禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用

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分类号：Ｓ８５２授予学位单位代码：１０４３４学号：２０１１２０２７３山东农业大学全日制硕士专业学位论文禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｒｅｅｄｅｒＣｏｃｋｓｉｎＥｒａｄｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎＲｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅＲｉｓｋｏｆＶｅｒｔｉｃａｌＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＡｖｉａｎＬｅｕｋｏｓｉｓＶｉｒｕｓ姓名：赵颖洁学位类别：兽医硕士专业兽医研究方向：．分子病毒学学院：动物科技学院指导教师：赵鹏副教授崔治中教授２０１７年６月６白 论文提交日期：２０１７．０４．２８１７．论文答辩曰期：２０．０６０６学位授予日期：２０１７．０６学科类别：兽医硕士：尹燕博答辩委员会主席ｆ 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研宄期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。。本声明的法律责任由本人承担本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名导师签名＂曰期丨：如Ｈ７ 本研究由公益性行业（农业）科研专项经费（201203055）和十三五国家重点研发计划课题“种禽场禽白血病综合防控技术集成与示范研究”（2016YFD0501606）项目资助ThisstudywassupportedbySpecialFundforAgro-scientificResearchinthePublicInterest(201203055)andtheNationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(2016YFD0501606). 符号说明英文缩写英文全称中文全称ALVAvianleukosisvirus禽白血病病毒ALV-AAvianleukosisvirussubgroupAA亚群禽白血病病毒ALV-BAvianleukosisvirussubgroupBB亚群禽白血病病毒ALV-EAvianleukosisvirussubgroupEE亚群禽白血病病毒ALV-JAvianleukosisvirussubgroupJJ亚群禽白血病病毒ARVAvianreovirus禽呼肠孤病毒AmpAmpiciline氨苄青霉素CAVChickenanemiavirus鸡传染性贫血病毒CEFChickenembryofibroblast鸡胚成纤维细胞DDay天DMEMDulbeco'smodifiedeaglemedia极限必需培养基ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验envEnvelopegene囊膜糖蛋白基因gagGroupantigen群抗原gp85Glycoprotein85糖蛋白85HHour小时HIHemagglutinationinhibtion血凝抑制试验IFAIndirectimmunfluorescenceassay间接免疫荧光试验LTRLongterminalrepeatsequence长末端重复序列MDVMarek’sdiseasevirus马立克氏病病毒minMinute分钟NDVNewcastlediseasevirus新城疫病毒p27Protein27衣壳蛋白polProtease/polymerase蛋白酶/核酸聚合酶PBSPhosphate-buffersaline磷酸盐缓冲液禽网状内皮组织增生症REVReticuloendotheliosisvirus病毒 RSVRoussarcomavirus罗斯肉瘤病毒rpmRoundsperminute转/分钟Reversetranscription-polymeraseRT-PCR反转录-聚合酶链式反应chainreactionSPFSpecificpathogenfree无特定病原TCID50Mediantissuecultureinfectivedose半数组织细胞感染量WWeek周µlMicroliter微升 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................................III1前言........................................................................................................................................11.1ALV的研究进展..................................................................................................................11.1.1ALV的形态大小和理化特性...........................................................................................11.1.2ALV的抗原分型...............................................................................................................21.1.3ALV的化学组成...............................................................................................................21.1.4ALV的复制.......................................................................................................................31.1.5ALV的致病性...................................................................................................................51.1.6ALV的致瘤机制...............................................................................................................61.1.7ALV的流行病学特点.......................................................................................................71.1.7.1宿主范围.........................................................................................................................71.1.7.2传播方式.........................................................................................................................71.1.7.3鸡对ALV感染的免疫反应及病毒血症动态...............................................................81.1.8ALV的检测和诊断...........................................................................................................91.1.9ALV的防控措施.............................................................................................................111.2核苷类药物简介.................................................................................................................121.2.1核苷类药物的应用概况..................................................................................................121.2.2核苷类药物的作用机理..................................................................................................131.3本试验研究的目的和意义.................................................................................................132材料和方法...........................................................................................................................142.1试验材料.............................................................................................................................142.1.1病料来源与毒株来源......................................................................................................142.1.2细胞..................................................................................................................................142.1.3药物和疫苗......................................................................................................................142.1.4试验动物与SPF饲养设施.............................................................................................152.1.5主要试剂和试剂盒..........................................................................................................152.1.6药物的配制......................................................................................................................15 2.1.7其他试剂的配制..............................................................................................................152.2方法.....................................................................................................................................162.2.1净化鸡群种公鸡的病毒分离鉴定与gp85分析............................................................162.2.1.1血浆的采集与接种.......................................................................................................162.2.1.2精液的采集与接种.......................................................................................................172.2.1.3细胞上清ALV抗原的检测.........................................................................................172.2.1.4感染细胞DNA的提取................................................................................................182.2.1.5分离毒株gp85的PCR扩增.......................................................................................192.2.1.6gp85目的片段的回收..................................................................................................202.2.1.7回收片段的连接...........................................................................................................202.2.1.8连接产物的转化...........................................................................................................212.2.1.9阳性克隆菌的筛选与鉴定...........................................................................................212.2.1.10序列测定与分析.........................................................................................................212.2.2逆转录酶抑制剂类药物对鸡的保护作用......................................................................222.2.2.1毒株的增殖和定量.......................................................................................................222.2.2.2实验设计.......................................................................................................................232.2.2.3病毒的接种与鸡胚孵化...............................................................................................232.2.2.4孵化雏鸡ALV-J感染状态的鉴定..............................................................................242.2.2.5不同组别鸡体重的测定...............................................................................................252.2.2.6不同组别鸡ALV-J病毒血症的测定..........................................................................252.2.2.7不同组别鸡ALV-J抗体动态的测定.........................................................................262.2.2.8不同组别鸡NDV和AIV-H9疫苗免疫抗体水平的测定.........................................272.2.2.9数据的统计与分析.......................................................................................................283试验结果...............................................................................................................................283.1分离毒株gp85序列分析与亚群确定...............................................................................283.2逆转录酶抑制剂类药物对垂直传播ALV-J的治疗作用................................................333.2.1毒株的增殖定量结果......................................................................................................333.2.2孵化雏鸡ALV-J感染状态的鉴定结果.........................................................................333.2.3药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J体重的影响................................................333.2.4药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J病毒血症阳性率的影响............................34 3.2.5药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J抗体产生的影响........................................343.2.6药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J后NDV和AIV-H9疫苗免疫抗体产生的影响...............................................................................................................................................354讨论.......................................................................................................................................365结论.......................................................................................................................................386参考文献...............................................................................................................................397致谢.......................................................................................................................................448攻读学位期间发表论文情况...............................................................................................459附录.......................................................................................................................................46 山东农业大学全日制硕士专业学位论文中文摘要禽白血病病毒（AvianLeukosisVirus,ALV）自首次被报道以来已在世界各地爆发和流行，因其高致病性、高致死率、高肿瘤并发率给各国养禽业造成了巨大的损失。ALV主要通过垂直传播方式呈指数级扩大，种蛋和精液在病毒垂直传播过程中起着决定性的作用。在很长的时期内，我们主要通过检测母鸡的血浆以及种蛋中是否有ALV感染来实施净化，而常常忽略了对公鸡的检测，然而对于净化中公鸡检测究竟以血浆病毒分离为准还是以精液分离为准也无明确结论。