妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究

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一研究方向所在院部苏州大学第二附属医院论文提交日期２０１７年９月 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：日期： 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文□本学位论文属在年月解密后适用本规定。非涉密论文□论文作者签名：日期：导师签名：日期： 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究摘要妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究摘要研究目的：1、妊娠期糖尿病是最常见妊娠并发症，严重威胁母亲和子代的健康，临床上对该病的诊断时间和干预开始时间多在妊娠中晚期，胎儿在宫内的不良影响已经发生，发现妊娠早期或者孕前的高危因素以及早孕期的诊断标志物，使干预时间提前，对于控制GDM的发生以及疾病程度均具有特殊的意义；2、妊娠期糖尿病的病因及发病机制不明，既往研究往往从单一的蛋白质着手讨论其与GDM之间的关系，对于不同蛋白质之间的相互作用并不能很好的阐述。本研究采用差异蛋白组学研究，全面解析GDM的差异蛋白表达谱，在此基础上挖掘关键的致病因子，为进一步探讨GDM的发病机制、疾病的早期诊断、临床疗效的评估奠定重要的研究基础。对于GDM相关因子的干预和阻断，也将为GDM的临床治疗提供新的策略和思路。材料与方法：1、采用前瞻性研究，收集2015年2月-2015年10月在贵州医科大学附属医院产科门诊建卡的孕妇的基本资料，知情同意的原则下，完成对孕妇基本情况的记录，包括：孕妇年龄、孕产史、文化程度、家族史、身高、孕前体重、血压以及常规的孕检生化指标等。孕妇在妊娠24-28周常规行OGTT，根据结果分为GDM组与非GDM组。对GDM的危险因素进行单因素分析和多因素Logistic回归分析。2、所有入组孕妇在妊娠11-16周、妊娠24-28周两次收集血清标本，经过静置、低温离心、小剂量分装、编号、快速冷冻，贮于-80℃冰箱备用。按照IADPSG诊断标准将人群分成GDM组与非GDM组。每组按照基本情况相似的原则各抽取10例进行蛋白质组学研究。3、通过iTRAQ定量蛋白组学技术筛选GDM组与非GDM组之间差异表达的蛋白质，并对差异蛋白进行GO、疾病关联性、蛋白质相互作用等生物信息学分析。4、选取在妊娠11-16周及24-28周两个时间段均明显变化趋势的APOE、F9、FGAI 摘要妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究作为候选因子，通过GDM组及非GDM组各30例妊娠11-16周血清标本，进一步用酶联免疫ELISA验证，通过统计学分析判断这几个因子对于GDM早期的诊断价值。结果：1、GDM组与对照组各项危险因子的单因素分析显示：(1)孕妇年龄、孕前BMI、收缩压、舒张压均以GDM组高于非GDM组（P<0.05）；（2）两组家族史、产次情况分布差异具有显著性（P<0.05），具体为GDM组有家族史者和分娩次数大于0次者的检出率大于非GDM组；（3）孕期增重、早期空腹血糖、尿酸、白细胞计数组均以GDM组高于非GDM组（P<0.05）。GDM危险因素的多因素Logistic回归分析显示：影响妊娠期糖尿病的危险因素有早期空腹血糖、BMI、年龄、家族史、孕期增重、血尿酸。2、妊娠11-16周GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白组学研究：筛选最终能达到严格定量标准(比值≥1.5或≤0.67，或p<0.05)的蛋白数有33个，上调蛋白有14个，下调蛋白19个。利用OmicsBean数据库对筛选出来的妊娠11-16周阶段的血清差异蛋白进行蛋白质体内的生物学过程分析，发现这些蛋白在体内的生物学过程主要包括血液凝集、损伤应答、急性炎症反应、补体激活等；对差异蛋白进行细胞组分分析，发现这些蛋白质主要定位于细胞外的区域，在孔隙复合物、膜攻击复合物上，以及在脂蛋白颗粒、微粒体上；对筛选出来的差异蛋白质在体内的分子生物学功能进行富集，发现这些蛋白质在体内主要承担着一些内肽酶抑制剂的活性、酶抑制剂的活性、脂蛋白的受体结合、钙离子结合等分子生物学功能。相关疾病有静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺血性心脏病、子痫前期、1型糖尿病、2型糖尿病。用Cytoscape软件对GDM早期组与对照血清差异蛋白进行了功能网络分析，结果显示：早期组差异蛋白主要参与了血液凝集、纤维蛋白凝块的形成、血浆脂蛋白颗粒组织、蛋白成熟调控。3、妊娠24-28周的GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白组学研究：经过筛选最终能达到严格定量标准的蛋白数有32个，上调蛋白26个，下调蛋白有6个。用OmicsBean数据库对筛选出来的妊娠24-28周阶段的血清差异蛋白进行蛋白质体内的生物学过程分析，发现这些蛋白在体内的生物学过程主要包括损伤应答、凝集过程的负调节、体液免疫反应等。对差异蛋白进行细胞组分分析，发现这些蛋白质主要为血液微粒子、胞外体、脂蛋白微粒、囊泡等。对筛选出来的差异蛋白在体内的分子生物学功能进行分析，发现这些蛋白质在体内主要承担着一些内酶抑制剂的活性、肽酶II 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究摘要调节活性、乙醇结合、丝氨酸水解酶等分子生物学功能。相关疾病有心血管疾病、胰岛素抵抗、心肌梗死、高血压、肾病等。用Cytoscape软件对GDM晚期组与对照血清差异蛋白进行了功能网络分析，结果显示：晚期组差异蛋白主要与急性期反应，血液凝集，蛋白激活级联，极低密度脂蛋白的清除有关。4、将GDM早期组与后期组的差异蛋白进行比较分析，发现共同差异蛋白11个，分别是FA9、FA10、AOPE、FIBA、CO9、C4BPA、C1S、CO7、CO6、PON1、APOA5。