s，倒掉，待细胞变圆后加入含10%FBS的MEM培养基21mL，将细胞从细胞瓶底冲下，用电动助吸器反复吹散后平均分装到3个新培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，约2d长成单层。将消化好的HEK293T细胞接种于10cm细胞培养皿，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至单层细胞汇合度在70~80%。（2）转染按照Roche公司的X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent试剂说明书进行转染：用OPTI-MEM将质粒稀释至终浓度为0.01µg/µL（pMyc-VP1和pFLAG-zyxin各5μg），按X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent（µL）与DNA（µg）比值为3:1加入X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent30µL，用移液器轻柔吹打混匀，置于室温下孵育15min，缓慢逐滴加入待转染的细胞培养皿中，继续在37℃、5%CO2细胞培养箱培养约48h。3.2.8.3免疫共沉淀按照Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒进行：（1）转染48h后，小心吸弃培养液，用1×改良型杜氏PBS洗一次，加入冰上预冷的1mLIP裂解/洗涤缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解5min并间断混匀。转移至2mL离心管中，13,000g，4℃离心10min，取上清，分装备用。其中取出50µL用于input对照。（2）按照说明书分别将鼠抗Myc单抗、兔抗FLAG多抗、正常鼠IgG以及正常兔IgG固定到试剂盒提供的AminoLink偶联树脂上。（3）按照说明书用对照琼脂糖树脂预处理细胞裂解液。（4）将细胞裂解液分别加入到固定有抗体的树脂柱中，盖上螺旋盖，4℃翻转过夜。1500g，4℃离心1min，弃滤液。（5）将离心柱放置于一新的收集管中，加入200µLIP裂解/洗涤缓冲液，1500g，4℃离心1min，弃滤液。此步骤重复两次。（6）将离心柱放置于一新的收集管中，加入10µL洗脱缓冲液，1500g，4℃离心1min，收集流穿液。保持离心柱在收集管中，加入50µL洗脱缓冲液，室温静置5min，1500g，4℃离心1min，收集流穿液。将两次收集的流穿液混合到一管。（7）SDS-PAGE电泳：在上述样品及步骤（1）中的input样品中分别加入5×SDS上样buffer42 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究至终浓度为1×，沸水浴煮沸5~10min，立即插入冰中待用。用南京金斯瑞公司的4-12%梯度预制胶进行SDS-PAGE。（8）Westernblotting检测：电泳结束后，采用半干转印法将蛋白条带转印至NC膜，用含5%脱脂乳的PBST封闭液在室温、摇床上缓慢摇动封闭2h。直接加入一抗（按照使用说明书用封闭液稀释到工作浓度）4℃反应过夜。PBST洗涤三次，每次10分钟。加入稀释到工作浓度的二抗：Dye680标记山羊抗兔IgG或IRDye800CW标记山羊抗鼠IgG，作用1h。PBST洗膜三次，每次10分钟。用美国LI-COR公司Odyssey双色红外荧光成像系统扫描NC膜。3.2.9激光共聚焦技术检测VP1与zyxin在细胞中的共定位（1）将消化好的HEK293T细胞接种于35mm激光共聚焦专用玻底培养皿，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养至单层细胞汇合度在70~80%。设转染试验组：pMyc-VP1+pFLAG-zyxin，每种质粒各1µg，配制200µL转染复合物；阴性对照组：pCMV-Myc+p3xFLAG-CMV-10，每种质粒各1µg，配制200µL转染复合物；两组质粒分别按3.2.8.2所述转染方法共转染HEK293T细胞，继续培养约18~24h。（2）吸弃培养基，用PBS洗3次，每次5min，加入4%的多聚甲醛室温固定15min，1mL/孔。（3）PBS洗3次，加入0.2%的TritonX-100（PBS配制）室温透膜15min，1mL/孔。（4）PBS洗3次，加入含3%BSA的PBST溶液，室温封闭2h。（5）直接加入用封闭液1:1000稀释的鼠抗FLAG单抗和1:100稀释的兔抗Myc多抗，4℃孵育过夜。（6）PBS洗3次，加入1:500稀释的DyLight649荧光标记的山羊抗鼠IgG和DyLight488荧光标记的山羊抗兔IgG，室温避光孵育1h。（7）PBS洗3次，加入DAPI工作液室温避光孵育5min，吸弃。（8）PBS洗5次，用含50%甘油的PBS封板，1mL/孔，在激光共聚焦显微镜下观察拍照。3.2.10FMDV感染对细胞zyxin表达的影响为了研究FMDV感染是否对细胞zyxin的表达产生影响，我们将BHK-21细胞接种于60mm细胞培养皿，长至单层后以MOI=1的感染剂量接种FMDVO/CHN/Mya98，接毒步骤同第二章2.2.1。分别在接毒后1h、3h、5h、7h以及9h收集细胞，同时收集9h的未接毒细胞作为对照（Mock）。小心吸弃培养基后用预冷的PBS洗两遍，加入400µL预冷的含1mg/mLcocktail蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，4℃裂解30min，间断振摇混合。收集细胞裂解液于1.5mL离心管中，超声破碎20~30s，14,000g离心15min，收集上清进行Westernblotting检测，分别用1:1000稀释的兔抗zyxin多抗和1:800稀释的鼠抗β-tublin单抗作为一抗，以HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，分别检测zyxin以及内参β-tublin的表达情况。使用ImageJ的软件对zyxin蛋白和β-tublin蛋白在感染后不同时间点的相对浓度进行定量，并用GraphPad软件分析作图。43 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.2.11干扰zyxin的表达对FMDV增殖的影响用于干扰内源性zyxin蛋白的siRNA购自广州锐博生物科技有限公司，共三条siRNA，分别命名为siZYX1、siZYX2和siZYX3，按说明书方法配制成20µmol/L的储存液，分装保存，避免反复冻融。按照X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent使用说明书分别将100nM的siZYX1、siZYX2和siZYX3，150nMsiZYX3，以及无序siRNA(siNC)转染24孔板上长至融合度为30~50%的BHK-21细胞。转染48h后，收集细胞并裂解，取裂解液进行Westernblotting实验，用anti-zyxin单克隆抗体检测目的条带，以判定目的蛋白被干扰的效果。选择其中干扰效果最好的一条siRNA转染BHK-21细胞，同时设置转染siNC对照组。转染后48h，向每孔中接种MOI=1的FMDVO/CHN/Mya98，方法同前。于接毒后9h收集细胞上清液，用细胞中和试验测定病毒TCID50，用TaqMan实时荧光定量PCR方法测定病毒RNA拷贝数。3.2.11.1细胞中和试验测定病毒TCID50具体步骤同第二章2.2.1。3.2.11.2荧光定量PCR方法测定病毒RNA拷贝数（1）引物RQ1/RQ2及探针FRQ由中国农业科学院兰州兽医研究所包慧芳老师馈赠。（2）从收集的细胞上清中提取病毒RNA，具体步骤同3.2.3.2。（3）通过体外转录获得RNA标准品：1）pGEM-T-3D质粒的构建：按照3.2.3所述方法，从冻存的FMDVO/CHN/Mya98细胞毒提取病毒RNA，利用引物RQ1/RQ2扩增FMDV3D片段，扩增产物为124bp。纯化回收后，连接到pGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌DH5α并提取质粒，分别用PCR鉴定及测序鉴定筛出阳性克隆。2）体外转录：按照Promega公司的SP6/T7体外转录试剂盒Riboprobe®invitroTranscriptionSystems说明书进行。首先用speⅠ单酶切pGEM-T-3D质粒，20µL体系：7µL质粒、2µL10×buffer、1µLspeⅠ、10µLddH2O，37℃酶切3h。切胶回收线性化的质粒。取1.5mL离心管依次加入以下各成分，混匀后置于37℃孵育1h。TranscriptionOptimized5XBuffer4µLDTT,100mM2µLRecombinantRNasin®RibonucleaseInhibitor1µLrATP,rGTPandrUTP(2.5mMeach)4µLlinearizedtemplateDNA1µLSP6Polymerase1µLddH2O7µLfinalvolume20µL加入1U/µg模板DNA的RQ1RNasefreeDNase，37℃孵育15min，去除反应体系中的DNA44 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究模板。反应结束后加入DEPC水使产物体积调整至100µL，立即用RNeasyMinikit对转录的RNA产物进行抽提纯化。用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，-70℃保存备用。按以下公式计算RNA拷贝数：6C(g/mL)10233N(copie/L)6.021010K(fragmentsize/bp)3409本次试验测定的RNA拷贝数为2.25×10。（4）将体外转录合成的RNA用EASYDilution(由PrimescriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒提供)10倍梯度稀释作为参考品。分别以梯度稀释的参考品和步骤（2）中抽提的样品RNA为模板，用宝生物公司的一步法荧光定量RT-PCR试剂盒OneStepPrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime）进行荧光定量PCR检测，体系如下2×OneStepSYBRRT-PCRBufferⅢ10TaKaRaExTaqHS(5U/µL)0.4PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.4RQ1(20µmol/L)0.2RQ2(20µmol/L)0.2TaqManProbe(FRQ)0.8RoxReferenceDyeⅡ(50×)0.4TotalRNA1RnaseFreeH2O6.6Totalvolume20每个样品设3孔重复，标准品和样品同时进行RT-PCR反应，程序如下：温度时间循环数142℃5min1295℃10s1395℃5s40460℃34s通过MxProQPCR软件对结果进行分析。3.2.12宿主细胞zyxin过表达对FMDV增殖的影响将重组质粒pFLAG-zyxin转染BHK-21细胞，转染48h后接种MOI=1的FMDVO/CHN/Mya98，接毒后9h收集细胞上清液，用细胞中和试验测定病毒TCID50，用TaqMan实时荧光定量PCR方法测定病毒RNA拷贝数。方法同前。用相同方法转染空质粒p3xFLAG-CMV-10作为阴性对照。3.2.13统计分析45 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究使用GraphPadPrism3.0软件进行数据分析、处理以及图表绘制。用SEM表示误差值，各组数据的比较用单因素方差分析(onewayANOVA)。p<0.05被认为差异显著。（*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001)。3.3结果3.3.1猪组织总RNA的提取和鉴定将采集的猪组织等量混合后用Trizol法提取总RNA，浓度为3496.9ng/µL，OD260/OD280的比值为1.97（图3-2），1.2%的变性琼脂糖凝胶电泳检测可见28S、18S、5S3条带，且28S条带的亮度大约是18S条带的2倍，条带清晰（图3-3），说明所提取的总RNA未被降解，具有较好的完整性，并且未发生蛋白质污染，具有较高的纯度。1M28S18S5S图3-3总RNA电泳结果图3-2总RNA定量结果Fig.3-3ElectrophoresisoftotalRNAofpigtissuesFig.3-2QuantitativeanalysisofthetotalRNAM:1Kb相对分子质量标准；1：猪组织总RNAM:1KbPlusDNAladder;1:totalRNA3.3.2猪组织cDNA表达文库的质量鉴定+取50µL1:1000稀释的cDND表达文库涂布LB/Amp平板，37℃培养过夜后平板上的克隆数为529个（图3-4），按照公式分别计算其滴度及总库容量：滴度：CFU/mL=平板上的克隆数/50µL×1000倍×1000µL=529/50µL×1000×1000µL7=1.0×10/mL77总库容量：CFU=1.0×10/mL×3mL=3.0×1046 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究图3-4cDNA表达文库的库容量鉴定Fig3-4identificationofthecDNAlibrarystoragecapacity重组率和插入片段大小鉴定结果如图3-5所示，本试验所构建的cDNA表达文库的插入片段均在0.8~3.0kb之间，插入片段的平均大小为1.2kb，重组率为100%，达到了所需文库质量的标准。图3-5cDNA表达文库的PCR鉴定Fig3-5PCRidentificationofthecDNAlibraryM:1Kb相对分子质量标准；1~24：随机挑取的24个酵母菌落PCR结果M:1KbPlusDNAladder;1~24:PCRproductsofrandomlyselected24clones3.3.3重组克隆载体pMD18T-VP1的构建从本实验室冻存的FMDVO/CHN/Mya98细胞毒中提取病毒RNA，设计特异性引物VP1-F/VP1-R，用一步法RT-PCR试剂盒扩增得到包含VP1基因全长及其两端序列的DNA片段，扩增产物大约为850bp，与预期大小相符（图3-6A）。切胶回收后，连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒并作PCR方法鉴定。结果如图3-6B所示，扩增鉴定为阳性。将鉴定为阳性的质粒进行测序验证和序列比对分析，结果也完全正确。47 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究图3-6重组克隆载体pMD18T-VP1的构建Fig3-6ConstructionoftherecombinantvectorpMD18T-VP1A：FMDVVP1基因的扩增。M：分子量标准；1：VP1基因PCR产物B：重组克隆质粒的PCR鉴定。M：分子量标准；1，2：pMD18T-VP1质粒PCR鉴定A:FMDVVP1genewasamplifiedusingRT-PCR.M:DNAmarker;1:PCRproductofVP1gene;B:IdentificationofpMD18T-VP1recombinantplasmidbyPCR.M:DNAmarker;1,2:PCRproductofpMD18T-VP1recombinantplasmid3.3.4诱饵表达载体pDHB1-VP1的构建设计合成带有SfiI限制性酶切位点的VP1引物，以重组克隆质粒pMD18T-VP1为模板扩增带有SfiI酶切位点的VP1基因，扩增的VP1大小为639bp。将PCR产物和载体pDHB1分别进行SfiI酶切和回收，经T4连接酶连接后转化大肠杆菌提取质粒并作PCR检测、酶切鉴定以及序列测定，结果表明连接到诱饵载体pDHB1上的序列完全正确，诱饵表达载体pDHB1-VP1构建成功（图3-7）。图3-7诱饵表达载体pDHB1-VP1的构建Fig3-7ConstructionofthebaitvectorpDHB1-VP1A：诱饵表达载体pDHB1-VP1的PCR鉴定。M：分子量标准；1~3：PCR产物B：诱饵表达载体pDHB1-VP1的酶切鉴定。M：分子量标准；1,2：酶切产物A:IdentificationofpDHB1-VP1baitvectorbyPCR.M:DNAmarker;1~3:PCRproductofpDHB1-VP1baitvector;B:IdentificationofthebaitvectorpDHB1-VP1byrestrictionenzymedigestion.M:DNAmarker;1,2:FragmentsofthepDHB1-VP1baitvectordigestedbysfiⅠ48 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.3.5酵母菌株NMY51基因型的检测将生长在YPAD培养基上的酵母NMY51单克隆，划线接种至营养缺陷型平板培养基SD-L、SD-W后酵母不能生长（图3-8）。证明酵母NMY51的基因型正确。