另外，ALV经垂直传播感染后，会引起感染鸡体重、产蛋率等各种生产机能下降，也会导致很高的致死率，给鸡群造成很大的危害，对于一些高阳性率的地方品系鸡群还存在过度淘汰影响育种进度的现实问题，我们希望通过多种途径能够降低高阳性率鸡群的ALV带毒率或至少减少由于垂直传播带毒对雏鸡的致病作用，为此本研究通过鸡胚卵黄囊接种模拟雏鸡感染ALV，然后给感染雏鸡添加AZT等逆转录酶抑制剂类药物观察了此类药物对降低ALV垂直传播危害的作用。1．不同种鸡群禽白血病净化中的种公鸡检测本研究对我国两个正在实施禽白血病净化的种鸡场的公鸡分别采取血浆病毒分离和精液病毒分离两种方式观察和比较了两种检测途径对评价种公鸡ALV感染状态时的对应性，并对部分阳性毒株做了序列测定和分析。结果显示，对正在实施净化的某蛋鸡场检测公鸡400份，其中精液样品病毒分离阳性为11份，血浆样品病毒分离阳性为13份，精液和血浆病毒分离同时为阳性的有8份。对正在实施净化的某野山鸡场检测公鸡1800份，其中精液样品病毒分离阳性为45份，血浆样品病毒分离阳性为188份，精液和血浆病毒分离同时为阳性的仅有16份。上述数据说明仅仅通过单纯的血浆病毒分离或者单纯的精液病毒分离均不能有效的检出所有的ALV阳性公鸡，从净化效率角度考虑应该同时对公鸡的血浆和精液做全面的病毒分离来确定阳性个体进而淘汰，这将有助于在最短的时间内淘汰阳性公鸡。对部分毒株gp85序列的测定和同源性分析结果显示，所分离到的20个毒株之间同源性高达99.0%~100%，这些样品与A亚群参考株之间的同源性最高，为88.6%~99.2%，显著高于与B、E、F、J、K亚群的同源性，与B、E、F、J、K等不同亚群同源性分别为83.2%~83.7%、85.4%~89.6%、83.0%~83.9%、50.0%~51.1%和84.8%~85.9%。进化树比对分析也发现，分离到的所有毒株均与A亚群毒株在一个分支上。I 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用2．逆转录酶抑制剂类药物对垂直传播感染ALV的SPF鸡的保护作用本研究通过对SPF鸡胚卵黄囊接种NX0101毒株模拟鸡胚经垂直传播感染ALV-J，待鸡胚孵育出壳后，将鸡胚分为两组，只对其中一组在出壳后的连续一周内肌肉注射5mg的Zidovudine（AZT）和2mg的Lamivudine（LAM），另一组在出壳后的连续一周内肌肉注射等剂量的生理盐水，与卵黄囊接种空白DMEM并且出壳后连续一周内肌肉注射等剂量生理盐水的完全空白对照组对比，观察逆转录酶抑制剂类药物对SPF鸡的保护作用以及对降低垂直传播危害的作用。结果显示，未使用药物的病毒感染组其体重、死亡率以及免疫NDV和AIV-H9所产生的抗体水平均显著低于使用药物的病毒感染组，更显著低于未接毒的生理盐水对照组，但是药物的使用未能阻止感染组ALV病毒血症的形成，说明药物无法替代针对禽白血病的净化工作。上述相关数据不仅进一步展示了ALV-J垂直传播对鸡群的危害，也显示了AZT和LAM等逆转录酶抑制剂类药物的使用有助于降低ALV-J垂直传播感染对鸡群的危害。关键词：禽白血病病毒；净化；精液；逆转录酶抑制剂类药物；垂直感染II 山东农业大学全日制硕士专业学位论文DetectionofBreederCocksinEradicatonandApplicationofReverseTranscriptaseInhibitorsinReducingtheRiskofVerticalTransmissionofAvianLeukosisVirusAbstractAvianleukosisvirus(ALV)hasbeenreportedthatcausedgreatoutbreakandepidemicsintheworld.Duetohighpathogenicity,mortalityandincidenceoftumorshascausedeconomiclossesinpoultryindustry.ALVisexpandedexponentiallymainlybyverticaltransmission,thesamplesofhatchingeggsandsemenplayanimportantroleintheverticaltransmissionofthevirus.ALVeradicationhasbeencarriedoutbydetectingtheplasmasamplesandeggalbumenforthepresenceofALV,andbreedercocksdetectionwereofenoverlooked.ThedetectionofALVinplasmaorcocksemenforvirusisolationineradicationbreedercocksisnotclear.Inaddition,theALVwillresultindecresingthebodyweight,eggproductionandmoremortalityafterinfection,causinggreatriskstothechickenflocks.However,ithadanextortionateALVinfectionrateinsomeChinseselocalchickenbreeds,thehighrateofALVinfectionwasreducedbyvarietymethodsandreducethepathogenicityofchickensduetotheverticaltransmission.Inthispresentstudy,chickenswereinoculatedwithALV-JviayolksacinembryostoestablishALVverticaltransmissionmodel,andreversetranscriptaseinhibitors(RTI)suchasAZTwereadminisatratedininfectedchickenstoevalvatetheeffectofRTIsinreducingthepathogenicityofALV-Jinchickens.1.DetectionofALVinplasmaandsemeninbreedercocksThesamplesofplasmaandsemenwerecollectedfrombreedercocksfromtwofarmswhichhadbeenimplementingALVerdadicationprograminChinaandinoculatedtoDF-1cellsforisolatingthevirusandcomparetwodifferentdetectionmethodtoevaluatetheALVinfection,andafewisolatesweresequencedandanalyzed.Theresultsshowedthat11semonsamplesarepositive,13plasmasamplesarepositiveintotal400samplesfrombreedercocksinlayerfarm,totalof8sampleswereALVpositiveinbothplasmaandsemen.Inanotherpheasantfarm,therewere45positivesemonsamplesand188positiveplasmasampleswereIII 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用detectedintotal1800samplesfrombreedercocks,while,thetotalof16sampleswereALVpositiveinbothplasmaandsemen.TheresultsdemonstratedthatitcannoteffectivelydetectedtheALV-positivebreedercocksbyvirusisolationfromplasmaorsemenalone.ALVisolationshouldbeperformedusingbothplasmaandsemensamplesatthesametimetodeterminetheALV-positivechickens.Analysisofgp85genesequencesofpatialisolatedvirusfromlayerfarmsshowedthatthehomologyoftheisolateswas99.0%-100%.Thehomologyofthesesampleswas88.6%~99.2%withsubgroupA,whichwassignificantlyhigherthanthatofB,E,F,J,Kthatwere83.2%~83.7%,85.4%~89.6%,83.0%~83.9%,50.0%~51.1%and84.8%~85.9%respectively.PhylogeneticanalysisdemonstratedthatallsampleswereinsamebranchbrachwithsubgroupA.2.ProtectiveeffectsofreversetranscriptaseinhibitorsonSPFchickensinfectedwithALVChickenembryoswereinoculatedwithALV-JstrainNX0101viayolksactoestablishALVverticaltransmissionmodel.Chickenswerehatchedanddiviededintotwogroups.Chickenswereinjectedwith5mgZidovudine(AZT)and2mgLamivudine(LAM)viaintramuscularlylastoneweekfortreatmentgroup.Chickenswereinjectedphysiologicalsalineinsamevolumeintramuscularlyatthesametimeascontrolgroup.ChickenswerehatchedtoevalvatetheeffectofRTIsinreducingthepathogenicityofALV-Jinchickens.TheresultsshowedthatthebodyweightandantibodytitersofNDVandAIV-H9inuntreatmentchickensweresignificantlylowerthantreatmentgroupwithAZTandLAM,moresignificantlylowerthanthecontrolgroup.However,NRTItreatmentcouldnotpreventALVreplicationinchickens,indicatingthatthedrugscouldnotreplacetheeradicationprogram.TheabovedatanotonlyillustratedthephathologyofALV-Jbyverticaltransmissioninforthechickenflocks,italsoshowedthatNRTIsuchasAZTandLAMhelpstoreducetheriskofverticaltransmissionofALV-Jinchickenflocks.Keywords:ALV;Eradication;semen;ReverseTranscriptaseInhibitors;VerticaltransmissionIV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1前言1.1ALV的研究进展禽白血病（Avianleukosis，AL）是指由一类禽反转录病毒引起的鸡的良性和恶性肿瘤性疾病，其中，以淋巴白血病（LL）最常见。引起这类病的病毒都是具有反转录酶的禽白血病病毒和肉瘤病毒（Avianleukosis/sarcomaviruses,ALSV），简称为禽白血病病毒（Avianleukosisvirus,ALV）。家禽感染禽白血病病毒后可引起多种肿瘤性疾病，如骨髓细胞瘤、纤维瘤和纤维肉瘤等（Payneetal.,2012）。此外，感染家禽还会出现免疫抑制，生长迟缓，生产性能和产蛋率下降，疫苗免疫失败等亚临床症状。自禽白血病被发现以来，特别是制毒性更强的ALV-J的发现与传播给全世界的种鸡和养殖场带来了严重的危害。大约在2005年以后，全世界大多数养鸡业发达的国家的商业经营的规模化养鸡场都已经基本消灭和控制了ALV在鸡群中的流行，但是在我国鸡群中，特别是特有地方品系鸡中ALV的感染仍然非常普遍同时表现出我国特有的发生与蔓延特点（Chengetal.,2010;Gaoetal.,2010;Shietal.,2011;Gaoetal.,2012;Caietal.,2013;Lietal.,2013;Zengetal.,2014;Dongetal.,2015）。在商业化经营的鸡群中，因ALV感染造成的死亡率可达到1%~2%，在某些地方甚至高达20%以上。在2008、2009年中，据保守估计，在全国饲养的12亿~15亿只产蛋鸡中，一年至少有5000万只因ALV-J肿瘤和血管瘤造成直接死亡（崔治中,2010）。更为严重的是，禽白血病病毒不仅可以通过横向传播给其他结群，也可以通过垂直传播由精液、种蛋传播给下一代鸡群（Payne,2012），同时，近年来由于弱毒疫苗存在ALV污染情况而导致禽白血病的扩散与传播，加重了我国禽白血病的发病情况，使该病的防控与净化工作愈来愈空难。禽白血病无疑已经成为危害我国养禽业发展的一种重要疾病。1.1.1ALV的形态大小和理化特性通过感染病毒细胞的超薄切片可以看出病毒是由外膜、中间膜以及中央电子致密核芯三部分构成，符合C型反转录病毒粒子的典型形态。病毒粒子整体呈圆球形，总体直径约为80~125nm，平均直径约为90nm。外部有囊膜，且在囊膜表面有病毒囊膜蛋白糖蛋白形成的直径约为8nm的纤突（Gildenetal.,1977;殷震等,1997;赛弗等,2005）。ALV对多种化学和物理因子都很易感，因此很容易被灭活。在ALV囊膜中类脂类1 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用物质含量很高，其传染性很容易被乙醚等脂溶性溶剂所灭活。十二磺酸钠等去污剂可以破坏病毒粒子的结构并释放出RNA及衣壳蛋白。根据病毒所在的介质、组织的来源和毒株的自身特点的不同，不同禽白血病病毒在37℃下的半衰期为100~540min，平均约为260min，在50℃下半衰期为15min，在60℃下仅0.7min。只有在-60℃的保存条件下，禽反转录病毒才能长期保存，其传染性在几年内都不会下降。反复冻融会降解病毒并释放出群特异性抗原。当PH介于5~9之间时，PH的变化对ALV没有不良影响，但是当在此PH范围之外即过酸或过碱时，将会显著降低ALV的传染性。图1禽白血病病毒粒子从细胞膜出芽及其病毒粒子形态Fig.1ThemorphologyandbuddingofAvianleukosisvirus(ALV)A：禽白血病病毒粒子从细胞膜出芽;B：禽白血病病毒粒子的形态A:ALVbudding;B:ALVmorphology1.1.2ALV的抗原分型根据病毒的宿主范围、病毒间的干扰作用以及病毒基因组中囊膜蛋白的抗原特性可将禽白血病病毒分为A~J十个亚群（Hanafusa,1973;Hanafusaetal.,1976;Frisbyetal.,1979;Troeschetal.,1985;Baietal.,1995）。在这些亚群中，能够自然感染鸡群的只有六个亚群：A、B、C、D、E和J。其中，J亚群致病性最强，是上世纪90年代从英国的肉用型鸡中分离到的新亚群（Baietal.,1995;Bensonetal.,1998)。而E亚群则广泛存在于宿主基因组中，为内源性病毒，一般不具有致病性或致病性很弱。但是，本实验董宣等（2015）通过对近几年从中国地方品种鸡分离到的几十株ALV进行囊膜糖蛋白gp85基因序列的同源性比较分析后发现，有相当一部分的分离株其gp85基因与A~J亚群同源性较低，约在77.7%~82.4%之间，不属于任何已知亚群，极有可能是新亚群“K亚群”。1.1.3ALV的化学组成ALV为单股正链RNA病毒，长度介于7~8kb。在每个有传染性的病毒粒子中有两条完全相同的单链RNA分子，在其的5’端以非共价键连接在一起，每个单链RNA分2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文子就是病毒的RNA。每个基因组分子由三个主要编码基因组成，即衣壳蛋白基因（gag）、聚合酶基因（pol）、囊膜蛋白基因（env），在基因组上的排列为5’gag-pol-env。在两端还分别有非编码区，其中有一段重复序列及5’端独特序列或3’端独特序列，这些非编码区的序列具有启动子或增强子的活性。在反转录产生的前病毒DNA中，它们形成了长末端重复序列LTR，其与病毒RNA的复制和翻译有关。从ALV三个编码基因gag、pol、env转录产生的原始转录子，经过不同的剪辑和翻译后再加工，产生一系列不同的蛋白质。gag基因编码一些结构蛋白p19、p27、p12、p15，其中，p19又称基质蛋白（MA），而p27普遍存在于不同亚群之间的高度保守基因，是ALV的主要群特异性抗原。另外两个蛋白，p12是核衣壳蛋白（NC），参与基因组的剪辑和包装；p15是一种蛋白酶（PR），与病毒基因组编码的蛋白质前体的裂解相关。env基因编码一些囊膜蛋白gp85、gp37，它决定病毒的抗原性和毒力。位于病毒粒子衣壳中的由pol基因编码的反转录酶是一个复合体蛋白，由α（68kD）和β（95kD）两个亚单位组成，具有反转录功能，可以以RNA或DNA为模板合成DNA。囊膜基因env编码课糖基化的囊膜蛋白，包括位于囊膜纤突表面的gp85和将纤突与囊膜连接起来的gp37，其二者连接成一个二聚体。图2ALV前病毒的基因组结构图Fig.2GenomeStructureofALVprovirusgenomestructure1.1.4ALV的复制禽白血病病毒的复制分为经典ALV的复制和复制缺陷型ALV的复制两种形式。经典ALV的复制过程如下：和其他反转录病毒一样，在ALV的复制过程中，都需要经过反转录过程，即需要由反转录酶介导从基因组RNA形成前病毒DNA，并整合进宿主细胞基因组中，再由前病毒DNA转录产生病毒RNA并进一步转译产生各种前体蛋白质及组成病毒粒子的成熟蛋白质。3 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用ALV粒子吸附到细胞膜上是一个非特异性过程，不同亚群ALV能吸附到不同细胞的细胞膜上，即使细胞对ALV毒株有抵抗力，病毒粒子也可以吸附到细胞膜上。但是，某种特定毒株能否顺利进入某种细胞取决于细胞膜上是否有特定亚群病毒囊膜蛋白的受体以及病毒囊膜能否与细胞膜发生融合作用。通常情况下，当ALV吸附到易感细胞膜上120min内，病毒粒子就能以液泡的形式被带入细胞，病毒RNA也随之进入细胞核。在ALV的复制过程中，在病毒粒子的反转录酶的作用下，进入宿主细胞的病毒基因组正链单股RNA反转录为双股DNA，即前病毒cDNA。在这个过程中，原来的5’端和3’端的独特区序列（U5和U3）分别在另一端形成了一个重复区。因此，在前病毒cDNA分子上，两端都形成了相同U3-R-U5序列，即LTR。随后，在病毒的整合酶的作用下整合进细胞的染色体基因组的某个位点。新的病毒基因组RNA将从整合进细胞基因组上的前病毒DNA序列转录产生。ALV基因组的复制过程比较复杂，形成反转录病毒DNA的主要步骤包括四步：第1步是以病毒基因组RNA为模板，在自身反转录酶作用下合成病毒DNA的第一链，这时形成的可能是一个RNA:DNA的杂交链；第2步是在RNase-H作用下脱掉杂交链的RNA链，再以DNA负链为模板形成病毒DNA的第二条链即DNA正链，产生线性DNA双螺旋体；第3步是线性DNA迁移到细胞核内，转变为一个闭锁的环状结构；第4步是环化的病毒DNA再线性化后整合到宿主DNA上。在感染细胞中，新的病毒粒子的形成是前病毒DNA转录和翻译的结果。在宿主RNA聚合酶的作用下，以整合进细胞基因组的前病毒DNA的一条链为模板转录病毒RNA。新产生的病毒RNA分子可以作为mRNA与聚合体相结合，转录并翻译产生各种病毒蛋白质，也可以作为新形成的病毒子的基因组RNA。在细胞感染后的24h内，即可以检测到新的病毒RNA。另一种复制缺陷型ALV的复制则是因为这些急性致肿瘤性白血病病毒基因组复制所必须的gag基因、pol基因、或env基因可能被某种肿瘤基因完全或部分取代，不能再单独形成完整的病毒粒子，成为复制缺陷型病毒，所以这些病毒无法产生与病毒复制相关的全套蛋白质，因而不能在任何细胞上单独生长复制。只有当有其他ALV作为辅助病毒存在时，才能复制并形成病毒粒子。此时，这些病毒的基因组则被辅助病毒形成的所有病毒蛋白以及病毒外壳所包装，以辅助缺陷型病毒释放到细胞外并识别和感染新的易感细胞。4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1.1.5ALV的致病性ALV感染对鸡群的危害表现为两方面：一是ALV感染后会诱发鸡群产生肿瘤导致死亡，死亡率通常可达1%~2%，偶尔也可高达20%甚至更高；二是对感染鸡会产生ALV亚临床感染症状，引起一些重要的生产性能如产蛋率和蛋的质量的下降。在临床上，禽白血病以表现内脏肿瘤或体表皮肤血管瘤为特征，但更多的感染鸡可能仅表现出的亚临床病理作用，如产蛋下降、免疫抑制或生长迟缓等，所带来的经济损失可能大于临床上显示肿瘤性死亡带来的损失。ALV感染鸡后产生的免疫抑制作用与感染的年龄、感染毒株的亚群与毒力、以及鸡的遗传背景等情况密切相关。J亚群ALV的免疫抑制作用比其他亚群更强一些，另外，在鸡群早期感染以及通过垂直感染方式诱发的免疫抑制作用也要更强一些。ALV诱发免疫抑制后，最主要的不良反应是导致感染鸡对其他疫病的保护性免疫反应下降，进而导致对其他传染病的抵抗力下降。目前已分离到的大多数ALV野毒株均属于慢性致肿瘤病毒，即使是先天感染或幼雏早期感染，一般情况下都要经过几个月的潜伏期才能产生肿瘤。ALV可以引起鸡的多种内脏器官、不同组织、不同表现的肿瘤。常见的发病脏器有肝脏、脾脏、肾脏、心脏、卵巢等，另外，法氏囊、胸腺、皮肤、肌肉、骨膜等器官组织也会产生肿瘤。肿瘤的表现形式多种多样，有的形状规则，有的形状不规则，有的呈现大块肿瘤结节，有的则呈现弥漫性细小结节。产生肿瘤的细胞类型也不尽相同，有淋巴细胞瘤、髓样细胞瘤、成红细胞瘤、纤维肉瘤、血管内皮细胞瘤等，这主要取决于病毒毒株的特性和鸡的遗传性有关。一般而言，A、B亚群大多会引发淋巴细胞肿瘤，且会形成较大的肿瘤块；J亚群毒株多引起髓细胞样肿瘤，感染鸡会呈现肝脏肿大并有大量弥漫性分布的白色的细小的肿瘤结节分布，在其他的易感脏器也会有形状不规则的肿瘤产生。E亚群毒株不会引发肿瘤，但是先天感染或者出壳后即感染的鸡往往死淘率比较高，对外源性ALV更易感。这可能是因为早期感染E亚群后，鸡体内容易产生对ALV的免疫耐受性，从而在感染外源性ALV之后不易产生相应的特异性抗体。与慢性致肿瘤病毒相反，急性致肿瘤病毒感染鸡后，只要几天或者几周就能诱发鸡体产生肿瘤，如罗斯肉瘤病毒（RSV）。