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硕士学位论文亲本烟草暴露诱发子代胎源性糖尿病的动物模型Parentalexposuretotobaccoinducesfetaloriginsofdiabetesinanimalmodel专业：妇产科学研究生:黄珺导师：余波澜研究员副究广州医科大学.广州2017年5月 目录中文摘要.......................................................................................................................1ABSTRACT..................................................................................................................5缩略词索引.................................................................................................................11前言..........................................................................................................................12材料和方法.................................................................................................................17结果..........................................................................................................................33讨论..........................................................................................................................46结论..........................................................................................................................59不足与展望.................................................................................................................60参考文献.....................................................................................................................61综述..........................................................................................................................68在读期间完成的论文和译著.....................................................................................76致谢..........................................................................................................................77学位论文独创性声明.................................................................................................78学位论文知识产权权属声明.....................................................................................78学位论文使用授权声明.............................................................................................78 中文摘要亲本烟草暴露诱发子代胎源性糖尿病的动物模型专业：妇产科学研究生：黄珺黄珺导师：余波澜研研究员究副波澜副研究员中文摘要背景目前越来越多的研究开始关注早期生命事件在人类晚期疾病风险产生中可能扮演的角色。2003年Barker提出了多哈理论。多哈（developmentaloriginsofhealthanddisease，DOHaD）即健康与疾病的发育起源，是近年来通过大量流行病学研究提出的关于人类疾病起源的新的医学概念。该理论表明人类在生命早期（胎儿期、婴儿期、儿童期）这一关键阶段经历任何一种不良因素暴露，都可能影响胎儿，婴幼儿的发育可塑性，带来表型特点的改变即组织和器官在结构与功能上会发生永久性或程序性改变，最终导致将来一系列儿童期，成年期疾病的发育源性改变，包括代谢性疾病，心血管疾病，癌症，出生缺陷，精神行为异常等慢性非传染性疾病（慢性病）的发生与发展。生命早期有4个时期可能是远期疾病起源的敏感窗口，分别是配子形成期，合子形成期，宫内发育期和青春发育期。在生命早期众多不良暴露中，烟草是常见及重要的不良暴露因素。流行病学结果表明，父亲受孕前长期吸烟或可导致男性后代出生后超重及肥胖。父亲吸烟可将慢性疾病遗传给下一代,后代出现内分泌紊乱，肥胖，患上代谢性疾病甚至心理障碍，癌症的发生概率可能也会增加。生命早期母本单方面孕期烟草暴露可导致孕期流产，围产儿死亡率增高，低出生体重儿、早产，胎儿宫内发育受限。女性孕期吸烟可导致后代出现超重甚至肥胖。一些动物实验发现围产期暴露尼古丁对子代糖尿病病理生理过程的重要途径造成破坏，包括减少胰岛β细胞体积和β细胞功能受损。生命早期父母本双重烟草暴露可能与儿童期超重风险增加密切相关。孕期父母同时吸烟的后代女性青春期和成年期的体重增加的风险上升。1 广州医科大学硕士学位论文为了明确生命早期亲本烟草暴露引起子代胎源性代谢性疾病具体作用时期（配子形成期，合子形成期，宫内发育期），我们建立了生命早期亲本烟草暴露诱发后代胎源性糖尿病的动物模型，这给予了我们很多启示，无疑为探索后代慢性病的病因学及干预措施提供了一个新的窗口，为今后制定严格的控烟计划及大力倡导优生优育提供了理论依据。研究目的：根据人类的流行病学调查研究结果，利用C57亲本小鼠通过香烟烟雾浓缩物（CSC）饲喂建立生命早期烟草暴露诱发子代鼠糖尿病的动物模型,明确生命早期亲本烟草暴露对后代代谢性疾病的影响，确定生命早期烟草暴露发挥作用的敏感窗口时期。同时了解生命早期亲本烟草暴露对后代生长发育的影响。研究方法：1）父本C57小鼠CSC暴露处理（配子形成期）：C57BL/6J野生型雄鼠从4周龄起，连续饲喂香烟烟雾浓缩物CSC(2mg/mL，隔天换一次)。即香烟烟雾浓缩物（CSC）父本暴露组；2）父本C57小鼠正常处理（配子形成期）：另一组C57BL/6J野生型雄鼠从4周龄起正常饲养记为对照组。3）母本C57小鼠CSC暴露处理(宫内发育期）：对2月-6月龄的C57BL/6J野生型雌鼠进行阴道涂片检测雌鼠发情周期中的发情期，雌鼠与CSC雄鼠/对照组雄鼠按1：1比例合笼。第二天阴道涂片查到阴道栓或阴道涂片发现雄鼠精子确定为受精，当日计为孕0.5天。从孕0.5天起，一组雌鼠连续饲喂CSC(2mg/mL，隔天换一次)至18.5天称重并取出单笼饲养。4）母本C57小鼠正常处理（宫内发育期）一组雌鼠见栓或查到精子后正常饲养至18.5天称重并取出单笼饲养。5）上述四组动物模型为：①♀╳♂；②♀CSC╳♂；③♀╳♂CSC；④♀CSC╳♂CSC；6）检测四组仔鼠血糖血脂相关指标：上述四组母鼠产下的仔鼠生长到4周及8周尾静脉取血行OGTT检测（检测血糖时间点为空腹，仔鼠腹腔注射实验剂量葡萄糖后第30min，60min，90min及120min血糖水平）；四组仔鼠生长到第4周及第8周利用收集的血清进行血脂（总胆固醇及甘油三酯）的检测；四组仔鼠出生当日取下肢肌肉组织标本行病理组织切片查找脂肪细胞;7）上述四组仔鼠在出生后第4周及第8周取肠道粪便提取基因组总DNA进行2 中文摘要16SV4微生物分析测序以了解各组微生物菌群与血糖血脂之间的关系。8）检测四组仔鼠生长发育指标记录上述四组孕14.5天胎鼠体重及形态发育；记录仔鼠出生时及出生后每周增重情况并绘制生长曲线至第8周。9）了解四组孕鼠妊娠过程及结局：记录妊娠期（孕0.5天至孕18.5天）四组母鼠体重增加情况；分娩时的窝胎数；分娩天数等。实验结果：1各组仔鼠代谢方面，我们分别在各组仔鼠相当于青春期及性成熟期的第4周及第8周检测了较为有代表性的代谢指标血糖及血脂。结果表明亲本双重烟草暴露组的仔鼠出现了在第4周及第8周出现了糖代谢异常，血糖水平明显升高，达到了糖尿病诊断标准[1]。血脂异常升高，达到了高脂血症的诊断标准[2]。值得注意的是，该组仔鼠同正常对照组仔鼠除出生当日外在生长发育的各个阶段，体重均有一定程度的增高。2在四组共计97例动物模型中，亲本双重烟草暴露组有5例，单纯母本孕期烟草暴露组及单纯父本孕前烟草暴露组分别发现了2例及3例新生鼠下肢肌肉脂肪异常沉积。3各组仔鼠出生后第4周肠道微生物：亲本双重烟草暴露组的仔鼠组拟杆菌门比厚壁菌门比例下降，在疣微菌门(Verrucomicrobia)比例急剧下降，变形菌门（Proteobacteria）丰度增加，具有统计学差异的Biomarker也是变形菌门（Proteobacteria）。各组仔鼠出生后第8周肠道微生物：与4周仔鼠不同的是，同正常对照组相比，亲本双重烟草暴露组，单纯父本烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组Alpha多样性指数均是下降的，其中亲本双重烟草暴露组最为明显，这说明这三组物种的多样性是下降的，以亲本双重烟草暴露组为甚。4在四组雌鼠妊娠期间，我们也了解了四组雌鼠孕14.5天时胎鼠生长发育的情况。发现四组胎鼠在母鼠孕14.5天体重方面出现了差异，结果是同正常对照组相比，亲本双重烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组的胎鼠体重明显下降，而单纯父本烟草暴露组同正常对照组相比未出现体重明显减轻的情况。相比正常对照组，亲本双重烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组在仔鼠出生后第1周龄，第2周龄及第3周龄体重明显增大。而同正常对照组相比，单纯父本烟草暴露组仔鼠从第1周龄起至第6周龄体重明显减轻，差异有统计学意义，反映出受亲本烟草暴露的影响，各组仔鼠在从出生到出生后第8周各个阶段生长发育的不同变化。3 广州医科大学硕士学位论文5在雌鼠妊娠期间，虽然亲本双重烟草暴露组雌鼠孕期增重的程度有所下降，产仔数量也略有减少，但这些变化并没有统计学意义，四组雌鼠妊娠期间体重增加及产仔数量基本接近。四组孕鼠在生产天数方面基本一致，均在正常生产期（19-21天）内生产，并未出现早产或过期产等异常情况。研究结论：1、宫内烟草暴露可以诱发成年期糖尿病；父本烟草暴露叠加后可以进一步诱发青少年期糖尿病。2、宫内烟草暴露导致子代青春期和成年期的糖脂代谢异常和肥胖相关的肠道微生物菌群发生改变，父本烟草暴露叠加后该类变化更为显著。3、亲本烟草暴露不影响孕期增重、产仔数、分娩期等妊娠基本指标，但是均会导致子代妊娠晚期和出生时体重显著性降低；同时宫内暴露的子代在幼年期和青春期有明显的生长追赶效应。4、亲本烟草暴露均对子代的糖脂代谢有不良影响，亲本双重暴露可能诱发子代胎源性糖尿病。【关键词】香烟烟雾浓缩物亲本暴露生长发育代谢性疾病肠道微生物DOHaD4 AbstractParentalexposuretotobaccoinducesfetaloriginsofdiabetesinanimalmodelMajor:ObstertricsandGynecologyPostgraduateJunHuangHuangSupervisorBolanYuoProfessorY.BolanYuAbstractBackgroundAgrowingbodyofresearchisnowconcernedwiththepossibleroleofearlylifeeventsinthedevelopmentofdiseaseriskinlaterhumanlife.In2003,BarkerputforwardthetheoryofDoha.Doha(developmentaloriginsofhealthanddisease,DOHaD),theoriginofhealthanddiseasedevelopment,isanewmedicalconceptproposedbyalargenumberofepidemiologicalstudiesinrecentyearsontheoriginofhumandiseases.Thetheorysuggeststhathumansinearlylife(fetal,infant,childhood)thiskeystageexposedtoanyadversefactorsmayaffectthefetus,infantdevelopmentalplasticity,bringthephenotypechangesoftissuesandorgansoccurpermanentorproceduralchangesinthestructureandfunctionofthefinal.Infutureaseriesofchildhooddevelopmentoriginofadultdiseases,includingmetabolicdiseases,cardiovasculardisease,cancer,birthdefects,mentalandbehaviordisordersandotherchronicnoncommunicablediseases(NCD)occurrenceanddevelopment.Thereare4periodsinearlylifethatmaybethesensitivewindowfortheoriginoflong-termdiseases,includinggametogenesis,zygoteformation,intrauterinedevelopmentandpuberty.Intheearlylifeofmanyadverseexposure,tobaccoisanimportantandcommonadversefactorinearlylifeofoffspring.Epidemiologicalfindingssuggestthatsmokingbeforefathersmayleadtooverweightandobesitywhenmaleoffspringareborn.Fathersmokingcanbegeneticchronicdiseasetothenextgeneration,offspringofendocrinedisorders,obesity,sufferingfrommetabolicdiseasesandmental5 广州医科大学硕士学位论文disorders,theprobabilityofoccurrenceofcancermayincrease.Intheearlystageoflife,maternalunilateralpregnancyexposuretotobaccocanleadtomiscarriageduringpregnancy,higherperinatalmortality,lowerbirthweight,prematurebirth,andintrauterinegrowthrestriction.Womenwhosmokeduringpregnancycanleadtooverweightorevenobesitylaterinlife.Someanimalstudieshavefoundthatperinatalexposuretonicotineisanimportantpathwaytothepathophysiologyofdiabetesintheoffspring,includingreducedbetacellvolumeandimpairedbetacellfunction.Intheearlystageoflife,parentaldualtobaccoexposuremaybeassociatedwithanincreasedriskofoverweightinchildhood.Offspringofparentswhosmokeatthesametime,womenhaveanincreasedriskofpubertyandadultweightgain.Inordertoclarifytheearlylifeexposuretotobaccocausedbyparentaloffspringfetalderivedmetabolicdiseasespecificperiod(gameteformation,zygoteformationstage,intrauterinegrowthperiod),weestablishedananimalmodelofearlylifeexposuretotobaccoinducedoffspringparentfetaloriginsofdiabetes,whichgaveusalotofinspiration,willundoubtedlyprovideanewthewindowforexploringtheetiologyandinterventionofchronicdiseasesforfuturegenerations,formulatestricttobaccocontrolplanandvigorouslypromoteeugenicsprovidesatheoreticalbasisfor.ObjectiveAccordingtotheresultsofepidemiologicalstudiesonhuman,theuseofC57micethroughparentalcigarettesmokingcondensate(CSC)wasestablishedinearlylifeexposuretotobaccoanimalmodelofelicitorsgenerationindiabeticrats,clearearlylifeexposuretotobaccoparentaleffectsonoffspringmetabolicdiseases,determinethelifetoplaytheroleofearlytobaccosensitivewindowperiod.Tounderstandtheinfluenceofearlytobaccoexposureonthegrowthanddevelopmentofoffspringinearlylife.Methods1)paternalC57miceCSCexposuretreatment(gameteformationstage):C57BL/6Jwild-typemalerats,from4weeksold,continuousfeedingcigarettesmokeconcentrateCSC(2mg/mL,changethenextday).Cigarettesmokeconcentration(CSC)maleparentexposuregroup;6 