图3-8酵母菌株NMY51基因型的检测Fig3-8CheckingthegenotypeofNMY513.3.6诱饵载体pDHB1-VP1转入酵母菌NMY51及其毒性检测3.3.6.1诱饵载体pDHB1-VP1毒性检测将诱饵载体pDHB1-VP1和空载体pDHB1分别转化NMY51菌株，以1:100稀释后涂布于SD-L固体培养基，30℃培养三天后，如图3-9所示，转化有诱饵质粒的菌株与转化有空载体的菌株相比，菌落数量和大小都没有减少，表明构建的诱饵质粒对酵母菌株没有毒性，可用于进一步酵母双杂交筛选试验。图3-9诱饵载体pDHB1-VP1毒性检测Fig3-9ToxicitydetectionofpDHB1-VP149 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.3.6.2菌液PCR鉴定诱饵载体pDHB1-VP1转入酵母菌将质粒pDHB1-VP1转化酵母菌NMY51后，涂布SD-L平板，30℃培养三天后，随机挑取长势良好的直径大约2~3mm的单菌落于SD-L液体培养基中培养至OD546为0.6～0.8之间，以pDHB1-VP1-F/pDHB1-VP1-R为引物，进行菌液PCR扩增鉴定，结果如图3-10所示，扩增得到大小合适的目的片段，表明诱饵载体pDHB1-VP1已经成功转化进了酵母菌株中。图3-10诱饵载体pDHB1-VP1转入酵母菌株的PCR鉴定Fig3-10IdentificationofyeastcloniestransformedwithpDHB1-VP1baitvectorbyPCRM：分子量标准；1,2：PCR产物M:DNAmarker;1,2:PCRproductofyeastcloniestransformedwithpDHB1-VP1baitvector3.3.7DUALhunter系统功能验证以及诱饵载体自激活检测用表型验证法检测DUALhunter系统功能及诱饵载体的自激活作用，共设置了6组共转化，分别是重组诱饵载体pDHB1-VP1与功能对照载体pOst1-NubI，重组诱饵载体pDHB1-VP1与空的猎物载体pPR3-N，阳性对照组pTSU2-APP与pNubG-Fe65，阴性对照组pTSU2-APP与pPR3-N，猎物载体检测组pPR3-N-L与pTSU2-APP，以及实验组pDHB1-VP1与pPR3-N-L。各组分别共转化二缺三缺四缺SD培养基后，30℃培养4天，如图3-11所示，阳性对照组pTSU2-APP+pNubG-Fe65在选择性培养基上均有生长，阴性对照组pTSU2-APP+pPR3-N在四缺培养基SD-AHLW上未见生长。重组诱饵载体pDHB1-VP1与pOst1-NubI共转化后在选择性培养基上均有菌落生长，生长百分率在10%~100%之间，且大多是直径2~3mm长势良好的菌斑，说明构建的重组诱饵载体有正确表达。而共转化了重组诱饵载体pDHB1-VP1和空的猎物载体pPR3-N的选择性培养基上没有菌落生长，这说明诱饵载体pDHB1-VP1没有自激活效应，不用添加3-AT进行筛选。猎物载体组也在选择性培养基上没有菌落生长，说明猎物载体不存在非特异性结合。实验组pDHB1-VP1+pPR3-N-L在选择性培养基SD-HLW和SD-AHLW中均有长斑，但在SD-AHLW平板上的菌斑数量明显少于在SD-HLW平板中的，说明SD-AHLW平板选择压力更大，背景更少，所以可以用四缺培养基SD-AHLW进行酵母双杂交筛选cDNA文库试验。50 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究图3-11DUALhunter系统功能验证以及诱饵载体pDHB1-VP1自激活检测Fig3-11TheDUALhunterfunctionalassayandself-activateddetectionofpDHB1-VP13.3.8以VP1为诱饵蛋白利用酵母双杂交方法筛选猪组织cDNA文库3.3.8.1诱饵pDHB1-VP1筛选猪组织cDNA文库利用酵母双杂交方法从猪组织cDNA文库中筛选与FMDVVP1相互作用的蛋白。将转化有pDHB1-VP1的NMY酵母菌株与猪组织cDNA文库进行大规模杂交试验，产物涂于30个直径为15cm的四缺培养基上，30℃倒置培养3~4天，进行第一轮筛选。挑取第一轮筛选到的直径约2~3mm、表面光滑的菌落一一转移到另一新鲜的SD-AHLW平板上进行第二轮筛选。挑取第二轮筛选的阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测，选择OD615值较大的进行后续的菌液PCR鉴定（图3-12）同时取少量转化后的酵母菌液10倍梯度稀释后计算转化效率。本试验中测得的总转化数为663.2×10cfu，高于规定标准2×10cfu。51 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究图3-12诱饵载体pDHB1-VP1筛选猪组织cDNA文库Fig3-12LibrarytransformationandselectionofinteractorswithpDHB1-VP1bait3.3.8.2酵母菌落PCR鉴定及测序分析将经过以上筛选初步验证为阳性的克隆，用猎物载体pPR3-N的测序引物pPR3-N-F/pPR3-N-R进行酵母菌落PCR鉴定（图3-13），选择扩增片段500bp以上大小不同的15个菌落提取酵母质粒，转入大肠杆菌中，重新提取质粒后送华大基因公司测序。将测序结果在GenBank中进行Blast比对分析，结果以VP1为诱饵共鉴定出3个互作物，分别为斑连蛋白（zyxin），核糖体蛋白L29（RPL29）以及E3泛素连接酶（HERC1），详见表3-1。其中通过酵母双杂交筛选到的斑连蛋白互作区域位于其C末端329~572位氨基酸，编码三个LIM域。图3-13以pDHB1-VP1为诱饵筛选到的阳性克隆PCR结果Fig3-13ThePCRresultsofpositiveclonesscreenedbypDHB1-VP1baitM：分子量标准；1~15：酵母菌落PCR产物M:DNAmarker;1~15:PCRproductsofyeastclones52 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究表3-1酵母双杂交方法筛选出的VP1的互作蛋白Table3-1PutativeVP1-interactingproteinsinY2HscreeningBiatconstructGeneIDsymbolFullname中文名称pDHB1-VP1XM_005657719.1ZYXzyxin斑连蛋白pDHB1-VP1XM-005669562.1RPL29RibosomalproteinL29核糖体蛋白L29pDHB1-VP1XM_001927251.5HERC1HECTandRLDdomaincontainingE3E3泛素连接酶ubiquitionproteinligasefamilyHERC1member13.3.8.3酵母共转化验证阳性克隆将以上试验中筛选分离到的三个捕获质粒分别与诱饵质粒pDHB1-VP1共转化酵母菌NMY51，涂布于SD-AHLW平板培养基，30℃倒置培养3~4d后，如图3-14所示，阴性对照组pDHB1/pPR3-N-hits和pTSU2-APP/pPR3-N均未观察到菌斑生长，而pPR3N-zyxin与pDHB1-VP1共转化组有菌斑生长，表明zyxin蛋白与FMDVVP1蛋白之间存在相互作用。其他两种筛选到的蛋白RPL29和HERC1分别与诱饵质粒共转化酵母菌后均没有在SD-AHLW平板上观察到菌落生长，故判定为假阳性，予以排除。图3-14pPR3N-zyxin与pDHB1-VP1酵母共转化验证阳性克隆Fig3-14RetestingthepositiveinteractionofpPR3N-zyxinandpDHB1-VP1byyeasttwo-hybrid3.3.9免疫共沉淀技术验证VP1蛋白与zyxin蛋白的相互作用3.3.9.1真核表达载体pMyc-VP1和pFLAG-zyxin的构建以质粒pMD18T-VP1为模板，以pMyc-VP1-F/pMyc-VP1-R为引物扩增带有EcoRI和XhoI酶切位点的VP1基因。经回收、酶切后与pCMV-Myc载体连接并转化大肠杆菌，提取质粒后进行PCR和酶切鉴定。结果如图3-15所示，PCR扩增出的片段、酶切产生的片段大小都与预期相符，测序结果表明插入的序列完整、准确、阅读框正确。表明真核表达载体pMyc-VP1构建成功。以质粒pPR3N-zyxin为模板,以FLAG-zyxin-F/FLAG-zyxin-R为引物扩增带有HindIII和XbaI酶切位点的zyxin基因，连接载体p3×FLAG-CMV-10，PCR和酶切鉴定结果如图3-16所示，53 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究PCR扩增出的片段、酶切产生的片段大小都与预期相符，测序结果表明插入的序列完整、准确、阅读框正确。表明真核表达载体pFLAG-zyxin构建成功。图3-15真核表达载体pMyc-VP1的构建Fig3-15ConstructionoftheeukaryoticexpressionplasmidpMyc-VP1A：真核表达载体pMyc-VP1的PCR鉴定。M：分子量标准；1：PCR产物B：真核表达载体pMyc-VP1的酶切鉴定。M：分子量标准；1：酶切产物A:IdentificationoftheplasmidpMyc-VP1byPCR.M:DNAmarker;1:PCRproductofplasmidpMyc-VP1;B:IdentificationoftheplasmidpMyc-VP1byrestrictionenzymedigestion.M:DNAmarker;1:FragmentsoftheplasmidpMyc-VP1digestedbyEcoRIandXhoI图3-16真核表达载体pFLAG-zyxin的构建Fig3-16ConstructionoftheeukaryoticexpressionplasmidpFLAG-zyxinA：真核表达载体pFLAG-zyxin的PCR鉴定。M：分子量标准；1：PCR产物B：真核表达载体pFLAG-zyxin的酶切鉴定。M：分子量标准；1：酶切产物A:IdentificationofplasmidpFLAG-zyxinbyPCR.M:DNAmarker;1:PCRproductofplasmidpFLAG-zyxin;B:IdentificationofplasmidpFLAG-zyxinbyenzymedigestion.M:DNAmarker;1:FragmentsoftheplasmidpFLAG-zyxindigestedbyHindIIIandXbaI54 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.3.9.2免疫共沉淀验证前期研究中利用酵母双杂交筛选到与FMDVVP1相互作用的宿主细胞蛋白zyxin，并在酵母水平上进行了β-半乳糖苷酶检测以及相互作用对的酵母共转化验证，尽管如此，依然不能完全排除假阳性的可能，还需进一步从哺乳细胞水平上验证二者之间的相互关系。免疫共沉淀技术是用于研究两种蛋白质在细胞内相互作用的经典方法。在本研究中，我们将构建的重组表达质粒pMyc-VP1和pFLAG-zyxin共转染HEK293T细胞，48h后收集并裂解细胞，取出50µL用于input对照，其余进行免疫共沉淀实验。用小鼠抗Myc标签单抗进行免疫沉淀，用兔抗FLAG标签多抗进行westernblotting，检测免疫沉淀复合物中是否存在猎物蛋白（FLAG-zyxin）。同时用同型正常小鼠的IgG进行免疫共沉淀试验作为阴性对照。如图3-17A所示，带FLAG标签的zyxin蛋白被带Myc标签的VP1蛋白免疫共沉淀下来，而在用正常小鼠的IgG进行免疫共沉淀的阴性对照组没有检测到带FLAG标签的蛋白。在反向Co-IP试验中，用兔抗FLAG标签多抗进行免疫沉淀，用小鼠抗Myc标签单抗进行westernblotting，检测免疫沉淀复合物中是否存在诱饵蛋白（Myc-VP1）。同时用同型正常兔的IgG进行免疫共沉淀试验作为阴性对照。如图3-17B所示，带Myc标签的VP1蛋白被带FLAG标签的zyxin蛋白免疫共沉淀下来，而在用正常兔的IgG进行免疫共沉淀的阴性对照组没有检测到带Myc标签的蛋白。说明VP1蛋白与zyxin蛋白在哺乳动物细胞内确实存在相互作用。图3-17免疫共沉淀验证VP1与zyxin的相互作用Fig3-17CoimmunoprecipitationdemonstratedaninteractionbetweenVP1andzyxin.3.3.10激光共聚焦技术检测VP1与zyxin在细胞中的定位将质粒pMyc-VP1及pFLAG-zyxin共转染HEK293T细胞，培养约18~24h后进行激光共聚焦检测VP1与zyxin是否存在共定位。以空载体pCMV-Myc和p3xFLAG-CMV-10共转染组为阴性对照。结果如图3-18所示，VP1蛋白与zyxin蛋白在细胞中存在共定位。55 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究图3-18激光共聚焦技术检测VP1蛋白与zyxin蛋白在细胞中的共定位Fig.3-18ColocalizationofVP1withzyxininHEK293Tcellsidentifiedbyconfocal3.3.11FMDV感染诱导zyxin表达量上调用FMDVO/CHN/Mya98以MOI=1的感染剂量接种BHK-21细胞后于不同时间点收集细胞蛋白，用兔抗zyxin多抗和鼠抗β-tublin单抗分别检测zyxin蛋白和内参β-tublin蛋白的表达情况，以同步处理的未接毒的9h细胞为对照（Mock）。用ImageJ的软件对zyxin蛋白和β-tublin蛋白在感染后不同时间点的相对浓度进行定量，并用GraphPad软件进行分析。结果如图3-19所示，随着FMDV感染时间的延长，zyxin的表达量逐渐增加，在感染后9h表达量最高（p<0.001)。说明FMDV感染后能够诱导宿主细胞蛋白zyxin表达量上调。图3-19FMDV感染诱导zyxin表达量上调Fig3-19UpregulationofzyxinexpressionafterFMDVinfection.A：Westernblotting检测zyxin蛋白的表达；B：zyxin蛋白和β-tublin蛋白的相对浓度定量分析A：ExpressionofzyxinatdifferenttimepointsfollowingFMDVinfectionwasexaminedbywesternblottingusingananti-zyxinprimaryantibody.B：Therelativeconcentrationsofthezyxinandβ-tublinproteinsateachtimepointfollowingFMDVinfectionwerequantified,andtheextrapolatedvalueswereplottedusingβ-tublinasthenormalizedcontrol.56 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.3.12干扰zyxin的表达抑制FMDV的增殖为了研究宿主细胞蛋白zyxin是否对FMDV的增殖有影响，本研究用购自广州锐博生物科技有限公司的针对zyxin基因不同区域的三条siRNA来干扰内源性zyxin蛋白的表达，取转染后细胞裂解液，用anti-zyxin单克隆抗体进行Westernblotting检测目的蛋白被干扰的效果。以β-tublin蛋白为内参，用ImageJ的软件对zyxin蛋白和β-tublin蛋白在感染后不同时间点的相对浓度进行定量，用GraphPad软件进行分析。结果如图3-20A和3-20B所示，siZYX3以100nM的浓度转染BHK-21细胞48h后，可有效抑制细胞zyxin蛋白的表达。应用siRNA干扰技术，将BHK-21细胞中内源性的zyxin蛋内表达下调之后，接种MOI=1的FMDVO/CHN/Mya98，于接毒后9h收集细胞上清液，进行细胞中和试验测定病毒TCID50并用TaqMan实时荧光定量PCR方法测定病毒RNA拷贝数。设置转染无序siRNA组（siNC）为对照组。结果如图3-20C所示，转染siZYX3的试验组中FMDVRNA拷贝数显著低于转染siNC组（p<0.05），同样，在细胞中和试验结果中（图3-20D），转染siZYX3的试验组中FMDV滴度显著低于转染siNC组（p<0.05）。说明下调宿主细胞蛋白zyxin的表达会抑制FMDV的增殖。图3-20干扰zyxin的表达抑制FMDV的增殖Fig3-20KnockdownofzyxininhibitsFMDVgrowth.A：Westernblotting检测siRNA干扰后zyxin蛋白的表达；B：zyxin蛋白和β-tublin蛋白的相对浓度定量分析；C：zyxin蛋白表达下调后FMDVRNA拷贝数；D：zyxin蛋白表达下调后FMDV的滴度AandB：WesternblottingofzyxininsiRNAtreatedcells.C：TheFMDVgenomecopynumberandD:viraltiterinthezyxinknockdowncells.57 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究3.3.13上调zyxin表达促进FMDV的增殖为了进一步研究宿主细胞蛋白zyxin对FMDV增殖的影响，本研究将重组质粒pFLAG-zyxin转染入BHK-21细胞使得zyxin得到瞬时过表达（图3-21A），再感染FMDVO/CHN/Mya98，检测病毒TCID50以及RNA拷贝数。