同样，由急性病毒诱发的急性肿瘤也可以表现为不同细胞类型的肿瘤，如成红细胞瘤、纤维肉瘤、成髓细胞瘤、由不成熟巨噬细胞形成的髓细胞样瘤、由不成熟巨噬细胞或者成纤维细胞形成的内皮细胞瘤等。诱发急性肿瘤的ALV一般都带有肿瘤基因，为复制缺陷型病毒。5 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用1.1.6ALV的致瘤机制鸡是目前已分离到的所有ALV的天然宿主，一些野鸡、鹧鸪、鹌鹑等其他鸟类也可以感染。致瘤性是评判禽白血病致病性的重要指标，根据ALV引发肿瘤的快慢，可以将禽白血病病毒分为两种致瘤机制——慢性致肿瘤ALV和急性致肿瘤ALV。慢性致肿瘤ALV：慢性致肿瘤ALV基因组当中没有原癌基因，但是基因结构完整，可以独立完成复制。它们能够导致肿瘤是因为ALV基因组通过整合重组入侵到宿主细胞染色体基因组当中，形成了前病毒cDNA，而后插入到细胞原癌基因中，从而间接地启动了宿主染色体基因组当中原癌基因的转录（Haywardetal.,1981;Sourvinosetal.,2000；Kaetal.,2009）。此后，细胞的原癌基因被前病毒DNA中的LTR序列的启动子或者增强子激活，导致细胞肿瘤基因的异常表达，进而改变了细胞的分化和生长的活性，转变为肿瘤细胞，最终产生肿瘤。不同亚群的禽白血病病毒对于插入到宿主细胞的基因位点的选择有着不同的偏好。例如，J亚群往往容易插入到MYC、TERT和ZIC1等基因之前，这可能与J亚群导致肿瘤等密切相关（Lietal.,2014）；而A、B亚群除了插入到上述位点之外，还往往容易插入到TNFRSF1A、CTDSPL等基因的上游，所插入到的这些基因都与淋巴细胞瘤的发生和发展有着密切关系。当慢性致瘤性ALV感染鸡后，前病毒cDNA的LTR序列插入到细胞某个原癌基因的相应位点是个概率非常小的事件，这也就是为什么通常只有小部分感染鸡会发生肿瘤而且要经过非常长时间的潜伏期才能发生肿瘤的原因所在。急性致肿瘤ALV：不同于慢性致瘤性ALV，急性致肿瘤ALV在其本身的基因组当中就携带有致瘤基因，这些基因都来自于正常细胞的肿瘤基因，是在长期的进化和筛选中通过基因重组而获得。它们不受细胞正常的调控控制，导致该类基因产物的大量表达，改变了细胞的分化、生长过程，导致了细胞的肿瘤化转变，进而形成了肿瘤。例如，Bishop等从RSV当中发现了病毒带有肿瘤基因，而且这个基因就来源于正常鸡体的原癌基因c-src。在RSV基因组中，鸡的原癌基因取代了禽白血病病毒基因组的整个pol基因以及部分gag、env片段。这样，病毒在感染细胞后，不论其前病毒cDNA整合到细胞染色体基因组的哪个部位，肿瘤相关基因产物都有很大的可能会过量表达而诱发细胞转化为肿瘤细胞，因此在感染鸡后就会很快诱发肿瘤。不过，这些失去了pol、gag、env基因片段的病毒都属于复制缺陷型病毒，必须要有辅助性ALV同时感染一个细胞才能复制，其本身无法单独完成复制过程。在自然界正常发病的鸡群中，急性致肿瘤性白血病并不多见。6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1.1.7ALV的流行病学特点1.1.7.1宿主范围ALV的天然宿主是鸡，只有少部分是从野鸡、鹧鸪、鹌鹑等其他鸟类等分离得到的，余下的都是从鸡中分离得到的。近几年来，我国有学者还报道过从东北地区的一些野鸟，比如野鸭中，利用PCR检测技术检测到ALV-J，其在流行病毒方面的意义还有待证实和进一步阐明（李德龙等,2013;杨波等,2013;Lietal.,2013;Haoetal.,2014;Jiangetal.,2014;Zengetal.,2014;Hanetal.,2015）。但是在人工接种的实验室条件下，有些禽白血病病毒毒株却能呈现出较广的宿主范围，在一些很年幼的动物接种后或者是在诱导免疫抑制的动物连续传代后，一些ALV毒株甚至可以在一些比较特别的宿主内适应并复制。比如，RSV可以在鸡、野鸡、珍珠鸡、鸭、鸽子、鹌鹑、火鸡和石鹧鸪体内诱发肿瘤。一些RSV毒株还能在包括猴子在内的哺乳动物体内诱发肿瘤。最近，我国也有学者报道称，在山鸡和鹌鹑体内人工接种ALV-J则可感染宿主在其体内复制并诱发淋巴细胞瘤，但还没有发现诱发任何临床病理变化，其具体的致瘤机制还有待进一步查验（李建亮,2015）。1.1.7.2传播方式禽白血病病毒可以通过横向传播和垂直传播两种方式进行病毒传播。垂直传播：通过感染的鸡胚从母鸡垂直传染给下一代鸡是禽白血病传播最重要的途径。在传播的过程中，病毒是通过种用母鸡输卵管的卵白分泌腺产生ALV粒子而传播给下一代，这是因为在大多数能从生殖道传播ALV的母鸡，在其输卵管的壶腹部当中其病毒滴度最高，这就表明了导致鸡胚感染的病毒主要来自输卵管产生的ALV而不是其他部位产生的，并且通过电子显微镜观察也能看出输卵管的峡部也能大量复制产生ALV。但是，并非所有在卵白中含有ALV的蛋都能够产生被感染的鸡胚或雏鸡。在一些学者的研究中已经证明，用卵白中含有ALV的种蛋孵化得到的鸡胚中，只有1/8~1/2比例的鸡胚存在病毒感染。这有可能是因为卵白当中的病毒会被卵黄囊中的抗体中和或者由于热的灭活作用导致了只有部分带有ALV的种蛋在孵化出壳后带毒而呈现为先天性感染。而另一方面，在一些检测不到群特异性p27的抗原的鸡胚中，却有可能存在ALV先天性垂直传播。鸡胚的先天性垂直传播和母鸡输卵管当中的病毒及病毒像卵白中的排毒密切相关，也和母鸡本身的病毒血症等密切相关。另外，在感染鸡胚的多种器官当中都可以检测到病毒粒子，尤其是在胚胎的胰腺腺泡细胞当中也可以发现大量病毒出芽和聚集。这些具有高度传染特性的病毒粒子极有可能释放到刚出壳的雏鸡的排泄物7 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用当中，并且还会在其成长过程中继续存在于感染鸡的唾沫和粪便当中，在与其他鸡的接触后成为向其他鸡传播的传染源，引发横向传播。垂直传播实现了从曾祖代到祖代，祖代到父母代，父母代再到商品代鸡群的扩散和传播，且呈现逐级放大的趋势。并且，垂直传播还能够引起感染鸡的免疫耐受，使鸡不能产生相应抗体，导致其终生带毒，甚至可能诱发产生成髓细胞瘤。因此，垂直传播给养殖业带来的危害非常大。公鸡在ALV垂直传播中的作用还不够明确，但其精液中极有可能带有病毒，并在配种的过程中成为接触感染或者横向传播的感染源，至于其能否成为垂直传播的渠道还有待进一步研究。横向传播：由于ALV的理化性质导致了其对外界环境的抵抗力比较弱，在体外环境中不会存活太长时间，可以通过对鸡舍使用巴斯消毒液、SDS等消毒剂去污剂等对其进行消毒处理，消灭ALV的传染性，因此其横向传播能力相对较弱，但是其产生的危害仍不可忽视。经过垂直传播而携带病毒的鸡胚在孵化出壳后，其在孵化厅和运输箱这种高度密集的环境下，与其他雏鸡的直接接触大大增加，可以导致相当高比例的初出壳的雏鸡之间的相互横向感染，在运输箱中共同生活1~2天内可以达到30%的感染率。除了上述所提到的垂直传播和横向传播两种方式外，ALV还可以通过人为传播，特别是给雏鸡接种外源性ALV污染的弱毒疫苗等方式导致了ALV的传播和扩散。并且，在疫苗免疫的过程中，由于不更换注射器的针头，极有可能在接种完感染鸡后紧接着接种空白未感染鸡而导致ALV的横向传播。这种因为人为操作的失误而导致的人为传播往往是灾难性的，因为它能让鸡群内的大多数个体同时感染，特别是在对ALV相当易感的雏鸡阶段时会引起鸡群的生长迟缓、免疫抑制以及后期肿瘤的产生。对于实施ALV净化的种鸡场而言，一旦污染了外愿ALV，这就意味着之前为鸡场净化所做的一切努力都要推倒重来。1.1.7.3鸡对ALV感染的免疫反应及病毒血症动态ALV感染鸡群后能够诱发其产生免疫反应，但其所产生的免疫反应的发展动态似乎其他病毒感染鸡群后所产生的显著不同，免疫反应的强度也显著低于其他病毒，并且针对不同品系的鸡所产生的免疫反应也都不尽相同（PayneL.N.etal.,1993）。通过ALV垂直感染的鸡或者在出壳后不久感染的雏鸡，都会产生严重的免疫抑制反应，会显著抑制感染鸡对后期免疫的疫苗或者抗原的抗体反应，更为显著的抑制感染鸡对本身感染的禽白血病病毒的免疫反应，呈现出免疫耐受感染。这就导致了相当高比例的感染鸡自始至终都不能发生抗体反应，不能产生对抗ALV抗原的抗体，也有可能出现抗体反应滞后，最终，导致了感染鸡在很长的时期内都呈现持久或者间隙性病毒血症甚至终身病毒8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文血症。但是，感染鸡的免疫功能会随着年龄的增长而逐渐成熟，对ALV的抵抗力也会一天天地逐渐增强。大多数感染禽白血病病毒的成年鸡，都可以逐渐产生抗体反应，但是不同个体之间在血清抗体反应的强度和持续时间上存在很大的差异。根据鸡群感染ALV后有无病毒血症（V+或V-）或对ALV血清抗体的阴阳性（Ab+或Ab-），可以将ALV感染鸡群的感染状态分为以下四种类型：V+Ab-（病毒血症阳性，抗体阴性）、V+Ab+（病毒血症阳性，抗体阳性）、V-Ab+（病毒血症阴性，抗体阳性）、V-Ab-（病毒血症阴性，抗体阳性）。在一个已被ALV感染的鸡群的不同时期，这四种感染状态的鸡所占的比例是不同的，且在时刻变化当中。一般情况下，随着鸡群年龄的增长，处在V+Ab-和V+Ab+感染状态的鸡所占的比例会逐渐减少，而处在另两种状态的鸡所占的比例会逐渐增多。此外，影响ALV致病性的多种因素都可能影响鸡群中这四种感染状态的比例，只是年龄因素是最大的影响因素。由垂直感染的鸡胚孵化出的雏鸡，多表现为V+Ab-，只有病毒血症表现为阳性，而并无抗体反应，抗体呈阴性，称之为耐受性感染，其持续时期相当长甚至终生持续该状态。如果这些鸡发育到性成熟阶段，最容易将病毒垂直感染给下一代，也是这些鸡最容易发生免疫抑制并且诱发肿瘤，引起的死亡率也最高。在已经孵化出壳后才感染ALV的雏鸡当中，一部分雏鸡会表现出V+Ab-状态，另外一部分雏鸡会表现出V+Ab+。并且，随着雏鸡的生长，V+Ab+状态所占的比例会逐渐增加，有的雏鸡会再进一步转变为V-Ab+状态。已经成年的鸡感染ALV后，通常只在很短暂的时间内表现为病毒血症阳性，并且还处于抗体反应的潜伏期，这时会呈现V+Ab-的感染状态，但是随即该状态消失，转变为抗体阳性病毒血症阴性的V-Ab+状态。但是，由于抗体反应弱且持续时间相对较短，有些V-Ab+状态的鸡并不能检测到白血病抗体，呈现出V-Ab-，而误以为是没有被感染的鸡。鸡群中这四种感染状态之间相互转化的动态与肿瘤的发生以及死亡率等都有密切相关，病血呈现阳性的鸡尤其是病血阳性但抗体阴性的鸡所占比例越高，该状态维持的时间越长，鸡群发病的可能性就越大，发病率也越高。1.1.8ALV的检测和诊断可以通过禽白血病在鸡群中的流行病学、临床症状以及病理剖检查看引起的肿瘤的表现形式来进行初步的判断，但是由于鸡马立克氏病毒（MDV）和禽网状内皮组织增殖症病毒（REV）和禽白血病三种病毒在肿瘤的表现上都存在多样性，而且一些表现又常常类似，因此要对禽白血病进行确诊，还需要在实验室条件的基础上运用病毒的分离鉴定、血清抗体检测、病毒基因检测等方法。同时，为了确保检测的准确性，避免假阳9 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用性和假阴性结果的出现，最好使用两种或两种以上的检测手段进行对比检测，对不同检测方法出现结果差异的要重复检测或者使用另外一种方法进行验证。病毒的分离与鉴定：病毒的分离和鉴定是对禽白血病进行诊断鉴别并区分亚群的最重要的诊断手段。最常用的检测样品有全血、血浆、血清、各种组织脏器、精液、蛋清、鸡胚、泄殖腔和阴道拭子、肿瘤病灶等。将处理好的样品悬液接种到鸡胚成纤维细胞或传代细胞系DF-1细胞上。虽然此前有报道称感染ALV的CEF经过多次细胞传代培养后会使其在形态上发生一些变化，但是大多数的ALV在DF-1和CEF上培养时通常不产生细胞的病理变化，因此不能通过显微镜观察细胞的病变来确诊，而是需要在维持细胞生长5~7天后通过特异性抗原检测法或者核酸检测法等来发现和鉴定所分离到的病毒。对于一些病毒含量较低的病料样品，可能需要在细胞上连续传代3代左右才能检测到。利用ALV-p27抗原检测试剂盒只能初步鉴定感染ALV，但是要区分亚群还需要通过间接免疫荧光反应（IFA）和PCR扩增并对扩增产物进行测序来进一步确定亚群。血清抗体检测：从群体防控的角度来看，对鸡群进行ALV抗体的检测是非常必需的，这是用来评估鸡群是否被外源性ALV感染的重要依据。目前，市面上已经有各种用于检测抗体的试剂盒，分别针对不同亚群，针对A/B抗体和J抗体的试剂盒被广泛应用于ALV流行病学调查（郭慧君等,2010）。对于特定厂家的特定产品，都有特定的使用说明书，在使用的过程中，应该严格遵守各商品对应的使用说明书上的操作步骤，不能随意改动，否则将会导致检测结果的不准确，厂家对如此检测结果的可靠性也不承担责任。但是，利用此类试剂盒进行检验的过程中也会遇到假阳性的结果，此时，应该反思是否是因为技术性的原因，或者是试剂盒本身发生质量问题，进行重复试验或者使用IFA等其他方法进一步确诊。病毒基因检测：最常见的病毒基因检测技术是普通PCR的扩增，通过根据保守序列设计一段引物用来扩增ALV基因组当中的特定片段来判断是否感染ALV。此方法操作简单、快速，并且成本较低。除了普通PCR扩增之外，还有多重PCR、套氏PCR、LAMP、荧光定量PCR、基因芯片、竞争ELISA等诸多方法都广泛应用于ALV的基因检测（Silvaetal.,2007;Zhangetal.,2010;Sunetal.,2011;Zhouetal.,2011;王莉等,2013;Daietal.,2015;Pengetal.,2015;Qianetal.,2015;苏霞等,2015）。另外，值得一提的是，崔治中等（2011）研制出一种RT-PCR结合核酸探针斑点杂交（Dot-Blot）方法检测外源性ALV的试剂盒，其核心是利用PCR/RT-PCR技术将样品中含量较低的病毒基因组核酸扩增，这样即使很少量的病毒经过扩增后其病毒含量也会呈指数倍扩增达到相对较10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文高的浓度，而后在用针对A/B或者J亚群的特异性核算探针进行斑点杂交来确定其特异性。此方法灵敏度高，特异性好，具有很好的操作性和可重复性，适用于大批量样品的检测，极大地缩短了样品检测的时间，对ALV的诊断和检测具有重要作用。1.1.9ALV的防控措施我国鸡群中禽白血病的感染率、发病率和死亡率还比较高，并且呈现出我国特有的特点。因为我国地方品系鸡种类繁多、种鸡场规模庞大、分布区域广泛，并且垂直传播、横向传播和人为传播严重，导致我国禽白血病的防控和净化的难度都非常大。另外，目前还没有研发出针对ALV的商品化疫苗来预防禽白血病，因此，要实现预防和控制禽白血病就需要采用严格的综合性生物安全措施。在采取的各项措施中，最核心的是保证种源的净化，这与前面提到的禽白血病传播有关。如果一个种鸡场中，有一只鸡感染ALV，就能够通过垂直传播不断扩散到后代鸡群中，并且通过横向传播互相感染扩大传播面积，还能够通过人为操作而扩散，因此保证纯净的种源非常重要，这就需要我们对原种鸡场的ALV净化下大力气去做。以下是几点在鸡群净化时需要遵守的几项基本原则：①孵化和饲养规模要小，在20～50只/群为宜；②对鸡群中的每一只鸡都要采集抗凝血进行病毒分离检测，对于p27结果为阳性的鸡要全数淘汰；③在选用弱毒疫苗之前要找专业的机构进行严格的检测，绝不使用污染或疑似污染的疫苗；④在孵化时要保证各鸡群之间隔离，禁止混用和共用，杜绝横向感染。在对ALV的净化过程中，国外的一些跨国育种公司总结出一套比较完备可靠的净化方法：无菌采集核心鸡群的每只鸡的抗凝血后，离心取血浆接种于DF-1细胞，并在感染1天后换为维持液培养9天后取细胞上清液，利用p27抗原检测试剂盒检测是否感染外源性ALV，将病血检测为阳性的鸡全部淘汰。除此之外，当鸡群生长到68日龄和168日龄时要连续做两次病毒分离，淘汰阳性鸡，以此来保证子代鸡群的纯净。对于刚出壳的雏鸡，要通过检测胎粪p27来淘汰阳性雏鸡。通过这样的模式可以基本实现种群的净化，此后，只需抽样监控即可。但是，这种净化方式耗费了大量的人、财、物等资源，而且对于我国特有的一些地方品系鸡而言不具有可操作性，极有可能会导致某些地方品系鸡被全部淘汰。为了保护我国特有的地方品系鸡，更好地适应我国国情做好ALV的净化工作，可以将提高遗传抗病性作为重要的措施和手段，筛选抗病品种将成为未来发展趋势，特别是无内源性ALV商品鸡系的成功建立，说明该举措是一项切实可行、可操作性的防控11 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用措施（Baconetal.,2004;Zhangetal.,2008）。我国很多地方品系鸡是世界独有的品种，为了保护这些珍贵品种，筛选抗病育种将成为以后工作的重点方向。除了抗病育种方面的努力，我们还可以通过使用药物来进行治疗。这对于我国一些亟待净化的种鸡场而言，具有良好的辅助作用，可以通过给雏鸡服用抗白血病的药物来减少病毒的横向传播（Chenetal.,2007;Qianetal.,2014;Weietal.,2015）。在药物的选择上，可以参照治疗艾滋病的相关药物，艾滋病和禽白血病病毒均属于反转录病毒，药物的作用机理相似。1.2核苷类药物简介1.2.1核苷类药物的应用概况艾滋病（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）是一类由人类免疫缺陷病毒（humanimmumodeficiencyvirus,HIV）引起的免疫功能缺陷为主的综合征，又称获得性免疫缺陷综合征。其主要特征为HIV特异性的攻击T细胞，导致人体免疫系统瘫痪，最终诱发系统感染各类疾病并产生肿瘤。自1981年首次发现至今，已造成全球逾2500万人死亡，危害着人类的生命健康（Hahnetal.,2000）。目前，药物治疗是治疗艾滋病的一项重要措施，相关药物主要有以下几类：蛋白酶抑制剂（PI），核苷类逆转录酶抑制剂（NRTI），非核苷酸类逆转录酶抑制剂（NNRTI）。其中，常见的核苷类逆转录酶抑制剂药物有AZT、ddI、ddC、d4T、LAM、abacavir，均为DNA合成天然底物的衍生物。齐多夫定（AZT）：它是世界上第一个应用于临床的抗逆转录病毒的药物（MitsuyaHetal.,1985），也是第一个获得美国FDA批准生产广泛应用于市场上治疗HIV的药物，也是唯一一个被批准用于预防艾滋病在母婴间传播的药物，开启了抗逆转录病毒药物研究发展的大门。AZT为脱氧胸苷的类似物，可以与病毒的DNA聚合酶结合，终止DNA链的增长，阻止病毒的复制，从而延缓艾滋病的发病流程，推迟机会性感染。口服吸收迅速，服用胶囊经首过代谢后，生物利用度为52%~75%。以2.5mg/kg静滴1小时或者口服5mg/kg后，血药浓度可达到4~6μmol/L。其代谢产物约有74%经尿排出体内。拉米夫定（LAM）:由加拿大BiochemPharma公司研发的逆转录酶抑制剂类药物，于1995年在英国和美国上市。它具有非常强的抑制HIV-1逆转录酶活性，单独使用可在使用后一周内使体内病毒载量下降到10%~1%，并且具有细胞毒性小的特点。使用口服方式机体能够快速吸收，和奈韦拉平、沙奎那韦、AZT、ddI、地拉韦定、司他夫定12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文等药物有协同抗HIV-1作用，并且将齐多夫定和拉米夫定联合使用时，表现出比较好的耐受性。1.2.2核苷类药物的作用机理NRTI在进入被AIDS感染的细胞之后，在宿主酶的作用下，必须经过几步反应使其磷酸化转变为活性分子三磷酸化核苷，而从本身没有抗HIV活性转变为有抗HIV-1活性。因为NRTI的结构和dNTP底物非常相似，当它与宿主体内内源性的dNTP发生竞争都在RT的底物活性部位发生作用时，RT就会将NRTI误以为是dNTP底物并将其应用到DNA的延长过程中。但是NRTI的结构和dNTP的结构还是具有差距的，它没有能和下一个dNTP进行3’-5’相连的3’-羟基，所以如果NRTI在DNA的复制过程中能够嵌入到DNA链中，就会阻断DNA链的继续延长，从而起到抑制HIV复制的效果。齐多夫定：AZT与脱氧胸腺嘧啶核苷酸（T）在结构上具有很大的相似性，在反转录的过程中，逆转录酶会将其误以为是T而将其利用，但是齐多夫定缺少脱氧核糖第3位上的羟基，当逆转录酶将其利用后它不能与下一个核糖核苷酸上的5’端羟基与磷酸酯化相连，无法形成具有连接作用的3,5-磷酸二酯键，从而导致DNA链的编码在此处中断，进而阻止了HIV的复制。拉米夫定：当拉米夫定进入细胞后，就会被磷酸化，有不具活性的拉米夫定转变为有活性的三磷酸拉米夫定。由于拉米夫定的分子结构类似于脱氧胞嘧啶核苷酸结构，在反转录的过程中，逆转录酶错将其以为是脱氧胞嘧啶核苷酸而被利用，将其用于DNA的复制过程当中，但是LAM脱氧核糖与脱氧胞嘧啶核苷酸相比，其在第3位缺少羟基，导致其无法和另一核糖核苷酸上第5位羟基与磷酸酯化相连而无法形成3,5-磷酸二酯键，导致了DNA链的编码中断，从而抑制艾滋病病毒的复制(Akilimalietal.,2015;Geleziunasetal.,1993;Kewnetal.,1997)。拉米夫定具有很多优点，服用方便，易于吸收，细胞毒性小，在临床用药上已被广泛应用，成为临床上治疗和对抗艾滋病的首选核苷类逆转录酶药物。1.3本试验研究的目的和意义ALV可以通过垂直传播方式扩散，并且这种扩散是呈指数级扩大的。如果一个曾祖代种鸡感染ALV，那么它所孵育出的所有祖代种鸡、以及祖代种鸡孵育出的所有商品化鸡全都感染ALV。目前，尚未研制出针对ALV的商品化疫苗，鸡群一经感染无法治愈。在病毒垂直传播过程中，种蛋和精液起着决定性的作用。之前，我们一直不确定13 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用公鸡感染ALV是否影响其后代中对ALV的先天感染率，所以，在检测中我们只侧重于检测母鸡的血浆以及种蛋中是否有ALV感染，而忽略了精液的检测。本试验则对公鸡血浆以及公鸡精液进行了病毒分离，通过大量的样品检测，对血浆病毒分离结果和精液病毒分离结果进行了比对，研究了精液病毒血症检测和血浆病毒血症检测二者的差异性，让我们重新了认识精液在垂直传播过程中的作用，为种鸡场禽白血病的净化工作提出了新的要求。另外，ALV经垂直传播感染后，会引起感染鸡体重、产蛋率等各种生产机能下降，也会导致很高的致死率，给鸡群造成很大的危害，对于一些高阳性率的地方品系鸡群还存在淘汰过度影响育种的现实问题，我们希望通过多种途径能够降低高阳性率鸡群雏鸡的带毒率或至少减少由于垂直传播带毒对雏鸡的致病作用，为此本研究通过鸡胚卵黄囊接种模拟雏鸡感染ALV，通过给感染雏鸡添加AZT等逆转录酶抑制剂类药物观察此类措施对降低ALV垂直传播危害的作用。2材料和方法2.1试验材料2.1.1病料来源与毒株来源病料来源：试验所用的所有血浆和公鸡精液均采集自国内某野山鸡场（代号SH）和某种蛋鸡场（代号JF），共计1673份公鸡精液、2057份血浆样品，并将阳性样品存于-80℃保存以备后续使用。毒株来源：NX0101株（GenBankaccessionNo.DQ115805）是本实验室在2001年从宁夏回族自治区某父母代种鸡场分离到的野毒株（Cuietal.,2003a），经过间接免疫荧光试验和RT-PCR结合斑点杂交等方法鉴定无REV，MDV，CIAV和IBDV污染，在抗内源性E亚群ALV的DF-1细胞上扩增后冻存于-80℃备用。