Abstract2)paternalC57micenormaltreatment(gameteformationstage):anothergroupofC57BL/6Jwildtypemalemicefrom4weeksoldnormalfeeding,asacontrolgroup.3)femaleC57miceexposedtoCSCtreatment(zygoteformationperiodandintrauterinegrowthperiod):thewildtypeC57BL/6JfemaleratsonFebruaryattheageof-6monthsoftheestrouscycleinfemaleratsvaginalsmeartodetectestrus,femaleratsandmaleCSCratsandcontrolgroupratsaccordingtotheproportionof1:1cage.Seconddays,vaginalsmears,vaginalplugsorvaginalsmearsrevealedthatthemalespermwasdeterminedtobefertilized,andthedaywas0.5days.Fromthe0.5dayofgestation,agroupoffemaleratswerecontinuouslyfedCSC(2mg/mL,changedeveryotherday)to18.5daystoweighandtakeoutasinglecagerearing.4)femalemiceC57micenormaltreatment(zygoteformationandintrauterinegrowth),agroupoffemaleratsseeplugorsperm,afternormalrearingto18.5days,weighingandtakeoutasinglecagerearing.5)thefourgroupsofanimalmodels:1x2femalemale;femaleCSCmaleandfemalemalexx;CSC;themalefemaleCSCxCSC;6)fourgrouprats,bloodglucoseandbloodlipidrelatedindicatorsdetection:thefourgroupsweretheoffspringofgrowthto4weeksand8weeksoftailveinbloodforOGTTdetection(detectiontimepointforfastingbloodglucose,ratsbyintraperitonealinjectionofglucoseafterexperimentaldose30,60,90and120min;fourgroupsofbloodglucoselevels)ratgrowthtofourthweeksand8weeksusingthecollectedserumlipids(cholesterolandtriglyceride)detection;fourpupsatpostnataldaysamplesofmusclebiopsyforlowerlimbspecimensforfatcells;7)thefourgroupsofratswerecollectedatfourthweeksand8weeksafterbirthtocollectthegenomicDNAandanalyzethesequenceof16SV4tounderstandtherelationshipbetweenmicrobialfloraandbloodglucoseandbloodlipids.8)thegrowthanddevelopmentindexesoffourgroupsweredetected,andthebodyweightandmorphologicaldevelopmentofthefourgroupswererecordedat14.5daysafterbirth.Theweightgainatbirthandafterbirthwasrecorded,andthegrowthcurvewasdrawnuptoeighthweeks.7 广州医科大学硕士学位论文9)understandthefourgroupsofpregnantrats:pregnancycourseandoutcomeofpregnancyrecords(pregnant0.5daysto18.5daysgestation)fourgroupsofmaternalweightgainincreased;thenumberoflitterdelivery;deliverytime.Result1metabolismofeachoffspringrats,wedetectedtherepresentativemetabolicindexes,bloodsugarandbloodlipidineachgroupatfourthand8weeksofpubertyandsexualmaturityrespectively.Theresultsshowedthattherewereabnormalglucosemetabolismatthefourthweekandthe8week,andthelevelofbloodsugarincreasedobviously,andreachedthediagnosticstandardofdiabetesmellitusAbnormallyelevatedserumlipidsreachedthediagnosticcriteriaforhyperlipidemia,Itisworthnotingthattheoffspringofratswithnormalcontrolgrouphavehigherbodyweightinadditiontothestagesofgrowthanddevelopmentduringthedayofbirth.2inthefourgroup,atotalof97casesofanimalmodel,doubleparenttobaccoexposuregrouphad5cases,singlefemalepregnancytobaccoexposuregroupandsingleparentbeforetobaccoexposuregroupwerefoundin2casesand3casesoflowerlimbmusclesinneonatalratswithabnormaldepositionoffat.3ratsineachgroupfourthweeksafterbirth,intestinalmicrobialexposuretotobaccogroup:DoubleparentoffspringgroupthanBacteroidesFirmicutesdecreasedtheproportioninverrucomicrobia(Verrucomicrobia)arapiddecreaseintheproportionofProteobacteria(Proteobacteria)abundanceincreased,withstatisticaldifferenceBiomarkerandProteobacteria(Proteobacteria).Ratsineachgroupeighthweeksafterbirthand4weeks:theintestinalmicrofloraofrats,comparedwithnormalcontrolgroup,theparentofdoubleexposuretotobaccogroup,simplegroupandsinglefemaleparenttobaccoexposureindexoftobaccoexposuregroupAlphadiversityaredeclining,theparentsdoubletobaccoexposuregroupwasthemostobvious,thisshowsthatthediversityofthesethreegroupsofspeciesisdecreased,theparentsdoubleexposuretotobaccogroupeven.4duringthegestationperiodoffourgroupsoffemalerats,wealsostudiedthegrowthanddevelopmentofthefourgroupsoffemaleratsat14.5daysgestation.Four8 Abstractgroupsoffetalratsappearedduringpregnancyanddifferencesinbodyweightof14.5days,theresultiscomparedwiththenormalcontrolgroup,theparentofdoubleexposuretotobaccogroupandsingleparenttobaccoexposuregroupfetalbodyweightdecreasedsignificantly,andtheonlymaletobaccoexposuregroupcomparedwiththenormalcontrolgroupdidnotshowsignificantweightloss.Comparedwiththenormalcontrolgroup,theparentsdoubletobaccoexposedgroupandthepurematernaltobaccoexposedgroupweresignificantlyincreasedinfirstweeks,secondweeksand3weeksafterbirth.Comparedwithnormalcontrolgroup,simplepaternalexposuretotobaccogroupratsfromfirstweekstosixthweeksbodyweightwassignificantlyreduced,thedifferencewasstatisticallysignificant,reflectingtheinfluenceofparentaltobaccoexposure,ratsineachgroupatdifferentgrowthfrombirthtoeighthweeksofchangestagesofpostnataldevelopment.5duringpregnancy,althoughparentsdoubleexposuretotobaccogroupweightgainduringpregnancydegreedecreased,litteramountwasalsoslightlyreduced,butthesechangeswerenotstatisticallysignificant,thefourgroupsoffemaleratsduringpregnancyandbirthweightincreasedthenumberofcloseto.Thefourgroupsofpregnantmicewerebasicallythesameinthenumberofdaysofproduction,allinthenormalproductionperiod(19-21days)production,anddidnotappearprematureoroverduebirthandotherabnormalities.Conclusion1.Earlylife,paternal,prepregnancyandmaternalpregnancy,whilecigaretteandtobaccoexposureinducedoffspringdiabetesinoffspring.2intheearlystageoflife,paternal,prenatalandmaternalpregnancycigarettesandtobaccoexposuremayaffectintestinalmicroflorainoffspringoffourthand8weeks,whichmayberelatedtodyslipidemiaandbloodglucosemetabolism.3theearlylifeofparentsexposedtotobaccodoesnotaffectthepregnancyrelatedindicators,suchasweightgainduringpregnancy,littersize,pregnancydaysandsoon4earlylifepaternalandmaternalprepregnancyandpregnancycigarettetobaccoexposureandsimplematernalpregnancycigarettetobaccoexposurecanleadtofetalratsinpregnancyandbirthweightdecreasedsignificantly,whileonlypaternalpre9 广州医科大学硕士学位论文exposuregrouphadnoobviouseffectonbodyweightinlatepregnancyonfetalratsoundshadow.Keywords:Cigarettesmokeconcentrate;Parentalexposure;growthanddevelopment;metabolicdisease：intestinalmicroorganismsDOHaD10 缩略词索引缩略词索引英文缩写英文全称中文全称CSCCigarettesmokeconcentrate香烟烟雾浓缩物PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应OGTTOralglucosetolerancetest口服葡萄糖耐量试验11 广州医科大学硕士学位论文前言如今越来越多的研究开始关注早期生命事件在人类晚期疾病风险产生中可[3]能扮演的角色。1989年，Barker对20世纪初出生于英国某郡的部分男性进行了调查，发现如果这些男性在出生时低体重及1周岁时体重低于正常标准那么成[4]年后死于缺血性心脏病的例数较多。1995年，Barker提出了“胎儿起源假说（thefetaloriginshypothesis，FOAD）”，认为妊娠中晚期如果胎儿发生营养[5]不良，会影响其生长发育，导致成年期易患冠状动脉粥样硬化性心脏病。FOAD假说逐渐发展，直到2003年，Barker在FOAD假说基础上提出了多哈理论。多哈（developmentaloriginsofhealthanddisease，DOHaD）即健康与疾病的发育起源，是近年来通过大量流行病学研究提出的关于人类疾病起源的新的医学概念。该理论强调，从形成受精卵开始到出生后2岁，生命个体基本完成了早期生命发育编程。除遗传和后期生活方式外，人类在生命早期（胎儿期、婴儿期、儿童期）这一关键阶段经历任何一种不良因素暴露，都可能影响胎儿，婴幼儿的发育可塑性，带来表型特点的改变即组织和器官在结构与功能上会发生永久性或程序性改变，最终导致将来一系列儿童期，成年期疾病的发育源性改变，包括代谢性疾病，心血管疾病，癌症，出生缺陷，精神行为异常等慢性非传染性疾病（慢[6,7]性病）的发生与发展。对多哈理论概念的重要支持来自于1944-1945年发生于荷兰饥荒的队列观察，该研究提示母亲孕期营养不良妊娠有持久的后果并影响后代成年后的健康，具体表现为暴露于母亲饥荒的后代成年后发生肾功能异常出[7]现蛋白尿。Tungalagsuvd等人的动物研究发现，大鼠产前宫内发育期出现营养不良情况，出生后会表现为促进食欲因子表达上调，在中年期对食物缺乏更加敏[8]感，这可能会增加在以后生活中患代谢性疾病的风险。Barker等人发现产妇在孕期如果出现蛋白质摄入受限可引起胎儿生长受限（FGR），在短期和长期均会影响胎儿的大脑发育，导致后代代谢系统，血液循环等出现异常，这可能促进在以[9,10]后的生活中代谢综合征的发生发展根据多哈理论的假说，在产前和产后发育的关键时期暴露于不利环境中，这其中包括生理及心理压力，暴露于各种毒物的环境之中（铅、砷、汞、双酚A、香烟烟雾），营养因素，母亲孕期患上妊娠期糖尿病，母亲在孕期不当使用抗生12 前言[11]素均可能会影响后代几年或数十年的健康，而其中因不利环境因素暴露影响后[12]代表型变化的可能机制之一为表观基因组的改变或重新修饰编程。表观遗传学是研究在没有DNA序列变化的情况下，引起基因表达可遗传性的改变。它能特异[13]性地调节相关组织的基因表达，从而诱导物质代谢长期的改变。DNA甲基化/去甲基化及组蛋白的共价修饰是主要的表观遗传修饰(epigeneticreprogramming)方式.在配子形成和早期胚胎发育中,其与基因组印记(genomicimprinting)、染色质结构重组(chromatinremodeling)、X-染色体失活(X-inactivation)的形成均有密切关系,它们的共同作用机制是调节基因的表达。表观遗传修饰至少发生在两个关键时期--配子形成期和植入前胚胎,如果在此期[14]间发生异常,则会影响早期胚胎发育，导致胚胎的死亡及生后各种疾病的发生。