以转染空质粒p3xFLAG-CMV-10作为阴性对照。结果如图3-21B和3-21C所示，转染重组质粒pFLAG-zyxin组中FMDVRNA拷贝数以及滴度值均显著高于转染空载体对照组（p<0.05）。说明上调zyxin的表达能够促进FMDV的增殖。图3-21上调zyxin表达促进FMDV的增殖Fig3-21OverexpressionofzyxinincreasesFMDVgrowth.A：Westernblotting检测zyxin蛋白的过表达；B：zyxin蛋白表达上调后FMDVRNA拷贝数；C：zyxin蛋白表达上调后FMDV的滴度A:Overexpressionofzyxindetectedbywesternblotting;B:TheFMDVgenomecopynumberwasdeterminedbyqRT-PCR.C:Virustiterwasdeterminedbyvirustitrationassay.3.4讨论小核糖核酸病毒借助大量RNA-蛋白之间的相互作用来完成其生命周期，包括内部核糖体进入位点（IRES）介导的翻译，基因组的环化，和RNA的复制（Linetal.,2009）。FMDV作为小核糖核酸病毒科的一个成员，它的复制依赖于病毒编码的蛋白质和许多细胞因子的共同作用。在感染过程中，FMDV利用各种策略来抑制宿主的免疫应答，抑制细胞的基因表达，改变细胞蛋白质-蛋白质间的相互作用，并重新排列细胞内膜以诱导有利条件来促进病毒自身的复制和组装(Grubmanetal.,2008;Lawrenceetal.,2009)。cDNA文库是指一种生物体在某个发育时期所转录的全部mRNA，经反转录酶在体外催化反转录为cDNA，与某种载体连接后转化受体菌而形成的克隆的集合。近年来，cDNA文库的构建已经成为研究功能基因组学的主要方法之一，尤其常被应用在寻找和筛选新基因的研究中。高质量的酵母双杂交cDNA文库的构建，可为筛选与病毒蛋白相互作用的宿主细胞蛋白提供技术平台和物质基础。本研究以经FMDVO/CHN/Mya98感染七天后的长白猪敏感组织为材料，构建出猪58 中国农业科学院博士学位论文第三章FMDVVP1互作蛋白的筛选与功能研究7组织cDNA表达文库，经检测其库容量为3.0×10CFU，插入文库中的片段长度大约在0.8～3kb之间，说明此文库代表性强、阳性克隆率高、多样性好，且充分保证了大分子cDNA的完整性。综合来看，该文库达到了高质量文库的标准，为后续利用酵母双杂交技术研究FMDV蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定了基础。随着siRNA筛选技术、亲和纯化技术、质谱技术、以及基因组、转录组、蛋白质组高通量测序技术的发展，病毒与宿主之间的相互作用不断被阐明。其中酵母双杂交筛选技术被广泛应用于识别蛋白质-蛋白质间的相互作用。迄今为止，许多FMDV蛋白的相互作用都是采用经典的酵母双杂交筛选方法来确定的。本研究以FMDVVP1为诱饵蛋白，采用分裂-泛素酵母双杂交系统筛选猪组织cDNA文库，寻找与FMDVVP1蛋白相互作用的宿主细胞蛋白，结果筛选到宿主细胞蛋白zyxin的第329~572位氨基酸能够与VP1蛋白发生相互作用。利用免疫共沉淀技术以及激光共聚焦技术进一步验证了FMDVVP1蛋白与宿主蛋白zyxin存在相互作用且在细胞中存在共定位。为了研究zyxin对FMDV增殖的影响，利用靶向zyxin基因的特异性干扰小RNA分子沉默细胞内源性zyxin蛋白的表达，通过TaqMan荧光定量PCR检测和细胞毒价测定表明下调zyxin蛋白的表达可抑制FMDV在细胞中的增殖，相反，过表达zyxin蛋白时可促进FMDV的增殖。而FMDV感染后能够诱导宿主细胞蛋白zyxin表达量上调。综合这些结果，本研究首次提出宿主细胞蛋白zyxin与FMDVVP1蛋白存在相互作用，并且zyxin有促进FMDV增殖的作用。此相互作用蛋白是否存在于FMDVA型或其他亚型毒株中，则需要进一步定位VP1与zyxin相互作用的关键氨基酸位点，研究此互作位点是否在FMDV各亚型中具有保守特性。zyxin，即斑联蛋白，分子量为82kDa，存在于多种细胞系，主要定位在细胞基质和细胞间粘附位点，参与黏着斑的形成(Lietal.,2001;Macalmaetal.,1997)。其结构包含N-端脯氨酸丰富区，富含亮氨酸的核输出信号（NES）区以及C-端三拷贝的半胱氨酸和组氨酸丰富区（LIM结构域）。zyxin参与调节细胞骨架肌动蛋白、影响细胞间的粘附和运动，参与细胞核与细胞质膜之间的信号转导，参与肿瘤细胞的生长和迁移、调控基因表达、细胞增殖、分化及凋亡等过程，是HIPK2-p53调亡信号轴的关键调节因子(Cerisanoetal.,2004;Hanetal.,2009;Hansenetal.,2006;Hobertetal.,1996;Katoetal.,2005;Nixetal.,1997;Nixetal.,2001;Yoshigietal.,2005)。zyxin多出现在肿瘤研究领域中，迄今为止，尚未见到zyxin蛋白在FMDV生命过程中产生作用的相关报道。有研究报道FMDV感染细胞或FMDVVP1蛋白通过干扰Akt信号通路均可诱发细胞调亡(Chenetal.,2011;Pengetal.,2004)。而zyxin蛋白也被报道与凋亡信号的调节有关，那么zyxin蛋白是不是在FMDV诱导细胞凋亡的过程中也发挥作用呢？我们将在以后的试验中加以验证。59 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究摘要：FMDV是引起猪、牛等家畜发病而造成巨大经济损失的一种RNA病毒。该病毒的复制不仅依赖于自身编码的蛋白，而且依赖于各种宿主细胞蛋白。FMDV编码的非结构蛋白在病毒复制过程中也发挥着重要作用。本研究利用膜酵母双杂交系统，以FMDV2B蛋白为诱饵筛选猪组织cDNA文库，结果发现与其产生相互作用的是宿主细胞蛋白eEF1G（208~437aa）。利用免疫共沉淀技术以及激光共聚焦技术进一步验证了FMDV2B蛋白与宿主蛋白eEF1G存在相互作用且在细胞中存在共定位。在研究eEF1G蛋白对病毒增殖的作用中发现，eEF1G蛋白的表达随FMDV感染时间上调。同时发现过表达eEF1G蛋白时，可促进FMDV的增殖；相反，利用RNA干扰技术沉默细胞内源性eEF1G蛋白的表达时，FMDV的增殖受到抑制。关键词：FMDV，2B，酵母双杂交，eEF1GFMDV非结构蛋白包括L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D和它们的前体，参与FMDV的复制以及抑制宿主的免疫反应等过程。L和3C蛋白具有蛋白酶活性，参与病毒多聚蛋白和某些宿主蛋白质的裂解(Ryanetal.,2004)。3D蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶(Newmanetal.,1979)。2B，2C和3A蛋白参与细胞膜重排并在病毒RNA的复制和衣壳组装过程中发挥作用(Andinoetal.,1999；Choetal.,1994；Towneretal.,1996)。前体蛋白3AB和3CD参与脊髓灰质炎病毒RNA合成所需核糖核蛋白复合物的形成，并且具有非特异性RNA结合活性，从而影响病毒的复制和翻译(Hopeetal.,1997；Xiangetal.,1995)。有研究报道FMDV2BC的瞬时表达能够抑制Vero细胞中宿主蛋白的分泌(Moffatetal.,2005)。FMDV非结构蛋白2B序列高度保守，目前对2B基因的研究还相对较少，本试验应用膜酵母双杂交技术筛选与FMDV非结构蛋白2B基因相互作用的宿主蛋白，从而进一步揭示非结构蛋白2B在病毒生命过程中的作用，为预防病毒感染奠定一定基础。4.1材料DUAL膜酵母系统试剂盒DUAmembranestarterkit购自瑞士DualsystemsBiotech公司。其中诱饵载体为pBT3-N，载体信息详见图4-1。毒株、细胞、载体、其他试剂、耗材及仪器同第三章。60 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究图4-1诱饵载体pBT3-N信息图Fig4-1BiatvectorpBT3-NmapofDUALmembranesystem4.2方法4.2.1引物设计与合成PrimersSequence(5'–3')RestrictionUsageenzyme2B-FGGGACGTGGAGTCCAACCpMD18T-2B2B-RATGTCACGTGCTTTGAGCTGpBT3-N-2B-FATTAACAAGGCCATTACGGCCATGCCCTTCTTCTTCSfiIpBT3-N-2BTCTpBT3-N-2B-RAACTGATTGGCCGAGGCGGCCTTACTGTTTCTCTGCSfiITCTpMyc-2B-FCGGAATTCCCCTTCTTCTTCTCTGACGTCEcoRIpMyc-2BpMyc-2B-RATCTCGAGTTACTGTTTCTCTGCTCTCTCGXhoIFLAG-eEF1G-FCGGAAGCTTAAGCTCTGTGAGAAGATGGCCHindIIIpFLAG-eEF1GFLAG-eEF1G-RCGGTCTAGATTACTTGAAGATCTTGCCCTGXbaIpPR3-N-FGTCGAAAATTCAAGACAAGGpPR3-N-RAAGCGTGACATAACTAATTAC所有引物均由上海生工生物技术有限公司合成。4.2.2FMDV2B诱饵表达载体的构建以提取的FMDVO/CHN/Mya98RNA为模板（见第三章3.2.3.2），用特异性引物2B-F/2B-R61 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究扩增出2B基因，回收纯化后与克隆载体pMD18-T相连，转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒进行PCR鉴定及测序鉴定。根据测得的2B基因序列，设计带有sfi1酶切位点的引物pBT3-N-2B-F/pBT3-N-2B-R，以构建的重组克隆载体pMD18T-2B为模板重新扩增带有sfi1酶切位点的2B基因，PCR回收产物经sfi1酶切后插入载体pBT3-N相同位点，获得重组诱饵载体pBT3-N-2B，并进行PCR鉴定、酶切鉴定及测序验证。具体方法、步骤同第三章3.2.3和3.2.44.2.3FMDV2B诱饵表达载体的毒性和自激活效应检测将诱饵质粒pBT3-N-2B和空载体质粒pBT3-N分别转化NMY51菌株，以1:10稀释后涂布于SD-L固体培养基，30℃培养三天，观察菌落生长情况。具体步骤同第三章3.2.5.3。用表型验证法检测诱饵蛋白是否具有自激活作用，共设置3组共转化，分别是诱饵载体组1：pBT3-N-2B+pOst1-NubI；2：pBT3-N-2B+pPR3-N；以及3：实验组pBT3-N-2B+pPR3-N-L。用LiOAc法共转化二缺、三缺和四缺培养基后，30℃培养4天，观察菌落生长情况以判断诱饵载体有无自激活效应。具体步骤同第三章3.2.6。阳性对照组pTSU2-APP+pNubG-Fe65、阴性对照组pTSU2-APP+pPR3-N以及猎物载体组pTSU2-APP+pPR3-N-L与第三章3.2.6相同，此处不再验证。4.2.4诱饵载体pBT3-N-2B筛选猪组织cDNA文库按照DUAL膜系统试剂盒说明书将转化有诱饵载体pBT3-N-2B的NMY51酵母菌株与猪组织cDNA文库进行酵母双杂交筛选，产物涂于33个直径为15cm的四缺培养基上，30℃倒置培养3~4天后，进行第一轮筛选，挑取第一轮筛选到的阳性克隆一一转移到另一新鲜的SD-AHLW平板培养基上进行第二轮筛选，挑取第二轮筛选的阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测。监测颜色变化，选择OD615值较大的进行菌液PCR鉴定，选择500bp以上大小不同的片段提取酵母质粒，转入大肠杆菌中，重新提取质粒后送华大基因公司测序。将pBT3-N-2B质粒和筛选获得的初步鉴定为阳性的诱饵质粒pPR3-N-prey共转化酵母菌株NMY51，同时设置阴性对照组pBT3-N/pPR3-N-hits和pTSU2-APP/pPR3-N，将转化产物涂布于SD-AHLW平板，30℃培养3~4天，进行酵母双杂交的再次验证。具体方法、步骤同第三章3.2.7。4.2.5免疫共沉淀技术验证2B蛋白与eEF1G蛋白的相互作用4.2.5.1真核表达载体pMyc-2B和及pFLAG-eEF1G的构建以重组克隆载体pMD18T-2B为模板，用特异性引物pMyc-2B-F/pMyc-2B-R扩增带有EcoRI和XhoI酶切位点的2B基因。将扩增产物经回收并酶切后连接到载体pCMV-Myc，转化感受态细胞E.coliDH5α并提取质粒。进行PCR鉴定、双酶切鉴定及测序。构建重组真核表达载体pMyc-2B。具体构建步骤同3.2.4。以质粒pPR3-N-eEF1G为模板，用特异性引物FLAG-eEF1G-F/FLAG-eEF1G-R扩增带有HindⅢ和XbaI酶切位点的长690bp的编码C末端208~437位氨基酸的eEF1G基因。酶切PCR产物62 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究及载体p3×FLAG-CMV-10，胶回收后连接并转化大肠杆菌抽提质粒构建真核表达载体pFLAG-eEF1G。构建步骤同前。4.2.5.2免疫共沉淀将构建成功的真核表达载体pMyc-2B和pFLAG-eEF1G共转染HEK293T细胞，转染后48h收集细胞并裂解获取细胞蛋白，用Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒进行免疫共沉淀反应。将沉淀复合物以及input经SDS-PAGE电泳后转印至NC膜进行Westernblotting检测。方法、步骤同第三章3.2.8。4.2.6激光共聚焦技术检测2B与eEF1G在细胞中的共定位将重组真核表达载体pMyc-2B和pFLAG-eEF1G共转染HEK293T细胞，同时设空载体pCMV-Myc和p3xFLAG-CMV-10共转染组为阴性对照组。按第三章3.2.9所述方法进行激光共聚焦检测试验。4.2.7FMDV感染对细胞eEF1G表达的影响将长至单层的BHK-21细胞以MOI=1的感染剂量接种FMDVO/CHN/Mya98，分别在接毒后2h、4h、6h、8h、9h以及10h收集细胞，同时收集10h的未接毒细胞作为对照（Mock）。以兔抗eEF1G多抗和鼠抗GAPDH作为一抗，HRP标记山羊抗兔IgG和HRP标记山羊抗鼠IgG作为二抗，按照第三章3.2.10所述方法分别检测eEF1G以及内参GAPDH的表达情况。4.2.8干扰eEF1G的表达对FMDV增殖的影响用于干扰内源性eEF1G蛋白表达的siRNA（siE1、siE2、siE3）以及用于对照的无序siRNA(siNC)购自广州锐博生物科技有限公司。按照第三章3.2.11所述方法，每组siRNA以150nM的浓度进行转染，用anti-eEF1G多克隆抗体检测目的条带，判定目的蛋白被干扰的效果。选择干扰效果最好的siRNA转染BHK-21细胞，48h后接种MOI=1的FMDVO/CHN/Mya98。于接毒后9h收集细胞上清液，用细胞中和试验测定病毒TCID50，用TaqMan实时荧光定量PCR方法测定病毒RNA拷贝数。设置转染siNC组为阴性对照。4.2.9宿主细胞eEF1G过表达对FMDV增殖的影响将重组质粒pFLAG-eEF1G转染BHK-21细胞，转染48h后接种MOI=1的FMDVO/CHN/Mya98，接毒后9h收集细胞上清液，用细胞中和试验测定病毒TCID50，用TaqMan实时荧光定量PCR方法测定病毒RNA拷贝数。方法同前。用相同方法转染空质粒p3xFLAG-CMV-10作为阴性对照。63 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究4.2.10统计分析使用GraphPadPrism3.0软件进行数据分析、处理以及图表绘制。用SEM表示误差值，用单因素方差分析(onewayANOVA)比较各组数据。p<0.05则认为差异显著。(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001)。4.3结果4.3.1诱饵表达载体pBT3-N-2B的构建以FMDVO/CHN/Mya98RNA为模板PCR扩增出2B基因，连接pMD18-T载体后构建重组克隆载体pMD18T-2B。经PCR检测及序列测定证明插入条带大小合适、基因序列正确（图4-2A）。构建的重组质粒pBT3-N-2B经PCR、酶切和测序证实插入诱饵载体上的目的序列完全正确，2B大小为462bp，编码154个氨基酸，见图4-2B和4-2C。说明诱饵载体构建成功，可进行后续试验。图4-2诱饵表达载体pBT3-N-2B的构建Fig4-2ConstructionofthebaitvectorpBT3-N-2BA：重组克隆载体pMD18T-2B的PCR鉴定。M：分子量标准；1：pMD18T-2B载体PCR鉴定B：诱饵表达载体pBT3-N-2B的PCR鉴定。M：分子量标准；1：PCR产物C：诱饵表达载体pBT3-N-2B的酶切鉴定。