2.1.2细胞DF-1细胞购自美国ATCC公司，该细胞对ALV-E有抗性，由本实验室连续传代培养并冻存于液氮保存。鸡胚成纤维细胞（CEF）由济南赛斯家禽科技有限公司购买的SPF鸡胚经本实验室人员制备。2.1.3药物和疫苗拉米夫定原粉、齐多夫定原粉购自葛兰素史克公司，并放于室温避光保存，在使用时现配现用，避免长时间放置。14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文鸡新城疫灭活疫苗（LaSota株），禽流感灭活疫苗（H9亚型,LG1株）均购自齐鲁动物保健有限公司。2.1.4试验动物与SPF饲养设施本试验所用的SPF鸡，由从济南SPAFS家禽科技有限公司购买的SPF鸡胚在本实验室由专用孵化器孵育21天后出壳得到1日龄SPF雏鸡；并将所有孵育出壳的雏鸡放于动物房的SPF鸡饲养隔离罩内饲养。2.1.5主要试剂和试剂盒用于普通PCR合成的DNA聚合酶（rTaq）、dNTP、10Buffe（r含有Mg2+）、PMD18-T连接载体试剂盒均购自大连宝生物公司；Trans2KDNAMarker购自北京全式金公司；凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司，蛋白酶K、氨苄青霉素、青霉素、硫酸链霉素、两性霉素B购自Amreso公司；肝素钠粉末购自Solarbio公司；DMEM培养基、胎牛血清、小牛血清、胰蛋白酶均购自美国Invitrogen公司；乙醇、氯仿均为国产分析纯；一次性96孔、24孔、6孔细胞培养板、一次性细胞培养大平皿均购自Costar公司；ALV特异性抗原检测试剂盒（AvianLeukosisVirusAntigenTestKit）、J亚群抗体检测试剂盒（AvianLeukosisVirusALV-JAntibodyTestKit）均购自美国IDEXX公司。2.1.6药物的配制根据所需喂药的鸡的数量确定需要配制的药物的量，保证每只鸡每天饲喂5mgAZT和2mgLAM，最终确定配制药物浓度为25mg/mlAZT和10mg/mlLAM。在给药期间，每天均称取0.300gAZT和0.120gLAM溶解于12mlPBS缓冲液中，充分溶解后，分装到12只1ml注射器中，放于室温保存备用。2.1.7其他试剂的配制（1）氨苄青霉素（Amp）：用电子天平称取10gAmp粉末融入到100ml去离子水中，完全溶解后用注射器吸取经由0.22µm滤膜滤器过滤到已灭菌的干净的1.5ml离心管中，将其放于-20℃冰箱中保存。（2）LB液体培养基：用电子天平称取胰蛋白胨10g，酵母胰提取物5g，NaCl10g加入到事先刷好的锥形瓶中，用量筒量取1L去离子水倒入锥形瓶中溶解，充分混匀溶解后将其分装到干净的溶液瓶中放于高压灭菌锅中在121℃温度下灭菌20min后拧紧放于室温冷却备用。（3）LB固体培养基：在配制液体培养基的基础上，按照1.5g/100ml比例向其中加入琼脂。经高压灭菌锅灭菌后，在室温下冷却至60℃左右时，在分子超净台操作环境下向其15 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用中加入1μl/ml浓度的Amp，将其均匀地倒于干净无菌的塑料平皿内，待其冷却凝固后放于4℃冰箱保存备用。（4）CaCl2溶液：用电子天平准确称取1.1g无水CaCl2颗粒，将其放入到100ml小溶液瓶中，用100ml量程的量筒量取100ml去离子水将其溶解，配制成0.1mol/L的浓度。然后将其用0.22μm虑膜过滤器过滤到新的干净的灭过菌的溶液瓶中，并放于-20℃冷冻柜中保存。（5）PBS缓冲液：用电子天平称取NaH2PO4·2H2O0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8.0g，加入到950ml去离子水中，使用PH测量仪将其PH调定至7.3，然后加去离子水定容至1000ml，经高压灭菌锅灭菌后放于室温保存。（6）肝素钠抗凝剂：将订购的一整瓶肝素钠粉末全部溶解到200ml灭菌PBS溶液中，待其完全溶解后用0.22μm虑膜过滤器过滤至干净无菌的溶液瓶中，并放于4℃冰箱存放。（7）50×TAE电泳缓冲液：称取242gTrisBase粉末，量取57.1ml冰醋酸溶液和100ml0.5M的EDTA溶液（pH为8.0）到锥形瓶中，量取750ml去离子水溶解，完全溶解后定容至1000ml。（8）1%琼脂糖凝胶：根据样品数按照0.8%~1.2%的比例称取琼脂糖溶解于50×TAE电泳缓冲液中，在微波炉中加热溶解大约2min后，当冷却至60℃左右时加入1~2滴EB替代物，晃匀后倒胶，凝固后使用。2.2方法2.2.1净化鸡群种公鸡的病毒分离鉴定与gp85分析2.2.1.1血浆的采集与接种对正在实施净化的某蛋种鸡场和地方品系种鸡场的种公鸡采集血浆实施病毒分离，首先在1ml一次性注射器中无菌吸取大约0.2ml肝素钠抗凝剂，无菌采集种鸡场中种鸡的静脉血，并对每一支血液进行编号。如采集后无法立即接种到细胞上，则将其放于4℃冰盒中暂时保存。在超净工作台中将注射器中的血液慢慢推到灭菌离心管当中，用镊子挨个夹起离心管以盖紧离心管的管盖，并将注射器和离心管一一对应，将注射器上的编号抄写到离心管表面。然后置于4℃恒温离心机中以2200rpm的转速离心2min，吸取中间的淋巴细胞接种到生长密度为70~80%的24孔DF-1细胞板上，在侵染2h后，将DF-1细胞原来的胎牛血清浓度为13%的生长液倒掉换为胎牛血清浓度为2%的维持液维16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文持。2.2.1.2精液的采集与接种在采集精液时，先用酒精棉球将泄殖腔周围擦拭干净，对种鸡场当中的公鸡精液采集到1.5ml离心管中，一只公鸡的精液对应一个离心管，并将其编号防止出现混淆，放入4℃冰盒中暂存。将精液接种到细胞上时，首先需要制备稀释液，因为精液在采集过程中，无法做到像采集抗凝血那样高度无菌，因此在PBS缓冲液中需要加入1ml两性霉素和1ml双抗以抑制细菌和真菌的生长。然后在灭菌1.5ml离心管中加入80μl稀释液和20μl采集的精液混匀稀释，在3000rpm的4℃离心机中离心3min。将上清液在无菌超净台中取出100μl加入到DF-1细胞上，侵染3h后，用灭菌PBS溶液润洗细胞除去精液，换为维持液，7d后取细胞上清，分两份冻存在-80℃冰箱中，取小剂量的一份反复冻融两次后测定p27。2.2.1.3细胞上清ALV抗原的检测收集2.2.1.1和2.2.1.2中血浆和精液病毒分离到的细胞上清，使用IDEXX公司的ALV抗原检测试剂盒对每个孔的细胞上清中的p27含量进行检测鉴定。具体操作步骤如下：（1）从4℃冰箱中取出反应板，放于22~25℃恒温箱中孵育片刻使其恢复到室温。（2）将阴性对照震荡混匀，用移液器依次吸取100μl加入到A1和B1孔中，将阳性对照震荡混匀，依次吸取100μl加入到C1和D1孔内。按照细胞板的顺序依次在剩余的检样孔加入100μl细胞上清，并在记录表上相应位置记录样品的编号。加样完毕后将反应板放置在25℃恒温箱中孵育并计时，计时时间为1h。（3）孵育结束后，将反应板中的样品倒掉，用大约350μl去离子水洗涤反应板，轻微震荡反应板，并注意每个孔的液体相互之间不要互混。如此反复洗涤4次，在洗涤的最后一次将反应板中的液体全部倒掉，并在吸水纸上轻轻拍打反应板（手指不可碰到反应板底部），减少孔中的水分残留。（4）用8道移液器向反应板的每个孔内加入100μl的辣根过氧化物酶标记的抗p27抗体，置于25℃温箱中孵育1h。（5）重复步骤（3）。（6）在反应孔加100μlTMB底物显示溶液，继续在25℃温箱中孵育15min。此时，可以将电脑和酶联检测仪打开进行自检和空气调零，并设置好软件的各选项。（7）孵育结束后，将反应板取出，在每个孔中加入100μl终止液，终止反应。17 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用（8）将反应板放于酶联检测仪上，测定样品在OD650波长下的吸光度，记录结果。（9）结果判定标准：只有当结果显示阴性对照平均值不高于0.150，阳性对照平均值与阴性对照平均值的差值大于0.200时，才表明本次操作的结果是可靠有效的。所检测的样品上清当中是否还有ALV抗原与其在650nm波长下的吸光度有关。具体计算公式为：S/P=（所测样品平均值-阴性对照平均值）/（阳性对照平均值-阴性对照平均值）。当S/P值大于0.2时，说明所测样品p27抗原为阳性，相反，则说明是阴性。对于p27读值在1.000以上的样品，可以将其细胞上清收到灭菌离心管中，并冻存于-80℃保存留做后续实验。对于读值较低的样品，可以进行细胞传代培养至其p27读值至1.000以上后收集上清冻存并保留细胞。细胞传代具体操作为：将细胞上清倒掉之后，先用PBS缓冲液将细胞板内残余的维持液洗净，再在每个孔中悬空加入500μl左右的胰酶消化液，注意枪头不能直冲细胞，要对着细胞板壁加入。然后将细胞放置在显微镜下观察细胞的消化状态，当消化好后向每个孔加入1ml的生长液终止消化，并将细胞轻轻地吹打下来接入到新的细胞板上生长。当细胞长满后，换为2%的维持液维持7天后，测定其p27读值。2.2.1.4感染细胞DNA的提取收集2.2.1.3当中p27读值大于1.000的样品的细胞，通过以下操作提取细胞DNA。（1）将维持液收好后用PBS缓冲液清洗细胞板，然后将其放于-20℃冰箱中冻存片刻，取出细胞板，加入1mlPBS溶液将细胞吹打下来，用移液枪转移到1.5ml离心管中，放于高速离心机中以12000rpm的转速离心4~5min。（2）倒掉上清，用大约50μlPBS缓冲液重悬。（3）向每管中加入500μl的组织抽提液以破碎细胞，再加入10μl蛋白酶，放在55℃恒温水浴锅中消化4h以上。（4）消化充分后，加入和离心管中液体等体积的苯酚溶液，加入后放在振荡器上充分振荡混匀，然后静置片刻待其分层。（5）分层后将离心管放在4℃超低温离心机中，12000rpm离心15min。（6）小心地将离心后的上清液吸出来，注意一定不能吸到下方的蛋白质沉淀，然后再次向上清液中加入等体积的苯酚溶液。（7）重复第（5）步操作步骤，取出上清。（8）向上清液中加入氯仿溶液，同样，加入氯仿的体积要等同于取出的上清液的体积，震荡混匀后静置，使其分层。18 山东农业大学全日制硕士专业学位论文（9）再次重复第（5）步操作。（10）将离心后的上清吸出到新的离心管中，加入相当于上清液体积的2~2.5倍的无水乙醇溶液来沉淀DNA，此时注意要上下轻晃离心管混匀。（11）将离心管置于-20℃冰箱中冰浴至少2h以充分沉淀DNA。（12）4℃离心机，12000rpm，30min。（13）倒掉上清，每管中加入1ml70%的无水乙醇溶液，12000rpm再次离心10min。（14）倒掉上清，12000rpm轻微离心2min。（15）倒掉上清，用黄枪头将残余的上清液吸干净弃掉，放在37℃的室温环境下干燥30min作用以除掉残余的乙醇。（16）向每管中加入30~50μlTE和2~5μlRNA酶溶解DNA，放于37℃水浴锅中消化溶解40~60min，充分溶解后放于-20℃冰箱中保存备用。2.2.1.5分离毒株gp85的PCR扩增根据GenBank中已经公布的各亚群禽白血病病毒的基因组序列，利用Premier5.0软件设计了一对适用于不同亚群的通用引物，并交由华大基因科技公司合成，正向引物为5’-GATGAGGCGAGCCCTCTCTTTG-3’，反向引物为：5’-TGTGGTGGGAGGTAAAATGGCGT-3’。以提取的DF-1细胞的DNA做为模板扩增约2.2kb目的片段，该目的片段包含gp85序列。具体反应体系如下：表1常规PCR反应体系Table1ReactionsystemofroutinePCRexperiment成分体积ddH2O18.2μl10×Buffer(含Mg2+)2.5μldNTP(2.5mmol/L)2.0μl上游引物F(25μM)0.5μl下游引物R(25μM)0.5μl聚合酶rTaq(5U/μl)0.3μlDNA模板(100ng/μl)1.0μl反应体系为25μl体系，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共31个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，将PCR扩增19 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用产物通过0.8%~1.2%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行分析，于凝胶成像仪下观察并将目的片段切下回收，同时要做好实验记录。2.2.1.6gp85目的片段的回收使用E.Z.N.A.TM(Omega,Norcross,GA,USA)凝胶回收试剂盒对2.2.1.5中切下的凝胶做目的片段的回收与提纯，具体操作步骤如下：（1）在凝胶成像仪下切下目的条带，将其放入1.5ml离心管中称重，然后减去离心管的重量得到所切胶的净重量，按照0.1g/100μl的比例加入BindingBuffer，放置在55℃水浴锅中融化，每隔2~3min将离心管上下颠倒一次，促进凝胶的溶解。（2）凝胶完全溶解后转移到套有收集管的过滤柱中，以12000rpm转速离心30s左右使液体滤过柱子即可，将下液再次倒入过滤柱内重复此操作以增大目的片段的回收量，然后将下液弃掉。（3）向过滤柱中加入700μlSPWBuffer，以12000rpm转速简短离心30s使洗液滤过吸附膜，倒掉废液。（4）12000rpm空离2min充分除掉滤膜上的水分，然后将柱子转入到装入新的1.5ml离心管中，在每管中加入35μl于55℃水浴中事先预热的ElutionBuffer，孵育5~8min后以12000rpm转速离心1min，将离下的DNA液体再次用移液器吸取加入到吸附膜上，重复孵育离心以增加DNA的回收量，将收集的DNA置于-20℃保存备用。2.2.1.7回收片段的连接将2.2.1.6当中回收到的gp85目的片段连接到PMD-18T载体中，具体反应体系如下。表2回收产物连接反应体系Table2eactionsystemofligationexperiment成分体积PMD-18TVector1μlSolutionI5μl胶回收产物4μl总体积10μl简短离心后置于16℃低温恒温槽中连接过夜后，放于-20℃冰箱中保存备用，但只能保存较短时间，需及时做后续试验。20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2.2.1.8连接产物的转化（1）将2.2.1.7当中所得到的10μl连接产物全部加入到100μlDH5α感受态细胞中，放于冰水混合物中冰浴30min后42℃热激90s。（2）热激后立马将离心管转移到冰水混合物中放置2min。（3）加入800μl灭菌LB液体培养基，放在37℃恒温摇床上以150rpm转速培养1h。（4）待摇好后以3000rpm转速离心3~4min，弃去上清，用残余上清重新溶解菌体，吸取到LB固体培养皿上，用涂板器均匀涂布至完全吸收。（6）将板放于37℃恒温箱中倒置过夜培养。2.2.1.9阳性克隆菌的筛选与鉴定将2.2.1.8当中培养皿上长出的肉眼可见的单菌落挑到氨苄浓度为1μl/ml的液体LB中，37℃220rpm培养5~6h，按照2.2.1.5当中同样的反应体系和反应条件扩增菌液，反应模板为1μl菌液，反应结束后通过0.8%~1.2%浓度的琼脂糖凝胶电泳判断其阴阳性。将每个样品挑选出3个左右的阳性菌液，从中取出大约400μl送生工生物公司测定其序列。2.2.1.10序列测定与分析将2.2.1.9当中筛选的阳性菌液送于生工生物公司测定其序列，对测序结果通过EditSeq软件截取gp85序列。从GenBank中下载不同亚群gp85序列作为参考毒株，通过MegAlign软件比对所分离到毒株与参考毒株之间在gp85序列上的同源性，同时通过MEGA5.05软件做进化树分析，分析所分离到的毒株之间的差异性以及判断所分离得到毒株的亚群。参考毒株及其GenBank登陆号见下表：表3：用于序列比较的参考毒株及其GenBank登陆号Table3Informationofreferencestrainsusedforsequencecomparisonandtheiraccessionnumber毒株亚群GenBank登陆号StrainSubtypesAccessionNO.SDAU09C1AHM452339SDAU09C3AHM452340SDAU09E1AHM452341SDAU09E2AHM452342MQNCSUADQ36581421 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用B53ADQ412729SDAU09E3BJF826241WB11008bBJX570790SDO5O1EEF467236ALVE-B11EKC610517ev-1EAY013303ev-3EAY013304Oki_009FAB669433FGVFAB112960NX0101JAY897227ADOL-7501JAY027920GD1109JJX254901HN0001JAY897219JS11C1KKF746200GD14LZKKU605774GDFX0601KKP686142GDFX0602KKP6861432.2.2逆转录酶抑制剂类药物对鸡的保护作用2.2.2.1毒株的增殖和定量此前，本实验室对逆转录酶抑制剂类药物已有些许研究，为了保证研究的连续性，本试验则在其研究的基础上，继续选择NX0101毒株作为试验毒株。取出液氮保存的NX0101毒株接种至生长密度为70%~80%的DF-1细胞培养皿上，盲传3代换为胎牛血清浓度为2%的维持液中，维持培养7天后取100μl细胞上清液按照上述2.2.1.3操作步骤使用p27抗原检测试剂盒测定其p27读值，收集细胞上清液冻存于-80℃超低温冰箱中，并通过Reed-Muench法测定病毒的TCID50。具体定量操作如下：从-80℃冰箱中取出事先收集的细胞上清，用灭菌的黄枪头取100μl在灭菌的1.5ml离心管中做连续的10倍倍比稀释。第一个稀释度为100μl病毒原液与900μl空白DMEM混匀，第二个稀释度即为100μl第一梯度稀释液与900μl空白DMEM混匀。依此类推，一般情况下稀释到第八个稀释度即可。将病毒原液以及每个梯度的稀释液接种到96孔板DF-1细胞中，每个22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文梯度对应一列的8个孔细胞，感染2h后换成维持液，向每个孔中加入200μl维持液，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养7天后，取上清用2.2.1.3当中操作步骤使用p27抗原检测试剂盒测定每个稀释度的p27抗原，并按照公式计算病毒的TCID50。2.2.2.2实验设计由于考虑孵化器的孵化成活率问题，本次试验选择从济南SPAFS家禽科技有限公司购进80枚SPF鸡胚以确保在出壳后各种雏鸡数量，相关分组和处理按照下表进行，在6~8胚龄时对其中的60只鸡胚进行鸡胚卵黄囊接种103TCID50NX0101毒株，剩余20枚鸡胚接种同等体积的空白DMEM溶液，并将攻毒鸡胚和未攻毒鸡胚分别放在两个标准孵化器中进行孵育，出壳后连续一周内需对部分攻毒鸡做给药处理，剩余攻毒鸡接种等体积的生理盐水，未攻毒鸡胚也要注射等体积的生理盐水，所有雏鸡整个生长过程均饲养在隔离罩内。表4实验分组和处理Table4Groupofanimalexperimentandtreatment组别鸡胚数量攻毒处理给药处理3TCID用药组30卵黄囊接种1050/枚出壳后第一周肌注5mgAZT和2mgLAM3TCID不用药组30卵黄囊接种1050/枚出壳后第一周肌注等体积生理盐水生理盐水组20接种同等体积空白DMEM出壳后第一周肌注等体积生理盐水2.2.2.3病毒的接种与鸡胚孵化病毒的接种：对所有鸡胚均采用采用卵黄囊接种方式，具体操作步骤如下：（1）待鸡胚孵化至6~8日龄能够看清血管和鸡胚头部时，用照蛋器从鸡胚的钝端照胚，淘汰死胚，用铅笔在活胚头部对面的气室边缘上方0.5cm处划×做为接毒点。（2）照完所需的80枚鸡胚后，取出其中的60枚攻毒，鸡胚钝端向上放置在蛋托上，用75%酒精浸泡的棉球擦拭胚体气室端消毒。（3）在事先标记好的接毒点处，用酒精灯烧过消毒的小剪刀尖端扎一个小孔，用一次性1ml注射器吸取稀释好的病毒液，将注射器针头换为5ml注射器的针头，从小孔处上方垂直扎针，针头扎入大约3cm，缓缓推入所需剂量，然后用蜡烛在酒精灯火焰上轻燎封闭气孔。（4）把攻好毒后的鸡胚放回孵化箱继续孵育至出壳，每天观察照看。所有鸡胚均放在科裕孵化器中孵化，在孵化之前均用甲醛和高锰酸钾混合物对孵化23 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用器进行熏蒸，除去孵化器中原有病菌，保证SPF鸡胚孵育的无菌条件。2.2.2.4孵化雏鸡ALV-J感染状态的鉴定A、病毒分离鉴定：待鸡胚出壳后，立马对出壳雏鸡无菌采取抗凝血，按照2.2.1.1当中操作步骤做血浆的采集与接种，接种到DF-1细胞中，待血浆侵染细胞2h后换为胎牛血清浓度为2%的维持液维持，7d后按照2.2.1.3当中操作步骤使用p27抗原检测试剂盒检测所有雏鸡病毒分离p27阳性情况，判定雏鸡是否感染NX0101。B、PCR结合斑点杂交检测：对于病毒分离培养所得到的细胞，可以通过PCR结合斑点杂交的方法判定其是否感染NX0101并且排除其他病毒的污染。具体操作步骤如下：（1）根据所需检测的样品数量剪取适当大小的尼龙膜（Roche公司,LOT:11669000），在其表变覆盖的光滑薄纸上划好格子（0.75cm×0.75cm），根据所划格子来标记正反和上下，以便于识别。（2）将细胞提取DNA后经PCR反应扩增的产物取2μl分别点到剪好的尼龙膜上，并在样品记录表上做好标记，记录加样顺序。（3）将膜点样面朝上完全浸没于事先配好的变性液中变性10min后再于中和液中和5min。（4）用滤纸抵在膜的边缘吸净膜两边和平皿上的残余中和液至没有水珠，然后在80℃恒温干烤箱中固定DNA2h，使DNA牢牢地结合在膜上。（5）干烤后向放膜的平皿中加入20ml左右预杂交液放在事先设置好的68℃水浴锅中（温度视毒株而定）预杂交1.5h。（6）准备杂交液：将探针按照10~30ng/ml的浓度加入到预杂交液中，放在沸水中热变性10min后立马置于冰浴中迅速冷却并维持5min。（7）将平皿中原有的预杂交液倒掉，然后将处理好的杂交液倒入平皿中，继续放于水浴锅中杂交6h以上，通常过夜杂交。（8）次日，将杂交液回收到离心管中冻于-20℃保存可重复使用2~3次，向平皿中加入洗液I浸没膜并放在室温摇床上洗涤两次，每次15min。（9）洗I后倒掉放膜于洗液II中68℃（温度与本操作中5步骤的温度相同）继续洗涤两次，每次15min。（10）两次洗液洗涤后将膜放于BufferI溶液中室温洗涤1min。（11）将膜取出倒掉BufferI，向平皿中加入BufferII中在37℃浸泡30min，再用BufferI在室温环境下洗1min。