具体机制为，两个表观遗传再编程事件所形成的表观遗传修饰可能参与了胚胎形成及胎儿发育这两个过程。第一次表观遗传修饰表观发生在配子形成过程中，此时，大部分DNA甲基化信息被擦除并重建。第二次发生在受精时，在父本的绝大多DNA甲基化标记被删除后，母本的甲基化信息也被删除，在胚胎植入期间新的DNA甲基化信息重建，因而发生在孕期的暴露可能会影响到孕妇本身，妊娠第4到12周发育中的胚胎或胎儿。在这些关键时间如果受到不利因素的干扰，可能会导致组织结构和功能的不可逆转的变化（例如，改变细胞类型，数量和功能）。这些变化可以体现在以后的生活中，调节人的生理功能和对疾病的易感性[15]。另一个可能的机制为宫内发育期如果受到不利环境的暴露可能会导致miRNA的表达水平发生变化，进而引起生理功能的变化，导致一系列疾病的发生。Herberth等人发现脐带血中miRNA-223水平升高与新生儿出生时T细胞水平下降相关，这又与发展特应性皮炎发病风险上升相关[16]。异常的miRNA的表达可以引起心血管疾病（如冠状动脉疾病，心脏缺血性损伤，动脉粥样硬化，高血[17]压），代谢综合征及老化。第三个可能的机制为异常的组蛋白修饰。组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、[18]ADP核糖基化等修饰的过程。异常的组蛋白修饰也可引发代谢性疾病。炎症和氧化应激似乎也发挥了作用.Sen等人在他们的研究中发现在怀孕前和怀孕期间暴露于西方式高脂饮食可以改变氧化还原状态，导致轻度氧化应激。这种状态在孕期及后代生命早期持续存在，这一时期也是脂肪形成的关键阶段，而应用抗氧13 广州医科大学硕士学位论文化剂后可逆转氧化应激反应，并完全防止后代的肥胖和葡萄糖不耐受的发展，这[19]表明氧化应激在肥胖的发展中起着重要的作用。生命早期有4个时期可能是远期疾病起源的敏感窗口，分别包括配子形成期，合子形成期，宫内发育期和青春发育期。配子形成期指的是人类精子与卵子的形成期。表观遗传修饰对哺乳动物的早期胚胎发育和出生行为起非常关键的作用。配子不完全表观遗传修饰会导致胚胎的发育异常，早期流产，出生后的遗传表型[20]异常。合子形成期即植入前胚胎阶段，介于卵子受精后与胚胎植入前阶段。此时胚胎已经形成了一个囊胚，内层为胚胎内细胞团，外层为上皮细胞滋养层。植入前胚胎已证明对不良环境因素暴露十分敏感，这可能与后代出生后心血管系统功能障碍，代谢异常密切相关[21]。一系列的动物模型证明，通过饮食或体外培养影响植入前环境会对产后表型产生不利影响[22]。宫内发育期即胚胎种植在子宫后到出生前的阶段。多哈理论提出在宫内发育期如果受到不良因素的影响，导致后代可能会出现儿童期或成年期疾病[6,7]。青春发育期指的是青少年11到16岁这一阶段，该时期也同样影响成年后的健康状况。Steven等人发现青春期体重增加过多可能会导致成年期肥胖的发生[23]。目前在生命早期众多不良暴露中，烟草是子代生命早期重要及常见的不良暴露因素。据世界卫生组织（WHO）估计全球吸烟人数有近10亿，目前观点认为在[24]未来二十五年内这一数字将上升至16亿。每年大约有600万人死于烟草暴露，[25]这其中超过60万人因被动吸烟将过早死亡。烟草成分十分复杂，香烟烟雾含有7000多种化学物质其中包括69种已证明的致癌物。烟草烟雾在燃烧过程中可产生的有害物质包括苯，致癌物甲醛，芘，一氧化碳和氰化物丙烯醛及放射性致[26]癌物质钋。本次实验研究中使用的香烟烟雾浓缩物（CSC）中含有多环芳香烃（PAHs），芳族胺，N-亚硝基化合物等有害物质。主动或被动吸烟可引起众多疾病，呼吸系统疾病，心血管疾病如高血压及动脉粥样硬化疾病，代谢性疾病如糖尿病。在生命早期父本单方面烟草暴露对后代生长发育及代谢的危害。在生长发育方面，动物实验表明，CSC暴露的雄鼠精子数量减少,运动能力及受精能力下降，[27][28]流产率增加。胎鼠出生后体重降低和头臀长度变短，出生后的仔鼠个头小。在代谢方面，父亲受孕前长期吸烟或可导致男性后代出生后出现超重及肥胖。最14 前言近的流行病学结果表明父亲吸烟可将慢性疾病遗传给下一代,后代出现内分泌紊[29]乱，肥胖，患上代谢性疾病甚至心理障碍，癌症的发生概率可能会增加。尽管引起后代疾病的机制尚不明确，但一些研究认为香烟代谢产物使青春期前睾丸精原细胞生产过程中发生表观遗传的变化。这一变化可能通过精子传递给下一代使[30]之发生表型变化导致疾病的发生。在生命早期母本单方面孕期烟草暴露对后代生长发育及代谢的危害。除了男性吸烟外，据2010年进行的全球烟草情况调查指出我国成年女性吸烟率为2.1%，全国成年女性吸烟人数约为1017.1万，吸烟率及吸烟人数呈现逐年增长趋势。此外女性二手烟暴露问题突出。全国大于15岁的成人女性非吸烟者二手烟暴露率为71.6%，大约40.7%的女性几乎每天都遭受二手烟暴露。而我国女性孕期的二手烟暴露情况更加突出。据2008年调查，女性孕期二手烟暴露率为31.4%，[31]39.2%孕妇的配偶吸烟时未回避引起被动吸烟。对后代生长发育影响：众所周知孕妇在怀孕期间吸烟是一个公认的是危险因素，可导致孕期流产，围产儿死[32]亡率增高，低出生体重儿、早产，胎儿宫内发育受限。2008年的一项研究表明，在英国和威尔士出生的3759个婴儿非染色体先天异常中，与母亲孕期吸烟导致的5种最常见出生缺陷有：心脏缺陷/心血管系统疾病（27%），四肢异常（22%）[33]泌尿生殖系统疾病（11%），和唇腭裂。最新研究证实，女性孕期吸烟可导致后代出现超重甚至肥胖,女性孕期吸烟已成为儿童期肥胖的一个独立危险因素。另一些动物实验发现围产期暴露尼古丁对子代糖尿病病理生理过程的重要途径造[34]成破坏，包括减少胰岛β细胞体积和β细胞功能受损。在生命早期父母本双重烟草暴露对后代生长发育及代谢的危害。除了以上父本及母本烟草暴露分别引起子代发育及代谢异常外，有研究表明在生命早期父母[35]本双重烟草暴露情况下可能与儿童期超重风险增加密切相关。而儿童期的超重与肥胖往往与高血压、血管功能受损、血脂异常、动脉粥样硬化、代谢综合征、[36]2型糖尿病、全身炎症反应和氧化应激反应相关。Harrisetal.等人也发现[37]孕期父母同时吸烟的后代女性青春期和成年期的体重增加的风险上升。InoueS等人的研究发现孕期母亲单独吸烟的影响与低出生体重（LBW）、短身长和头围小相关，父亲单独吸烟与短身长、头围小有关，而如果父母亲在孕期同时吸烟可[38]能导致后代出生后身长进一步缩短。15 广州医科大学硕士学位论文根据大部分基于人类的流行病学调查的结果，我们发现人类在生命早期亲本烟草暴露的情况下会影响后代的生长发育，导致后代儿童期或成年期代谢性疾病如糖尿病的发生，那么人类究竟是生命早期的哪一个时期是引起后代代谢性疾病发生的敏感窗口期呢？我们选用C57小鼠通过利用香烟烟雾浓缩物（CSC）进行饲喂模拟人类男性从青春期起至性成熟期交配前单独重度吸烟（父本配子形成期），模拟人类女性在孕期单独主动或被动吸烟（宫内发育期），模拟人类男性从青春期起至性成熟期交配前重度吸烟同时人类女性在孕期主动或被动吸烟（父本配子形成期宫内发育期），成功地建立了生命早期亲本烟草暴露诱发子代胎源性糖尿病的动物模型，得出了在父本配子形成期烟草暴露叠加母本宫内发育期烟草暴露诱发了子代青少年期胎源性糖尿病，宫内发育期烟草暴露诱发成年期糖尿病的结论。同时也了解了生命早期亲本烟草暴露对妊娠过程和结局及后代生长发育产生的影响。16 材料和方法材料和方法1.实验材料1.1主要试剂试剂公司香烟烟草提取物中山大学基础医学院自制吕氏碱性美蓝染液上海晶旷生物科技有限公司EDTA,DMSO溶液Sigma公司50%葡萄糖溶剂（20毫升，10克）南京便诊生物科技有限公司OMEGA磁珠粪便DNA提取试剂盒(50)D4015-01北京雷根生物技术有限公司EX-TaqPCR扩增试剂宝生物工程(大连)有限公司饱和苦味酸溶液上海远慕生物科技有限公司甘油三酯（TG）测定试剂盒南京建成生物工程研究所总胆固醇测定试剂盒南京建成生物工程研究所1.2主要仪器和器材SHZIIID型多功能循环水系统St.LouisMissouriUSA1ml注射器康德莱公司恒温水浴箱Memmert公司酶标仪及生化分析仪BIO-RAD公司高速离心机eppendorf公司电泳凝胶成像系统BIO-RAD公司一次性采血针头欧姆龙公司血糖仪欧姆龙公司血糖仪试纸欧姆龙公司17 广州医科大学硕士学位论文玻璃点样毛细管0.9-1.1100mm华西医科大学仪器厂解剖显微镜Olympus公司倒置显微镜数码照相机NIKON公司-40冰箱海尔冰箱-80度冰箱Thermo公司超净工作台NUAIR公司移液器Eppendorf公司EP管Eppendorf公司电子称香山公司紫外分光光度计Thermo公司1.3一次性耗材：一次性枪头、棉签、盖玻片、防脱载玻片、去离子水、棉球及一次性手套等。2.实验对象及试剂配方1.1实验动物：使用SPF级雄性及雌性C57BL/6小鼠，均购买于广东省实验动物中心。1.2香烟烟雾浓缩物制备：使用SHZIIID型，多功能循环水系统获得的香烟烟雾浓缩物。SHZIIID型多用途循环水系统，具有滤瓶，其中包括100毫升二甲基亚砜（DMSO,Sigma），一根香烟完全燃烧后转化成香烟烟雾浓缩物，最终浓度为232.2mg/100mlDMSO.1.3香烟烟雾浓缩物饮用水：在常温饮用纯净水中添加实验室自制的浓度为232.2mg/100mlDMSO.，配置成2mg/ml的使用浓度。1.4对照组饮用水：常温饮用纯净水，不添加任何物质。1.518 材料和方法16SrRNAV4区域PCR反应体系（50ul）体系成份体积(ul)10XEXbuffer(Mg2+plus)5.0dNTPMIXTURE(各2.5mM)4.0引物967F(10uM)2.0引物1046R(10uM)2.0DNATemplate(<500ng)2.0TAKARAEX-Taq(5u/ul)0.5ddH2034.53实验技术流程图一ACSC处理C57交配成功雌鼠孕期正常喂养a记录四组仔野生型雄鼠子代出生后正鼠生长发育常喂养至8周正常2-6月龄C57指标野生型雌鼠b代谢指标检测交配成功从雌鼠孕0.5天BCSC处理C57c子代在第4起喂养CSC(2mg/mL)至孕野生型雄鼠18.5天子代出生后正周及第8周正常2-6月龄C57野生型雌鼠常喂养至8周的肠道微生至物分析测序d取各组仔C正常C57野生鼠下肢肌肉交配成功从雌鼠孕0.5天起喂养型雄鼠进行病理切正常2-6月龄C57CSC(2mg/mL)至18.5天子代出生后正片分析去寻野生型雌鼠常喂养至8周找有无脂肪细胞异常沉积。D正常C57野生交配成功雌鼠孕期正常喂养e以上结果进型雄鼠行统计学分正常2-6月龄C57子代出生后正析野生型雌鼠常喂养至8周19 广州医科大学硕士学位论文实验技术流程图一说明：A组从4周起C57野生型雄鼠饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至第8周同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配受孕后正常喂养至孕18.5天换单笼正常喂养；B从4周起C57野生型雄鼠饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至第8周起同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配，从雌鼠受孕0.5天起饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至孕18.5天换单笼正常饲养；C组8周龄以上正常饲养的C57野生型雄鼠同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配，从雌鼠受孕第0.5天起饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至孕18.5天换单笼正常饲养；D为对照组，8周龄以上正常饲养的C57野生型雄鼠同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配，受孕后正常喂养至孕18.5天换单笼正常饲养。将以上四组雌鼠在孕18.5天时再次称量体重并记录。用同一只雌鼠孕18.5天记录的体重数字减去孕0.5天体重即为此雌鼠整个孕期的体重增长并记录。E需要记录的数据：1记录四组仔鼠生长发育指标2血糖血脂代谢指标检测3子代鼠在第4周及第8周的肠道微生物分析测序4取各组仔鼠下肢肌肉进行病理切片分析去寻找有无脂肪细胞异常沉积。F以上结果进行统计学分析20 材料和方法实验技术流程图二ACSC处理C57交配成功雌鼠孕期正常喂养至孕14.5天野生型雄鼠正常2-6月龄C57野生型雌鼠处死各组孕14.5天雌交配成功从雌鼠孕0.5天起喂养BCSC处理C57鼠，对雌鼠腹部进行解CSC(2mg/mL)至孕14.5天野生型雄鼠剖，用剪刀剪开羊膜囊，正常2-6月龄C57野生型雌用镊子分离出胚胎及胎鼠盘，观察其发育情况有无异常畸形，用吸水纸C正常C57野生吸干后准确称取胎儿体交配成功从雌鼠孕0.5天起喂养型雄鼠重，用标尺标记胚胎组CSC(2mg/mL)至孕14.5天正常2-6月龄织大小，并用相机拍摄C57野生型雌鼠后存档。将各组胎鼠数据进行统计学分析。D正常C57野生型雄鼠正常2-6月龄C57野生型雌鼠交配成功雌鼠孕期正常喂养至孕14.5天21 广州医科大学硕士学位论文实验技术流程图二说明A组从4周起C57野生型雄鼠饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至第8周同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配受孕后正常喂养至孕14.5天处死孕鼠，解剖取胎鼠；B组从4周起C57野生型雄鼠饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至第8周起同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配，从雌鼠受孕0.5天起饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至孕14.5天处死孕鼠，解剖取胎鼠；C组8周龄以上正常饲养的C57野生型雄鼠同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配，从雌鼠受孕第0.5天起饲喂香烟烟草浓缩物(2mg/mL，隔天换一次)至孕14.5天处死孕鼠，解剖取胎鼠；D组为对照组，8周龄以上正常饲养的C57野生型雄鼠同2-6月龄成年C57野生型雌鼠进行交配，受孕后正常喂养至孕14.5天处死孕鼠，解剖取胎鼠。E处死各组孕14.5天雌鼠，对雌鼠腹部进行解剖，用剪刀剪开羊膜囊，用镊子分离出胚胎及胎盘，观察其发育情况有无异常畸形，用吸水纸吸干后准确称取胎儿体重，用标尺标记胚胎组织大小，并用相机拍摄后存档。将各组胎鼠数进行统计学分析。4实验方法4.1实验动物饲养参与实验的C57BL/6I野生型小鼠周龄相仿，体重接近。所有小鼠购买于广东省动物中心均是SPF级，购买后在SPF级饲养室同室分宠饲养，并至少适应性喂养一周后才开始各类动物实验。动物饲养室具有12小时昼/12小时夜循环温度控制的无病原体设施，环境温度22-26摄氏度，温度40-60%。给小鼠打耳标记以防混乱。方法为抓取小鼠，用耳标钳在接近小鼠耳朵根部打入带有数字编号的耳标标记，同时根据数字编号进行记录。食物为SPF级紫外线灭菌高级配方饲料，自由饮食，每周固定时间更换垫料清洗笼具，定期清毒，灭菌饲养室。4.2雄鼠的分组C57BL/6野生型雄鼠从4周起进行分组，一组为喂香烟烟雾浓缩物水（2mg/ml）记为CSC组，另一组C57BL/6野生型雄鼠喂常温纯净水作为对照组。将上述两组雄鼠饲养至8周后同2-6月龄C57BL/6野生型雌鼠交配。22 材料和方法4.3孕鼠模型的建立上述实验步骤中重要的一步需要精确把握交配时间及交配后雌鼠的妊娠天数，故我们采用雌鼠阴道涂片法确定雌鼠发情期再将其与实验用雄鼠按1：1比例合笼配种。具体方法如下：当日下午约17时左右进入动物饲养房，从鼠笼中挑选出C57野生型雌鼠，用棉签放入装有去离子水的玻璃瓶润湿，提起鼠尾将雌鼠从鼠笼中拿出，使雌鼠前部两爪抓住笼架，再次提起雌鼠使其后部朝上充分暴露阴道口，用湿棉签轻轻插入其阴道慢慢旋转后将棉签拿出，将取好的雌鼠阴道分泌物涂到准备好的载玻片上，滴上吕氏碱性美蓝染液充分覆盖，静置15分钟后用清水冲洗，盖上盖玻片放显微镜下观察，若观察到几乎全是无核角质化细胞（镜下观察到此细胞形态似落叶）则判定为发情期，将处于发情的雌鼠于18时按1：1比例合笼。第二日清晨8时至9时肉眼见于雌鼠阴道口处见淡黄色阴道栓则判定为已受孕，记为孕0.5天；若未见阴道栓，用20微升枪头吸取生理盐水注入雌鼠阴道内来回冲洗，再将冲洗液放到载玻片上，盖上盖玻片放显微镜下观察，若镜下观察到活动的雄鼠精子也判定为受孕，记为孕0.5天。称量雌鼠孕0.5天体重并记录。Nikon10倍显微镜下发情期阴道涂片Nikon40倍显微镜下发情期阴道涂片23 广州医科大学硕士学位论文肉眼可见雌鼠交配后阴道栓Nikon40倍显微镜下可见雄鼠精子4.4实验设计分组实验组一：如上流程图一及说明实验组二：如上流程图二及说明24 材料和方法4.5仔鼠的饲养和处理记录出生当天的每窝仔鼠数量，取出每窝仔鼠的三分之一备用。将全部新生仔鼠用备好的称重称，在称上铺上消毒纸巾，打开称重称开关置零，将新生仔鼠用消毒纸巾包好放置到称重称上称重，读取数值并记录，用消毒棉签沾取饱和苦味酸溶液，仔鼠背面朝上，在四爪及尾巴上涂色，实验标记方法如下：1左上爪6左上爪+尾巴11左下爪+右下爪2右上爪7右上爪+尾巴12左上爪+右下爪3左下爪8左下爪+尾巴13左下爪+右上爪4右下爪9右下爪+尾巴14左上爪+右上爪+左下爪5尾巴10左上爪+右上爪15左上爪+右上爪+右下爪子代：耳标ID号（孕鼠）+数字（胎儿），实验完毕后，用消毒纸巾包好仔鼠轻轻放回鼠笼，每日观察有无掉色情况，若出现掉色及时涂上苦味酸溶液进行补色，4周后对仔鼠进行雌鼠分笼并按打耳标方法重新标记仔鼠，将所有仔鼠饲养至8周龄。每周固定时间准确称取仔鼠体重并记录。仔鼠饮用常温纯净水，食物为SPF级紫外线灭菌高级配方饲料，自由饮食，定期更换垫料清洗笼具，定期清毒，灭菌饲养室。4.6孕14.5天孕鼠解剖胎鼠取样4.6.1孕14.5天孕鼠解剖：将孕鼠腹部朝上四肢固定于解剖台上，用酒精棉球消毒孕鼠皮肤后，用剪刀逐层剪开腹部皮肤，皮下筋膜，肌肉等暴露腹腔，肉眼可见胎鼠，剪刀剪开羊膜囊，用镊子分离出胚胎及胎盘，用吸水纸吸干附着于胎鼠皮肤上液体，观察其发育情况有无异常畸形，准确称取胎鼠体重记录，用标尺标记胚胎组织及胎盘大小，并用相机拍摄后存档。将胎鼠及胎盘装入EP管中-80度保存。