M：分子量标准；1：空载体pBT3-N；2：空载体pBT3-N酶切产物；3重组载体pBT3-N-2B的酶切产物A:IdentificationofrecombinantvectorpMD18T-2BbyPCR.M:DNAmarker;1:PCRproductoftherecombinantvectorpMD18T-2B.B:IdentificationofthebaitvectorpBT3-N-2BbyPCR.M:DNAmarker;1:PCRproductofthebaitvectorpBT3-N-2B.C:IdentificationofthebaitvectorpBT3-N-2Bbyrestrictionenzymedigestion.1:pBT3-N-2B;2:pBT3-NdigestedbysfiⅠ;M:DNAmarker;3:pBT3-N-2BdigestedbysfiⅠ4.3.2诱饵表达载体pBT3-N-2B的毒性和自激活效应检测64 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究转化有重组诱饵质粒pBT3-N-2B的菌株与转化有空载体pBT3-N的菌株相比，菌落数量和大小均没有减少（图4-3），表明构建的诱饵载体对酵母菌株没有毒性，可用于进一步酵母双杂交筛选试验。图4-3诱饵表达载体pBT3-N-2B毒性检测Fig4-3ToxicitydetectionofpBT3-N-2B表型验证法检测诱饵蛋白的自激活作用，结果显示：诱饵pBT3-N-2B与pOst1-NubI共转化后在选择性培养基上均有菌落生长，而共转化了诱饵载体pBT3-N-2B和空的猎物载体pPR3-N的选择性培养基上没有菌落生长，这说明诱饵载体pBT3-N-2B有正确表达而没有自激活效应，不需要进行3-AT筛选。实验组pBT3-N-2B与pPR3-N-L共转化后在选择性培养基SD-HLW和SD-AHLW中均有长斑，但在SD-AHLW平板上的菌斑数量明显少于在SD-HLW平板中的，说明SD-AHLW平板选择压力更大，背景更少，可以用四缺培养基进行酵母双杂交大规模筛选文库试验（图4-4）。图4-4诱饵表达载体pBT3-N-2B自激活效应检测Fig4-4Self-activateddetectionofpBT3-N-2B65 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究4.3.3诱饵载体pBT3-N-2B筛选猪组织cDNA文库将诱饵pBT3-N-2B与猪组织cDNA表达文库共转化NMY51酵母菌株的产物涂布于四缺培养基上，经过两轮筛选后挑取阳性克隆128个进行β-半乳糖苷酶活性检测（图4-5），共选择40个OD615值较大的进行菌液PCR鉴定（图4-6），根据PCR结果共选择32个500bp以上大小不同的片段提取酵母质粒，转入大肠杆菌中，重新提取质粒后送试剂公司测序。经在GenBank中进行Blast比对分析，以2B为诱饵共鉴定出3个互作物，分别为免疫球蛋白lambda样肽5（IGLL5）、真核翻译延伸因子1G（eEF1G）以及核糖体蛋白S20（RPS20）（表4-1）。将上述筛选并抽提到的三个阳性质粒分别与诱饵质粒pBT3-N-2B共转化酵母菌株NMY51，进一步验证其相互作用。结果显示阴性对照组pTSU2-APP+pPR3-N、pBT3-N+pPR3-N-eEF1G在四缺平板上不生长，而pBT3-N-2B+pPR3-N-eEF1G组在四缺平板上生长良好(图4-7)，证明eEF1G与FMDV2B存在相互作用。对IGLL5和RPS20也进行了回转酵母验证，但没检测到这样的相互作用，故予以排除。从本次酵母双杂交筛选分离到的eEF1G蛋白互作区域位于其C-末端的208~437位氨基酸。图4-5诱饵载体pBT3-N-2B筛选猪组织cDNA文库Fig4-5LibrarytransformationandselectionofinteractorswithpBT3-N-2Bbait66 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究图4-6以pBT3-N-2B为诱饵筛选到的阳性克隆PCR结果Fig4-6ThePCRresultsofpositiveclonesscreenedbypBT3-N-2BbaitM：分子量标准；1~40：酵母菌落PCR产物M:DNAmarker;1~40:PCRproductsofyeastclones表4-1：酵母双杂交方法筛选出的2B的互作蛋白Table4-1Putative2B-interactingproteinsinY2HscreeningBiatconstructGeneIDsymbolFullname中文名称pBT3-N-2BXM_007174410.1IGLL5Immunoglobulin免疫球蛋白lambda样肽5lambda-likepolypeptide5pBT3-N-2BNM_001243319.1eEF1GEukaryotictranslation真核翻译延伸因子1Gelongationfactor1gammapBT3-N-2BNM_001129954.1RPS20RibosomalproteinS20核糖体蛋白S20图4-7pBT3-N-2B与pPR3-N-eEF1G酵母共转化验证阳性克隆Fig4-7RetestingthepositiveinteractionofpBT3-N-2BandpPR3-N-eEF1Gbyyeasttwo-hybrid67 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究4.3.4免疫共沉淀技术验证2B蛋白与eEF1G蛋白的相互作用4.3.4.1重组真核表达载体pMyc-2B和pFLAG-eEF1G的构建通过基因克隆方法，分别将2B基因插入真核表达载体pCMV-Myc中，将eEF1G基因插入真核表达载体p3×FLAG-CMV-10中，重组载体pMyc-2B以及pFLAG-eEF1G分别经PCR、酶切和测序证实插入载体上的目的片段大小合适、序列完全正确，见图4-8和图4-9。说明重组真核表达载体pMyc-2B及pFLAG-eEF1G构建成功。图4-8真核表达载体pMyc-2B的构建Fig4-8ConstructionoftheeukaryoticexpressionplasmidpMyc-2BA：真核表达载体pMyc-2B的PCR鉴定。M：分子量标准；1：PCR产物B：真核表达载体pMyc-2B的酶切鉴定。M：分子量标准；1：酶切产物A:IdentificationofplasmidpMyc-2BbyPCR.M:DNAmarker;1:PCRproductofplasmidpMyc-2B;B:IdentificationofplasmidpMyc-2Bbyenzymedigestion.M:DNAmarker;1:fragmentsoftheplasmidpMyc-2BdigestedbyEcoRIandXhoI图4-9真核表达载体pFLAG-eEF1G的构建Fig4-9ConstructionoftheeukaryoticexpressionplasmidpFLAG-eEF1GA：真核表达载体pFLAG-eEF1G的PCR鉴定。M：分子量标准；1：PCR产物B：真核表达载体pFLAG-eEF1G的酶切鉴定。M：分子量标准；1：酶切产物A:IdentificationofplasmidpFLAG-eEF1GbyPCR.M:DNAmarker;1:PCRproductofplasmidpFLAG-eEF1GB:IdentificationofplasmidpFLAG-eEF1Gbyenzymedigestion.M:DNAmarker;1:fragmentsoftheplasmidpFLAG-eEF1GdigestedbyHindIIIandXbaI68 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究4.3.4.2免疫共沉淀验证将重组表达质粒pMyc-2B及pFLAG-eEF1G共转染HEK293T细胞，48h后收集细胞进行免疫共沉淀实验。结果如图4-10A所示，带FLAG标签的eEF1G蛋白被带Myc标签的2B蛋白免疫共沉淀下来，而在用正常小鼠的IgG进行免疫共沉淀的阴性对照组没有检测到带FLAG标签的蛋白。反向Co-IP试验结果如图4-10B所示，带Myc标签的2B蛋白被带FLAG标签的eEF1G蛋白免疫共沉淀下来，而在用正常兔的IgG进行免疫共沉淀的阴性对照组没有检测到带Myc标签的蛋白。说明2B蛋白与eEF1G蛋白在哺乳动物细胞内确实存在相互作用。图4-10免疫共沉淀验证2B与eEF1G的相互作用Fig4-10Coimmunoprecipitationdemonstratedaninteractionbetween2BandeEF1G4.3.5激光共聚焦技术检测2B与eEF1G在细胞中的共定位将质粒pMyc-2B及pFLAG-eEF1G共转染HEK293T细胞，培养约18~24h后进行激光共聚焦检测。以空载体pCMV-Myc和p3xFLAG-CMV-10共转染组为阴性对照。结果如图4-11所示，2B蛋白与eEF1G蛋白在细胞中存在共定位。图4-11激光共聚焦技术检测2B蛋白与eEF1G蛋白在细胞中的共定位Fig4-11Colocalizationof2BwitheEF1GinHEK293Tcellsidentifiedbyconfocal69 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究4.3.6FMDV感染诱导宿主细胞蛋白eEF1G表达量上调BHK-21细胞接种病毒后于2h、4h、6h、8h、9h以及10h收集细胞，同时收集10h的未接毒细胞作为对照（Mock），用兔抗eEF1G多抗和鼠抗GAPDH单抗分别检测eEF1G蛋白和内参GAPDH蛋白的表达情况。结果如图4-12所示，随着FMDV感染时间的延长，eEF1G的表达量逐渐增加，在感染后9h表达量达到最高（p<0.001)。说明FMDV感染后能够诱导宿主细胞蛋白eEF1G表达量上调。图4-12FMDV感染诱导eEF1G表达量上调Fig4-12UpregulationofeEF1GexpressionafterFMDVinfection.A：Westernblotting检测eEF1G蛋白的表达；B：eEF1G蛋白和GAPDH蛋白的相对浓度定量分析A:ExpressionofeEF1GatdifferenttimepointsfollowingFMDVinfectionwasexaminedbywesternblottingusingananti-eEF1Gprimaryantibody.B:TherelativeconcentrationsoftheeEF1GandGAPDHproteinsateachtimepointfollowingFMDVinfectionwerequantified,andtheextrapolatedvalueswereplottedusingGAPDHasthenormalizedcontrol.4.3.7干扰eEF1G的表达抑制FMDV的增殖既然FMDV2B蛋白与宿主细胞蛋白eEF1G存在相互作用，那么他们究竟是通过什么机制相互作用而影响彼此的呢？为了探索这个科学问题，本试验首先对宿主细胞蛋白eEF1G是否对FMDV的增殖产生影响进行了研究。利用Westernblotting试验对购买的三条针对eEF1G基因不同区域的siRNA进行最佳干扰效果的筛选，以GAPDH蛋白作为内参，结果如图4-13A和4-13B所示，siE3以150nM的浓度转染BHK-21细胞48h后，可有效抑制细胞内源性eEF1G蛋白的表达。用干扰效果最好的siE3将BHK-21细胞中内源性的eEF1G蛋内表达下调之后，接种FMDV。结果如图4-13C所示，转染siE3的细胞感染FMDV后细胞上清液中病毒RNA的拷贝数显著低于转染siNC组（p<0.05），同步进行的细胞中和试验结果如图4-13D所示，转染siE3的试验组中FMDV滴度也显著低于转染siNC组（p<0.05）。说明下调宿主细胞蛋白eEF1G的表达会抑制FMDV的增殖。70 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究图4-13干扰eEF1G的表达抑制FMDV的增殖Fig4-13KnockdownofeEF1GinhibitsFMDVgrowth.A：Westernblotting检测siRNA干扰后eEF1G蛋白的表达；B：eEF1G蛋白和GAPDH蛋白的相对浓度定量分析；C：eEF1G蛋白表达下调后FMDVRNA拷贝数；D：eEF1G蛋白表达下调后FMDV的滴度AandB:WesternblottingofeEF1GinsiRNAtreatedcells.ComparedwithsiNC-transfectedandmock-transfectedcells,thelevelofeEF1GexpressionwassignificantlyreducedinthesiE3-transfectedcellsat48hposttransfection.TheGAPDHwasusedasthenormalizedcontrol.C:TheFMDVgenomecopynumberandD:viraltiterintheeEF1Gknockdowncells.BHK-21cellsweretransfectedwithsiE3orsiNCfor48hbeforeinfectionwithFMDVfor9h.TheFMDVgenomecopynumberwasassessedusingqRT-PCR.Virustiterwasdeterminedbyvirustitrationassay,andtheresultisexpressedastheTCID50/0.1mL.Dataareexpressedasthemean±standarddeviationfromthreeindependentexperiments(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001).4.3.8过表达eEF1G促进FMDV的增殖本研究将重组质粒pFLAG-eEF1G转染入BHK-21细胞使得eEF1G得到瞬时过表达（图4-14A），之后接种FMDVO/CHN/Mya98，检测病毒TCID50以及RNA拷贝数。以转染空质粒p3xFLAG-CMV-10作为阴性对照。结果如图4-14B和4-14C所示，转染重组质粒pFLAG-eEF1G组中FMDVRNA拷贝数以及TCID50值均显著高于转染空载体对照组（p<0.05）。说明上调eEF1G的表达能够促进FMDV的增殖。71 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究图4-14过表达eEF1G促进FMDV的增殖Fig4-14OverexpressionofeEF1GincreasesFMDVgrowth.A：Westernblotting检测eEF1G蛋白的过表达；B：eEF1G蛋白表达上调后FMDVRNA拷贝数；C：eEF1G蛋白表达上调后FMDV的滴度A:BHK-21cellsweretransfectedwithpFlag-eEF1Gorp3xFlag-CMV-10(negativecontrol)for48hbeforeFMDVinfectionfor9h.Wholecelllysatesweresubjectedtowesternblottingusingamouseanti-Flagantibody.β-Tubulinwasincludedasaninternalcontrol.B:TheFMDVgenomecopynumberwasdeterminedbyqRT-PCR.C:Virustiterwasdeterminedbyvirustitrationassay,andtheresultisexpressedastheTCID50/0.1mL.Dataareexpressedasthemean±S.D.fromthreeindependentexperiments(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001).“pFlag”indicatestheemptyplasmidp3xFlag-CMV-10.4.4讨论FMDV通过与宿主因子相互作用而完成自己的生命过程，因而鉴定这些相互作用长期以来都被作为一个重要的研究目标，虽然目前已有许多相关研究成果被报导，但面对复杂的病毒与宿主相互作用网络，仍然还有许多未被鉴定。FMDV的2B基因大小为462bp，编码154个氨基酸，是FMDV基因组中最保守的区域。研究表明2B基因包含两个疏水区，主要定位于细胞的内质网，编码病毒的非结构蛋白，决定病毒的宿主范围，具有孔道蛋白样特性，在FMDV感染过程中发挥重要作用（Aoetal.,2015;Forssetal.,1984;Linetal.,2009;Santosetal.,2005）。2B基因能阻断蛋白质的分泌、提高细胞膜的通透2+性，而且能增加病毒感染细胞的Ca离子浓度，从而诱导自噬（Aldabeetal.,1997;Bienzetal.,1987;Moffatetal.,2005;Moffatetal.,2007;O'Donnelletal.,2011;VanKuppeveldetal.,2005）。鉴于2B蛋白在FMDV生命周期中发挥着如此广泛而又重要的作用，我们利用高通量酵母双杂交方法从FMDV感染的猪组织中筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白，从而进一步了解2B蛋白的功能。