24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文（12）将BufferII倒掉重新量取20mlBufferII加入平皿中，并在膜的周围分四个区域加入2μl碱性磷酸酶标记的抗Digoxiaenin抗体，37℃浸泡30min。（13）BufferI室温摇床洗涤5min×5次洗去未结合抗体。（14）BufferIII中浸泡洗涤2min后倒掉，重新加入20mlBufferIII，并根据所检测的样品数量加入对应体积的显色底物，一般情况下一个样品对应1μl显色底物。将膜置于37℃恒温箱中静置显色，显色终止后用自来水终止。2.2.2.5不同组别鸡体重的测定在雏鸡1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w日龄时分别对每个分组的每只鸡称量体重，在体重记录表上记录体重数值。把饲养期间内的死亡鸡剖检察看是否有病理变化，并详细记录每只鸡的死亡日期。2.2.2.6不同组别鸡ALV-J病毒血症的测定分别于1d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w日龄时无菌采集每只存活鸡的抗凝血，按照2.2.1.1中操作步骤做病毒分离，将血浆接种到CEF细胞上，在维持液中生长7d后取100μl细胞上清按照2.2.1.3中操作步骤测定每个样品的p27读值，检测各组SPF鸡的ALV-J的病毒血症。鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备：当鸡胚在孵化器中孵化至9~11胚龄时，用照蛋器照看鸡胚的生长情况，选取生长状态好的鸡胚做CEF细胞的制备。在细胞超净工作台内，用75%的酒精消毒棉球擦拭气室端消毒，先用火烧过的大镊子轻轻地敲开蛋壳，注意不要敲碎胚体，轻轻地将蛋壳一点点取走，用灭菌的小镊子揭开尿囊绒毛膜，将小镊子在酒精灯上烧一烧，在尿囊液中轻微接触以降低镊子温度，将镊子深入到蛋中夹起鸡胚，放入到灭菌的玻璃平皿中内，用灭菌PBS溶液轻柔地冲洗一次洗去鸡胚上多余的尿囊液，倒掉PBS溶液，用小剪刀和小镊子去掉鸡胚的眼、脑、四肢、内脏，将剩余的胚体转移到无菌迷你小烧杯中，再次用PBS缓冲液轻柔清洗3遍去除胚体上多余的血液至组织块发白，用小剪刀将胚体剪碎成非常细小的组织块后移入带有转子的灭菌三角瓶中，向其中加入事先配置好的消化液（胰酶、EDTA、PBS配制而成），放置到37℃恒温水浴磁力搅拌器上消化8~9min，2~3次，每次消化结束后将上清直接过滤到加入约5ml小牛血清的灭菌锥形瓶中。将锥形瓶中的上清液均匀地分装到2~3个10ml离心管中，1500rpm离心7min后，弃掉上清，用2~3ml小牛血清重悬细胞，分装到灭菌离心管中，最后在显微镜下计数观察。25 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用2.2.2.7不同组别鸡ALV-J抗体动态的测定在1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w日龄时采集抗体血，在12000rpm转速下离心2min取上清液即血清，使用ALV-JELISA抗体检测试剂盒（IDEXX,USA）检测各组ALV-J抗体。具体操作步骤如下：在检测上板前，需要先将样品进行500倍稀释，稀释液用检测试剂盒中所带的标准稀释液稀释，限于实验室使用排枪以及枪头的限制，在稀释时，选择20×25倍稀释，即先取10μl样品加入到190μl的样品稀释液中，用黄枪头反复吸取混匀，再取10μl第一次稀释后的样品加入到240μl的样品稀释液中。同p27检测试剂盒一样，抗体检测试剂盒在使用之前也需要在22~25℃温箱中恢复室温，并将其震荡混匀后进行使用。（1）事先找好加样纸，记录样品的加样顺序。（2）在A列的1~4孔内按照阴阴阳阳的顺序依次加入100μl阴阳对照液。（3）将事先稀释好的样品液，用排枪依次吸取100μl稀释液上到抗体细胞板上。（4）上样完毕后，将板盖好，放于22~25℃孵育箱中避光孵育30min。（5）在孵育期间，配好待会所需的抗体洗涤液，将试剂盒中的洗涤液浓缩液进行10倍稀释。（6）将抗体板中液体倒掉，用排枪向每孔加入175μl×2的洗涤液稀释液进行洗板，用手指抵住细胞板边缘轻微震荡1min，倒掉洗液，如此重复洗涤4次，在第四次洗涤后将孔内液体倒掉，在吸水纸使劲拍打除去板内水分。（7）拍干后，用100μl排枪向每孔加100μl的庆大霉素和凯松保护的酶标抗体，继续放在温箱中孵育30min。（8）重复第6步洗板步骤。（9）拍干反应板，向其中依次加入100μl的TMB底物液，继续放在温箱中孵育15min。（10）显色结束后，每孔分别加入100μl的终止液，终止显色。（11）在15min显色过程中，可以利用这段时间对酶标仪进行空气调零，并设计好软件的相关选项。（12）将反应板放在酶标仪上测定其在650nm波长的吸光值。（13）结果判定：读取数值后要第一时间查看阴性对照和阳性对照的读值，只有当阴性对照平均值不超过0.150，阳性对照平均值减去阴性对照平均值大于0.075的前提下，才能说明本次试剂盒的检测结果是有效的，具有参考性。26 山东农业大学全日制硕士专业学位论文被检血清的抗体水平的高低由S/P来确定。具体公式为：所测样品平均值-阴性对照平均值S/P=阳性对照平均值-阴性对照平均值阳性样品的S/P值应大于0.4，反之则为阴性对照。2.2.2.8不同组别鸡NDV和AIV-H9疫苗免疫抗体水平的测定在雏鸡长到7日龄时对每个组的每只鸡通过颈部皮下接种0.1ml新城疫灭活油乳疫苗（LaSota株）和禽流感灭活油乳疫苗（H9亚型），并于免疫接种后的第3周至第5周每个周均对雏鸡分别采集血清，通过血凝抑制试验检测鸡体针对NDV和AIV-H9的抗体效价。具体操作如下：（1）1%鸡红细胞的制备在10ml的注射器中无菌吸入1ml的肝素钠抗凝剂，从实验室中已成年且未免任何疫苗的SPF大公鸡的翅静脉处采集抗凝血，缓缓地将血液推入到10ml离心管中，1800rpm离心10min，用吸管轻轻吸走红细胞上方的液体和红细胞上浅浅的白细胞层。吸取适量的生理盐水轻轻地洗涤后1800rpm离心10min离心，再弃去上清液体和中间的白细胞层，保证红细胞纯净。根据所需样品吸取适量红细胞制成1%的稀释度的红细胞悬液。在整个操作过程中，动作要轻柔防止使红细胞破碎。（2）四单位抗原的配制及验证在96孔反应板中用微量排枪向每孔加入50μl的PBS，在第1孔中加入50μl的待检抗原，吹打均匀后倍比稀释至第11孔，将第12孔作为阴性对照。然后每孔中加入50µl事先配置好的体积分数为1%的鸡红细胞悬液，在37℃温箱中下孵育15min后判定结果。45℃角倾斜反应板，反应孔底部的红细胞沿着孔壁向下划线则表明红细胞未被凝集；如果孔底的红细胞仍为一个小红点，倾斜后小红点不消失，说明红细胞被病毒所凝集。以能使红细胞悬液发生凝集的抗原最后稀释倍数作为判定终点，以抗原稀释的倍数倒退两孔配制四单位抗原。假设病毒原液的血凝价为10孔（即1:1024），则四单位抗原的配制为10孔倒退2孔即为8孔（1:256）。四单位抗原配制好后需要对其进行验证：在96孔反应板中用微量排枪向每孔加入50μl的PBS，在第1孔中加入50µl四单位抗原，吹打混匀后倍比稀释至第4孔，第5孔作为阴性对照，然后每孔加入1%的鸡红细胞悬液50µl，37℃下孵育15min后进行结果判定，若只是前两孔出现血凝现象，则表示该四单位病毒可用，反之，则需要更换试剂重新配制。（3）血凝抑制实验27 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用在96孔反应板中用微量排枪向每孔加入50μl的PBS，在第一列反应板的每个孔中依次加入50µl的8个样品的待检血清，用微量移液器反复吹打混匀，从第一列中的每个孔中各取出50µl加到第二列的对应孔中，然后依次如此稀释，稀释到最后一列孔混匀后取出50µl弃去，再向反应中的每个孔中加入验证无问题的四单位抗原50μl，37℃恒温箱15分钟，取出后再向每孔中加入1﹪红细胞悬液50µl，再次置于37℃恒温箱15分钟，计时结束会后将反应板取出倾斜45度角读取数值并判定结果。反应孔底部的红细胞沿着孔壁向下划线则表明红细胞未被凝集；如果孔底的红细胞仍为一个小红点，倾斜后小红点不消失，说明红细胞被病毒所凝集。使红细胞发生凝集的抗原的最高稀释倍数为该抗原滴度红细胞凝集价，即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。2.2.2.9数据的统计与分析采用Excel软件处理数据，经过分析后各组别之间的差异显著性。如P<0.05则说明两组间差异显著，如P<0.01则说明两组间差异不显著。3试验结果3.1分离毒株gp85序列分析与亚群确定通过对两个种鸡场共计4000余份血浆和精液样品做病毒的分离鉴定，发现了大量的阳性血浆和精液，病毒分离后选择部分阳性样品经PCR扩增后其目的片段电泳图片如下图。图3目的片段电泳图片Fig.3Electrophoresispicturesoftargetfragment注：M：Marker（DL，2000），1：PCR产物。Note：M：Marker（DL，2000），1：PCRproduction.28 山东农业大学全日制硕士专业学位论文通过对两个种鸡场进行病毒分离，结果统计发现，对正在实施净化的某蛋鸡场检测公鸡400份，其中精液病毒分离阳性率为11/400，血浆病毒分离阳性率13/400，精液病毒分离和血浆病毒分离同时为阳性的有8份；对正在实施净化的某野山鸡场检测公鸡1800份，其中精液病毒分离阳性率为45/1273，血浆病毒分离阳性率188/1657，精液病毒分离和血浆病毒分离同时为阳性的有16份，具体部分结果如下表5、表6，汇总结果见附表1、附表2。从结果中，我们不难发现，某些血浆病毒分离检测为阳性的种鸡，其精液的病毒分离结果显示阴性；某些血浆病毒分离检测为阴性的种鸡，其精液的病毒分离结果竟然是阳性。这逼着我们反思在禽白血病净化中一味检测血浆阳性率而忽视种鸡场公鸡精液的病毒分离鉴定的方法是否全面有效。表5某野山鸡场公鸡病毒分离检测报告（部分结果）Table5Reportofvirusisolationdetectionofcocksfromawildberghaanfarm（partialresults）公鸡精液病毒血浆病毒公鸡精液病毒血浆病毒公鸡精液病毒血浆病毒编号分离结果分离结果编号分离结果分离结果编号分离结果分离结果SH0006+-SH0693-+SH0952-+SH0124-+SH0696+-SH0984+-SH0134-+SH0697+-SH0997+-SH0214-+SH0710-+SH1022+-SH0226++SH0720-+SH1037+-SH0278-+SH0744+-SH1040+-SH0604-+SH0827-+SH1045+-SH0606++SH0828-+SH1046+-SH0607-+SH0830-+SH1059-+SH0611+-SH0839+-SH1061-+SH0670+-SH0857+-SH1118+-SH0683-+SH0858-+SH1129-+SH0684+-SH0899+-SH1148+-SH0685-+SH0930+-SH1153+-SH0692-+SH0951+-SH1423-+注：表中“-”代表阴性，“+”代表阳性，“*”代表未检测Note:"-"represent"negative","+"represent"positive","*"represent"notest".29 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用表6某种蛋鸡场公鸡病毒分离检测报告（部分结果）Table6Reportofvirusisolationdetectionofcocksfromapoultrybreedingfarm（partialresults）公鸡精液病毒血浆病毒公鸡精液病毒血浆病毒公鸡精液病毒血浆病毒编号分离结果分离结果编号分离结果分离结果编号分离结果分离结果JF048++JF214--JF340-+JF057--JF215+-JF341--JF058++JF216--JF350--JF089-+JF265-+JF351++JF099--JF266--JF352--JF100-+JF282--JF368--JF166--JF283+-JF369--JF167+-JF284--JF370--JF174--JF310--JF380--JF175++JF311++JF381--JF176--JF312--JF382--JF177--JF313++JF397--JF178++JF320--JF398--JF203--JF321++JF399--JF204-+JF322--JF400--注：表中“-”代表阴性，“+”代表阳性，“*”代表为检测Note:"-"represent"negative","+"represent"positive","*"represent"notest".表7鸡场ALV病毒分离的检测结果Table7Reportofvirusisolationdetectionofcocksfromthetwofarms检测精液精液阳性检测血浆血浆阳性精液、血浆均精液、血浆均阳样品数样品数样品数样品数检测样品数性样品数SH种鸡场1273451657188121216JF种鸡场40011400134008从所有阳性样品中分离到20株毒株，其中9株阳性精液毒株编号为J1~J9，11株阳30 山东农业大学全日制硕士专业学位论文性血浆毒株编号为X1~X11，并通过MegAlgn软件比较分离毒株与参考毒株的同源性，通过MEGA5.05软件做进化树分析。所分离到的20个毒株之间具有高度的同源性，高达99.0%~100%，并且这些样品与A亚群参考株之间的同源性最高，高达88.6%~99.2%，显著高于与B、E、F、J、K亚群的同源性，与B亚群同源性介于83.2%~83.7%，与E亚群同源性介于85.4%~89.6%，与F亚群同源性介于83.0%~83.9%，与J亚群同源性介于50.0%~51.1%，与K亚群同源性介于84.8%~85.9%。另外，通过进化树比对分析发现，所分离到的所有毒株均与A亚群毒株在一个分支上，因此判定该种群中流行的是禽白血病A亚群。各毒株之间的同源性很高，通过比对没有发现明显的差异。图4分离株与ALV参考株的同源性比较Fig.4Sequencecomparisonofgp85between20samplestrainsandALVreferencestrains31 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用表8分离株与各亚群同源性比对结果Table8ResultofSequencecomparisonofgp85between20samplestrainsandALVreferencestrainsA亚群B亚群E亚群F亚群J亚群K亚群与参考株同源性比对88.6%-99.2%83.2%-83.7%85.4%-89.6%83.0%-83.9%50.0%-51.1%84.8%-85.9%经MEGA5.05软件做进化树比对分析后显示，所分离到的20株毒株均属于A亚群。进化树结果如下：图520株分离株gp85核酸系统进化树Fig.5Phylogenetictreeof20samplestrains32 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3.2逆转录酶抑制剂类药物对垂直传播ALV-J的治疗作用3.2.1毒株的增殖定量结果将接种NX0101毒株DF-1细胞盲传三代后维持7天，将收集的细胞上清液按照Reed-Muench法测定TCID4.550，测定其细胞半数感染量为10/100µl。3.2.2孵化雏鸡ALV-J感染状态的鉴定结果将隔离罩内饲养的三组SPF雏鸡在出壳的第一天分别于颈静脉采取每一只鸡的颈静脉抗凝血，分离血浆接种到CEF细胞上进行病毒分离，维持7d后测定p27抗原判定其是否感染禽白血病，结果显示，30只卵黄囊接种NX0101的雏鸡均为阳性，而10只未通过卵黄囊接毒的空白鸡结果为阴性，这说明本次卵黄囊接毒成功并且攻毒组雏鸡和空白组雏鸡未发生横向传播。PCR结合斑点杂交检测显示，本试验所用的SPF雏鸡在孵育以及转移的过程当中没有相互感染，也不存在CIAV、REV、MDV、ARV、IBDV和ALV-A/B等感染。3.2.3药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J体重的影响如下表所示，在鸡胚6~8日龄是通过卵黄囊接种ALV-J的攻毒组，未注射5mgAZT和2mgLAM组其体重要远远低于使用药物的NX0101攻毒组，更要远远低于接种生理盐水的不接毒的完全空白对照组。这说明垂直传播对鸡群生产性能的影响要比水平传播严重的多，并且药物的使用可以显著降低鸡体内禽白细胞病毒对家禽生长繁殖的危害作用，保护了雏鸡的部分生长性能，降低ALV-J通过垂直传播对鸡体重的抑制作用。表9卵黄囊接种ALV-J的SPF鸡（垂直感染）用药与否对SPF鸡体重的影响Table9EffectsofreversetranscriptaseinhibitorsonthebodyweightofSPFchickens(infectedALVbyvertictransmission)处理1周2周3周4周5周6周7周8周9周10周44.17±8.71.30±2110.10±3157.40±4225.07±6317.63±8405.90±1471.20±11528.23±1598.67±1用药11A0.40A4.73A7.91A8.61A7.98A06.49A3.56A40.30AB56.30A42.22±6.64.87±180.00±17.112.89±2160.22±3219.00±3299.56±3346.44±446.75±7488.25±8不用药84A3.93A14B3.09B4.58B4.97B7.25B44.81B8.34B4.33B55.90±4.96.25±1149.50±1184.05±2249.60±3362.94±4427.44±7493.69±562.25±1626.31±1生理盐水98C0.47C7.65C1.84A8.64A5.64A6.22A94.90A13.10A33.88A注：同列肩标大写字母不同者表示差异显著（P<0.05），大写字母相同者表示差异不显著（P>0.05）Note:Differentlowercasemeanssignificantdifference(p<0.05),andthesamelowercasemeansnoobviousdifference(p>0.05).33 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用3.2.4药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J病毒血症阳性率的影响此前，本实验室的研究结果显示，如果对刚出壳的1日龄雏鸡攻毒，然后持续给药，最后病毒血症完全消失。但是，这种方法是否也适用于在出生时即带毒的雏鸡还无从得知。通过对每一周采集抗凝血病毒分离结果测定p27发现，通过卵黄囊接种ALV-J的组即模拟因垂直传播出壳带毒的雏鸡，即使在连续使用7天药物的情况下病毒血症阳性率也依然保持很高的水平，没有消退。这表明在本次试验中药物未能有效阻止病毒血症的形成，使用效果并没有在1日龄攻毒雏鸡上的效果明显。虽然药物的使用在病毒血症方面没有发挥理想作用，但是在致死率方面显示出较好的效果。结果显示不使用药物攻毒组在第三周时就有3只鸡死亡，在第十周时死亡鸡的数量达到7只，即使未死亡的鸡病毒血症阳性率也一直保持在很高比例，这说明药物的使用尽管未能有效阻止病毒血症的产生，但是显著降低了ALV-J垂直感染造成的死淘率。表10卵黄囊接种ALV-J的SPF鸡（垂直感染）用药与否对ALV-J病毒血症阳性率的影响Table10EffectsofreversetranscriptaseinhibitorsonthepositiverateofALV-JviremiaofSPFchickens(infectedALVbyvertictransmission)处理1周2周3周4周5周6周7周8周9周10周用药14/15A14/15A13/15A15/15A15/15A15/15A14/15A13/15A15/15A15/15A不用药15/15A15/15A11/12A9/9A9/9A8/9A8/8A8/8A8/8A7/8A生理盐水0/100/100/100/100/100/100/100/100/100/10注：表中阳性率计算=阳性数/存活数。同列肩标大写字母不同者表示差异显著（P<0.05），大写字母相同者表示差异不显著（P>0.05）。Note:positiverate=positivesamplenumbers/survivalsamplenumbers.Differentlowercasemeanssignificantdifference(p<0.05),andthesamelowercasemeansnoobviousdifference(p>0.05).3.2.5药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J抗体产生的影响通过对每个周的雏鸡检测ALV-J抗体发现，在对6~8日龄通过卵黄囊接种的所有鸡连续观察的十周内均未产生针对ALV-J的抗体，不管是攻毒后用药组，还是攻毒后未用药组。这说明可能在小鸡的孵化期间所攻入的病毒已经对雏鸡产生了免疫抑制，并且相比之前的试验结果也进一步证实鸡通过垂直传播感染ALV-J比水平传播更容易造成免疫抑制。34 山东农业大学全日制硕士专业学位论文表11卵黄囊接种ALV-J的SPF鸡（垂直感染）用药与否对SPF鸡ALV-J抗体产生的影响Table11EffectsofreversetranscriptaseinhibitorsontheantibodylevelsofALV-JofSPFchickens(infectedALVbyvertictransmission)处理1周2周3周4周5周6周7周8周9周10周用药0/150/150/150/150/150/150/150/150/150/15不用药0/150/150/120/90/90/90/80/80/80/8生理盐水0/100/100/100/100/100/100/100/100/100/10注：表中阳性率计=算阳性数/存活数。Note:positiverate=positivesamplenumbers/survivalsamplenumbers3.2.6药物使用对SPF鸡垂直传播感染ALV-J后NDV和AIV-H9疫苗免疫抗体产生的影响通过对免疫NDV和AIV-H9灭活疫苗后的抗体水平的测定判定病毒疫苗免疫的抑制作用。结果显示，通过卵黄囊接种ALV-J的组如在出壳后第一周内不肌肉注射逆转录酶抑制剂类药物，其免疫NDV和AIV-H9灭活疫苗后的抗体水平不仅远低于使用药物的攻毒组，更远远低于接种生理盐水的不接毒完全空白对照组。并且使用逆转录酶抑制剂类药物的攻毒组与接种生理盐水的不接毒完全空白对照组差异不明显，这一结果一方面说明垂直传播ALV-J能够对鸡形成非常严重的免疫抑制，另一方面说明药物的使用显著减缓了ALV-J通过垂直传播对鸡群疫苗免疫抗体的抑制作用。