，4.7仔鼠第4周及第8周眼眶取血取分离血清检测血脂4.7.1仔鼠眼眶取血分离血清4.7.1.1将仔鼠按压在鼠笼上，拇+中+食指固定住头部25 广州医科大学硕士学位论文4.7.1.2紧握颈部，压迫颈两侧，使眼突出，眶后静脉丛充血4.7.1.3右手持毛细管从眼内侧与鼠面呈45度夹角旋转刺入4.7.1.4固定鼠体，压住鼠后肢放松手指调整毛细管流畅出血，取血量约50微升入准备好的EP管中。4.7.1.5取血完成，立即除去颈部压力将采血器拔出，用消毒棉球按轻压小鼠眼球部止血4.7.1.6将血样摇匀，防止凝血溶血，将血样放入离心机中在4条件下4000rpm离心20分钟，吸取分离后的上层血清放入-80度冰箱冻存。4.7.2利用ELISA试剂盒检测仔鼠血清甘油三酯及总胆固醇4.7.2.1从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需96孔板，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃冰箱。4.7.2.2．空白孔加蒸馏水2.5ul和工作液250ul稀释，标准孔加入2.26mmol/l校准品及和工作液250ul稀释，其余相应孔中加标本和工作液250ul稀释，用封板胶纸封住反应孔，全部混匀后37℃孵箱孵育10分钟。4.7.2.3打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。主波长510nm，空白孔加蒸馏水2.5ul和工作液250ul设置调零。读取数据并记录。4.7.2.4结果判定：每个工作液和标本的OD值应减去空白孔的OD值。利用EXCEL表格绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。线性0-9.04mmol/l范围内，r2》0.995.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。4.8各组仔鼠第4周及第8周各取肠道粪便提取基因组DNA，PCR扩增测序4.8.1动物实验及样品处理：将上述四组各4及8周龄C57仔鼠在无菌条件下收集肛门排出新鲜粪便各200mg，装入2mlEP管中-80度冰箱冻存备用.4.8.2肠道粪便基因组总DNA提取：对收集的粪便样品，应用OMEGAE.Z.N.AStoolDNAKit(50)D4015-01试剂盒，严格按说明书要求提取粪便基因组总DNA，使用NANODROP2000检测肠道总DNA浓度，提取所得的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否存在目的片段DNA.若检测发现有RNA残留，向溶液中加入适量RNA酶去除RNA.26 材料和方法4.8.3实验之前准备：1.5ml离心管2ml离心管；无水乙醇；冰离心管盒；常温离心管座；制冰；ElutionBuffer需60-70℃预热。所需仪器：高速离心机；70℃水浴锅；漩涡振荡器；计时器；制冰机；移液枪1ml200µL20µL；实验步骤：a.加80mL(96%-100%)无水乙醇至DNAWashBuffer中以稀释b.在2ml离心管（自备）中装200mg粪便样品。冰上预冷c.样品融化之前迅速加1800µLBufferSP1，漩涡最大速度震荡5min直至粪便样品完全均匀d.添加500µLBufferSP2。通过漩涡震荡10s使样品混合充分。冰上孵育5mine.将混合液在室温下全速（≥13000g）离心3分钟f.将1.4ml清澈的上清液转移到新的2ml离心管中，加200µLHTRReagent。g.室温孵化2minh.将混合液在室温下全速（≥13000g）离心2分钟，目的是使抑制剂吸收HTR成颗粒状i.将600ul上清液转移到新的2ml离心管中，加入20ulproteinaseK(20mg/ml)漩涡混匀j.添加600ulBLBuffer漩涡10秒混匀k.在70℃水浴锅温育10分钟，在温育期间漩涡2次以充分混合，快速离心去除管壁上的残留液滴l.加入600ul无水乙醇漩涡10秒充分混匀，快速离心去除管壁上的残留液滴m.加入600ul混合液（12步骤）到装在2mlconectingtube的HIBINDDNACOLUMN中，在室温下全速（≥13000g）离心1分钟，丢弃过滤液及收集管n.将HIBIND装入新的2ml收集管中，加入（l.步骤）中600ul样品，重复此步骤o.再次加入600ul样品溶液重复（l.步骤）p.将COLUMN放入新的2ml收集管中，加入500ulHBBuffer洗涤，室温下全速（≥13000g）离心1分钟，丢弃过滤液及收集管q.将HIBINDDNACOLUMN放入新的收集管中，加入750ulDNAWash27 广州医科大学硕士学位论文Buffer入COLUMN中，室温下全速（≥13000g）离心1分钟，丢弃过滤液，将COLUMN重新放入空的收集管中r.室温下全速（≥13000g）离心2分钟以甩干COLUMN以去除无水乙醇对下一步的干扰s.将COLUMN放入干净的1.5ml离心管中，向每个HIBINDmatrix中加入200ul提前预热（60-70℃）ElutionBuffer，在室温下静置2分钟，全速（≥13000g）离心1分钟洗提出DNAt.釆用紫外分光光度计分别检测肠道基因组总DNA在260nm和280nm两处的吸光度,得到总DNA的浓度和OD260/OD280的比值，若该比值在1.6-1.8之间说明样品的DNA的纯度较高无蛋白质和RNA污染，若比值<1.6说明有蛋白质污染，若比值在1.8-2.0之间说明有RNA污染u.检测DNA纯度：琼脂糖凝胶电泳法。称取0.60g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入60ml1ⅹTAE缓冲液，保鲜膜封口，置微波炉加热至完全澄清透明取出摇匀，加EB显色替代物，倒入槽凝固呈胶。DNA样品与10Xloadingbuffer混匀后点样，跑胶，紫外灯下观察条带4.8.416SrRNA基因扩增：⑴引物设计：按细菌16SrRNA基因V4区，合成带有barcode的特异引物测序区域引物名称引物序列V4:515F和806R515FＡＹＴＧＧＧＹＤＴＡＡＡＧＮＧ806RＴＡＣＮＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ(2)PCR反应参数a初始变性：94℃2minb94℃30s，57℃30s，72℃30s(共25个循环)c72℃10min4℃hold(3)PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。（4）文库构建和上机测序使用TruSeq®DNAPCR-FreeSamplePreparation28 材料和方法Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用HiSeq2500PE250进行上机测序。（5）信息分析部分1测序数据处理根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据（RawTags）；拼接得到的RawTags，需要经过严格的过滤处理[18]得到高质量的Tags数据（CleanTags）。参照Qiime的Tags质量控制流程，进行如下操作：a）Tags截取：将RawTags从连续低质量值（默认质量阈值为<=19）碱基数达到设定长度（默认长度值为3）的第一个低质量碱基位点截断；b）Tags长度过滤：Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过与数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据（EffectiveTags）。2OTU聚类和物种注释利用Uparse软件对所有样品的全部EffectiveTags进行聚类，默认以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为OTUs（OperationalTaxonomicUnits），同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs代表序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8~1），获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom（界），phylum（门），class（纲），order（目），family（科），genus（属），species（种）统计各样本的群落组成。使用MUSCLE软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后对各样品的数据进行均一化处理，以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。3样品复杂度分析（AlphaDiversity）使用Qiime软件计算Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage，PD_whole_tree指数，使用R软件（Version2.15.3）绘制稀释曲线，Rankabundance曲线，物种累积曲线并使用R软件进行Alpha多样性指数组间差异分析；Alpha多样性指数组间差异分29 广州医科大学硕士学位论文析会分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。4多样品比较分析（BetaDiversity）用Qiime软件（Version1.7.0）计算Unifrac距离、构建UPGMA样品聚类树。使用R软件（Version2.15.3）绘制PCA，PCoA和NMDS图。PCA分析使用R软件的ade4包和ggplot2软件包，PCoA分析使用R软件的WGCNA，stats和ggplot2软件包，NMDS分析使用R软件的vegan软件包。使用R软件进行Beta多样性指数组间差异分析，分别进行有参数检验和非参数检验，如果只有两组，选用T-test和wilcox检验，如果多于两组，选用的是Tukey检验和agricolae包的wilcox检验。LEfSe分析使用LEfSe软件，默认设置LDAScore的筛选值为4。Metastats分析使用R软件在各分类水平（Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species）下，做组间的permutationtest，得到p值，然后利用BenjaminiandHochbergFalseDiscoveryRate方法对于p值进行修正，得到q值[Anosim，MRPP和Adonis分析分别使用Rvegan包的anosim函数，mrpp函数和adonis函数。AMOVA分析使用mothur软件amova函数。组间差异显著的物种分析利用R软件做组间T_test检验并作图。4.9仔鼠第4周及第8周行尾静脉采血OGTT试验4.9.1禁食将上述四组各4及8周龄C57仔鼠于实验前一晚约21时起禁食，自由饮水至第二日清晨约9时共计12小时4.9.2尾静脉采血用小鼠固定器固定C57仔鼠，充分暴露其尾部，用消毒棉球消毒并拭干，找准小鼠尾静脉，用1ml注射器在尾静脉近心端刺入，用注射器回吸见血后吸取约0.1ml尾静脉血，将血糖试纸插入血糖仪，将尾静脉血滴入血糖试纸凹槽处，约5秒后准确读取小鼠空腹血糖值并记录。4.9.3腹腔注射葡萄糖溶液行OGTT实验[39]以小鼠每公斤体重2g/kg对四组4周龄及8周龄仔鼠进行腹腔葡萄糖溶液的注射，并记录未注射葡萄糖前空腹，注射葡萄糖后30分钟，60分钟，90分钟及120分钟的血糖值并记录。OGTT实验完成后，用消毒棉球按压尾静脉出血点，待出血停止后将C57仔鼠往回鼠笼，返回动物饲养室继续饲养。30 材料和方法5.0四组仔鼠出生当日取下肢肌肉组织标本行病理组织切片查找脂肪细胞5.1将四组新生鼠下肢肌肉组织标本浸泡10%福尔马林室温复溶固定5.2、自动组织脱水机处理标本处理步骤处理时间二甲苯（TO）2h75%乙醇1h85%乙醇1h95%乙醇I、II、III各1h无水乙醇I、II、III各1h二甲苯I、II各1h石蜡I30min石蜡II60mim石蜡III1h5.3、包埋①在进行石蜡包埋时，先将熔化的石蜡倒入包埋模具，而后用加温的镊子将浸蜡的组织放入。②待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将包埋模具移入冷水中加速凝固。③从包埋模具中取出凝固的蜡块，修整，以备切片。5.4、切片5.5苏木素-伊红（HE）染色（一）HE染色原理即是苏木精-伊红染色法。石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。易于被碱性或酸性染料着色的性质分别称为嗜碱性和嗜酸性；若于两种染料的亲和力都不强，则称中性。一般的组织变化和组织产物都可以通过这一染色法显示出来。是形态学最常用的染色方法。直到目前为止，病理组织学的基本知识，绝大多数都是从观察HE染色标本中得来，在质量较佳的HE染色切片上，各种组织或细胞的一般形态结特点都可以观察到。（二）染色步骤1、石蜡切片脱蜡至水二甲苯脱蜡2次，每次10分钟。依次经100%，95%，85%，75%酒精各1次，每次5分钟。2、自来水冲洗，一般不超过10min3、苏木精染核3-5min4、自来水冲洗1min5、用1%盐酸酒精分化30s6、流水冲洗，返蓝7、伊红染液染色20s-5min8、自来水洗30s7、常规脱水，从85%、95%乙醇1min，无水乙醇I/II各一次2min31 广州医科大学硕士学位论文8、苯酚-TO溶液透明9、二甲苯I、II各2min9、中性树胶封片（三）染色结果细胞核呈蓝色，细胞质、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。5.1统计学分析所有统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行分析，实验结果采用均数±标准差表示。单因素方差分析（one-wayANOVA）用于组间比较。方差齐时采用最小显著差异法，方差不齐时采用Games-Howell法。采用F检验，P<0.05或P<0.01时有统计学意义。32 结果结果1香烟烟雾浓缩物父本暴露及母本暴露对孕鼠整个孕期体重增加，生产天数及产仔数的影响。如下表1所示，在四组孕鼠孕期增重方面可以看到亲本双重烟草暴露组及单纯父本烟草暴露组同正常对照组相比，首先，孕期增重的程度有所下降（♂X♀组14.31±1.90；CSC♂XCSC♀组14.24±3.28；CSC♂X♀组13.83±1.81），单纯母本烟草暴露组同正常对照组相比孕期增重有所上升（♂X♀组14.31±1.90，♂XCSC♀15.52±3.49）。再次，窝胎数量（♂X♀7.25±1.03；CSC♂XCSC♀6.33±2.60；CSC♂X♀6.75±1.03）也有略有减少，但没有统计学意义。而且单纯母本烟草暴露组同正常对照组相比在孕期增重及生产的窝胎数方面无明显差异。四组孕鼠在生产天数方面基本一致，均在正常生产期内生产，未出现早产或过期产的情况。表1.孕鼠孕期增重及生产一般情况记录表每组孕鼠的实验分组孕期增重（g）生产时天数窝胎数(只)数量（只）♂X♀814.31±1.9019.62±0.357.25±1.03CSC♂XCSC♀1214.24±3.2819.50±0.426.33±2.60♂XCSC♀915.52±3.4919.50±0.507.44±2.00CSC♂X♀813.83±1.8119.50±0.006.75±1.03方差齐（P0.05)*<0.052香烟烟雾浓缩物父本暴露及母本暴露对孕14.5天胎鼠体重及生长发育的影响如下表2所示，在母鼠孕14.5天胎鼠体重比较方面，同正常对照组相比，亲本双重烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组的体重明显下降（♂X♀组0.440±0.128；CSC♂XCSC♀组0.248±0.993；♂XCSC♀组0.204±0.1159）P<0.05，差异有统计学意义。而单纯父本烟草暴露组同正常对照组相比体重无明显差异。33 广州医科大学硕士学位论文表2.孕14.5天胎鼠的体重实验分组每组胎鼠数量（只）孕14.5D胎鼠体重（g）♂X♀390.440±0.128CSC♂XCSC♀270.248±0.993*无♂XCSC♀340.204±0.1159*CSC♂X♀300.429±0.0785#p方差齐（P0.05)*<0.05与♂X♀相比#>0.05与♂X♀相比图1为CSC♂XCSC♀组孕14.5天胎鼠及胎盘形态照片图2为CSC♂ⅹ♀组孕14.5天胎鼠及胎盘形态照片34 结果图3为CSC♂ⅹCSC♀组孕14.5天胎鼠及胎盘形态照片图4为♂ⅹ♀组孕14.5天胎鼠及胎盘形态照片3香烟烟雾浓缩物父本暴露及母本暴露对仔鼠从出生起至生长到8周龄体重的影响分组情况：♂X♀组共计仔鼠26只，CSC♂XCSC♀组共计仔鼠25只，CSC♂X♀组共计仔鼠19只，♂XCSC♀组共计仔鼠19只。如下表3及仔鼠图5生长曲线图所示，从0周龄即仔鼠新生当天称新生鼠体重可见相比于正常对照组，亲本双重烟草暴露组，单纯母本烟草暴露组及单纯父本烟草暴露组的出生体重明显下降（♂X♀组1.36±0.01；CSC♂XCSC♀组1.25±0.08；♂XCSC♀组1.22±0.08CSC♂X♀组1.27±0.13）P<0.05，差异有统计学意义。亲本双重烟草暴露组，单纯母本烟草暴露组同正常对照组在仔鼠出生后第1周龄，第2周龄及第3周龄体重明显增大。（第1周龄♂X♀组3.20±0.33；CSC♂XCSC♀组3.79±0.37；♂XCSC♀组3.82±0.49；第2周龄♂X♀组5.90±0.74；CSC♂XCSC♀组6.33±0.52；♂XCSC♀组6.54±0.66：第3周龄♂X♀组7.43±0.60；CSC♂XCSC♀组7.93±0.88；♂XCSC♀组8.38±0.89）P<0.05，差异有统计学意义。而同正常对照组相比，单35 广州医科大学硕士学位论文纯父本烟草暴露组仔鼠从第1周龄起至第6周龄体重明显减轻（♂X♀组：第1周龄3.20±0.33第2周龄5.90±0.74第3周龄7.43±0.60第4周龄12.73±1.18第5周龄16.06±1.10第6周龄18.22±2.03；CSC♂X♀组：第1周龄3.06±0.63第2周龄5.25±0.95第3周龄6.42±1.07第4周龄9.47±2.21第5周龄13.53±2.42第6周龄16.56±2.79）P<0.05，差异有统计学意义。36 结果表3.