在本研究中，我们运用酵母双杂交膜系统来确定与FMDV2B互作的宿主细胞蛋白。相对于经典的酵母双杂交筛选系统，dualmembrane系统可以在细胞膜识别全长整合膜蛋白、膜结合蛋白以及可溶性蛋白质之间的相互作用。我们通过以FMDV2B为诱饵筛选猪组织cDNA文库发现宿主细胞蛋白eEF1G的C末端208~437位氨基酸编码的蛋白能够与FMDV2B蛋白发生相互作72 中国农业科学院博士学位论文第四章FMDV2B互作蛋白的筛选与功能研究用。进一步利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术也证实了FMDV2B与eEF1G之间确实存在相互作用。接下来，为了探究宿主细胞蛋白eEF1G是否能够调节FMDV的增殖过程，我们利用蛋白过表达技术以及RNA干扰技术上调或下调细胞eEF1G的表达，然后通过实时荧光定量PCR检测方法和细胞中和试验检测方法来研究当宿主细胞蛋白eEF1G表达量改变时FMDV的增殖情况。结果发现细胞eEF1G的过表达促进了FMDV的增殖，而eEF1G表达的敲低则抑制FMDV的增殖。这一发现与eEF1G的表达量随FMDV感染上调的试验结果一致。综合这些结果，本研究首次提出宿主细胞蛋白eEF1G与FMDV2B蛋白存在相互作用，并且eEF1G的表达能够促进FMDV的增殖。本研究鉴定出的FMDV2B基因的互作蛋白eEF1G，即真核翻译延伸因子1G，是真核翻译延伸因子1(eEF1)复合物的一个亚基，可以与内质网的膜融合并且具有一种锚定作用。eEF1G的开放阅读框编码437个氨基酸，分子量大小在50kD的蛋白质。eEF1G蛋白的N-末端包含一个谷胱甘肽转移酶结构域，可以参与调节含有该延伸因子和氨酰基tRNA合成酶多亚基复合物的装配（Kooninetal.,1994;Sandersetal.,1992）。有研究报道eEF1G蛋白通过与PolII相互作用，或者结合到波形蛋白启动子区来调节波形蛋白基因（Corbietal.,2010）。eEF1G和eEF1A亚基在人免疫缺陷病毒-1反转录过程中发挥关键作用(Warrenetal.,2012)，在番茄丛矮病毒的复制过程中发挥协同作用(Sasvarietal.,2011)。过表达的eEF1G通过改变肿瘤细胞的氧化还原平衡来影响肿瘤的侵袭性(LeSourdetal.,2006;Mimorietal.,1996)。研究发现，eEF1G的错误定位会减少膜蛋白的合成。而某些膜蛋白是形成囊泡必不可少的，所以在缺乏eEF1G时会严重影响囊泡的形成（Ongetal.,2006）。FMDV2B蛋白与感染细胞的膜质改变和膜通透性增加有关。因此，我们推测宿主细胞蛋白eEF1G协助2B蛋白在制造病毒诱导的囊泡和引起细胞裂解的过程中发挥潜在作用。然而，其中的具体机制还需要进一步研究，在后续的实验中，我们将继续关注它们之间相互作用的分子机制，从而为今后发展新的抗病毒策略以及研制新型疫苗提供更充分的依据。73 中国农业科学院博士学位论文第五章全文结论第五章全文结论1．成功制备了A型FMD合成肽疫苗3D(346～370)-PPS-VP1(129～134(T→C)～156(Q→C)～169)，用其以50µg/只的剂量免疫豚鼠2次，可100%的抵抗同型病毒的攻击；以100µg/头份的剂量免疫牛1次，可达到60%的保护率。有望成为生产实践中有效的牛A型FMD合成肽疫苗。2．宿主细胞蛋白zyxin（329~572aa）能够与FMDVVP1蛋白相互作用，且在FMDV增殖过程中起促进作用。3．宿主细胞蛋白eEF1G（208~437aa）能够与FMDV2B蛋白相互作用，且在FMDV增殖过程中起促进作用。74 中国农业科学院博士学位论文参考文献参考文献1.谢庆阁.口蹄疫.北京:中国农业出版社,2004:30-31.2.Abdul-HamidN.F.,etal.Phylogeographyoffoot-and-mouthdiseasevirustypesOandAinMalaysiaandsurroundingcountries[J].InfectionGeneticsandEvolution,2011,11:320–328.3.AldabeR.,etal.Poliovirusprotein2BCincreasescytosolicfreecalciumconcentrations[J].JournalofVirology,1997,71:6214–6217.4.AlexandersenS.andMowatN.Foot-and-mouthdisease:hostrangeandpathogenesis[J].CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,2005,288:9–42.5.AntoniF.,etal.Efficacyofexperimentalsyntheticpeptidevaccinesagainstfootandmouthdisease[J].MagyarAllatovosokLapja,1988,43:561–566.6.AndinoR.,etal.Intracellulardeterminantsofpicornavirusreplication[J].TrendsinMicrobiology,1999,7:76–82.7.AoD.,etal.Viroporinactivityofthefoot-and-mouthdiseasevirusnon-structural2Bprotein[J].PloSONE,2015,10:e0125828.8.AuerbachD.,etal.Thepost-genomiceraofinteractiveproteomics:factsandperspectives[J].Proteomics,2002,2:611~623.9.BaiX.,etal.Effectsoftwoaminoacidsubstitutionsinthecapsidproteinsontheinteractionoftwocell-adaptedPanAsia-1strainsoffoot-and-mouthdiseasevirusserotypeOwithheparansulfatereceptor[J].VirologyJournal,2014,11:132.10.BarnettP.V,andCarabinH.Areviewofemergencyfoot-and-mouthdisease(FMD)vaccine[J].Vaccine,2002,20:1505–1514.11.BarnettP.V.andStathamR.J.Stratifiedandcryogenicallystored(SACS)vaccines,anewconceptinemergencyfoot-and-mouthdiseasevaccineformulationandstorage[J].Vaccine,2002,20:2060–2064.12.BartelingS.J.andVreeswijkJ.Developmentsinfoot-and-mouthdiseasevaccines[J].Vaccine,1991,9:75–88.13.BeardC.W.andMasonP.W.GeneticdeterminantsofalteredvirulenceofTaiwanesefoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,2000,74:987–991.14.BelshamG.J.andBrangwynJ.K.Aregionofthe5’noncodingregionoffoot-and-mouthdiseasevirusRNAdirecetsefficientinternalinitiationofproteinsynthesiswithincells:InvolvementwiththeroleofLproteaseintranslationalcontrol[J].JournalofVirology,1990,64:5389–5395.15.BelshamG.J.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirus3CproteaseinducescleavageoftranslationinitiationfactorseIF4AandeIF4Gwithininfectedcells[J].JournalofVirology,2000,74:272–280.16.BerrymanS.,etal.Positivelychargedresiduesatthefive-foldsymmetryaxisofcellculture-adaptedfoot-and-mouthdiseaseviruspermitnovelreceptorinteractions[J].JournalofVirology,2013,87:8735-8744．17.BienzK.,etal.AssociationofpolioviralproteinsoftheP2genomicregionwiththeviralreplication75 中国农业科学院博士学位论文参考文献complexandvirus-inducedmembranesynthesisasvisualizedbyelectronmicroscopicimmunocytochemistryandautoradiography[J].Virology,1987,160:220–226.18.BittleJ.L.,etal.Protectionagainstfoot-and-mouthdiseasebyimmunizationwithachemicallysynthesizedpeptidepredictedfromtheviralnucleotidesequence[J].Nature,1982,298:30–33.19.BlancoE.,etal.IdentificationofT-cellepitopesinnonstructuralproteinsoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,2001,75:3164–3174.20.BrownC.C.,etal.Pathogenesisofwild-typeandleaderlessfoot-and-mouthdiseasevirusincattle[J].JournalofVirology,1996,70:5638–5641.21.BrownF.,etal.Delineationofaneutralizingsubregionwithintheimmunodominantepitope(GHloop)offoot-and-mouthdiseasevirusVP1whichdoesnotcontaintheRGDmotif[J].Vaccine,1999,18:50–56.22.BurmanA.,etal.SpecificityoftheVP1GHloopoffoot-and-mouthdiseasevirusforαvintegrins[J].JournalofVirology,2006,80:9798-9810.23.CapozzoA.V.E.,etal.Expressionoffootandmouthdiseasevirusnon-structuralpolypeptide3ABCinduceshistoneH3cleavageinBHK21cells[J].VirusResearch,2002,90:91–99.24.Cedillo-BarronL.,etal.InductionofaprotectiveresponseinswinevaccinatedwithDNAencodingfoot-and-mouthdiseasevirusemptycapsidproteinsandthe3DRNApolymerase[J].JournalofGeneralVirology,2001,82:1713–1724.25.CerisanoV.,etal.MolecularmechanismsofCD99-inducedcaspase-independentcelldeathandcell-celladhesioninEwing’ssarcomacells:actinandzyxinaskeyintracellularmediators[J].Oncogene,2004,23:5664-5674.26.ChanE.W.C.,etal.AnimmunoglobulinGbasedchimericproteininducedfoot-and-mouthdiseasespecificimmuneresponseinswine[J].Vaccine,2001,19:538–546.27.ChengZ.,etal.Thenonstructuralprotein2Cofapicorna-likevirusdisplaysnucleicacidhelixdestabilizingactivitythatcanbefunctionallyseparatedfromitsATPaseactivity[J].JournalofVirology,2013,87:5205–5218.28.ChenT.A.,etal.RecombinantVP1,anAktinhibitor,suppressesprogressionofhepatocellularcarcinomabyinducingapoptosisandmodulationofCCL2production[J].PLoSOne,2011,6:e23317.29.ChinsangaramJ.,etal.Abilityoffoot-and-mouthdiseasevirustoformplaquesincellcultureisassociatedwithsuppressionofalpha/betainterferon[J].JournalofVirology,1999,73:9891–9898.30.ChinsangaramJ.,etal.AntibodyresponseinmiceinoculatedwithDNAexpressingfoot-and-mouthdiseaseviruscapsidproteins[J].JournalofVirology,1998,72:4454–4457.31.ChinsangaramJ.,etal.ProtectionofswinebyliveandinactivatedvaccinesPreparedfromaleaderproteinase-deficientserotypeA12foot-and-mouthdiseasevirus[J].Vaceine,1998,16:1516–1522.32.ChoM.W.,etal.Membranerearrangementandvesicleinductionbyrecombinantpoliovirus2Cand2BCinhumancells[J].Virology,1994,202:129–145.33.CollenT.,etal.HeterotypicrecognitionofrecombinantFMDVproteinsbybovineT-cells:the76 中国农业科学院博士学位论文参考文献polpolymerase(P3D)asanimmunodominantT-cellimmunogen[J].VirusResearch,1998,56:125–133.34.CollenT.Foot-and-mouthdisease(aphthovirus):viralTcellepitopes.In:GoddeevisBMLandMorrisonWI(ed)Cellmediatedimmunityinruminants.CRCPress,Inc.,BocaRaton,Fla,1994,pp173–197.35.CollenT.,etal.ATcellepitopeinVP1offoot-and-mouthdiseasevirusisimmunodominantforvaccinatedcattle[J].JournalofImmunology,1991,146:749–755.36.CorbiN.,etal.TheeEF1gammasubunitcontactsRNApolymeraseIIandbindsvimentinpromoterregion[J].PLoSONE,2010,5:e14481.37.CrowtherJ.R.,etal.IdentificationofafifthneutralizablesiteontypeOfoot-and-mouthdiseasevirusfollowingcharacterizationofsingleandquintuplemonoclonalantibodyescapemutants[J].JournalofGeneralVirology,1993,74:1547–1553.38.CubillosC.,etal.EnhancedmucosalimmunoglobulinAresponseandsolidprotectionagainstfoot-and-mouthdiseaseviruschallengeinducedbyanoveldendrimericpeptide[J].JournalofVirology,2008,82:7223–7230.39.DevaneyM.A.,etal.Leaderproteinoffoot-and-mouthdiseasevirusisrequiredforcleavageofthep220componentofthecap-bindingproteincomplex[J].JournalofVirology,1988,62:4407–4409.40.DiMarchiR.,etal.Protectionofcattleagainstfoot-and-mouthdiseasebyasyntheticpeptide[J].Science,1986,232:639–641.41.DoedensJ.R.andKirkegaardK.Inhibitionofcellularproteinsecretionbypoliovirusproteins2Band3A[J].EMBOJournal,1995,14:894-907.42.DoelT.R.FMDvaccines[J].VirusResearch,2003,91:81–99.43.DomingoE.