表12卵黄囊接种ALV-J的SPF鸡（垂直感染）用药与否对NDV和AIV-H9抗体产生的影响Table12EffectsofreversetranscriptaseinhibitorsontheantibodylevelsofNDVandAIV-H9ofSPFchickens(infectedALVbyvertictransmission)疫苗免疫后时间疫苗免疫后时间处理处理种类3周4周5周种类3周4周5周用药6.40±0.63A7.00±1.00A7.13±1.19A用药5.20±1.82A5.00±1.46A5.20±1.61ANDV不用药5.89±1.54AB4.67±1.32B5.22±1.30BAIV-H9不用药3.78±1.48B3.22±1.09B3.33±0.71B生理盐水5.10±1.37BC7.00±2.21A7.25±1.04A生理盐水3.10±1.73B3.40±2.12B5.50±3.34A注：同列肩标大写字母不同者表示差异显著（P<0.05），大写字母相同者表示差异不显著（P>0.05）Note:Differentlowercasemeanssignificantdifference(p<0.05),andthesamelowercasemeansnoobviousdifference(p>0.05).35 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用4讨论近年来，我国不同鸡群感染ALV的报道越来越多，特别是在一些地方品系鸡群中ALV感染的阳性率非常高，为此一些种鸡场不得不通过实施严格的净化措施来逐步控制ALV。在ALV垂直传播过程中，通过种蛋垂直传播是其主要方式，它给鸡群带来的危害远远大于通过在孵化和育雏期间的横向传播感染带来的危害。例如，此前本实验室通过卵黄囊接种不同地方品系鸡的鸡胚来模拟ALV-J的垂直传播感染，通过对体重、病毒血症、抗体以及对疫苗免疫应答水平等指标来系统观察ALV-J垂直传播对不同地方品系鸡致病性的差异，结果发现不同地方品系鸡通过种蛋垂直传播感染ALV-J后几乎不产生针对ALV-J的抗体并形成持续性病毒血症（栾怀彪，2016），而且对鸡的生长和疫苗免疫应答具有明显的抑制作用，如何减轻垂直传播给种鸡场造成的严重危害是我们不得不关注的问题之一。在净化的过程中，我们会面临淘汰种鸡的选择。国际上用于原种鸡群的最优净化方案是对核心鸡群全部采血接种DF-1细胞进行外源性ALV的分离鉴定并全部淘汰阳性鸡。另外我们还会对刚出壳的小鸡采集胎粪进行快速检测来淘汰阳性雏鸡和种母鸡，但是从来没有提出过要对公鸡特别是精液进行病毒的分离鉴定。在以往的研究中，一直以为ALV不能在精子内复制，似乎感染的公鸡不会造成ALV的先天性感染，即使是存在感染也只是在与母鸡交配的时候横向传播感染母鸡。但是，感染ALV的精液在垂直传播过程中是否具有流行病学意义一直是未知的。本实验室近期试验证明，ALV感染的公鸡确实可以通过精液将病毒传播给母鸡，并传至下一代（李阳等，待发表）。这说明，精液阳性的公鸡可以作为传染源将ALV垂直扩散到下一代。在很长的一段时间内，由于忽视了对公鸡的检测特别是对公鸡精液的检测，部分种鸡场净化进展较慢，甚至出现未知原因的反弹，这些警示我们不得不重视精液检测在种群净化中的作用。本次试验将血浆和精液病毒分离结果进行对比后发现，单纯依靠血浆阳性淘汰感染鸡是不全面的，某些血浆病毒分离为阴性的种鸡其精液病毒分离检测结果却为阳性，如果单单只依靠血浆病毒分离结果淘汰种鸡无疑会产生漏网之鱼。因此，增加对公鸡精液的检测并淘汰阳性种鸡有利于降低ALV通过垂直传播造成的危害。另外，通过序列分析发现，所分离到的不同鸡体的精液和血浆样品的gp85序列没有发现显著的差异。在净化的初期我们还经常会面临一些现实问题，在很多鸡群中ALV阳性率过高导36 山东农业大学全日制硕士专业学位论文致净化中需要淘汰的种鸡数量过多，并且如果涉及到我国特有的地方品系鸡，一味通过淘汰阳性种鸡会失去我国一些特有地方品种，严重影响了ALV的净化进程。此前，我们曾尝试利用逆转录酶抑制剂类药物LAM和AZT来阻止ALV-J在体内外的复制，特别是对一日龄人工攻毒ALV-J的海蓝褐鸡，使用药物后其病毒血症阳性率显著低于未使用药物的人工攻毒组，该过程主要模拟了雏鸡通过早期横向传播后药物的使用对ALV-J复制的抑制作用（苏红芹等，2016）。而本研究通过卵黄囊接种SPF鸡胚的方式模拟了类似鸡群经垂直传播方式感染ALV-J，结果显示垂直传播造成的危害是极其严重的。所有鸡均形成持续性病毒血症而且不产生抗体，对于接种NDV和AIV-H9疫苗后抗体的产生也具有非常明显的抑制作用，这些结果与此前本实验室栾怀彪对不同地方品系鸡的观察结果是非常一致的。然而药物的使用并未达到我们的预期，因为不管使用药物与否，所有接毒鸡均形成了持续性病毒血症，即药物的使用并未有效阻止ALV-J在鸡体内的复制，而且药物的使用也并不能促使鸡产生针对ALV-J的抗体，这是否是因为接种剂量过大所致，有待进一步研究。但非常明显的是，未使用药物的感染组因ALV-J的垂直传播导致的死亡率明显高于使用药物干预组，仅就这一指标而言即可观察到药物的使用对于减缓ALV-J垂直传播对鸡群的危害是有巨大辅助作用的。此外，使用药物的感染组其体重以及免疫NDV和AIV-H9疫苗后产生的抗体水平与未接毒对照组相比几乎没有差异，而未使用药物的感染组则出现了体重和疫苗免疫后抗体水平的显著下降，这说明药物的使用还是减缓了ALV-J垂直传播对鸡群生产性能的不良影响和对免疫应答的抑制作用。结合本实验室此前的研究结果，对于两种不同病毒接种方式同等使用药物的情况下对ALV-J抑制作用的差异性，我们不难分析其可能的原因。逆转录酶抑制剂类药物的作用机制主要是在病毒复制过程中特别是在复制初期或鸡体内病毒量较低时干扰病毒复制；而通过鸡胚卵黄囊接种病毒，即使在鸡出壳后立即使用药物，鸡体内已经随其生长发育而形成非常明显的病毒血症，此时药物对ALV-J复制的抑制作用是非常有限的，或需要加大药物使用剂量才能更好的阻止ALV-J的复制。然而，根据我们此前研究发现，药物剂量过高同样会对鸡生产性能和免疫机能有一定的不良影响（李思菲等，2016）。总体上，本研究结果展示了精液检测在种鸡场ALV净化中的重要作用以及逆转录酶抑制剂类药物AZT和LAM对于减缓ALV-J垂直传播对鸡群危害的作用，这对于种鸡场中ALV的净化工作具有很好的指导意义。当然，上述结果还需要在更大的群体和范围内进行实践以评估其实际应用效果。37 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用5结论1、在实施禽白血病净化中，种公鸡的精液病毒分离结果和血浆病毒分离结果并不完全一致，单纯采用哪种方式均可能造成漏检，增加精液病毒分离对加速种鸡场净化工作具有非常重要的意义。2、逆转录酶抑制剂类药物可以降低ALV-J通过垂直传播对鸡群的危害，但是不能阻止病毒血症的形成，即逆转录酶抑制剂类药物无法完全取代净化，只能加速和辅助鸡群的禽白血病净化。38 山东农业大学全日制硕士专业学位论文参考文献崔治中,赵鹏,孙淑红,王鑫,李文平.鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的研制.中国兽药杂志,2011,08:5-11.崔治中.禽白血病病毒的亚群和准种多样性及其在不同选择压作用下的演变.生命科学,2016,03:283-294.崔治中.禽白血病病毒研究的过去、现在和将来.生命科学,2012,04:305-309.崔治中.我国J亚群禽白血病的防控及其启示.中国家禽,2015,06:1-3.崔治中.种鸡场禽白血病防控和净化技术方案.中国家禽,2015,23:1-7.郭慧君,李中明,李宏梅,柴家前,马诚太,王洪进,崔治中.3种ELISA试剂盒检测不同亚型外源性鸡白血病病毒的比较.畜牧兽医学报,2010,03:310-314.李思菲,苏红芹,王一新,吕艳艳,赵颖洁,崔治中,常爽,赵鹏.拉米夫定对禽白血病病毒的体内外抑制效应及其应用.中国预防兽医学报,2016,(09):700-704.李德龙,高玉龙,曾祥伟,杨波,刘婉思,高奇,秦立廷,高宏雷,王笑梅,刘思当.东北地区野生鸟类J亚群禽白血病分子流行病学调查及部分基因组序列分析.畜牧兽医学报,2013,03:488-494.李建亮.不同遗传背景鸡群来源J亚群禽白血病病毒gp85的分子演变分析.山东农业大学博士论文,2015.栾怀彪.J亚群禽白血病病毒对三种不同地方品系鸡的致病性分析.山东农业大学,2016.孟凡峰,范建华,徐步,董宣,崔治中,赵鹏.J亚群禽白血病病毒TCID50不同测定方法的比较.中国兽医杂志,2015,09:31-33.苏红芹.逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生.山东农业大学,2016.苏霞,朱瑞豪,陈小玲,杨丽聪,周宏专,徐福洲,杨兵.鸡传染性贫血病毒、网状内皮增生症病毒与禽白血病病毒基因芯片检测方法的建立.华北农学报,2015,06:91-96.王莉,黄安宁,李槿年,张丹俊,刘雪兰.J亚群禽白血病SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立.中国预防兽医学报,2013,09:733-737.杨波,高玉龙,高宏雷,秦立廷,刘婉思,李德龙,高奇,曾祥伟,王笑梅.我国东北地区野生鸟类A亚群禽白血病病毒分子流行病学调查及env基因序列分析.中国预防兽39 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用医学报,2013,03:245-247.AkilimaliP.Z.,Kashala-AbotnesE.,MusumariP.M.,TylleskarT.andMapatanoM.A..PredictorsofPersistentAnaemiaintheFirstYearofAntiretroviralTherapy:ARetrospectiveCohortStudyfromGoma,theDemocraticRepublicofCongo.PLoSOne,2015,10(10):e0140240Bacon,L.D.,Fulton,J.E.,Kulkarni,G.B.MethodsforevaluatinganddevelopingcommercialchickenstrainsfreeofendogenoussubgroupEavianleukosisvirus.AvianPathol,2004,33(2):233-243.Bai,J.,Payne,L.N.,Skinner,M.A.HPRS-103(exogenousavianleukosisvirus,subgroupJ)hasanenvgenerelatedtothoseofendogenouselementsEAV-0andE51andanEelementfoundpreviouslyonlyinsarcomaviruses.JVirol,1995,69:779-784.Benson,S.J.,Ruis,B.L.,Fadly,A.M.,Conklin,K.F.TheuniqueenvelopegeneofthesubgroupJavianleukosisvirusderivesfromev/Jproviruses,anovelfamilyofavianendogenousviruses.JVirol,1998,72:10157-10164.Cai,L.,Shen,Y.,Wang,G.,Guo,H.,Liu,J.,Cheng,Z.Identificationoftwonovelmultiplerecombinantavianleukosisvirusesintwodifferentlinesoflayerchicken.JGenVirol,2013,94:2278-2286.Chen,M.,Granger,A.J.,Vanbrocklin,M.W.,Payne,W.S.,Hunt,H.,Zhang,H.,Dodgson,J.B.,Holmen,S.L.Inhibitionofavianleukosisvirusreplicationbyvector-basedRNAinterference.Virology,2007,365:464-472.Cheng,Z.,Liu,J.,Cui,Z.,Zhang,L.TumorsassociatedwithavianleukosisvirussubgroupJinlayerhensduring2007to2009inChina.JVetMedSci,2010,72:1027-1033.Dai,M.,Feng,M.,Liu,D.,Cao,W.,Liao,M.DevelopmentandapplicationofSYBRGreenIreal-timePCRassayfortheseparatedetectionofsubgroupJAvianleukosisvirusandmultiplexdetectionofavianleukosisvirussubgroupsAandB.VirolJ,2015,12:52.Dong,X.,Zhao,P.,Li,W.,Chang,S.,Li,J.,Li,Y.,Ju,S.,Sun,P.,Meng,F.,Liu,J.,Cui,Z.DiagnosisandsequenceanalysisofavianleukosisvirussubgroupJisolatedfromChinesePartridgeShankchickens.PoultSci,2015,94:668-672.Dong,X.,Zhao,P.,Xu,B.,Fan,J.,Meng,F.,Sun,P.,Ju,S.,Li,Y.,Chang,S.,Shi,W.,Cui,Z.Avianleukosisvirusinindigenouschickenbreeds,China.EmergMicrobesInfect,2015,40 山东农业大学全日制硕士专业学位论文4,e76.Frisby,D.P.,Weiss,R.A.,Roussel,M.,Stehelin,D.ThedistributionofendogenouschickenretrovirussequencesintheDNAofgalliformbirdsdoesnotcoincidewithavianphylogeneticrelationships.Cell,1979,17:623-634.Gao,Y.L.,Qin,L.T.,Pan,W.,Wang,Y.Q.,LeQi,X.,Gao,H.L.,andWang,X.M.AvianleukosisvirussubgroupJinlayerchickens,China.EmergInfectDis,2010,16:1637-1638.Gao,Y.,Yun,B.,Qin,L.,Pan,W.,Qu,Y.,Liu,Z.,Wang,Y.,Qi,X.,Gao,H.,Wang,X.MolecularepidemiologyofavianleukosisvirussubgroupJinlayerflocksinChina.JClinMicrobiol,2012,50:953-960.GeleziunasR.,ArtsE.J.,BoulericeF.,GoldmanH.andWainbergM.A..Effectof3'-azido-3'-deoxythymidineonhumanimmunodeficiencyvirustype1replicationinhumanfetalbrainmacrophages.AntimicrobAgentsChemother,1993,(37):1305-1312HahnBH,ShawGM,CockKM.AIDSasazoonosiis:scientificandpubichealthimplications.Science,2000,287:607-614.Han,C.,Hao,R.,Liu,L.,Zeng,X.Molecularcharacterizationof3'UTRsofJsubgroupavianleukosisvirusinpasserinebirdsinChina.ArchVirol,2015,160:845-849.Hanafusa,T.,Hanafusa,H.Isolationofleukosis-typevirusfrompheasantembryocells:possiblepresenceofviralgenesincells.Virology,1973,51:247-251.Hanafusa,T.,Hanafusa,H.,Metroka,C.E.,Hayward,W.S.,Rettenmier,C.W.,Sawyer,R.C.,Dougherty,R.M.,Distefano,H.S.Pheasantvirus:newclassofribodeoxyvirus.ProcNatlAcadSciUSA,1976,73:1333-1337.Hao,R.,Han,C.,Liu,L.,Zeng,X.Firstfindingofsubgroup-EavianleukosisvirusfromwildducksinChina.VetMicrobiol,2014,173:366-370.Hayward,W.S.,Neel,B.G.,andAstrin,S.M.ActivationofacellularoncgenebypromoterinsertioninALV-inducedlymphoidleukosis.Nature,1981,290:475-480.Jiang,L.,Zeng,X.,Hua,Y.,Gao,Q.,Fan,Z.,Chai,H.,Wang,Q.,Qi,X.,Wang,Y.,Gao,H.,Gao,Y.,Wang,X.Geneticdiversityandphylogeneticanalysisofglycoproteingp85ofavianleukosisvirussubgroupJwild-birdisolatesfromNortheastChina.ArchVirol,2014,159:1821-1826.41 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用Ka,S.,Kerje,S.,Bornold,L.,Liljegren,U.,Siegel,P.B.,Andersson,L.,Hallbook,F.Proviralintegrationsandexpressionofendogenousavianleucosisvirusduringlongtermselectionforhighandlowbodyweightintwochickenlines.Retrovirology,2009,6:68.KewnS.,VealG.J.,HoggardP.G.,BarryM.G.andBackD.J..Lamivudine(3TC)phosphorylationanddruginteractionsinvitro.BiochemPharmaco,1997,l(54):589-595Li,D.,Qin,L.,Gao,H.,Yang,B.,Liu,W.,Qi,X.,Wang,Y.,Zeng,X.,Liu,S.,Wang,X.,Gao,Y.AvianleukosisvirussubgroupAandBinfectioninwildbirdsofNortheastChina.VetMicrobiol,2013,163:257-263.Li,H.,Shang,H.,Shu,D.,Zhang,H.,Ji,J.,Sun,B.,Li,H.,Xie,Q.gga-miR-375playsakeyroleintumorigenesispostsubgroupJavianleukosisvirusinfection.PLoSOne,2014,9,e90878.Payne,L.N.,Nair,V.Thelongview:40yearsofavianleukosisresearch.AvianPathol,2012,41:11-19.Payne,L.N.,Gillespie,A.M.,Howes,K.RecoveryofacutelytransformingvirusesfrommyeloidleukosisinducedbytheHPRS-103strainofavianleukosisvirus.AvianDis,1993,37:438-450.Peng,H.,Qin,L.,Bi,Y.,Wang,P.,Zou,G.,Li,J.,Yang,Y.,Zhong,X.,Wei,P..Rapiddetectionofthecommonavianleukosisvirussubgroupsbyreal-timeloop-mediatedisothermalamplification.VirolJ,2015,12:195.Qian,K.,Gao,A.J.,Zhu,M.Y.,Shao,H.X.,Jin,W.J.,Ye,J.Q.,Qin,A.J.GenisteininhibitsthereplicationofavianleucosisvirussubgroupJinDF-1cells.VirusRes,2014,192:114-120.Qian,K.,Liang,Y.Z.,Yin,L.P.,Shao,H.X.,Ye,J.Q.,Qin,A.J.Developmentandevaluationofanimmunochromatographicstripforrapiddetectionofcapsidproteinantigenp27ofavianleukosisvirus.JVirolMethods,2015,221:115-118.Shi,M.,Tian,M.,Liu,C.,Zhao,Y.,Lin,Y.,Zou,N.,Liu,P.,Huang,Y.SequenceanalysisforthecompleteproviralgenomeofsubgroupJAvianLeukosisvirusassociatedwithhemangioma:aspecial11bpdeletionwasobservedinU3regionof3'UTR.VirolJ,2011,8:158.42 山东农业大学全日制硕士专业学位论文Silva,R.F.,Fadly,A.M.,Taylor,S.P.Developmentofapolymerasechainreactiontodifferentiateavianleukosisvirus(ALV)subgroups:detectionofanALVcontaminantincommercialMarek'sdiseasevaccines.AvianDis,2007,51:663-667.Sourvinos,G.,Tsatsanis,C.,Spandidos,D.A.Mechanismsofretrovirus-inducedoncogenesis.FoliaBiol(Praha),2000,46:226-232.Sun,F.,Ferro,P.J.,Lupiani,B.,Kahl,J.,Morrow,M.E.,Flanagan,J.P.,Estevez,C.,Clavijo,A.Aduplexreal-timepolymerasechainreactionassayforthesimultaneousdetectionoflongterminalrepeatregionsandenvelopeproteingenesequencesofReticuloendotheliosisvirusinavianbloodsamples.JVetDiagnInvest,2011,23:937-941.Troesch,C.D.,Vogt,P.K.AnendogenousvirusfromLophortyxquailistheprototypeforenvelopesubgroup1ofavianretroviruses.Virology,1985,143:595-602.Wei,R.,Ma,X.,Wang,G.,Guo,H.,Liu,J.,Fan,L.,Cheng,Z.SynergisticinhibitionofavianleukosisvirussubgroupJreplicationbymiRNA-embeddedsiRNAinterferenceofdouble-target.VirolJ,2015,12:45.Zeng,X.,Gao,Y.,Li,D.,Hao,R.,Liu,W.,Han,C.,Gao,H.,Qi,X.,Wang,Y.,Liu,L.,Wang,X.MolecularcharacteristicsofthecompletegenomeofaJ-subgroupavianleukosisvirusstrainisolatedfromEurasiantealinChina.VirusGenes,2014,49:250-258.Zeng,X.,Liu,L.,Hao,R.,Han,C.DetectionandmolecularcharacterizationofJsubgroupavianleukosisvirusinwildducksinChina.PLoSOne,2014,9,e94980.Zhang,X.,Liao,M.,Jiao,P.,Luo,K.,Zhang,H.,Ren,T.,Zhang,G.,Xu,C.,Xin,C.,Cao,W.Developmentofaloop-mediatedisothermalamplificationassayforrapiddetectionofsubgroupJavianleukosisvirus.JClinMicrobiol,2010,48:2116-2121.Zhang,H.,Bacon,L.D.,Fadly,A.M.Developmentofanendogenousvirus-freelineofchickenssusceptibletoallsubgroupsofavianleukosisvirus.AvianDis,2008,52:412-418.Zhou,G.,Cai,W.,Liu,X.,Niu,C.,Gao,C.,Si,C.,Zhang,W.,Qu,L.,Han,L.Aduplexreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreactionforthedetectionandquantitationofavianleukosisvirussubgroupsAandB.JVirolMethods,2011,173:275-279.43 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用致谢时光荏苒，岁月如梭，不知不觉中，两年的研究生生活就这样结束。