各组仔鼠从出生至第8周龄体重1周龄体2周龄体3周龄体4周龄体5周龄体重6周龄体重7周龄体8周龄体实验分组0周龄体重（g）重（g）重（g）重（g）重（g）（g）（g）重（g）重（g）♂X♀1.36±0.013.20±0.335.90±0.747.43±0.6012.73±1.1816.06±1.1018.22±2.0319.62±2.5220.77±2.79♂XCSC♀1.22±0.08*3.82±0.49*6.54±0.66*8.38±0.89*13.24±0.7816.70±1.2018.70±2.0220.08±2.6021.00±2.95CSC♂XCSC♀1.25±0.08*3.79±0.37*6.33±0.52*7.93±0.88*13.14±1.0316.71±1.2718.91±2.2520.18±2.4921.27±2.84CSC♂X♀1.27±0.13*3.06±0.635.25±0.95*6.42±1.07*9.47±2.21*13.53±2.42*16.56±2.79*18.25±2.8719.42±2.99方差齐（P0.05)*<0.0537 广州医科大学硕士学位论文C57mousegrowthcurve252015*thgie*w10♂X♀*CSC♂XCSC♀**♂XCSC♀CSC♂X♀5****00246810week注：C57小鼠体重均为克（g）图5各组C57仔鼠生长曲线4香烟烟雾浓缩物父本暴露及母本暴露对各组仔鼠出生第4和第8周龄血糖代谢的影响分组情况：4周仔鼠共36只仔鼠，♂X♀组共11只，CSC♂ⅹCSC♀组共8只，♂ⅹCSC♀组共9只，计为，CSC♂ⅹ♀组共8只。对第4周龄血糖代谢的影响：见表4及图6。同正常对照组相比，亲本双重烟草暴露组的血糖水平在腹腔注射50%葡萄糖溶液后第30min,60min,90min,120min出现明显升高（CSC♂XCSC♀组：第30min19.10±3.00;第60min15.02±2.55；第120min9.13±1.83），其中第30min及第60min血糖值大于11.1mmol/L达到了糖尿病的诊断标准，并出现了血糖峰值后延的情况（120min血糖值大于7.8mmol/L）。正常对照组，单纯性父本烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组血糖代谢无异常。38 结果分组情况：8周仔鼠共收集40只，♂X♀组共1只，CSC♂ⅹCSC♀组共11只，♂ⅹCSC♀组共10只，CSC♂ⅹ♀组共9只。对第8周龄血糖代谢的影响：见表5及图7。同正常对照组相比，亲本双重烟草暴露组的血糖水平在腹腔注射50%葡萄糖溶液后第30min,60min,90min及120min出现明显升高（CSC♂XCSC♀组：第30min22.20±4.99;第60min16.40±4.78；第90min12.56±3.22；第120min9.02±1.94）。其中第30min及第60min血糖值大于11.1mmol/L达到了糖尿病的诊断标准，并出现了血糖峰值后延的情况（120min血糖值大于7.8mmol/L）。P<0.05，差异有统计学意义。单纯母源性暴露组同正常对照组相比在腹腔注射50%葡萄糖溶液后第30min及90min出现血糖升高情况（♂XCSC♀组：第30min15.45±4.80第90min9.87±1.92）其中第30min血糖值大于11.1mmol/L达到了糖尿病的诊断标准，P<0.05，差异有统计学意义。单纯性父本烟草暴露组及正常对照组仔鼠相比未出现血糖代谢异常情况。表4各组仔鼠第4周龄行OGTT检测血糖代谢情况（注：血糖单位mmol/L）实验分组0min30min60min90min120min♂X♀6.11±0.889.95±2.118.54±1.937.30±1.206.22±0.99CSC♂XCSC♀5.07±0.68*19.10±3.00*15.02±2.55*11.77±3.62*9.13±1.83*♂XCSC♀6.02±1.059.92±1.518.55±2.786.37±1.835.89±0.79CSC♂X♀5.15±0.90*10.42±2.319.02±1.717.03±1.395.99±1.59方差齐（P0.05)*<0.05注：OGTT实验诊断糖尿病标准：空腹静脉血浆血糖≥7.0mmol/L服糖后血糖水平急剧升高，峰时后延（120min血糖值大于7.8mmol/L）且峰值（第30及第[1]60min）血糖值超过11.1mmol/L39 广州医科大学硕士学位论文表5各组仔鼠第8周龄行OGTT检测血糖代谢情况（注：血糖单位mmol/L）实验分组0min30min60min90min120min♂X♀5.63±1.0011.35±3.598.64±1.237.72±1.436.96±1.98CSC♂XCSC♀6.28±1.2722.20±4.99*16.40±4.78*12.56±3.22*9.02±1.94*♂XCSC♀6.30±1.6215.45±4.80*11.07±2.599.87±1.92*8.14±1.74CSC♂X♀5.51±1.4914.21±4.069.47±1.247.70±0.906.25±1.32方差齐（P0.05)*<0.05注：OGTT实验诊断糖尿病标准：空腹静脉血浆血糖≥7.0mmol/L服糖后血糖水平急剧升高，峰时后延（第120min血糖值大于7.8mmol/L）且峰值（第30及[1]第60min）血糖值超过11.1mmol/L4W-OGTT25*♂X♀)20CSC♂XCSCL/l*♂XCSC♀o*m15CSC♂X♀m(ra*g10usdoo5lb00306090120150T(min)图6.各组C57小鼠4周龄行OGTT检测血糖结果40 结果8W-OGTT30*♂X♀CSC♂XCSC)L/*l♂XCSC♀o20*mCSC♂X♀*m(r*agus10*doolb00306090120150T(min)图7.各组C57小鼠8周龄行OGTT检测血糖结果5香烟烟雾浓缩物父本暴露及本暴露对各组仔鼠出生第4和第8周龄血脂代谢的影响4及8周仔鼠甘油三酯分组情况：♂X♀组共29个样品，CSC♂ⅹCSC♀组共25个样品，♂ⅹCSC♀组共20个样品，计为，CSC♂ⅹ♀组共20个样品。4周及8周仔鼠总胆固醇分组情况：♂X♀组共22个样品，CSC♂ⅹCSC♀组共18个样品，♂ⅹCSC♀组共21个样品，计为，CSC♂ⅹ♀组共18个样品。如表6所示，同正常对照组相比亲本双重烟草暴露组的第4周及第8周血脂水平明显升高，已达到高脂血症的诊断标准。具体表现为甘油三酯及总胆固醇水平均明显升高（CSC♂XCSC♀组第4周及第8周甘油三酯值分别为2.52±1.62，2.52±1.04；第4周及第8周总胆固醇分别为（5.23±0.66，5.17±1.00），P<0.05，差异有统计学意义。单纯母本烟草暴露组同正常对照组相比第4周及第8周甘油三酯及总胆固醇水平均明显升高（♂XCSC♀组第4周及第8周甘油三酯值分别为1.58±0.79，1.84±0.43第4周及第8周总胆固醇分别为5.03±0.56，4.81±0.44）P<0.05，差异有统计学意义。但该组血脂水平虽在正常范围内升高但未达到高脂41 广州医科大学硕士学位论文血症的诊断标准。单纯父本烟草暴露组血脂水平均在正常范围内，同正常对照组相比无明显差异。表6各组仔鼠第4周龄及第8周龄检测血脂代谢情况实验分组4周甘油三酯8周甘油三酯4周总胆固醇8周总胆固醇♂X♀0.84±0.431.08±0.304.35±0.654.25±0.43CSC♂XCSC♀2.52±1.62*2.52±1.04*5.17±1.00*5.23±0.66*♂XCSC♀1.58±0.79*1.84±0.43*5.03±0.56*4.81±0.44*CSC♂X♀1.16±0.541.11±0.363.80±1.014.15±0.65方差齐（P0.05)*<0.05与♂X♀相比（注：甘油三酯及总胆固醇单位mmol/L）高脂血症的诊断标准：空腹血清胆固醇(TC)>6.2mmol/L甘油三脂(TG)>2.28mmol/L[2]。6香烟烟雾浓缩物父本暴露及母本暴露对各组仔鼠出生第4和第8周肠道微生物菌群的影响第4周4组仔鼠肠道粪便提取基因组DNA，PCR扩增测序结果检测参数基因组DNA---胶浓度：1%电压：100v电泳时间：40minPCR产物------胶浓度：2%电压：80v电泳时间：40min图8肠道基因组DNA扩增产物电泳图注:图中“标”为标准品，上样5μL(10ng/μL)；M1为15Kmarker，上样2μL；白色数字为样本序列号，原液上样2μL42 结果图9PCR产物扩增产物电泳图注:图中M1为100bpladder，上样2μL；白色数字为样本序列号，上样3μL第8周4组仔鼠肠道粪便提取基因组DNA，PCR扩增测序结果图10肠道基因组DNA扩增产物电泳图注:图中“标”为标准品，上样5μL(10ng/μL)；M1为15Kmarker，上样2μ白色数字为样本序列号，原液上样2μL图11PCR产物扩增产物电泳图注:图中M1为100bpladder，上样2μL；白色数字为样本序列号，上样3μL43 广州医科大学硕士学位论文6.1四组4周仔鼠肠道菌群相对丰度门水平影响4周仔鼠共收集36个样品，其中♂X♀组共11个样品，计为group1.1，CSC♂ⅹCSC♀组共8个样品，计为group1.2，♂ⅹCSC♀组共9个样品，计为group1.3，CSC♂ⅹ♀组共8个样品，计为group1.4。肠道菌群主要有9个门的菌群，其中98%的细菌可归于以下四个：拟杆菌群，厚壁菌群，变形菌群及放线菌群。根据物种注释结果，选取每组在门分类水平（Phylum）上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各组样品在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。门水平物种相对丰度柱形图为例展示如下：由下图7及表7可知，四组共计36个样品序列主要集中在拟杆菌门（Bacteroidetes），厚壁菌门（Firmicutes）及变形菌门（Proteobacteria）。在拟杆菌门（Bacteroidetes）方面，同♂X♀组相比（0.565112），CSC♂ⅹCSC♀组比例有所下降（0.520342），而♂ⅹCSC♀组（0.690721）及CSC♂ⅹ♀（0.709703）组比例明显上升；厚壁菌门（Firmicutes）方面，同♂X♀组（0.257697）相比，♂ⅹCSC♀组（0.149211）及CSC♂ⅹ♀组（0.128517）比例明显下降；在变形菌门（Proteobacteria）方面，同♂X♀组（0.124996）相比，CSC♂ⅹCSC♀组（0.197727）比例上升。在放线菌门（Actinobacteria）方面，同♂X♀组相比（0.000902），CSC♂ⅹCSC♀组（0.001135），♂ⅹCSC♀组（0.001171）及CSC♂ⅹ♀（0.001393）组比例均上升。值得注意的是同♂X♀组（2.1929）相比，CSC♂ⅹCSC♀组拟杆菌门比厚壁菌门比例（0.21175）下降。CSC♂ⅹ♀组较其他三组在疣微菌门(Verrucomicrobia)比例是增加的（0.037947）。而CSC♂ⅹCSC♀组在疣微菌门(Verrucomicrobia)比例是急剧下降的（0.000597）。44 结果图12门水平上的物种相对丰度柱形图表7门水平上的物种相对丰度比例表Taxonomygroup1.1group1.2group1.3group1.4Bacteroidetes0.5651120.5203420.6907210.709703Firmicutes0.2576970.2457680.1492110.128517Proteobacteria0.1249960.1977270.1012950.095222Tenericutes0.0277790.009040.0216430.015141Verrucomicrobia0.0050240.0005970.0187010.037947Deferribacteres0.0154660.0170340.0125470.008803Cyanobacteria0.0013880.0048880.002410.002454Saccharibacteria0.0011960.0018090.0009080.000671Actinobacteria0.0009020.0011350.0011710.001393Fusobacteria0.0000070.0000140.000002045 广州医科大学硕士学位论文6.2四组4周仔鼠肠道菌群在门水平组间差异的物种为了研究组间具有显著性差异的物种，从不同层级的物种丰度表出发，利用MetaStat方法对组间的物种丰度数据进行假设检验得到p值，通过对p值的校正，得到q值；最后根据q值筛选具有显著性差异的物种，并绘制差异物种在组间的丰度分布箱图（展示门水平具显著差异top12的物种）。展示结果见下图。图13组间物种显著性差异统计图46 结果图14组间物种显著性差异统计图注：图中，横轴为样品分组；纵向为对应物种的相对丰度。横线代表具有显著性差异的两个分组，没有则表示此物种在两个分组间不存在差异。“＊”表示两组间差异显著（qvalue<0.05），“＊＊”表示两组间差异极显著（qvalue<0.01）。从图13中我们可以看出相较于其他三组CSC♂ⅹCSC♀组在变形菌门（Proteobacteria）丰度数是增加的，图14中可以看出相对于其他两组，CSC♂ⅹ♀组在疣微菌门(Verrucomicrobia)丰度数是增加的，上述结果具有统计学意义。6.3四组4周仔鼠肠道菌群组间多样性的生物学标志物和统计分析LEfSe(LDAEffectSize)分析能够在组与组之间寻找具有统计学差异的Biomarker，即组间差异显著的物种。LEfSe是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件。包括基因，代谢和分类，用于区别两个或两个以上生物条件（或者是类群）。该算法强调的是统计意义和生物相关性。让研究人员能够识别不同丰度的特征以及相关联的类别。LEfSe的统计结果是LDA值分布柱状图在不同组中丰度比较图。结果展示如下47 广州医科大学硕士学位论文图15LDA值分布柱状图说明：LDA值分布柱状图中展示了LDAScore大于设定值（默认设置为4）的物种，即组间具有统计学差异的Biomarker。展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小（即为LDAScore）由上图15可知♂ⅹ♀组中2种细菌丰度增加，分别是芽孢杆菌（Bacilli）（从纲到属）太平洋海洋杆菌（Oceanobacillus）（从属到种）。CSC♂ⅹCSC♀组变形菌门（Proteobacteria）增加，紫单胞菌科(Porphyromonadaceae),也增加。CSC♂ⅹ♀组疣微菌(Verrucomicrobia)（从门到科）增加，拟杆菌科24-7组(Bacteroidales_S24_7_group)增加，Akkermansia菌属增加。6.4四组8周仔鼠肠道菌群相对丰度门水平影响8周仔鼠共收集40个样品，其中♂X♀组共10个样品，计为group2.1，CSC♂ⅹCSC♀组共11个样品，计为group2.2，♂ⅹCSC♀组共10个样品，计为group2.3，CSC♂ⅹ♀组共9个样品，计为group2.4.肠道菌群主要有9个门的菌群，其中98%的细菌可归于以下四个：拟杆菌群，厚壁菌群，变形菌群及放线菌群。根据物种注释结果，选取每组在门分类水平（Phylum）上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，以便直观查看各组样品在不同分类水平上，相对丰度较高的物种及其比例。门水平物种相对丰度柱形图为例展示如48 结果下：由下图16及表8可知，四组共计40个样品序列主要集中在拟杆菌门（Bacteroidetes），厚壁菌门（Firmicutes）及变形菌门（Proteobacteria）。在拟杆菌门（Bacteroidetes）方面，同♂X♀组相比（0.542806），CSC♂ⅹCSC♀组（0.669984），♂ⅹCSC♀组（0.642937）及CSC♂ⅹ♀（0.589804）组比例有所上升；在厚壁菌门（Firmicutes），变形菌门（Proteobacteria）及放线菌门（Actinobacteria）方面，同♂X♀组相比，CSC♂ⅹCSC♀组，♂ⅹCSC♀组及CSC♂ⅹ♀组比例均有所下降；♂ⅹCSC♀组在疣微菌门（(Verrucomicrobia）较其他三组丰度明显升高（0.012136）。图16门水平上的物种相对丰度柱形图49 广州医科大学硕士学位论文表8门水平上的物种相对丰度比例表Taxonomygroup2.1group2.2group2.3group2.4Bacteroidetes0.5428060.6699840.6429370.589804Firmicutes0.3396410.2226730.2702150.287981Proteobacteria0.1059140.0909920.0667490.112054Verrucomicrobia0.000370.0078610.0121360.000171Deferribacteres0.0039340.0027290.0025080.002888Saccharibacteria0.0016310.0022140.0020560.001323Cyanobacteria0.001360.0010250.0009120.001361Tenericutes0.0021970.0015140.001870.002529Actinobacteria0.0011260.0007750.0004570.000997Spirochaetes0.000002000.0004426.5四组8周仔鼠肠道菌群组间多样性的生物学标志物和统计分析由下图17可知♂ⅹ♀组中2种细菌丰度增加，分别是芽孢杆菌（Bacilli）（纲）乳杆菌目（Lactobacillales）。♂ⅹCSC♀组梭菌（Clostridia）（从纲到目）增加，毛螺菌（Lachnospiraceae）（科）增加，毛螺菌NK4A136组（Lachnospiraceae_NK4A136_group）（属）。CSC♂ⅹ♀组乳酸链球菌(Streptococcaceae)（科）增加，乳球菌(Lactococcus)(属)增加，乳酸乳球菌（Lactococcus_piscium）（种）增加。图17LDA值分布柱状图6.6四组8周仔鼠肠道菌群Alpha多样性指数组间差异分析Alpha多样性指数组间差异分析中，箱形图可以直观的反应组内物种多样性的50 图18observed_species指数组间差异箱形图中位数、离散程度、最大值、最小值、异常值。同时，通过T-test检验，wilcox秩和检验和Tukey检验（只有2个分组时进行T-test和wilcox秩和检验，分组大于2时进行Tukey和wilcox秩和检验）分析组间物种多样性差异是否显著。