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirus[J].ComparativeImmunology,MicrobiologyandInfectiousDiseases,2002,25:297–308.44.DuJ.,etal.Molecularcharacterizationandexpressionanalysisofporcineintegrinsalphavbeta3,alphavbeta6andalphavbeta8thatarepotentiallyinvolvedinFMDVinfection[J].MolecularandCellularProbes,2010,24:256-265.45.DurfeeT.,etal.Theretinoblastomaproteinassociateswiththeproteinphosphatasetype1catalyticsubunit[J].Genes&Development,1993,7:555–569.46.DuY.J.,etal.3C(pro)offoot-and-mouthdiseasevirusantagonizestheinterferonsignalingpathwaybyblockingSTAT1/STAT2nucleartranslocation[J].JournalofVirology,2014,88:4908–492.47.EngelenderS.,etal.Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions[J].NatureGenetics,1999,22:110–114.48.ErdtmannL.,etal.ThehepatitisCvirusNS2proteinisaninhibitorofCIDE-B-inducedApoptosis[J].JournalofBiologicalChemistry,2003,278:18256–18264.49.FalkM.M.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusprotease3CinducesspecificproteolyticcleavageofhostcellhistoneH3[J].JournalofVirology,1990,64:748–756.50.FalkM.M.,etal.VPggeneamplificationcorrelateswithinfectiveparticleformationin77 中国农业科学院博士学位论文参考文献foot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,1992,66:2251–2260.51.FieldsS.andSongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions[J].Nature,1989,340:245–246.52.ForssS.,etal.Nucleotidesequenceandgenomeorganizationoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].NucleicAcidsResearch,1984,12:6587–6601.53.FosterM,etal.Serologicalandcellularimmuneresponsestonon-structuralproteinsinanimalsinfectedwithFMDV[J].VeterinaryQuarterly,1998,20:28–30.54.FrancisM.J.,etal.Non-responsivenesstoafoot-and-mouthdiseaseviruspeptideovercomebyadditionofforeignhelperTcelldeterminants[J].Nature,1987,330:168–170.55.FreitasM.J.,etal.Identificationoftherapeuticanddiagnostictargetsthroughyeasttwohybridsystem:molecularbiologyinmedicine[J].ActaMedicaPortuguesa,2012,25:427–432.56.Garcia-BrionesM.M.,etal.ImmunogenicityandTcellrecognitioninswineoffoot-and-mouthdiseaseviruspolymerase3D[J].Virology,2004,322:264–275.57.GeertD.J.,etal.Analysisoftheinteractionbetweensingle-chainvariablefragmentsandtheirantigeninareducingintracellularenvironmentusingthetwo-hybridsystem[J].FEBSLetters,2000,467:316–320.58.GernerW.,etal.Identificationofnovelfoot-and-mouthdiseasevirusspecificT-cellepitopesinc/candd/dhaplotypeminiatureswine[J].VirusResearch,2006,121:223–228.59.GladueD.P.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusnonstructuralprotein2CinteractswithBeclin1,modulatingvirusreplication[J].JournalofVirology,2012,86:12080–12090.60.GladueD.P.,etal.Foot-and-MouthDiseaseVirusModulatesCellularVimentinforVirusSurvival[J].JournalofVirology,2013,87:6794–6803.61.GladueD.P.,etal.Interactionoffoot-and-mouthdiseasevirusnonstructuralprotein3AwithhostproteinDCTN3isimportantforviralvirulenceincattle[J].JournalofVirology,2014,88:2737–2747.62.GlaserW.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusleaderproteinase:InvolvementofC-terminalresiduesinself-processingandcleavageofeIF4G[J].JournalofBiologicalChemistry,2001,276:35473–35481.63.GlassE.JandMillarP.BovineTcellspreferentiallyrecognizenon-viralspacerepitopesinaputativeFMDVvaccinalpeptide[J].Vaccine,1995,13:225–229.64.GoldeW.T.,etal.Vaccinationagainstfoot-and-mouthdiseasevirusconferscompleteclinicalprotectionin7daysandpartialprotectionin4days:Useinemergencyoutbreakresponse[J].Vaccine,2005,23:5775–5782.65.GreenwoodD.L.V.,etal.Vaccinationagainstfoot-and-mouthdiseasevirususingpeptidesconjugatedtonano-beads[J].Vaccine,1998,26:2706–2713.66.GrosselM.J.,etal.Ayeasttwohybridsystemfordiscerningdifferentialinteractionsusingmultiplebaits[J].Naturebiotechnology,1999,17:1232–1233.67.GrubmanM.J.andBaxtB.Foot-and-mouthdisease[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2004,17:78 中国农业科学院博士学位论文参考文献465–493.68.GrubmanM.J.,etal.Evadingthehostimmuneresponse:howfoot-and-mouthdiseasevirushasbecomeaneffectivepathogen[J].FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology,2008,53:8–17.69.HanJ.,etal.ZyxinisinvolvedinthrombinsignalingviainteractionwithPAR-1receptor[J].FASEBJournal,2009,23:4193–4206.70.HansenM.D.H.andBeckerleM.C.OpposingrolesofZyxin/LPPACTArepeatsandtheLIMdomainregionincell–celladhesion[J].JournalofBiologicalChemistry,2006,281:16178–16188.71.HintonT.M.,etal.ConservationofLand3Cproteinaseactivitiesacrossdistantlyrelatedaphthoviruses[J].JournalofGeneralVirology,2002,83:3111–3121.72.HobertO.,etal.SH3domain-dependentinteractionoftheprotooncogeneproductVavwiththefocalcontactproteinzyxin[J].Oncogene,1996,7:1577–1581.73.HopeD.A.,etal.Geneticdissectionofinteractionbetweenpoliovirus3Dpolymeraseandviralprotein3AB[J].JournalofVirology,1997,71:9490–9498.74.IsakoffS.J.,etal.IdentificationandanalysisofPHdomaincontainingtargetsofphosphatidylinositol3-kinaseusinganovelinvivoassayinyeast[J].EMBOJournal,1998,17:5374–5387.75.JacksonT.,etal.EfficientinfectionofcellsinculturebytypeOfoot-and-mouthdiseasevirusrequiresbindingtocellsurfaceheparansulfate[J].JournalofVirology,1996,70:5282–5287.76.JacksonT.,etal.Integrinαvβ1isareceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,2002,76:935–941.77.JacksonT.,etal.Theepithelialintegrinαvβ6isareceptorforfoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,2000,74:4949–4956.78.JamalS.M.andBelshamG.J.Foot-and-mouthdisease:past,presentandfuture[J].VeterinaryResearch,2013,44:116-130.79.Jimenez-ClaveroM.A.,etal.Molecularcloning,expressionandimmunologicalanalysisofthecapsidprecursorpolypeptide(P1)fromswinevesiculardiseasevirus[J].VirusResearch,1998,57:163–170.80.JohnssonN.andVarshavskyA.Splitubiquitinasasensorofproteininteractionsinvivo[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1994,91:10340–10344.81.KatoT.,etal.AtrialnatriureticpeptidepromotescardiomyocytesurvivalbycGMP-dependentnuclearaccumulationofzyxinandAkt[J].JournalofClinicalInvestigation,2005,115:2716–2730.82.KeeganL.,etal.SeparationofDNAbindingfromthetranscription-activatingfunctionofaeukaryoticregulatoryprotein[J].Science,1986,231:699–704.83.KimSA,etal.DNAvaccinationagainstfoot-and-mouthdiseaseviaelectroporation:studyofmolecularapproachesforenhancingVP1antigenicity[J].TheJournalofGeneMedicine,2006,8:1182–1191.84.KitchingR.P.,etal.Developmentoffoot-and-mouthdiseasevirusstraincharacterisation–A79 