在这两年时间里，我感受到了许多，学会了许多，成长了许多。首先，我要感谢我的导师赵鹏副教授和崔治中教授，没有他们的悉心指导和耐心教导。我不可能顺利的完成学业甚至没有机会攻读硕士学位。两位导师治学严谨、视野开阔、精诚敬业，这些优良品质无不包围着我，鼓励着我，感动着我，使我受益终生。两位导师不管在实验中还是生活中都给了我很大的帮助，是我研究生生活乃至整个人生的启明灯和风向标。他们包容我的缺点，在实验失败之后帮助我分析原因，鼓励我继续探索。在以后的工作和生活中，我一定会铭记恩师的教导，砥砺前行。感谢山东农业大学的各位老师和各位前辈，正是他们的努力教学和辛勤拼搏，造就了山东农业大学的辉煌，为我们优越的科研条件打下坚实的基础，我为是山东农业大学的一份子而感到骄傲和自豪。特别感谢常爽老师、王一新博士、李阳博士、孟凡峰博士的给予我的实验上和生活上的帮助和支持，没有他们的帮助我不可能如期完成实验，顺利毕业，也是他们带我去开启了实验研究的大门，带着我去融入我们实验室这个大家庭。衷心感谢李思菲师姐、许书珍师姐、栾怀彪师兄、崔贺师兄、孙鹏师兄、房立春师兄、陈俊霞师姐、苏红芹师姐对我的照顾、帮助和支持，感谢我的同级吕艳艳、韩妮、崔帅、任志浩、张言坤、刘英楠、李晓晗、付佳媛，感谢我的师弟张玉标、任衍倍、李秋辰、董桂伟、田似报、苏奇。衷心感谢实验室的科研辅助人员孙文丽、鲁金、吕汉英为我的实验付出的辛勤劳动和汗水。最后，我要感谢我的父母，感谢他们对我的养育之恩，感谢他们对我的关爱，感谢他们一直支持我的决定，做我前行道路中坚实的后盾。另外，值此论文完成之际，向所有给予我指导、关心和帮助的所有老师、领导、同学和朋友表示深深的谢意！同时向参加本论文评阅和答辩工作的各位老师和前辈表示深深的谢意！44 山东农业大学全日制硕士专业学位论文攻读学位期间发表论文情况赵颖洁,张玉标,孟凡峰,吕艳艳,崔治中,常爽,徐步,范建华,赵鹏.ALV-J经卵黄囊接种对鸡的致病性与逆转录酶抑制剂类药物对鸡的保护作用[J].中国家禽,2016,(23):20-23.栾怀彪,赵颖洁,吕艳艳,徐颖,崔治中,常爽,赵鹏.核酸斑点杂交法与ELISA在SPF鸡检测弱毒疫苗中ALV污染的应用与比较[J].中国家禽,2016,04:10-13.（并列第一作者）45 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用附录：附表1某野山鸡场公鸡病毒分离检测报告（汇总结果）EncloseTable1Reportofvirusisolationdetectionofcocksfromawildberghaanfarm（allresults）公鸡精液病毒血浆病毒公鸡精液病毒血浆病毒公鸡精液病毒血浆病毒编号分离结果分离结果编号分离结果分离结果编号分离结果分离结果SH0001--SH0601--SH1201**SH0002--SH0602--SH1202**SH0003--SH0603--SH1203--SH0004--SH0604-+SH1204--SH0005*-SH0605**SH1205-+SH0006+-SH0606++SH1206**SH0007*-SH0607-+SH1207--SH0008--SH0608--SH1208--SH0009--SH0609--SH1209--SH0010*-SH0610--SH1210--SH0011*-SH0611+-SH1211--SH0012--SH0612--SH1212--SH0013--SH0613--SH1213--SH0014--SH0614-+SH1214--SH0015*-SH0615--SH1215--SH0016*-SH0616--SH1216--SH0017--SH0617--SH1217--SH0018*-SH0618+*SH1218-+SH0019*-SH0619--SH1219**SH0020*-SH0620-+SH1220-+SH0021*-SH0621--SH1221*-SH0022--SH0622++SH1222--SH0023*-SH0623--SH1223--SH0024--SH0624--SH1224*-46 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0025--SH0625++SH1225*+SH0026--SH0626++SH1226--SH0027*-SH0627-+SH1227-+SH0028--SH0628-*SH1228--SH0029--SH0629--SH1229+-SH0030--SH0630++SH1230*-SH0031--SH0631--SH1231-+SH0032--SH0632-+SH1232-+SH0033--SH0633-*SH1233--SH0034*-SH0634--SH1234-+SH0035*-SH0635--SH1235--SH0036--SH0636-+SH1236--SH0037--SH0637--SH1237--SH0038--SH0638--SH1238*-SH0039--SH0639--SH1239**SH0040--SH0640--SH1240-+SH0041--SH0641--SH1241--SH0042--SH0642--SH1242**SH0043--SH0643*-SH1243--SH0044--SH0644--SH1244-+SH0045--SH0645--SH1245--SH0046--SH0646+-SH1246--SH0047--SH0647**SH1247--SH0048--SH0648--SH1248--SH0049--SH0649**SH1249-+SH0050--SH0650--SH1250-+SH0051--SH0651--SH1251--SH0052--SH0652-+SH1252-+SH0053--SH0653--SH1253--47 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0054--SH0654--SH1254-+SH0055*-SH0655--SH1255--SH0056--SH0656--SH1256--SH0057*-SH0657**SH1257--SH0058*-SH0658-+SH1258*-SH0059--SH0659--SH1259--SH0060*-SH0660++SH1260-+SH0061--SH0661**SH1261--SH0062*-SH0662--SH1262-+SH0063--SH0663--SH1263**SH0064--SH0664--SH1264--SH0065--SH0665**SH1265--SH0066**SH0666-+SH1266--SH0067*-SH0667--SH1267-+SH0068--SH0668-*SH1268*-SH0069--SH0669--SH1269--SH0070--SH0670+-SH1270--SH0071*-SH0671--SH1271--SH0072--SH0672--SH1272-+SH0073*-SH0673--SH1273-+SH0074*-SH0674-+SH1274*-SH0075--SH0675--SH1275-+SH0076--SH0676--SH1276--SH0077--SH0677--SH1277--SH0078--SH0678--SH1278--SH0079*-SH0679--SH1279--SH0080--SH0680-*SH1280--SH0081--SH0681--SH1281--SH0082--SH0682**SH1282--48 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0083--SH0683-+SH1283--SH0084*-SH0684+-SH1284--SH0085--SH0685-+SH1285-+SH0086--SH0686--SH1286--SH0087*-SH0687--SH1287--SH0088--SH0688--SH1288--SH0089--SH0689--SH1289--SH0090*-SH0690--SH1290--SH0091--SH0691--SH1291--SH0092--SH0692-+SH1292--SH0093*-SH0693-+SH1293--SH0094--SH0694**SH1294--SH0095--SH0695--SH1295--SH0096*-SH0696+-SH1296--SH0097--SH0697+-SH1297--SH0098--SH0698--SH1298-*SH0099--SH0699--SH1299--SH0100*-SH0700--SH1300--SH0101--SH0701--SH1301-+SH0102--SH0702--SH1302--SH0103*-SH0703--SH1303--SH0104--SH0704--SH1304--SH0105--SH0705-*SH1305--SH0106--SH0706--SH1306--SH0107--SH0707--SH1307--SH0108--SH0708++SH1308--SH0109*-SH0709++SH1309--SH0110--SH0710-+SH1310*-SH0111*-SH0711--SH1311*-49 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0112*-SH0712--SH1312*-SH0113--SH0713--SH1313*-SH0114*-SH0714--SH1314*-SH0115*-SH0715--SH1315--SH0116*-SH0716--SH1316--SH0117--SH0717++SH1317*-SH0118--SH0718--SH1318--SH0119*-SH0719--SH1319--SH0120--SH0720-+SH1320--SH0121--SH0721--SH1321--SH0122*-SH0722--SH1322--SH0123--SH0723--SH1323--SH0124-+SH0724--SH1324--SH0125--SH0725--SH1325--SH0126--SH0726--SH1326--SH0127--SH0727**SH1327--SH0128--SH0728-+SH1328--SH0129*-SH0729*-SH1329--SH0130*-SH0730--SH1330--SH0131**SH0731--SH1331*-SH0132--SH0732--SH1332--SH0133--SH0733-+SH1333--SH0134-+SH0734++SH1334--SH0135--SH0735--SH1335--SH0136**SH0736-+SH1336--SH0137**SH0737--SH1337--SH0138--SH0738--SH1338--SH0139--SH0739--SH1339-*SH0140*-SH0740-*SH1340--50 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0141--SH0741--SH1341**SH0142--SH0742--SH1342--SH0143--SH0743--SH1343--SH0144*-SH0744+-SH1344--SH0145*-SH0745--SH1345--SH0146--SH0746--SH1346--SH0147--SH0747--SH1347*-SH0148--SH0748*-SH1348**SH0149--SH0749-+SH1349--SH0150--SH0750--SH1350**SH0151--SH0751--SH1351--SH0152--SH0752**SH1352*-SH0153*-SH0753*-SH1353--SH0154--SH0754--SH1354--SH0155--SH0755--SH1355--SH0156--SH0756--SH1356*-SH0157--SH0757--SH1357--SH0158--SH0758--SH1358-+SH0159*-SH0759--SH1359--SH0160--SH0760--SH1360--SH0161--SH0761--SH1361--SH0162--SH0762--SH1362*-SH0163--SH0763-*SH1363--SH0164--SH0764--SH1364*-SH0165--SH0765-+SH1365--SH0166*-SH0766--SH1366--SH0167*-SH0767*-SH1367--SH0168--SH0768-+SH1368**SH0169--SH0769--SH1369--51 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0170--SH0770--SH1370-+SH0171--SH0771--SH1371--SH0172--SH0772--SH1372**SH0173*-SH0773--SH1373**SH0174**SH0774--SH1374--SH0175--SH0775--SH1375--SH0176--SH0776--SH1376--SH0177**SH0777--SH1377--SH0178--SH0778--SH1378--SH0179--SH0779-*SH1379--SH0180--SH0780-+SH1380--SH0181--SH0781--SH1381**SH0182--SH0782-+SH1382--SH0183--SH0783--SH1383--SH0184--SH0784--SH1384--SH0185--SH0785--SH1385--SH0186*-SH0786-+SH1386**SH0187--SH0787*-SH1387--SH0188--SH0788--SH1388**SH0189--SH0789--SH1389--SH0190--SH0790*-SH1390**SH0191--SH0791--SH1391--SH0192--SH0792--SH1392*-SH0193--SH0793-+SH1393--SH0194--SH0794--SH1394--SH0195--SH0795--SH1395--SH0196*-SH0796--SH1396--SH0197--SH0797--SH1397--SH0198--SH0798--SH1398--52 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0199--SH0799--SH1399*-SH0200--SH0800--SH1400--SH0201*-SH0801--SH1401*-SH0202*-SH0802--SH1402--SH0203--SH0803--SH1403--SH0204--SH0804**SH1404--SH0205--SH0805--SH1405++SH0206--SH0806-+SH1406*-SH0207--SH0807--SH1407--SH0208--SH0808--SH1408--SH0209**SH0809--SH1409--SH0210--SH0810--SH1410--SH0211--SH0811--SH1411--SH0212--SH0812--SH1412--SH0213--SH0813--SH1413--SH0214-+SH0814*-SH1414--SH0215--SH0815-+SH1415--SH0216**SH0816-+SH1416--SH0217--SH0817--SH1417--SH0218--SH0818--SH1418*-SH0219*-SH0819--SH1419--SH0220--SH0820--SH1420--SH0221--SH0821--SH1421--SH0222--SH0822--SH1422--SH0223*-SH0823-+SH1423-+SH0224--SH0824--SH1424--SH0225--SH0825--SH1425*-SH0226++SH0826--SH1426--SH0227--SH0827-+SH1427*-53 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0228**SH0828-+SH1428--SH0229--SH0829--SH1429-+SH0230--SH0830-+SH1430-+SH0231--SH0831**SH1431--SH0232--SH0832--SH1432--SH0233--SH0833--SH1433*-SH0234**SH0834--SH1434--SH0235--SH0835--SH1435--SH0236**SH0836--SH1436--SH0237**SH0837--SH1437--SH0238--SH0838--SH1438--SH0239**SH0839+-SH1439*-SH0240**SH0840--SH1440--SH0241--SH0841--SH1441--SH0242*-SH0842--SH1442--SH0243--SH0843--SH1443*-SH0244*-SH0844--SH1444-*SH0245--SH0845-+SH1445--SH0246*-SH0846--SH1446--SH0247**SH0847--SH1447--SH0248--SH0848*-SH1448--SH0249--SH0849--SH1449*-SH0250--SH0850-+SH1450--SH0251--SH0851--SH1451--SH0252--SH0852-+SH1452--SH0253**SH0853--SH1453*-SH0254--SH0854--SH1454--SH0255--SH0855--SH1455--SH0256*-SH0856--SH1456--54 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0257*-SH0857+-SH1457--SH0258--SH0858-+SH1458--SH0259--SH0859--SH1459*-SH0260--SH0860--SH1460--SH0261--SH0861--SH1461--SH0262*-SH0862--SH1462--SH0263*-SH0863-*SH1463*-SH0264--SH0864--SH1464--SH0265--SH0865--SH1465-*SH0266*-SH0866--SH1466--SH0267--SH0867--SH1467*-SH0268*-SH0868--SH1468*-SH0269*-SH0869--SH1469--SH0270--SH0870-*SH1470--SH0271--SH0871--SH1471--SH0272--SH0872++SH1472--SH0273*-SH0873++SH1473**SH0274--SH0874--SH1474--SH0275--SH0875-+SH1475--SH0276--SH0876--SH1476*-SH0277--SH0877--SH1477--SH0278-+SH0878--SH1478**SH0279--SH0879-+SH1479*-SH0280--SH0880--SH1480--SH0281--SH0881**SH1481**SH0282--SH0882**SH1482--SH0283--SH0883-+SH1483--SH0284--SH0884-+SH1484--SH0285*-SH0885--SH1485--55 