以observed_species和shannon指数为例，其组间差异分析的箱形图如下图18observed_species指数组间差异箱形图51 广州医科大学硕士学位论文图19shannon指数组间差异箱形图由图13及14可以看出相较于♂ⅹ♀组，CSC♂ⅹCSC♀组，♂ⅹCSC♀组及CSC♂ⅹ♀组Alpha多样性指数均是下降的，其中以CSC♂ⅹCSC♀组最为明显，这说明这三组物种的多样性是下降的，以CSC♂ⅹCSC♀组为甚。7．四组仔鼠出生当日取下肢肌肉组织标本行病理组织切片查找脂肪细胞实验结果：97例共四组新生鼠下肢肌肉样本。其中CSC♂ⅹCSC♀组取样27个，♂ⅹ♀组25个，♂ⅹCSC♀组22个，CSC♂ⅹ♀组23个。97例标本中可见皮肤、肌肉组织，软骨组织和骨组织。97例标本中有10例在下肢肌肉组织中可见少量脂肪细胞。CSC♂ⅹCSC♀组5个，♂ⅹCSC♀组2个，CSC♂ⅹ♀组3个，♂ⅹ♀组0个。从形态学上观察，10例（阳性）脂肪细胞分化未见明显差异。典型图片见下图20，21，22。52 图22脂肪细胞高倍图20脂肪细胞低倍图21脂肪细胞低倍图22脂肪细胞高倍53 广州医科大学硕士学位论文讨论从我们的研究结果中看出，首先在雌鼠妊娠期间，虽然亲本双重烟草暴露组雌鼠孕期增重的程度有所下降，产仔数量也略有减少，但这些变化并没有统计学意义，四组雌鼠妊娠期间体重增加及产仔数量基本接近。四组孕鼠在生产天数方面基本一致，均在正常生产期（19-21天）内生产，并未出现早产或过期产等异常妊娠情况。这说明在本次研究中在生命早期的任何时期，烟草暴露都未对母鼠妊娠过程及结局有影响。众所周知，第一和二手香烟烟雾含有数以千计的有害成分，包括多种致癌物质和具有细胞毒性能导致体内慢性炎症反应的化学物质[40]。香烟是一种最常见的致畸因素，怀孕期间香烟烟雾暴露可引起产科并发症[41]。香烟中的主要成分尼古丁很容易穿过胎盘。研究表明，尼古丁在羊水、胎儿血清和胎盘中的含量比相应母体血清含量高[42]。其对胎盘和胎儿细胞的增殖和分化有直接影响，增加流产的风险，胎儿生长受限（FGR）死胎、早产和胎盘早剥的发生率明显增高。引起FGR的具体机制可能是尼古丁抑制活性氨基酸（AA）致使人胎盘绒毛和滋养细胞侵袭力下降，而香烟中的镉可以抑制11β-羟基类固醇脱氢酶2型的表达和活性，[43]该物质与FGR的发生密切相关。四组雌鼠妊娠期间，我们针对亲本烟草暴露是否导致FGR的产生也进行了研究。了解了四组雌鼠孕14.5天时胎鼠生长发育的情况。结果表现为不同组胎鼠体重方面的差异。同正常对照组相比，亲本双重烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组的胎鼠体重明显下降，而单纯父本烟草暴露组同正常对照组相比未出现体重明显减轻的情况。证实了宫内发育期亲本烟草暴露确实可引起FGR。人类的流行病学研究表明产妇吸烟显着相关后代出生体重和长度，但父亲吸烟不是。具体表现为母亲吸烟影响与新生儿低出生体重（LBW）、短身长和头围小有关，而父亲吸烟则与新生儿身长短小和头围小有关，而如果父母同时吸烟也会明显的降低新生儿出生体重以及导致新生儿身长短小，父亲和母体因素[44]对胎儿出生体重的影响较大，但母体因素贡献较大。母本烟草暴露组新生鼠的出生体重偏低结果也再一次证实了之前关于这方面的研究，亲本双重烟草暴露组新生鼠及单纯父本烟草暴露组也出现了出生体重降低的情况，这可能说明了父本在配子形成期及宫内发育期烟草暴露均可能导致新生儿出生体重过低，与研究相54 讨论[44]符，但其中的涉及的机制我们仍不太清楚。值得注意的是，同正常对照组仔鼠相比从出生后第1周起至出生后第3周，亲本双重烟草暴露组及单纯母本烟草暴露组仔鼠体重明显增加，表明出了上述两组仔鼠出生后解除了环境中不利因素暴露后的出现了生长追赶效应。生长追赶效应指的是因病理因素导致生长迟缓的儿[45]童在去除这些因素后出现的生长加速现象。本次研究中出现了幼儿期近青春期生长加速现象可能与仔鼠出生后去除了烟草暴露环境有关。大部分足月小于胎[46]龄儿存在生长追赶，其快速的生长追赶与成年期的代谢综合征密切相关，这或许可以解释亲本双重烟草暴露组诱发子代青少年期及成年期糖尿病及单纯母本烟草暴露组诱发子代成年期糖尿病的原因。而同正常对照组相比，单纯父本烟草暴露组仔鼠从第1周龄起至第6周龄体重明显减轻，差异有统计学意义，但英国的研究人员发现，小于11岁开始吸烟的男性，成年后生育超重男性后裔的风险较高。这与我们的实验结果不太相符。流行病学研究表明，在宫内和婴儿期的暴露于不良环境可以造成整个人生的肥胖和代谢障碍[47]。孕妇孕前体重、孕期体重增加、怀孕期间吸烟和抑郁都与儿童早期及成年肥胖有关[48]，父母吸烟与儿童和青少年BMI值较高相关[49]。但引起肥胖的机制未明确。我们分别在各组仔鼠相当于青春期及性成熟期的第4周及第8周检测了较为有代表性的代谢指标血糖及血脂的。结果表明亲本双重烟草暴露组的仔鼠在青春期及成年期出现了糖代谢异常，血糖水平明显升高，达到了糖尿病的诊断标准。血脂异常升高，达到了高脂血症的诊断标准。单纯母本烟草暴露组的仔鼠在成年期血糖水平升高也达到了糖尿病的诊断标准。这说明在宫内发育期烟草暴露可以诱发子代成年期糖尿病，而亲本双重烟草暴露引起了青少年期的糖尿病，说明父本在配子形成期的烟草暴露叠加宫内发育期烟草暴露是引发青春期糖尿病的机制之一。人的肠道是一个丰富的微生态系统,含有100万亿多的微生物,种类多达500～1000个,这些微生物的基因总数是人体基因组所含基因总数的100倍。肠道不仅是人体消化吸收的重要场所，同时也是最大的免疫器官，寄居在人体肠道内的微生物被统称为肠道微生物菌群。人体肠道微生物组是人体最庞大而复杂的微生物群落，也是人体的一个重要的代谢“器官”。人体肠道微生物不仅帮助人[50]类摄取营养物质与能量，在维持正常免疫防御功能中发挥着极其重要的作用。55 广州医科大学硕士学位论文认识肠道微生物是阐明其与人体健康和疾病关系的第一步。肠道菌群作为调控人体健康的重要组成部分，分属6大菌门：壁厚菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)，构成包括拟杆菌属(Bacteroides)、真杆菌属(Eubacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacteri-um)、消化链球菌属(Peptostreptoccocus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、瘤胃球菌属(Ｒ[51]uminococcus)、梭菌属(Clostridium)和乳杆菌属(Lactobacillus)。研究表明人体肠道菌群失调在代谢性疾病如肥胖的发生发展中起着重要作用。肠道微生物丛的组成种类和数量与宿主的肥胖有关。人类T2DM和肥胖以胰岛素抵抗为特征,而肠道菌群与宿主间在调节能量平衡代谢方面存在着密切联系，超重或肥胖者肠道菌群往往发生菌群比例失调，其中拟杆菌门／厚壁菌门的比例较之密切相关，[52]表现为比例下降。许多人类的研究表明，肥胖的人类表现为低丰度肠道拟杆菌[53,54]门和高丰度的厚壁菌门，并伴有细菌多样性的减少。肠道中的双歧杆菌似乎在宿主的代谢中起重要作用。在小鼠实验中，进食了高脂食物后，小鼠肠道出现[55]了双歧杆菌丰度减少，活性降低，小鼠进而出现了体脂增加及胰岛素抵抗。Hildebrandt等人在将常规野生型小鼠从标准饮食切换到高脂肪饮食时，发现常规野生型鼠变得肥胖，肠道菌群中变形菌门、厚壁菌门和放线菌门比例增加，拟[56]杆菌门比例减少。而个体肠道微生物具有特异的代谢效能，而微生物构成的特定特征可能诱发肥胖。Bao等人也发现，随着饲喂高脂饲料时间的增加，小鼠的体重、血清甘油三酯，以及总胆固醇的含量与正常对照组相比均明显增加，肠道内乳杆菌属和双歧杆菌属的数量明显降低，拟杆菌门呈递增趋势且平缓，而梭菌[57,58]属呈递增趋势，且相对于拟杆菌门变化较大。而Akkermansia作为益生菌能减轻小鼠肥胖相关的代谢紊乱，从而提高粘液层厚度、肠屏障。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，乳酸链球菌(Streptococcuslactis),二者均属于球菌。食用后在人体的生理pH条件和α—胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不[59]会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题。毛螺菌在肠道中较早被发现，含量丰富，其中一部分菌种含有丁酸激酶可促进丁酸的产生，影响其他细菌和宿主上皮细胞的生长，这可能与２型糖尿病、直肠癌有相关性56 讨论[60]。Li等人对C57小鼠进行的动物实验中发现同高脂喂养的小鼠相比，高纤维素喂养的小鼠体重正常，其肠道微生物的研究发现拟杆菌门比例上升，而疣微菌[61]门比例下降。为了明确亲本烟草暴露诱发子代糖尿病导致血脂及血糖异常是否与仔鼠肠道微生物菌群变化相关，我们分别收集四组仔鼠粪便提取基因组DNA，进行16SV4测序。本研究中对四周仔鼠微生物进行分析发现CSC♂ⅹCSC♀组同♂X♀组（2.1929）相比，CSC♂ⅹCSC♀组拟杆菌门比厚壁菌门比例（0.21175）下降，在疣微菌门(Verrucomicrobia)比例是急剧下降的（0.000597）。CSC♂ⅹCSC♀组变形菌门（Proteobacteria）丰度增加，具有统计学差异的Biomarker也是变形菌门（Proteobacteria）。这与之前研究发现的出现肥胖及导致2型糖尿病的肠道微生物研究结果较一致，这可能解释了CSC♂ⅹCSC♀组仔鼠体重异常增加及血脂血糖代谢异常的原因。CSC♂ⅹ♀组较其他三组在疣微菌门(Verrucomicrobia)比例是增加的（0.037947）。CSC♂ⅹ♀组在疣微菌门(Verrucomicrobia)丰度数是增加的，具有统计学差异的Biomarker也是疣微菌(Verrucomicrobia)（从门到科）增加，拟杆菌科24-7组。(Bacteroidales_S24_7_group)增加，Akkermansia菌属增加。上述结果具有统计学意义，该结果可能说明了CSC♂ⅹ♀组在前4周生长过程中体重较正常组偏低，以及血糖血脂未出现异常的原因。♂ⅹCSC♀组仅发现同正常对照组相比，放线菌门（Actinobacteria）方面比例有所增加，但拟杆菌门比厚壁菌门比例上升，是否放线菌门（Actinobacteria）丰度比例增加是导致♂ⅹCSC♀组体重增加及糖代谢异常的主要因素有待进一步实验证实。与4周仔鼠不同的是，同正常对照组相比♂X♀组相比，CSC♂ⅹCSC♀组，♂ⅹCSC♀组及CSC♂ⅹ♀组拟杆菌门比厚壁菌门比例下降比例均有所上升；变形菌门（Proteobacteria）及放线菌门（Actinobacteria）方面，CSC♂ⅹCSC♀组，♂ⅹCSC♀组及CSC♂ⅹ♀组比例均有所下降；CSC♂ⅹCSC♀组，♂ⅹCSC♀组及CSC♂ⅹ♀组Alpha多样性指数均是下降的，其中以CSC♂ⅹCSC♀组最为明显，这说明这三组物种的多样性是下降的，以CSC♂ⅹCSC♀组为甚。在具有统计学差异的Biomarker方面，♂ⅹCSC♀组梭菌（Clostridia）（从纲到目）增加，毛螺菌（Lachnospiraceae）（科）增加，毛螺菌NK4A136组（Lachnospiraceae_NK4A136_group）（属）。故我们推测CSC♂ⅹCSC♀组的血脂增加血糖代谢异常可能与物种的多样性明显下57 广州医科大学硕士学位论文降相关，而♂ⅹCSC♀组血糖代谢异常可能与梭菌及毛螺菌增加相关。4周仔鼠肠道微生物在具有统计学差异的Biomarker方面，♂ⅹ♀组中2种细菌丰度增加，分别是芽孢杆菌（Bacilli）（从纲到属）太平洋海洋杆菌（Oceanobacillus）（从属到种）。8周仔鼠肠道微生物在具有统计学差异的Biomarker方面，♂ⅹ♀组中2种细菌丰度增加，分别是芽孢杆菌（Bacilli）（纲）乳杆菌目（Lactobacillales）。能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收，而太平洋海洋杆菌属属于芽孢杆菌纲的一种，作用相似。而乳杆菌目属于芽孢杆菌纲，乳杆菌属于乳酸菌的一种，它通过产生有机酸、细菌素、过氧化氢和双乙酰等多种抑菌物质，促进营养物质吸收等多种功能，能改善调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，作用于人类可以改善胃肠道菌群,增加肠动力,降低血脂[60]。故我们推测上述几种细菌在维持4周及8周仔鼠血脂血糖代谢正常方面可能发挥了主要的作用。脂肪异位沉积(ectopicdepositionoflipids)是指血清游离脂肪酸产生过多,超过了组织的氧化能力,从脂肪组织中溢出过多的血清游离脂肪酸转向非脂肪细胞,例如肝脏、心脏、骨骼肌以及胰岛β细胞等。血清游离脂肪酸在[62]这些非脂肪细胞内再被酯化为甘油三酯,堆积在细胞质内。2型糖尿病(T2DM)发生的两个重要环节是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍。近年来的研究表明,血清游离脂肪酸升高以及甘油三酯在非脂肪组织,例如肝脏、骨骼肌、心脏中的异位沉积与这两个环节密切相关。人们发现在肌细胞内,脂质含量与胰岛素抵抗之间呈明显正相关,这提示了肌细胞内脂质沉积可能干扰了胰岛素作用通路中的分子环节,从而使胰岛素作用受到阻碍,糖代谢紊乱[63]加重。肌肉是葡萄糖代谢的主要组织,大约有75%胰岛素刺激的葡萄糖的吸收在肌肉中进行。Kuhlmann等人对雄性肥胖大鼠与实验同期的正常大鼠进行骨骼肌内甘油三酯含量沉积的比较,结果显示,肥胖大鼠骨骼肌内甘油三酯[64]含量明显高于正常组,而胰岛素敏感性低于正常组。目前,认为在骨骼肌中明确表达脂滴相关蛋白有周脂素、亲脂素等,这些脂滴相关蛋白的表达增多可能通过降低糖耐量,增加胰岛素抵抗,从而加重脂质在骨骼肌内的沉积。大量甘油三酯的在骨骼肌内沉积能增加脂质过氧化物的形成,导致线粒体的损伤,进一步降低脂肪酸的氧化能力,从而进一步加剧甘油三酯在骨骼58 结论肌细胞内的沉积,加重胰岛素抵抗,从而反过来加重骨骼肌内的脂肪异位沉[65]积,形成恶性循环。本次研究中我们也发现了在血糖代谢异常的CSC♂ⅹCSC♀组，♂ⅹCSC♀组出现了数量较少的骨骼肌内的脂肪异位沉积，而♂ⅹ♀组未出现骨骼肌内的脂肪异位沉积，代谢正常。这提示了CSC♂ⅹCSC♀组，♂ⅹCSC♀组骨骼肌内脂肪异位沉积可能与血糖代谢异常密切相关。结论1、宫内烟草暴露可以诱发成年期糖尿病；父本烟草暴露叠加后可以进一步诱发青少年期糖尿病。2、宫内烟草暴露导致子代青春期和成年期的糖脂代谢异常和肥胖相关的肠道微生物菌群发生改变，父本烟草暴露叠加后该类变化更为显著。3、亲本烟草暴露不影响孕期增重、产仔数、分娩期等妊娠基本指标，但是均会导致子代妊娠晚期和出生时体重显著性降低；同时宫内暴露的子代在幼年期和青春期有明显的生长追赶效应。4、亲本烟草暴露均对子代的糖脂代谢有不良影响，亲本双重暴露可能诱发子代胎源性糖尿病。59 广州医科大学硕士学位论文不足与展望不足：人类大量流行病学研究表明，人类男性单独吸烟或女性单独在妊娠期间主动或被动的吸烟，及人类男性吸烟叠加女性妊娠期间主动或被动的吸烟与后代出生缺陷，出生体重过轻相关，对后代青春期成年期生长发育及代谢有负面影响。根据以上的研究我们设计了该动物实验以探究亲本烟草暴露对子代的确切影响，得出的实验结论也基本上符合人类流行病学研究的结果。但本次实验也存在着明显的不足之处，即生命早期亲本双重烟草暴露诱发子代青少年期胎源性糖尿病机制不清，需进一步研究明确。展望：首先，多哈理论使我们对疾病的预防和控制不再持一种线性思维和简单的因果推理。传统的基因组遗传并不能决定一切，在生命早期暴露于不利环境因素可通过表观遗传学机制同样对后代疾病的产生与发展有着巨大的影响。基于以上的认识我们可以对疾病的干预从成年期提前到儿童期，婴儿期甚至是围生期,使科学家们客观地确定、量化和评估能够修正导致成年不良结局的围生期环境的策略,使健康的育龄妇女孕育的胎儿在出生后能有健康的体魄和良好的生存质量。此外，在日常生活中除了常见的烟草暴露外，随着中国特别是华北地区的大气污染日益严重，人类亲本暴露于大气污染中，如可吸入微粒（ＰＭ10、ＰＭ2.5）、二氧化硫（ＳＯ２）、一氧化碳（ＣＯ）、氧化氮（ＮＯｘ）会对后代产生怎样的影响也值得我们进一步研究。60 参考文献参考文献[1]ReuschJEB,MansonJAE.ManagementofType2Diabetesin2017:GettingtoGoal[J].JAMA,2017.[2]GoAS,MozaffarianD,RogerVL,BenjaminEJ,BerryJD,BordenWB,BravataDM,DaiS,FordES,FoxCS,FrancoS,FullertonHJ,GillespieC,HailpernSM,HeitJA,HowardVJ,HuffmanMD,KisselaBM,KittnerSJ,LacklandDT,LichtmanJH,LisabethLD,MagidD,MarcusGM,MarelliA,MatcharDB,McGuireDK,MohlerER,MoyCS,MussolinoME,NicholG,PaynterNP,SchreinerPJ,SorliePD,SteinJ,TuranTN,ViraniSS,WongND,WooD,TurnerMB,o.b.o.t.A.H.A.S.C.a.S.S.SubcommitteeHeartDiseaseandStrokeStatistics–2013Update:AReportFromtheAmericanHeartAssociation.Circulation.2013;127:e6–e245.[3]BarkerDJ,OsmondC,GoldingJ,etal.Growthinutero,bloodpressureinchildhoodandadultlife,andmortalityfromcardiovasculardisease[J].BMJ,1989,298(6673):564-567.[4]BarkerDJ.Fetaloriginsofcoronaryheartdisease[J].BMJ,1995,311(6998):171-174.[5]YeungEH,RobledoC,BoghossianN,etal.DevelopmentalOriginsofCardiovascularDisease[J].CurrEpidemiolRep,2014,1(1):9-16.[6]KvehaugenAS,DechendR,RamstadHB,etal.Endothelialfunctionandcirculatingbiomarkersaredisturbedinwomenandchildrenafterpreeclampsia[J].Hypertension,2011,58(1):63-69.