中国农业科学院博士学位论文参考文献review[J].TropicalAnimalHealthandProdution,1989,21:153–166.85.KitsonJ.D.A.,etal.SequenceanalysisofmonoclonalantibodyresistantmutantsoftypeOfoot-and-mouthdiseasevirus:evidencefortheinvolvementofthethreesurfaceexposedcapsidproteinsinfourantigenicsites[J].Virology,1990,179:26–34.86.KleinJ.Understandingthemolecularepidemiologyoffoot-and-mouth-diseasevirus[J].InfectionGeneticsandEvolution,2009,9:153–161.87.KleinaL.G.andGrubmanM.J.AntiviraleffectsofathiolProteaseinhibitoronfoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,1992,66:7168–7175.88.KnowlesN.J.andSamuelA.R.Molecularepidemiologyoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].VirusResearch,2003,91:65–80.89.KooninE.V.,etal.Eukaryotictranslationelongationfactorlγcontainsaglutathionetransferasedomain-Studyofadiverse,ancientproteinsuperfamilyusingmotifsearchandstructuralmodeling[J].ProteinScience,1994,3:2045–2054.90.KuhnR,etal.Functionalanalysisoftheinternaltranslationinitiationsiteoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,1990,64:4625–4631.91.KuprianovaM.N.,etal.SyntheticpeptideconstructsonthebasisofimmunoactivefragmentsoftheA22strainVP1ofthefoot-and-mouthdiseasevirus[J].RussianJournalofBioorganicChemistry,2000,26:832-837.92.LawrenceP.andRiederE.IdentificationofRNAhelicaseAasanewhostfactorinthereplicationcycleoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofVirology,2009,83:11356–11366.93.LeSourdF.,etal.eEF1B:Atthedawnofthe21stcentury[J].BiochimicaetBiophysicaActa,2006,1759:13–31.94.LiB.andTruebB.Analysisofthealpha-actinin/zyxininteraction[J].JournalofBiologicalChemistry,2001,276:33328–3333595.LiX.Y.,etal.Engagementofsolubleresistance-relatedcalciumbindingprotein(sorcin)withfoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)VP1inhibitstypeIinterferonresponseincells[J].VeterinaryMicrobiology,2013,166:35–46.96.LiZ.,etal.ExpressionofFoot-and-MouthDiseaseVirusCapsidProteinsinSilkworm-BaculovirusExpressionSystemandItsUtilizationasaSubunitVaccine[J].PLoSONE,2008,3:e2273.doi:10.1371/journal.pone.0002273.97.LinJ.Y.,etal.Viralandhostproteinsinvolvedinpicornaviruslifecycle[J].JournalofBiomedicalScience,2009,16:103.98.LivingstonB.,etal.ArationalstrategytodesignmultiepitopeimmunogensbasedonmultipleThlymphocyteepitopes[J].JournalofImmunology,2002,168:5499–5506.99.LofthouseS.A.,etal.Injectablesiliconeimplantsasvaccinedeliveryvehicles[J].Vaccine,2002,20:1725–1732.100.MacalmaT.,etal.Molecularcharacterizationofhumanzyxin[J].JournalofBiologicalChemistry,1997,271:31470–31478.80 中国农业科学院博士学位论文参考文献101.MadanV.,etal.Cellpermeabilizationbypoliovirus2Bviroporintriggersbystanderpermeabilizationinneighbouringcellsthroughamechanisminvolvinggapjunctions[J].CellularMicrobiology,2010,12:1144–1157.102.Martinez-GilL.,etal.Membraneintegrationofpoliovirus2Bviroporin[J].JournalofVirology,2011,85:11315–11324.103.MasonP.W.,etal.Evaluationofalive-attenuatedfoot-and-mouthdiseasevirusasavaccinecandidate[J].Virology,1997,227:96–102.104.MasonP.W.,etal.MolecularbasisofpathogenesisofFMDV[J].VirusResearch,2003,91:9–32.105.McCulloughK.C.,etal.Protectiveimmuneresponseagainstfoot-and-mouthdisease[J].JournalofVirology,1992,66:1835–1840.106.MichaelN.,etal.Analysisofsynphilin-1andsynucleininteractionsbyyeasttwohybridβ-galactosidaseliquidassay[J].NeuroscienceLetters,2002,325:119–123.107.MimoriK.,etal.Elongationfactor1gammamRNAexpressioninoesophagealcarcinoma[J].Gut,1996,38,66–70.108.MockliN.,etal.Yeastsplit-ubiquitin-basedcytosolicscreeningsystemtodetectinteractionsbetweentranscriptionallyactiveproteins[J].BioTechniques,2007,42:725–730.109.MoffatK.,etal.Effectsoffoot-and-mouthdiseasevirusnonstructuralproteinsonthestructureandfunctionoftheearlysecretorypathway:2BCbutnot3Ablocksendoplasmicreticulum-to-Golgitransport[J].JournalofVirology,2005,79:4382–4395.110.MoffatK.,etal.Inhibitionofthesecretorypathwaybyfoot-and-mouthdiseasevirus2BCproteinisreproducedbycoexpressionof2Bwith2C,andthesiteofinhibitionisdeterminedbythesubcellularlocationof2C[J].JournalofVirology,2007,81:1129–1139.111.MohapatraJ.K.,etal.Cellcultureadaptationmutationsinfoot-and-mouthdiseasevirusserotypeAcapsidproteins:Implicationsforreceptorinteractions[J].JournalofGeneralVirology,2015,96:553-564.112.MorganD.O.andMooreD.M.Protectionofcattleandswineagainstfoot-and-mouthdisease,usingbiosyntheticpeptidevaccines[J].AmericanJournalofVeterinaryResearch,1990,51:40–45.113.MulcahyG.,etal.lsotyperesponsesofinfected,virus-vaccinatedandpeptide-vaccinatedcattletofoot-and-mouthdiseasevirus[J].Vaccine,1990,8:249–256.114.MulcahyG.,etal.Maturationoffunctionalantibodyaffinityinanimalsimmunisedwithsyntheticfoot-and-mouthdiseasevirus[J].ResearchinVeterinaryScience,1992,52:133–140.115.NewmanJ.F.E.,etal.PurificationandidentificationoftheRNA-dependentRNApolymeraseoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].JournalofGeneralVirology,1979,45:497–507.116.NixD.A.andBeckerleM.C.Nuclear-cytoplasmicshuttlingofthefocalcontactprotein,zyxin:Apotentialmechanismforcommunicationbetweensitesofcelladhesionandthenucleus[J].JournalofCellBiology,1997,138:1139–1147.117.NixD.A.,etal.Targetingofzyxintositesofactinmembraneinteractionandtothenucleus[J].JournalofBiologicalChemistry,2001,276,34759–34767.81 中国农业科学院博士学位论文参考文献118.O'DonnellV.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusutilizesanautophagicpathwayduringviralreplication[J].Virology,2011,410:142–150.119.OldstoneM.B.A.,etal.Discriminatedselectionamongviralpeptideswiththeappropriateanchorresidues:implicationsforthesizeofthecytotoxicT-lymphocyterepertoireandcontrolofviralinfection[J].JournalofVirology,1995,69:7423–7429.120.OngL.L.,etal.Kinectindependentassemblyoftranslationelongationfactor-1complexonendoplasmicreticulumregulatesproteinsynthesis[J].JournalofBiologicalChemistry,2006,281:33621–33634.121.PaulA.V.,etal.IdentificationofanRNAhairpininpoliovirusRNAthatservesastheprimarytemplateintheinvirouridylylationofVPg[J].JournalofVirology,2000,74:10359-10370.122.PengJ.M.,etal.VP1offoot-and-mouthdiseasevirusinducesapoptosisviatheAktsignalingpathway[J].JournalofBiologicalChemistry,2004,279:52168-52174.123.PerryB.D.andRichK.M.Povertyimpactsoffoot-and-mouthdiseaseandthepovertyreductionimplicationsofitscontrol[J].VeterinaryRecord,2007,160:238–241.124.PfaffE.,etal.Antibodiesagainstapreselectedpeptiderecognizeandneutralizefoot-and-mouthdiseasevirus[J].EMBOJournal,1982,1:869–874.125.QianP.,etal.AnapproachtoaFMDvaccinebasedongeneticengineeredattenuatedpseudorabiesvirus:oneexperimentusingVP1genealonegeneratesanantibodyrespondsonFMDandpseudorabiesinswine[J].Vaccine,2004,22:2129–2136.126.RacanielloV.R.Picornaviridae:Thevirusesandtheirreplication.InFundamentalVirology,4thed.;Knipe,D.M.;Howley,P.M.,Eds.;LippincottWilliamsandWilkins:Philadelphia,US,2001,pp:685–722.127.RajagopalaS.V.,etal.Studyingproteincomplexesbytheyeasttwo-hybridsystem[J].Methods,2012,58:392-399.128.ReedL.J.andMuenchH.Asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints[J].AmericanJournalofTropicalMedicineandHygiene,1938,27:493–497.129.RodriguezL.L.andGrubmanM.J.Footandmouthdiseasevirusvaccines[J].Vaccine,2009,27:D90–D94.130.RodriguezL.L.andGayC.G.Developmentofvaccinestowardtheglobalcontrolanderadicationoffoot-and-mouthdisease[J].ExpertReviewofVaccines,2011,10:377–387.131.RodriguezL.L.,etal.AsyntheticpeptidecontainingtheconsensussequenceoftheG–Hloopregionoffoot-and-mouthdiseasevirustype-OVP1andapromiscuousT-helperepitopeinducespeptide-specificantibodiesbutfailstoprotectcattleagainstviralchallenge[J].Vaccine,2003,21:3751–3756.132.Ruiz-SaenzJ.,etal.Cellularreceptorsforfootandmouthdiseasevirus[J].Intervirology,2009,52:201–212.133.RyanM.D.,etal.Foot-and-mouthdiseaseproteinases.InFoot-and-MouthDisease,Domingo,F.S.a.E.Ed.CurrentPerspectives.HorizonBioscience:Norfolk,UK,2004,pp:53–76.82 中国农业科学院博士学位论文参考文献134.SandersJ.,etal.Elongationfactor-1messenger-RNAlevelsinculturedcellsarehighcomparedtotissueandarenotdrasticallyaffectedfurtherbyoncogenictransformation[J].NucleicAcidsResearch,1992,20:5907-5910.135.SantosT.D.L.,etal.ShorthairpinRNAtargetedtothehighlyconserved2Bnonstructuralproteincodingregioninhibitsreplicationofmultipleserotypesoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].Virology,2005,335:222–231.136.SantosT.D.L.,etal.Theleaderproteinaseoffoot-and-mouthdiseasevirusinhibitstheinductionofbetainterferonmRNAandblocksthehostinnateimmuneresponse[J].JournalofVirology,2006,80:1906–1914.137.SasvariZ.,etal.Synergisticrolesofeukaryotictranslationelongationfactors1Bγand1Ainstimulationoftombusvirusminus-strandsynthesis[J].PLoSPathogens,2011,7:e1002438.138.SkernT.,etal.AstructuralmodelofPicornavirusleaderProteinasesbasedonPapainandbleomycinhydrolase[J].JournalofGeneralVirology,1998,79:301–307.139.SobrinoF.