利用OmicsBean数据库对筛选出来的GDM组的早期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白进行蛋白质体内的生物学过程分析，发现这些蛋白在体内的生物学过程主要包括脂质转运的正向调节、损伤应答、体液免疫反应、脂蛋白小体的血浆调节等。对差异蛋白进行细胞组分分析，发现这些蛋白质主要为血液微粒子、脂蛋白微粒、胞外体。对筛选出来的差异蛋白质在体内的分子生物学功能进行富集，发现这些蛋白质在体内主要承担着一些内甾族化合物结合、乙醇结合、脂质转运活性等分子生物学功能。共同血清差异蛋白参与的相关疾病有心血管疾病、心肌梗死、静脉血栓形成、2型糖尿病等。5、ELISA结果显示，妊娠11-16周GDM组APOE、F9、FGA结果均高于同期对照组（P<0.05），AOPE、F9、FGA的曲线下面积均大于0.5(P<0.05)，表明对GDM均有较高诊断价值，其中APOE的曲线下面积最高（0.965，P<0.05）。结论：1、孕妇高龄、糖尿病家族史、孕前超重或者肥胖、孕期增长过快、血尿酸高、妊娠早期空腹血糖≥5.1mmol/L均为GDM的危险因素，需要引起重视，早期进行控制血糖的一系列的干预措施；2、GDM的疾病发生可能涉及凝血/纤溶系统、脂肪代谢、补体激活、损伤应答等；3、APOE、F9、FGA有望成为GDM的早期诊断因子。关键词：GDM、高危因素、早期诊断、发病机制、蛋白组学作者：赵丹青指导教师：吴浩荣赵淑云III AbstractsDifferentialProteomicAnalysisonSerumofGestationalDiabetesMellitusDifferentialProteomicAnalysisonSerumofGestationalDiabetesMellitusAbstractsObjectives1．Gestaionaldiabetesmellitus(GDM)isthemostcommonpregnancycomplicationinclinic,whichcanthreatenthehealthofmotherandoffspringseriously.BecausediagnoseperiodandinterveningperiodofGDMisalwaysinlatepregnancy,theadverseeffectsofthefetusintheintrauterinehaveoccurred.Highriskfactorsofearlypregnancyorpre-pregnancyandthediagnosticmarkersofearlypregnancyhavespecialsignificancetocontrolGDM.2.TheetiologyandpathogenesisofGDMisstillunknown.RelationshipbetweensingleproteinandGDMhasbeendiscussedmoreinrecentyears.However,interactionbetweendifferentproteinsforclearingGDMhasnotbeenstudiedthoroughly.Inthisstudy,differentialproteomictechnologywasusedtoanalyzekeypathogenesisofGDM,whichwilllayimportantfoundationforexploringthepathogenesisofGDM,earlydiagnosisofdiseaseandtheevaluationofclinicalcurativeeffect,andalso,willprovidenewstrategiesandideasfortheclinicaltreatmentofGDM.Materialsandmethods1．DataofpregnantwomenwhoregisteredinGuizhoumedicaluniversityaffiliatedhospitalduringFebruary2015toOctober2015werecollectedwiththemethodofprospectivestudy.Undertheprincipleofinformedconsent,suchbasicconditionsofthepregnantwomenwerecollected:age,pregnancyhistory,educationlevel,familyhistory,height,weight,bloodpressure,andbiochemicalindex.OGTTtestwerecarriedoutduring24to28week,andallpregnantwomenweredividedintoGDMgroupandnon-GDMgroupaccordingtotheOGTTresults.RiskfactorsofGDMwereanalyzedbythemethodofsinglefactoranalysisandmultipleLogisticregressionanalysis.2.Serumsamplesofallpregnantwomenwerecollectedduring11-16weekand24-18week.Allserumsampleswerepreparedwithincubation,centrifugation(4℃),splitting,number,quickfreezingandfinallystoragein-80℃refrigerator.AllsamplesIV