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0286--SH0886-+SH1486--SH0287--SH0887--SH1487--SH0288*-SH0888--SH1488--SH0289--SH0889-+SH1489-+SH0290--SH0890-+SH1490--SH0291--SH0891--SH1491*-SH0292--SH0892--SH1492*-SH0293--SH0893--SH1493--SH0294--SH0894--SH1494*-SH0295--SH0895--SH1495--SH0296--SH0896--SH1496--SH0297--SH0897**SH1497*-SH0298--SH0898--SH1498--SH0299--SH0899+-SH1499-+SH0300-+SH0900-+SH1500**SH0301-*SH0901--SH1501*-SH0302--SH0902--SH1502*-SH0303--SH0903+-SH1503*-SH0304-*SH0904--SH1504*-SH0305--SH0905--SH1505*-SH0306--SH0906--SH1506*+SH0307--SH0907--SH1507*-SH0308*-SH0908--SH1508*-SH0309*+SH0909-*SH1509*-SH0310*-SH0910--SH1510*-SH0311--SH0911--SH1511*-SH0312-+SH0912--SH1512*-SH0313*-SH0913--SH1513*-SH0314--SH0914--SH1514*-56 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0315--SH0915--SH1515*-SH0316--SH0916--SH1516*-SH0317--SH0917--SH1517*-SH0318--SH0918--SH1518*-SH0319--SH0919--SH1519*-SH0320--SH0920--SH1520*-SH0321--SH0921--SH1521*-SH0322--SH0922--SH1522*-SH0323--SH0923--SH1523*-SH0324--SH0924--SH1524*-SH0325--SH0925--SH1525*-SH0326**SH0926--SH1526*+SH0327--SH0927--SH1527*-SH0328*-SH0928--SH1528*-SH0329--SH0929--SH1529*-SH0330--SH0930+-SH1530*-SH0331**SH0931--SH1531*-SH0332*-SH0932--SH1532*-SH0333--SH0933--SH1533*-SH0334--SH0934--SH1534*-SH0335--SH0935--SH1535*-SH0336--SH0936**SH1536*-SH0337--SH0937--SH1537*-SH0338--SH0938-+SH1538*-SH0339--SH0939--SH1539*-SH0340--SH0940-+SH1540*-SH0341*-SH0941-+SH1541*-SH0342--SH0942--SH1542*-SH0343--SH0943--SH1543*-57 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0344--SH0944--SH1544*-SH0345--SH0945--SH1545*+SH0346--SH0946--SH1546*-SH0347--SH0947--SH1547*+SH0348*-SH0948--SH1548*+SH0349--SH0949--SH1549*+SH0350--SH0950--SH1550*+SH0351--SH0951+-SH1551*+SH0352*-SH0952-+SH1552*-SH0353**SH0953--SH1553*-SH0354--SH0954--SH1554*+SH0355--SH0955--SH1555*+SH0356--SH0956--SH1556*-SH0357--SH0957--SH1557*+SH0358--SH0958--SH1558*-SH0359--SH0959--SH1559*-SH0360--SH0960--SH1560*-SH0361--SH0961-+SH1561*-SH0362--SH0962--SH1562*-SH0363--SH0963--SH1563*-SH0364--SH0964--SH1564*-SH0365--SH0965--SH1565*-SH0366--SH0966--SH1566*-SH0367--SH0967--SH1567*-SH0368-+SH0968--SH1568*+SH0369--SH0969--SH1569*+SH0370--SH0970--SH1570*-SH0371--SH0971--SH1571*-SH0372--SH0972--SH1572*-58 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0373--SH0973--SH1573**SH0374--SH0974--SH1574*-SH0375--SH0975--SH1575*-SH0376--SH0976--SH1576*-SH0377*-SH0977--SH1577*-SH0378--SH0978--SH1578*-SH0379--SH0979-+SH1579*-SH0380--SH0980--SH1580*-SH0381--SH0981**SH1581*-SH0382--SH0982**SH1582*-SH0383--SH0983--SH1583**SH0384*-SH0984+-SH1584*-SH0385--SH0985--SH1585**SH0386--SH0986--SH1586*-SH0387--SH0987--SH1587*+SH0388--SH0988--SH1588**SH0389--SH0989--SH1589*-SH0390--SH0990--SH1590*-SH0391--SH0991--SH1591*-SH0392*+SH0992*-SH1592*-SH0393--SH0993-*SH1593*-SH0394--SH0994**SH1594*-SH0395*-SH0995-+SH1595*+SH0396--SH0996-+SH1596*+SH0397*+SH0997+-SH1597*-SH0398--SH0998**SH1598*-SH0399--SH0999--SH1599*-SH0400--SH1000--SH1600*-SH0401--SH1001*-SH1601*-59 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0402--SH1002--SH1602*-SH0403--SH1003--SH1603*+SH0404--SH1004--SH1604*-SH0405--SH1005--SH1605*-SH0406*-SH1006--SH1606*-SH0407--SH1007--SH1607*-SH0408--SH1008--SH1608*-SH0409--SH1009--SH1609**SH0410--SH1010*-SH1610--SH0411--SH1011--SH1611*-SH0412--SH1012--SH1612*-SH0413*-SH1013*-SH1613*-SH0414--SH1014--SH1614*-SH0415**SH1015*-SH1615*-SH0416*-SH1016--SH1616**SH0417--SH1017--SH1617**SH0418--SH1018--SH1618*-SH0419--SH1019--SH1619**SH0420--SH1020--SH1620*+SH0421--SH1021--SH1621*-SH0422*-SH1022+-SH1622*-SH0423--SH1023--SH1623*+SH0424-+SH1024--SH1624*+SH0425*-SH1025**SH1625*-SH0426--SH1026--SH1626*-SH0427-+SH1027--SH1627*-SH0428--SH1028--SH1628*-SH0429--SH1029--SH1629*-SH0430-+SH1030--SH1630*+60 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0431--SH1031--SH1631*-SH0432--SH1032--SH1632*-SH0433-+SH1033*-SH1633*-SH0434--SH1034--SH1634*-SH0435--SH1035--SH1635*-SH0436--SH1036**SH1636**SH0437--SH1037+-SH1637*-SH0438--SH1038--SH1638*-SH0439--SH1039--SH1639*-SH0440--SH1040+-SH1640*-SH0441--SH1041--SH1641*-SH0442-+SH1042--SH1642*-SH0443--SH1043--SH1643*-SH0444--SH1044--SH1644*-SH0445--SH1045+-SH1645*-SH0446--SH1046+-SH1646*+SH0447--SH1047--SH1647*-SH0448--SH1048*-SH1648*-SH0449*-SH1049+*SH1649**SH0450--SH1050--SH1650*+SH0451--SH1051--SH1651*-SH0452--SH1052**SH1652*+SH0453--SH1053*-SH1653*-SH0454--SH1054--SH1654*+SH0455*-SH1055*-SH1655*+SH0456--SH1056--SH1656*+SH0457--SH1057*-SH1657*-SH0458--SH1058--SH1658*+SH0459--SH1059-+SH1659*-61 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0460--SH1060--SH1660*+SH0461--SH1061-+SH1661*-SH0462--SH1062--SH1662*-SH0463--SH1063*-SH1663*+SH0464--SH1064--SH1664*+SH0465--SH1065--SH1665**SH0466**SH1066--SH1666*-SH0467--SH1067--SH1667*+SH0468--SH1068-+SH1668*-SH0469--SH1069*+SH1669*-SH0470*-SH1070--SH1670*-SH0471*-SH1071--SH1671*-SH0472--SH1072--SH1672*+SH0473--SH1073**SH1673*-SH0474--SH1074--SH1674**SH0475--SH1075--SH1675*-SH0476--SH1076--SH1676*-SH0477--SH1077*-SH1677*-SH0478--SH1078--SH1678*-SH0479--SH1079--SH1679*+SH0480--SH1080*-SH1680*+SH0481--SH1081--SH1681*-SH0482--SH1082*-SH1682*+SH0483--SH1083--SH1683*-SH0484--SH1084--SH1684*+SH0485--SH1085--SH1685*-SH0486--SH1086-*SH1686*-SH0487--SH1087-+SH1687*-SH0488--SH1088--SH1688*+62 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0489--SH1089--SH1689*-SH0490--SH1090--SH1690*-SH0491*-SH1091--SH1691*-SH0492**SH1092--SH1692*-SH0493--SH1093--SH1693*-SH0494--SH1094--SH1694*-SH0495--SH1095--SH1695*-SH0496--SH1096*-SH1696*-SH0497--SH1097**SH1697*-SH0498--SH1098--SH1698*-SH0499--SH1099--SH1699*+SH0500-+SH1100**SH1700*-SH0501--SH1101--SH1701**SH0502--SH1102-+SH1702*-SH0503--SH1103--SH1703*+SH0504--SH1104--SH1704*-SH0505--SH1105-+SH1705*+SH0506--SH1106--SH1706**SH0507--SH1107--SH1707*+SH0508--SH1108--SH1708*-SH0509--SH1109--SH1709*-SH0510**SH1110-*SH1710*-SH0511--SH1111--SH1711*-SH0512--SH1112--SH1712*+SH0513--SH1113--SH1713*-SH0514--SH1114--SH1714*-SH0515--SH1115**SH1715**SH0516--SH1116--SH1716*+SH0517*-SH1117--SH1717*+63 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0518--SH1118+-SH1718**SH0519--SH1119--SH1719**SH0520--SH1120--SH1720*-SH0521-*SH1121**SH1721*+SH0522--SH1122--SH1722**SH0523-+SH1123--SH1723*-SH0524--SH1124--SH1724*-SH0525--SH1125-+SH1725*-SH0526*-SH1126--SH1726*-SH0527**SH1127*-SH1727*-SH0528--SH1128-*SH1728*-SH0529--SH1129-+SH1729*-SH0530--SH1130-*SH1730*-SH0531--SH1131**SH1731*-SH0532--SH1132--SH1732*+SH0533--SH1133--SH1733*+SH0534--SH1134*-SH1734*+SH0535--SH1135--SH1735*-SH0536--SH1136--SH1736*-SH0537*-SH1137--SH1737*+SH0538-+SH1138**SH1738*+SH0539--SH1139--SH1739*-SH0540--SH1140--SH1740**SH0541--SH1141++SH1741**SH0542--SH1142--SH1742*-SH0543*-SH1143--SH1743*-SH0544--SH1144--SH1744*-SH0545--SH1145--SH1745*-SH0546--SH1146--SH1746**64 山东农业大学全日制硕士专业学位论文SH0547--SH1147-*SH1747*-SH0548--SH1148+-SH1748*-SH0549--SH1149--SH1749*-SH0550--SH1150--SH1750*+SH0551--SH1151**SH1751*-SH0552**SH1152**SH1752*-SH0553--SH1153+-SH1753**SH0554--SH1154--SH1754*-SH0555--SH1155--SH1755*-SH0556**SH1156--SH1756*+SH0557*-SH1157--SH1757*-SH0558--SH1158--SH1758*-SH0559-+SH1159--SH1759**SH0560--SH1160--SH1760*-SH0561--SH1161+-SH1761*-SH0562--SH1162--SH1762*-SH0563--SH1163--SH1763**SH0564-+SH1164--SH1764*-SH0565--SH1165**SH1765*-SH0566*-SH1166--SH1766*-SH0567--SH1167--SH1767*-SH0568--SH1168--SH1768*-SH0569--SH1169--SH1769*-SH0570--SH1170--SH1770*-SH0571*-SH1171--SH1771*+SH0572--SH1172--SH1772*-SH0573--SH1173--SH1773*-SH0574--SH1174-*SH1774*-SH0575**SH1175++SH1775*-65 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用SH0576*-SH1176--SH1776*-SH0577--SH1177-*SH1777*-SH0578--SH1178**SH1778*-SH0579--SH1179-*SH1779*-SH0580*-SH1180--SH1780*-SH0581--SH1181--SH1781*-SH0582--SH1182--SH1782*-SH0583--SH1183--SH1783*+SH0584*-SH1184-*SH1784*-SH0585*-SH1185**SH1785*-SH0586--SH1186--SH1786*+SH0587**SH1187--SH1787*-SH0588--SH1188--SH1788*-SH0589*-SH1189--SH1789*-SH0590--SH1190--SH1790*-SH0591--SH1191--SH1791*-SH0592--SH1192--SH1792*-SH0593-+SH1193--SH1793*-SH0594--SH1194**SH1794*-SH0595--SH1195--SH1795*-SH0596--SH1196--SH1796*-SH0597--SH1197--SH1797*-SH0598--SH1198--SH1798*+SH0599--SH1199--SH1799*+SH0600--SH1200--SH1800*-注：表中“-”代表阴性，“+”代表阳性，“*”代表未检测Note:"-"represent"negative","+"represent"positive","*"represent"notest".66 山东农业大学全日制硕士专业学位论文附表2某种蛋鸡场公鸡病毒分离检测报告（汇总结果）EncloseTable2Reportofvirusisolationdetectionofcocksfromapoultrybreedingfarm（allresults）公鸡精液病毒公鸡精液病毒血浆病毒公鸡精液病毒血浆病毒编号分离结果编号分离结果分离结果编号分离结果分离结果JF001-JF134--JF267--JF002-JF135--JF268--JF003-JF136--JF269--JF004-JF137--JF270--JF005-JF138--JF271--JF006-JF139--JF272--JF007-JF140--JF273--JF008-JF141--JF274--JF009-JF142--JF275--JF010-JF143--JF276--JF011-JF144--JF277--JF012-JF145--JF278--JF013-JF146--JF279--JF014-JF147--JF280--JF015-JF148--JF281--JF016-JF149--JF282--JF017-JF150--JF283+-JF018-JF151--JF284--JF019-JF152--JF285--JF020-JF153--JF286--JF021-JF154--JF287--JF022-JF155--JF288--JF023-JF156--JF289--JF024-JF157--JF290--JF025-JF158--JF291--67 禽白血病净化中的种公鸡检测及逆转录酶抑制剂类药物在降低禽白血病垂直传播危害中的应用JF026-JF159--JF292--JF027-JF160--JF293--JF028-JF161--JF294--JF029-JF162--JF295--JF030-JF163--JF296--JF031-JF164--JF297--JF032-JF165--JF298--JF033-JF166--JF299--JF034-JF167+-JF300--JF035-JF168--JF301--JF036-JF169--JF302--JF037-JF170--JF303--JF038-JF171--JF304--JF039-JF172--JF305--JF040-JF173--JF306--JF041-JF174--JF307--JF042-JF175++JF308--JF043-JF176--JF309--JF044-JF177--JF310--JF045-JF178++JF311++JF046-JF179--JF312--JF047-JF180--JF313++JF048+JF181--JF314--JF049-JF182--JF315--JF050-JF183--JF316--JF051-JF184--JF317--JF052-JF185--JF318--JF053-JF186--JF319--JF054-JF187--JF320--68 山东农业大学全日制硕士专业学位论文JF055-JF188--JF321++JF056-JF189--JF322--JF057-JF190--JF323--JF058+JF191--JF324--JF059-JF192--JF325--JF060-JF193--JF326--JF061-JF194--JF327--JF062-JF195--JF328--JF063-JF196--JF329--JF064-JF197--JF330--JF065-JF198--JF331--JF066-JF199--JF332--JF067-JF200--JF333--JF068-JF201--JF334--JF069-JF202--JF335--JF070-JF203--JF336--JF071-JF204-+JF337--JF072-JF205--JF338--JF073-JF206--JF339--JF074-JF207--JF340-+JF075-JF208--JF341--JF076-JF209--JF342--JF077-JF210--JF343--JF078-JF211--JF344--JF079-JF212--JF345--JF080-JF213--JF346--JF081-JF214--JF347--JF082-JF215+-JF348--JF083-JF216--JF349--69 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