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirus:alongknownvirus,butacurrentthreat[J].VeterinaryResearch,2001,32:1–30.140.StagljarI.,etal.Ageneticsystembasedonsplitubiquitinfortheanalysisofinteractionsbetweenmembraneproteinsinvivo[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1998,95:5187–5192.141.SteinbergerJ.,etal.Foot-and-mouthdiseasevirusleaderproteinase:Structuralinsightsintothemechanismofintermolecularcleavage[J].Virology,2014,468–470:397–408.142.StrebelK.andBeckE.AsecondproteaseofFMDV[J].JournalofVirology,1986.58:893-899.143.SuterB.,etal.DevelopmentandapplicationofaDNAmicroarray-basedyeasttwo-hybridsystem[J].NucleicAcidsResearch,2013,41:1496–1507.144.TabogaO.,etal.Alarge-scaleevaluationofpeptidevaccinesagainstfoot-and-mouthdisease:lackofsolidprotectionincattleandisolationofescapemutants[J].JournalofVirology,1997,71:2606–2614.145.TerpstraC.,etal.Comparisonoflaboratorytechniquesfortheevaluationoftheantigenicpotencyoffoot-and-mouthdiseasevirusculturesandvaccines[J].VeterinaryMicrobiology,1976,1:333–342.146.TesarM.andMarquardtO.Foot-and-mouthdiseasevirusprotease3CinhibitscellulartranscriptionandmediatescleavageofhistoneH3[J].Viology,1990,174:364–374.147.TesarM.,etal.Serologicalprobesforsomefoot-and-mouthdiseasevirusnonstructuralproteins[J].VirusGenes,1989,3:29-44.148.TownerJ.S.,etal.Determinantsofmembraneassociationforpoliovirusprotein3AB[J].JournalofBiologicalChemistry,1996,271:26810–26818.149.TwymanR.M.Principlesofproteomics.BIOSScientificPublishers,NewYork,2004.150.UdenfriendS.,etal.Fluorescamine:Areagentforassayofaminoacids,peptides,proteinsandprimaryaminesinthePicomolrange[J].Science,1972,178:871–872.83 中国农业科学院博士学位论文参考文献151.UrechD.M.,etal.Cellgrowthselectionsystemtodetectextracellularandtransmembraneproteininteractions[J].BiochimicaetBiophysicaActa,2003,1622:117–127.152.ValeroM.L.,etal.Cyclicpeptidesasconformationallyrestrictedmodelsofviralantigens:applicationtofoot-and-mouthdiseasevirus[J].BiomedicalPeptides,ProteinsandNucleicAcids,1995,1:133–140.153.VanKuppeveldF.J.M.,etal.Enterovirusprotein2Bpo(u)resoutthecalcium:aviralstrategytosurvive[J]?TrendsinMicrobiology,2005,13:41–44.154.VolpinaO.M.,etal.ApeptideconstructcontainingB-cellandT-cellepitopesfromthefoot-and-mouthdiseaseviralVP1proteininducesefficientantiviralprotection[J].Vaccine,1999,17:577–584.155.WaaijersS.,etal.IdentificationofhumanproteininteractiondomainsusinganORFeome-basedyeasttwo-hybridfragmentlibrary[J].JournalofProteomeResearch,2013,12:3181–3192.156.WangC.Y.,etal.Effectivesyntheticpeptidevaccineforfoot-and-mouthdiseaseinswine[J].Vaccine,2002,20:2603–2610.157.WangD.,etal.Foot-and-Mouthdiseasevirus3CproteasecleavesNEMOtoimpairinnateimmunesignaling[J].JournalofVirology,2012,86:9311-9322.158.WangD.,etal.Theleaderproteinaseoffoot-and-mouthdiseasevirusnegativelyregulatesthetypeIinterferonpathwaybyactingasaviraldeubiquitinase[J].JournalofVirology,2011,85:3758-3766.159.WangG.X.,etal.Howfoot-and-mouthdiseasevirusreceptormediatesfoot-and-mouthdiseasevirusinfection[J].VirologyJournal,2015,12:9.160.WangJ.C.,etal.AcriticalroleofN-mycandSTATinteractor(Nmi)infoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)2C-inducedapoptosis[J].VirusResearch,2012,170:59–65.161.WarrenK.,etal.Eukaryoticelongationfactor1complexsubunitsarecriticalHIV-1reversetranscriptioncofactors[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2012,24:9587–9592.162.WigdorovitzA.,etal.Inductionofaprotectiveantibodyresponsetofoot-and-mouthdiseasevirusinmicefollowingoralorparenteralimmunizationwithalfalfatransgenicplantsexpressingtheviralstructuralproteinVP1[J].Virology,1999,255:347–353.163.XiangW.,etal.Interactionbetweenthe5′-terminalcloverleafand3AB/3CDproofpoliovirusisessentialforRNAreplication[J].JournalofVirology,1995,69:3658–3667.164.YangM.,etal.Identificationofamajorantibodybindingepitopeinthenon-structuralprotein3Doffoot-and-mouthdiseasevirusincattleandthedevelopmentofamonoclonalantibodywithdiagnosticapplications[J].JournalofImmunologyMethods,2007,321:174–181.165.YoshigiM.,etal.Mechanicalforcemobilizeszyxinfromfocaladhesionstoactinfilamentsandregulatescytoskeletalreinforcement[J].JournalofCellBiology,2005,171:209–215.166.ZamoranoP.I.,etal.A10-amino-acidlinearsequenceofVP1offoot-and-mouthdiseaseviruscontainingB-andT-cellepitopesinducesprotectioninmice[J].Virology,1995,212:614–621.84 中国农业科学院博士学位论文参考文献167.ZamoranoP.I.,etal.InductionofantifootandmouthdiseasevirusTandBcellresponsesincattleimmunizedwithapeptiderepresentingtenaminoacidsofVP1[J].Vaccine,1998,16:558–563.168.ZhaoW.NegativeregulationofTBK1-mediatedantiviralimmunity[J].FEBSLetters,2013,587:542–5485 中国农业科学院博士学位论文致谢致谢时光如梭，匆匆而逝。还清楚的记得四年前下定决心考博时的激动心情和昂扬斗志，仿如昨日。四年的悲与喜，四年的得与失，回顾起来，感怀万千。感谢一路走来给予过我帮助和鼓励的人们，感谢那些使我不断成长的过往，感谢一直努力的自己。这四年，是磨练、是经历、是收获。感谢我的导师王永录研究员，从论文的设计、实施到完成，每一步都倾注着导师的亲切关怀和悉心指导。您对我的信任、鼓励和宽容让我在面对压力时能够从容不迫，让我在偶尔怠惰时又能及时自我约束。您认真负责、严谨细致的工作作风是我学习的榜样，您平易近人、真诚宽厚的人格魅力令我尊敬和爱戴。在此谨向王永录导师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢。感谢我的另一位指导老师、团队首席张永光研究员，感谢您对我论文的全力支持，四年来始终给予的指导、帮助和辛勤栽培。是您让我加入了现在的科研团队，为我提供了良好的科研环境。您渊博的学识、一丝不苟的敬业精神、实事求是的工作作风永远值得我学习。感谢本团队的潘丽副研究员，在我遇到困难时无私帮助我，在我困惑迷茫时及时开解我，在我颓废沮丧时常常鼓励我，您是我生活上的益友，是我学业上的良师。感谢口蹄疫防控技术团队的全体同仁们，包括周鹏硕士、吕建亮硕士、刘新生硕士、方玉珍老师、丁耀忠硕士、孙跃峰研究员、常惠芸研究员、张杰研究员、林彤硕士、邵军军硕士、赵付荣博士、陈豪泰博士。是你们，才有了如此和谐融洽的工作环境，感谢你们对我的关怀、指导和帮助。特别感谢同事周鹏在论文涉及大动物的试验中给予的无私帮助。感谢已退休的蒋守田老师、张维德老师在动物试验中给予的帮助和指导。感谢实验室的师弟程鹏飞、仝燕许、张庆勋、李登科、郑华彬，师妹王淼、齐琳琳、李静静、王园园等在生活和试验中给予的帮助和支持，是你们带来了青春和活力，营造了轻松的科研氛围，留下了许多共同的美好回忆。感谢同我一起奋斗的2012级博士同学们，连凯琪、曲子刚、马永华、杨顺利、贺君君、王帅、马丽娜、吴晓云、吴国泰、林伟静、丁宁等等，我们在学习和生活中结下了深刻的情谊，一起经历欢笑和困苦，彼此鼓励和帮助，共同度过难忘的博士研究生生活。感谢同事张蕾、智晓莹、陈启伟、周建华、张娟等在试验中提供的方便和在生活中给予的关心。感谢兰州兽医研究所这个蓬勃向上的团体，身处这个在改革大潮中不断奋进的集体当中，每个人都在努力奋斗、积极进取，使我每天都能得到激励，获得前行的力量。在此向兰州兽医研究所的各位领导、老师和同事们表示诚挚的感谢！最后，我要特别感谢我的爸爸妈妈和哥哥嫂嫂，我的每一个决定你们都给予了充分的尊重和全力的支持，你们无条件的爱是我不断前行的力量源泉。感谢我的丈夫左文彬，是你在生活中的默默支持和付出，让我没有后顾之忧地专心投入研究，完成了学业。从开始进入课题到论文的顺利完成，有太多的人和事需要感谢，我将心怀感恩，继续前行。本论文是在家畜疫病病原生物学国家重点实验室完成的。本论文得到“十二五”国家“863”计划项目（2011AA10A211）和“十二五”国家生猪现代产业技术体系项目（CARS-36-06B）的资助。86 中国农业科学院博士学位论文作者简历作者简历张中旺，女，1983年7月15日生，甘肃省临潭县人。助理研究员。2006年毕业于山西农业大学动物科技学院，动物医学专业，获学士学位；2009年毕业于中国农业科学院研究生院，预防兽医学专业，获硕士学位；2012年考入中国农业科学院研究生院，在兰州兽医研究所攻读预防兽医学博士学位；于2009年7月至今在兰州兽医研究所口蹄疫研究室工作，主要从事口蹄疫防控、口蹄疫疫苗研制以及口蹄疫致病机理等方面的研究。博士期间发表的论文:1.ZhongwangZhang,LiPan,YaozhongDing,PengZhou,JianliangLv,HaotaiChen,YuzhenFang,XinshengLiu,HuiyunChang,JieZhang,JunjunShao,TongLin,FurongZhao,YongguangZhang*,YongluWang*.Efficacyofsynthetic-peptidecandidatevaccinesagainstserotypeAfoot-and-mouthdiseasevirusincattle.AppliedMicrobiologyandBiotechnology.201599:1389–1398(IF:3.337).2.LiPan,ZhongwangZhang,JianliangLv,PengZhou,WenfaHu,YuzhenFang,HaotaiChen,XinshengLiu,JunjunShao,FurongZhao,YaozhongDing,TongLin,HuiyunChang,JieZhang,YongguangZhang*,YongluWang*.Inductionofmucosalimmuneresponsesandprotectionofcattleagainstdirect-contactchallengebyintranasaldeliverywithfoot-and-mouthdiseasevirusantigenmediatedbynanoparticles.InternationalJournalofNanomedicine.2014:95603–5618(IF:4.195).3.MiaoWang,ZeqianGao,ZhongwangZhang,LiPan*,YongguangZhang*.RolesofMCellsinInfectionandMucosalVaccines.HumanVaccines&Immunotherapeutics,10:12,1--8;November1,2014(IF:3.643).博士期间授权的发明专利:1.张永光，张中旺，王永录，潘丽，方玉珍，吕建亮，周鹏，刘新生，蒋守田.一种牛口蹄疫病毒A型合成肽及其制备和应用，2015.05.13，中国，ZL201310109630.8博士期间待发表的论文：1.ZhongwangZhang,LiPan,YaozhongDing,JianliangLv,PengZhou,YuzhenFang,XinshengLiu,YongguangZhang*,YongluWang*.eEF1GInteractswithViralNonstructuralProtein2BandModulatestheReplicationofFoot-and-MouthDiseaseVirus.PloSONE(submitted)87
此文档下载收益归作者所有