[7]PainterR.C.,RoseboomT.J.,vanMontfransG.A.,BossuytP.M.,KredietR.T.,OsmondC.,BarkerD.J.,BlekerO.P.MicroalbuminuriainadultsafterprenatalexposuretotheDutchfamine.J.Am.Soc.Nephrol.2005;16:189–194.doi:10.1681/ASN.2004060474[8]Tungalagsuvd,MatsuzakiIwasa,Munkhzaya,Yiliyasi,Kawami,Kato,KuwaharaIraharaTheexpressionoforexigenicandanorexigenicfactorsinmiddle-agedfemaleratsthathadbeensubjectedtoprenatalundernutrition.IntJDevNeurosci.2016Apr;49:1-5.doi:10.1016/j.ijdevneu.2015.12.002.Epub2015Dec15[9]D.J.Barker,J.G.Eriksson,T.Forsén,C.OsmondFetaloriginsofadultdisease:strengthofeffectsandbiologicalbasisInt.J.Epidemiol.,31(2002),pp.1235–123961 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广州医科大学硕士学位论文Felderb,AndrewCusumanob,KelleH.Moley(M.D)b,∗PaternalexposuretocigarettesmokecondensateleadstoreproductivesequelaeanddevelopmentalabnormalitiesintheoffspringofmiceReproductiveToxicology65(2016)283–294[31]中国疾病预防控制中心.2010全球成人烟草流行病学调查中国报告［Ｒ］．北京:中国三峡出版社，2011．[32]KallenK.Roleofmaternalsmokingandmaternalreproductivehistoryintheetiologyofhypospadiasintheoffspring.Teratology2002;66:185–191[33]OfficeforNationalStatistics(NationalCongenitalAnomalySystem).Congenitalanomalystatistics:notificationsEnglandandWales2008(seriesMB3no.23);2010.[34]MamtaBehl,1,2DeepaRao,3KjerstiAagaard,4TerryL.Davidson,5EdwardD.Levin,6TheodoreA.Slotkin,7SupriyaSrinivasan,8DavidWallinga,9MorrisF.White,10VickieR.Walker,11KristinaA.Thayer,11andAlisonC.Holloway12EvaluationoftheAssociationbetweenMaternalSmoking,ChildhoodObesity,andMetabolicDisorders:ANationalToxicologyProgramWorkshopReviewEnvironHealthPerspect.2013Feb;121(2):170–180.[35]DurmuşB,HeppeDH,TaalHR,ManniesingR,RaatH,HofmanA,etal.Parentalsmokingduringpregnancyandtotalandabdominalfatdistributioninschool-agechildren:theGenerationRStudy.IntJObes.2014;38:966–972.doi:10.1038/ijo.2014.9.[36]HalesC.N.,BarkerD.J.,ClarkP.M.,CoxL.J.,FallC.,OsmondC.,WinterP.D.Fetalandinfantgrowthandimpairedglucosetoleranceatage64.BMJ.1991;303:1019–1022.doi:10.1136/bmj.303.6809.1019.[37]HarrisHR,WillettWC,MichelsKB(2013)Parentalsmokingduringpregnancyandriskofoverweightandobesityinthedaughter.IntJObes(Lond)37:1356–1363[38]InoueS1,NaruseH2,YorifujiT3,KatoT4,MurakoshiT5,DoiH6,SubramanianSV7.Impactofmaternalandpaternalsmokingonbirthoutcomes.JPublicHealth(Oxf).2016May24.pii:fdw050.[Epubaheadofprint][39]PaulHA1,BomhofMR2,VogelHJ1,3,ReimerRA1,2Diet-inducedchangesinmaternalgutmicrobiotaandmetabolomicprofilesinfluenceprogrammingofoffspringobesityriskinrats.SciRep.2016Feb12;6:20683.doi:10.1038/srep20683.64 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参考文献resistance:alongitudinalinvivo1H-spectroscopicstudyinZuckerdiabeticfattyrats[J].Diabetes,2003,52(1):138-144.[64]龚艳琳陆付耳董慧胰岛素抵抗与脂肪异位沉积中西医结合研究2010年6月第2卷第3期1674-4616(2010)03-0144-04[65]BarkerD.J.,OsmondC.Infantmortality,childhoodnutrition,andischaemicheartdiseaseinenglandandwales.Lancet.1986;1:1077–1081.doi:10.1016/S0140-6736(86)91340-1.67 广州医科大学硕士学位论文综述父源性效应诱发子代代谢性疾病机制的研究进展目前在全世界范围内，约有14.6亿成年男性，超过1700万不满18岁的未成年人出现超重及肥胖。在发达国家，男性超重甚至肥胖的比例已高达70%，而这一比例还在不断增加。人类肥胖主要与遗传背景和环境因素之间复杂的相互作用有关。肥胖对人类的健康危害现已经十分明确，可引起心血管疾病，糖尿病及中风等[1]。值得注意的是女性孕期肥胖会增加后代患慢性疾病的风险。来自人类及动物实验的研究表明女性孕期肥胖会造成子代肥胖，患上糖尿病，高血压等疾病，并增加心血管病症的危险[2,3]。尽管女性孕前及孕期肥胖等不利因素导致后代患上代谢性疾病的观点现在得到普遍认同，但近年来日渐增多的人类流行病学及动物实验研究发现父亲健康状况同样与子代健康密切相关。受孕前人类或雄性动物暴露于具有干扰其内分泌功能的毒物，或者电离辐射及处于不良的营养水平或肥胖及年龄因素均可能影响下代的健康状况，改变后代代谢机制，引起代谢性疾病[4]，称为父源性效应。例如Miller等人研究发现人类高龄男性后代患上精神疾病（孤独症，抑郁狂躁型忧郁症，精神分裂症等）概率增加,[5,6,7]，更易患上某些癌症[8,9,10]。NorthstoneK等人发现同女性孕期肥胖会造成子代肥胖相似，父亲受孕前长期吸烟或身体处于肥胖状态也可导致男性后代出生后出现超重及肥胖。动物模型也表明，雄性动物出现肥胖对后代造成的负面影响包括肥胖、代谢综合征的风险增加和不孕[11,12]。传统观点认为遗传疾病的发生与父母本基因组DNA改变密不可分，但越来越多的研究证实子代疾病的发生机制并没涉及到基因组遗传物质的改变，而是父方受环境因素影响通过配子介导的表观遗传学改变将变化遗传给子代，导致子代表型发生变化进而引起如代谢性疾病及癌症等疾病的发生[13,14]。这其中涉及的表观遗传学机制包括影响配子印记基因表达，干扰配子DNA甲基化及小RNA表达变异等。在发育过程中，表观遗传学机制广泛参与了基因表达调控，它们发生在精子接触卵母细胞的过程中，并通过早期胚胎发育持续到胎儿发育和产后。研究父源性效应诱发子代代谢性疾病机制有着重要的临床及科学意义，随着研究的进一步加深，父源性效应诱发子代代谢性疾病68 综述的研究有了更深层次的进展，本文将围绕前述机制展开综述。1父源性效应通过影响印记基因表达诱发子代代谢性疾病印记基因是指有性繁殖生物中包括哺乳动物在内的父系和母系等位基因的不平等表达[15]，其特征是亲本来源相关的单等位基因表达。印记基因一直备受关注因为他们违背了一个中心假设孟德尔遗传，即双亲基因组可以看作是平等的。在配子中，印记基因的功能性单倍体状态由差异甲基化区域控制[16,17]。原始生殖细胞受精前会经历一个几乎完整的表观遗传擦除过程，随后会以印记基因DNA甲基化模式进行重新编程[18]。在精子形成期间，差异甲基化区域中的印记基因进行正常甲基化标识是必不可少的，如果发生了异常甲基化可能会导致不育及子代某些慢性疾病的发生。而父本的不正常的内分泌状态、营养低下、或不佳生活状态能增强代际遗传的表观遗传异常[19]。例如，参与人类早期生长调控的印记基因有MEST,PEG3,NNAT等，这些印记基因中的一个或几个出现基因表达下调可能与脂肪细胞增大，肥胖或多种肿瘤发生有关[20]。在已经进行的小鼠模型实验中发现，印记基因MEST启动子发生去甲基化可能会导致该基因的过度表达，引起后代脂肪细胞的肥大以及增强与糖尿病相关基因的表达。除了雄性父本动物，在肥胖雄性动物的后代中同时发现了印记基因NNAT的低甲基化表达，这与脂肪细胞和代谢调节及儿童期肥胖密切相关[21,22]。ASoubryt等人对人类进行的研究中也发现，肥胖父亲的新生儿其印记基因MEST，PEG3及NNAT等存在基因低甲基化情况，这与肥胖母亲的新生儿情况不相同，肥胖母亲的新生儿存在印记基因PLAGL1甲基化程度增加及印记基因MEG甲基化程度下降的情况[23]。等位基因表达模式的一个特点是有一些印记基因来自于父系遗传的等位基因，如DLK1基因。印记基因DLK1被称为脂肪细胞因子，能对脂肪细胞分化进行重要调节。在MartaMadon-Simon等人进行的动物中发现，敲除了父系DLK1基因的仔鼠在出生当日出现明显的生长迟缓，成年后出现了脂肪大量积聚的情况[24]。2父源性效应通过干扰配子DNA甲基化诱发子代代谢性疾病DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。在许多生物活动中，DNA甲基化是调控基因的重要表观遗传学机制。而能够改变这些表观遗传机制的环境因素可能会对胚胎及其之后的生长发育产生不利影响69 广州医科大学硕士学位论文[25,26]。过去十余年，人们对父源性效应如何影响后代发育及健康进行了许多研究。Pembrey等人类实验研究表明，青春期前开始吸烟的男性期其处于青春期的儿子患肥胖的风险很高[27]。NeilAYoungson等人的小鼠动物模型实验亦发现相比于对照组，多给予30%高脂饮食的雄性小鼠其子代小鼠有不同的表型差异，包括葡萄糖代谢异常和体重增加的变化[28]。这说明父亲受到不良因素刺激，营养状况好坏与后代的代谢密切相关，上述因素可以通过影响父亲精子信息传递给下一代[29]。而这其中涉及的机制之一，可能与精子发生的DNA甲基化变化导致子代发生表型变化有关。NeilAYoungson等在动物实验中发现同正常饮食小鼠比高脂饮食的小鼠其精子中的全部基因组DNA甲基化水平，印记基因DNA甲基化水平等均升高，这会影响后代的生长代谢结果[28]。在精子中的DNA甲基化标记传递给下一代过程中，在胚胎种植前全基因组的去甲基化时这些DNA甲基化标记会避免被消除，同时表观胞嘧啶甲基化状态,该状态很大程度上可以在印记基因差异甲基化区域维持[30]。Wei等人通过甲基化分析发现了处于糖尿病前驱期的父亲精子中许多基因往往存在甲基化差异，某些基因（如PIK3CA和PIK3R1）在受精后可以部分免除全基因组的去甲基化并且能大部分的继承来源于精子胞嘧啶甲基化状态，对糖尿病前驱期父亲的后代胰岛细胞表观遗传学研究发现许多基因也处于胞嘧啶甲基化状态，几个胰岛素信号基因甲基化可重复，这表明，胞嘧啶甲基化在基因组的很大一部分之间有代际传递。小鼠的另一项研究也支持配子的胞嘧啶甲基化变化引起环境表观遗传的观点。在子宫内营养不良的F1胚胎会影响F1成年男性的生殖细胞的DNA甲基化水平，全基因组甲基化分析表明,改变并不是随机的,而是在特定基因上的。在核小体保留区中有大量的差异甲基化区域，这些区域被发现在胚胎发育早期不参与去甲基化过程，保持胞嘧啶甲基化状态，这可能会影响F2的生长发育及代谢[31]。糖尿病前驱期父亲其精子中的整体甲基化模式也发生了改变，大部分发生了甲基化变化的基因与其子代胰岛细胞中的基因一致，几个重要的胰岛素信号基因已被证明部分继承了精子甲基化等位基因，这说明糖尿病前驱期这一表型可通过生殖细胞的表观遗传学机制进行隔代遗传[32]。3父源性效应通过小RNA表达变异诱发子代代谢性疾病除了配子DNA甲基化机制外，最近许多研究也关注了各类RNA及RNA修饰，它们被认为是通过改变精子表观遗传学引起后代表型变化的机制之一。研究70 综述表明母源性的非编码RNA在许多细胞分裂活动中保持稳定，并且有助于胚胎早期发育中基因的调控[33]。而早期的大量研究认为精子细胞中缺乏RNA，这是精子发生过程中大部分细胞质丢失的结果。最初检测到的父亲配子中的RNA往往被假定为精子形成过程中退化或剩余的，或是来源于周围其他细胞的污染物[34,35]。然而，近年来的研究表明小鼠精子含有丰富的约100fg总RNA，人类一个精原细胞中就含有10-20fg总RNA[36,37]。尽管各类RNA在成熟精子中含量较体细胞少而且基本无生物学功能，但近期的许多研究发现许多非编码RNA（noncodingRNAs）与由精子介导的饮食性肥胖和代谢紊乱的父系遗传密切相关[38]。一项动物实验研究发现，早期的应激导致小鼠精子中五种miRNAs的表达增加，随着血清中检测到五种miRNAs的表达增加，来自F1雄性小鼠的F2代表现出抑郁行为，并伴随着葡萄糖代谢受损。在这之中的miRNA-375与压力及后代代谢相关。miRNA-375在胰岛细胞中表达，通过管控胰腺β细胞中重组胰岛素样生长因子1基因及3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶基因的表达负性调节胰岛素的合成与分泌[39]。同样地，另一项动物实验发现，肥胖的雄性小鼠其精子中出现了11种miRNAs的异常表达，通过精子的传递作用，它们可能会造成未来两代小鼠的胰岛素抵抗[40]。ValérieGrandjean等人进行的动物研究中，当注入高脂高糖饮食喂养的雄鼠睾丸或精子RNA到一个正常卵细胞后，其后产生的子代出现了糖脂代谢紊乱，经研究后发现这与精子中一些微小RNA表达升高有关，如miR-19b[41]。Chen的动物实验中，向正常受精卵中注射精子tsRNA，F1子代出现了代谢性疾病，同时也改变了F1子代早期胚胎及胰岛代谢通路基因表达，此机制与CpG富集区DNA甲基化无关[38]。以上的研究说明了精子中的小RNA表达异常代表了另一种表观遗传机制，这一机制可能介导了父系代谢紊乱导致的隔代遗传。4总结与研究展望传统的研究大多基于基因组的遗传信息，主要是集中以DNA作为遗传信息的载体,将表型从父母本传递给后代。然而，越来越多的研究表明，除了基因组DNA外，独立DNA序列的表观遗传学机制在特定表型隔代遗传中也发挥着重要作用。大量的人类及动物实验证实除了母本以外，受环境作用影响的父本也可通过其配子的表观遗传学机制影响甚至改变后代的表型，干扰其生长发育，促使后71 广州医科大学硕士学位论文代出现行为异常，癌症及代谢性疾病发生率升高。此类研究中的分子实验表明其中涉及到的表观遗传学机制主要包括父本配子印记基因表达异常，配子DNA甲基化变化及非编码RNA的表达变异等。这些最新的研究成果可以很好地解释隔代肥胖，代谢性疾病，各种慢性病及癌症的发生与日渐流行。这提示了一种可能的方向，我们可以将某些可隔代遗传疾病的表观遗传学机制作为一种独立的危险因素，例如识别配子中的表观遗传学标记如异常非编码RNA可以为预测后代疾病提供一种参考。从优生优育的角度来说，在生殖细胞形成期间减少或避免外界环境中的有害刺激对提高后代胚胎的质量，预防一些慢性非遗传性代谢紊乱如肥胖和2型糖尿病也是有意义的。参考文献[1]Paternalobesity,interventions,andmechanisticpathwaystoimpairedhealthinoffspring.AnnNutrMetab.2014;64(3-4):231-8.[2]CatalanoPM,PresleyL,MiniumJ,Hauguel-deMouzonS.Fetusesofobesemothersdevelopinsulinresistanceinutero.DiabetesCare.2009;32(6):1076–80.doi:10.2337/dc08-2077.[3]FillerG,RayarMS,daSilvaO,BuffoI,PepelassisD,SharmaAP.Shouldpreventionofchronickidneydiseasestartbeforepregnancy?IntUrolNephrol.2008;40(2):483–8.doi:10.1007/s11255-007-9328-1.[4]NgSF,LinRC,LaybuttDR,BarresR,OwensJA,MorrisMJ.Chronichigh-fatdietinfathersprogramsb-celldysfunctioninfemaleratoffspring.Nature2010;467:963–966.[5]HareEH,MoranPA(1979)Raisedparentalageinpsychiatricpatients:evidencefortheconstitutionalhypothesis.BrJPsychiatry134:169–177.[6]MillerB,MessiasE,MiettunenJ,AlaraisanenA,JarvelinMR,etal.(2011)Meta-analysisofpaternalageandschizophreniariskinmaleversusfemaleoffspring.SchizophrBull37:1039–1047.[7]FransEM,SandinS,ReichenbergA,LichtensteinP,LangstromN,etal.(2008)Advancingpaternalageandbipolardisorder.ArchGenPsychiatry65:1034–1040.[8]OksuzyanS,CrespiCM,CockburnM,MezeiG,KheifetsL(2012)BirthweightandotherperinatalcharacteristicsandchildhoodleukemiainCalifornia.CancerEpidemiol36:e359–365.[9]MurrayL,McCarronP,BailieK,MiddletonR,DaveySmithG,etal.(2002)Associationofearlylifefactorsandacutelymphoblasticleukaemiainchildhood:historicalcohortstudy.BrJCancer86:356–361.[10]HemminkiK,KyyronenP,VaittinenP(1999)Parentalageasariskfactorofchildhoodleukemiaandbraincancerinoffspring.Epidemiology10:271–275.72 综述[11]Prepubertalstartoffather'ssmokingandincreasedbodyfatinhissons:furthercharacterisationofpaternaltransgenerationalresponses.EurJHumGenet.2014Dec;22(12):1382-6.[12]SpermtsRNAscontributetointergenerationalinheritanceofanacquiredmetabolicdisorderScience.2016Jan22;351(6271):397-400.[13]L.Daxinger,E.Whitelaw,Understandingtransgenerationalepigeneticinheritanceviathegametesinmammals.Nat.Rev.Genet.13,153–162(2012)[14]O.Rechavi,L.Houri-Ze’evi,S.Anava,W.S.Goh,S.Y.Kerk,G.J.Hannon,O.Hobert,Starvation-inducedtransgenerationalinheritanceofsmallRNAsinC.elegans.Cell158,277–287(2014).[15]YuanJ1,ChenS1,JiaoW1,WangL1,WangL1,YeW1,LuJ2,HongD1,YouS1,ChengZ3,YangDL1,ChenZJ1,2Bothmaternallyandpaternallyimprintedgenesregulateseeddevelopmentinrice.NewPhytol.2017Mar13.[16]DolinoyDC,WeidmanJR,JirtleRL.2007.Epigeneticgeneregulation:linkingearlydevelopmentalenvironmenttoadultdisease.ReprodToxicol23:297–307.[17]StrathdeeG,SimA,BrownR.2004.ControlofgeneexpressionbyCpGislandmethylationinnormalcells.BiochemSocTrans32:913–5.[18]LuciferoD,MertineitC,ClarkeHJ,BestorTH,etal.2002.Methylationdynamicsofimprintedgenesinmousegermcells.Genomics79:530–8.[19]MurphySK,JirtleRL.2003.Imprintingevolutionandthepriceofsilence.BioEssays25:577–88.[20]VrangN,MeyreD,FroguelP,JelsingJ,Tang-ChristensenM,VatinVetal.Theimprintedgeneneuronatinisregulatedbymetabolicstatusandassociatedwithobesity.Obesity2010;18:1289–1296.[21]TakahashiM,KameiY,EzakiO.Mest/Peg1imprintedgeneenlargesadipocytesandisamarkerofadipocytesize.AmJPhysiolEndocrinolMetab2005;288:E117–E124.[22]VrangN,MeyreD,FroguelP,JelsingJ,Tang-ChristensenM,VatinVetal.Theimprintedgeneneuronatinisregulatedbymetabolicstatusandassociatedwithobesity.Obesity2010;18:1289–1296.[23]ASoubry1,2,SKMurphy3,FWang1,ZHuang3,ACVidal4,BFFuemmeler5,JKurtzberg6,AMurtha7,RLJirtle8,JMSchildkraut1,5andCHoyoNewbornsofobeseparentshavealteredDNAmethylationpatternsatimprintedgenesInternationalJournalofObesity(2015)39,650–657[24]MartaMadon-Simon1,3,MichaelCowley1,4,AlastairSGarfield1,5,KimMoorwood1,StevenRBauer2andAndrewWardAntagonisticrolesinfetaldevelopmentandadultphysiologyfortheoppositelyimprintedGrb10andDlk1genesMadon-Simonetal.BMCBiology(2014)12:771[25]ArnaudP,FeilR(2005)Epigeneticderegulationofgenomicimprintinginhumandisorders73 广州医科大学硕士学位论文andfollowingassistedreproduction.BirthDefectsResCEmbryoToday75:81–97.[26]WeaverJR,SusiarjoM,BartolomeiMS(2009)Imprintingandepigeneticchangesintheearlyembryo.MammGenome20:532–543[27]NorthstoneK,GoldingJ,DaveySmithG,MillerLL,PembreyM:Prepubertalstartoffather’ssmokingandincreasedbodyfatinhissons:furthercharacterisationofpaternaltransgenerationalresponses.EurJHumGenet2014;22:1382–1386.[28]NeilAYoungson1,VirginieLecomte1,ChristopherAMaloney1,PrestonLeung2,JiaLiu3,LukeBHesson3,FabioLuciani2,LutzKrause4,5,MargaretJMorris1Obesity-inducedspermDNAmethylationchangesatsatelliterepeatsarereprogrammedinratoffspringAsianJournalofAndrology(2016)18,930–936.[29]Carone,B.R.,Fauquier,L.,Habib,N.,Shea,J.M.,Hart,C.E.,Li,R.,etal.,2010.Paternallyinducedtransgenerationalenvironmentalreprogrammingofmeta-bolicgeneexpressioninmammals.Cell143:1084e1096.[30]LaneN,DeanWErhardtSHajkovaPSuraniA,Walter,ReikWResistanceofIAPstomethylationreprogrammingmayprovideamechanismforepigeneticinheritanceinthemouse,Genesis2003vol.35(pg.88-93)[31]RadfordEJ1,ItoM1,ShiH1,CorishJA1,YamazawaK1,IsganaitisE2,SeisenbergerS3,HoreTA3,ReikW3,ErkekS4,PetersAH5,PattiME6,Ferguson-SmithAC7Inuteroeffects.Inuteroundernourishmentperturbstheadultspermmethylomeandintergenerationalmetabolism.Science.2014Aug15;345(6198):1255903[32]YanchangWeia,Cai-RongYanga,Yan-PingWeib,Zhen-AoZhaoa,YiHoua,HeideSchattenc,andQing-YuanSuna,1PaternallyinducedtransgenerationalinheritanceofsusceptibilitytodiabetesinmammalsProcNatlAcadSciUSA.2014Feb4;111(5):1873–1878.[33]SuhN,BlellochRSmallRNAsinearlymammaliandevelopment:fromgametestogastrulation,Development,2011,vol.138(pg.1653-1661)[34]PessotCA,BritoM,FigueroaJ,ConchaII,YanezA,BurzioLO.PresenceofRNAinthespermnucleus.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.1989;158(1):272–8.pmid:2463835[35]SendlerE,JohnsonGD,MaoS,GoodrichRJ,DiamondMP,HauserR,etal.Stability,deliveryandfunctionsofhumanspermRNAsatfertilization.Nucleicacidsresearch.2013;41(7):4104–17.[36]ConchaII,UrzuaU,YanezA,SchroederR,PessotC,BurzioLO.U1andU2snRNAarelocalizedinthespermnucleus.Experimentalcellresearch.1993;204(2):378–81.[37]KrawetzSA.Paternalcontribution:newinsightsandfuturechallenges.NaturereviewsGenetics.2005;6(8):633–42.[38]ChenQ,YanM,CaoZ,LiX,ZhangY,ShiJ,etal.SpermtsRNAscontributetointergenerationalinheritanceofanacquiredmetabolicdisorder.Science.74 综述2016;351(6271):397–400[39]ZhangN,LinJK,ChenJ,LiuXF,LiuJL,LuoHS,LiYQ,CuiS.MicroRNA375mediatesthesignalingpathwayofcorticotropin-releasingfactor(CRF)regulatingpro-opiomelanocortin(POMC)expressionbytargetingmitogen-activatedproteinkinase8.JBiolChem2013;288:10361–10373.[40]FullstonT,OhlssonTeagueEM,PalmerNO,DeBlasioMJ,MitchellM,CorbettM,PrintCG,OwensJA,LaneM.PaternalobesityinitiatesmetabolicdisturbancesintwogenerationsofmicewithincompletepenetrancetotheF2generationandaltersthetranscriptionalprofileoftestisandspermmicroRNAcontent.FASEBJ2013;27:4226–4243.[41]ValérieGrandjean1,2,3,SandraFourré4,DianaAndreaFernandesDeAbreu5,Marie-AlixDerieppe1,2,3,Jean-JacquesRemy5&MinooRassoulzadegan1,2,3RNA-mediatedpaternalheredityofdiet-inducedobesityandmetabolicdisordersSciRep.2015;5:1819375 广州医科大学硕士学位论文在读期间完成的论文和译著（1）JunHuang,JinhuaMo,GuanhuiWei,WeinanDeng,DunjinChen，BolanYu*.Applicationoftheamnioticfluidmetabolometothestudyoffetalmalformations,usingDownsyndromeasaspecificmodel.MolecularMedicineReports（已接收）（2）LuJiang，TingZheng，JunHuang，JinhuaMo，HuaZhou，MinLiu，XingchengGao，BolanYu*.Associationofsemencytokineswithreactiveoxygenspeciesandhistonetransitionabnormalities.JAssistReprodGenet.2016Sep;33(9):1239-46.（3）莫金桦、黄珺、蒋露、郑婷、陈敦金、余波澜*，胎儿生长受限的遗传学机制研究进展，妇产与遗传(电子版)，2016，6（1）：42~4676 致谢致谢光阴荏苒，研究生活即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅。在读研期间我得到了许多的关怀和帮助，现在要向他们表达我最诚挚的谢意。首先，我要深深感谢我的导师余波澜老师。余波澜老师为人谦和，平易近人。在论文的选题、搜集资料和写作阶段，余老师都倾注了极大的关怀和鼓励。在论文的写作过程中，提出许多中肯的指导意见，使我在研究和写作过程中不致迷失方向。她严谨的治学之风和对事业的孜孜追求将影响和激励我的一生，她对我的关心和教诲我更将永远铭记。借此机会，我谨向余老师致以深深地谢意。其次，我还要感谢中山大学中山医学院的黄朝峰教授，正是因为有了他的严格、高质量的教导，我才能在这几年的学习过程中汲取专业知识和迅速提升科研能力。感谢广州医科大学附属第三医院妇研所各位老师及同学对我科研学习及临床工作的指导和帮助。同时也感谢这三年来与我互勉互励的诸位同学师兄师弟师妹：龚炜，郑婷，蒋露，赵梅，徐小解，莫金桦，以及陈焕鹏，赵瑰丽，吴曼，徐晓婷等。在各位同学的共同努力之下，我们始终拥有一个良好的生活环境和一个积极向上的学习氛围，能在这样一个团队中度过，是我极大的荣幸。最后我还要感谢我的父母及家人，感谢他们一直以来给予我的极大的鼓励与帮助！77 广州医科大学硕士学位论文学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。文中依法引用他人的成果、对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：1．交回学校授予的学位证书；2．学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3．本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。4．本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：日期：年月日学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属广州医科大学及附属单位。广州医科大学及附属单位享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广州医科大学及附属单位。任何其他收存和保管本论文的单位和个人，未经本论文作者、导师授权，不得将本论文转借他人、复制、抄录或以其他任何方式传播，否则，引起有碍作者的著作权益问题，将会追究相应的法律责任。论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日学位论文使用授权声明1、学校可以保留本论文的原件及复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存、汇编学位论文；2、本人授权学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。送交学位论文时间选择（请在下面相应栏内打“√”）：①答辩后即可送：是否②延迟一年后送：③延迟二年后送：④延迟三年后送：论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日78
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