DifferentialProteomicAnalysisonSerumofGestationalDiabetesMellitusAbstractsweredividedintoGDMgroupandnon-GDMgroupaccordingtoIADPSGdiagnosticcriteria.Tenpiecesofthesampleineachgroupwereselectedwiththeprincipleofsimilarbasicconditionsforfurtherstudyofproteomics.3.WithiTRAQ-basedquantitativeproteomictechnology,differentiallyexpressedproteinswereidentifiedbetweenGDMgroupandnon-GDMgroup.AlldifferentiallyproteinsweremadebioinformaticsanalysiswithGO,diseaserelevance,proteininteractions.4.AOPE,F9,FGAhavesimilarchangetrendin11-16weekand24-28week,sothethreeindexeswereselectedasthecandidatefactorforfurthervalidation.30casesof11-16weekserumcamefromGDMgroupandnon-GDMgrouprespectivelywereselectedtofurthervalidationwithELISAassay.ThenttestandROCcurvewereusedtojudgethediagnosisvalueofthethreefactorsofGDM.Results1．SinglefactoranalysisaboutGDMgroupandnon-GDMgroupshowed:(1)Averageage,BMIbeforepregnancy,systolicpressure,anddiastolicpressureofGDMgroupwerehigherthannon-GDMgroup（P<0.05）.(2)Thereexistedsignificantdifferenceinfamilyhistoryandparitybetweenthetwogroups.Indetail,rateofGDMfamilyhistoryanddeliverytimesmorethanoneofGDMgroupwerehigherthannon–GDMgroup（P<0.05）.(3)Pregnancyweightgain,earlyfastingbloodglucose,uricacidandleukocytecountlevelofGDMgroupwerehigherthannon-GDMgroup（P<0.05）.Logisticregressionanalysisshowed,theriskfactorsofGDMwereearlyfastingbloodglucose,BMI,maternalage,diabetesfamilyhistory,pregnancyweightgain,anduricacidlevel.2.StudyondifferentialproteomicanalysisofserumbetweenGDMgroupandnon-GDMgroupduring11-16weekspregnancy:Therewere33proteinsthateventuallymeetthescreeningcriteria(fold≥1.5or≤0.67,orPvalue<0.05).Amongthe33proteins,therewere14down-regulatedproteinsand19up-regulatedproteins.BiologicalprocessanalysisaboutthealldifferentialexpressedproteinswithOmicsBeandatabaseshowedtheproteinswereinvolvedincoagulation,responsetowounding,acuteinflammatoryreaction,complementactivation,etc.Cellcomponentanalysisabouttheseproteinsshowedallproteinsweremainlyintheextracellularregion,especiallyintheporecomplexes,membraneattackcomplexes,lipoproteinparticalesandmicrosome.MolecularfunctionanalysisabouttheseproteinsshowedthattheproteinsmainlycarriedtheactivityofV AbstractsDifferentialProteomicAnalysisonSerumofGestationalDiabetesMellituspeptidaseregulator,enzymeinhibitor,protein-lipidcomplexbinding,calciumbinding,etc.Theproteinswereinvolvedinthediseasesasvenousthromboembolism,myocardialinfarction,ischemicheartdisease,preeclampsia,typeⅠdiabetes,andtypeⅡdiabetes,etc.NetworkanalysisaboutthedifferentialproteinswithCytoscapesoftwareshowedthattheproteinsmainlyinvolvedincoagulation,theformationoffibrinclot,plasmalipoproteinparticle,matureproteinregulation.3.StudyondifferentialproteomicanalysisofserumbetweenGDMgroupandnon-GDMgroupduring24-28weekspregnancy:Therewere32proteinsthateventuallymeetthescreeningcriteria(fold≥1.5or≤0.67,orPvalue<0.05).Amongthe32proteins,therewere6down-regulatedproteinsand26up-regulatedproteins.BiologicalprocessanalysisaboutthealldifferentialexpressedproteinswithOmicsBeandatabaseshowedtheproteinswereinvolvedinresponsetowounding,negativeregulationofcoagulation,andhumoralimmuneresponse,etc.Cellcomponentanalysisabouttheseproteinsshowedallproteinswerebloodmicroparticle,extracellularexosome,lipoproteinparticle,vesicle,etc.Molecularfunctionanalysisabouttheseproteinsshowedthattheproteinsmainlycarriedtheactivityofenzymeinhibitor,peptidaseregulator,alcoholbinding,serinehydrolase,etc.Theproteinswereinvolvedinthediseasesascardiovasculardiseases,insulinresistance,myocardialinfarct,hypertention,andnephropathy,etc.NetworkanalysisaboutthedifferentialproteinswithCytoscapesoftwareshowedthattheproteinsmainlyinvolvedinacute-phaseresponse,bloodcoagulation,regulationofproteinactivationcascade,very-low-densitylipoproteinparticleclearance,etc.4.AftercomparingthedifferentialproteinsbetweenearlyGDMgroupandlateGDMgroup,11commonproteinswerefound:FA9,FA10,AOPE,FIBA,CO9,C4BPA,C1S,CO7,CO6,PON1andAPOA5.BiologicalprocessanalysisaboutthealldifferentialexpressedproteinswithOmicsBeandatabaseshowedtheproteinswereinvolvedinpositiveregulationoflipidtransport,responsetowounding,humoralimmuneresponse,andregulationofplasmalipoproteinparticle,etc.Cellcomponentanalysisabouttheseproteinsshowedallproteinswerebloodmicroparticle,lipoproteinparticle,extracellularexosome,etc.Molecularfunctionanalysisabouttheseproteinsshowedthattheproteinsmainlycarriedtheactivityofsteroidbinding,alcoholbinding,lipidtransporter,etc.TheVI DifferentialProteomicAnalysisonSerumofGestationalDiabetesMellitusAbstractsproteinswereinvolvedinthediseasesascardiovasculardiseases,myocardialinfarct,venousthrombosis,andtypeⅡdiabetes,etc.5．ELISAassayresultsindicatedthatAOPE,F9,FGAlevelofGDMgroupduring11-16weekwerehigherthanthoseofnon-GDMgroupinthesameterm(P<0.05).ROCresultsshowedthatAUC(areaundercurve)ofAOPE,F9,FGAweremorethan0.5(P<0.05),whichmeansthethreeindexeshadhighdiagnosticvalueforGDM.Amongtheall,AOPEshowedthehighestAUC(0.965,P<0.05).Conclusions1.Advancedmaternalage,diabetesfamilyhistory,overweightorobesitybeforepregnancy,overgrowthduringpregnancy,highlevelofblooduricacid,fastingbloodglucose≥5.1mmol/LareriskfactorsofGDM.Seriesofinterventionsneedtobetakenearlytocontrolbloodglucose.2.EtiologyofGDMmayinvolvecoagulation/fibrinolysissystem,fatmetabolism,complementactivation,responsetowounding,etc.3.APOE,F9,FGAisexpectedtobecometheearlydiagnosismarkerofGDM.Keywords:GDM,riskfactor,earlydiagnosis,pathogenesis,proteomicsWrittenbyZhaoDanqingSupervisedbyWuHaorongZhaoShuyunVII 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究目录序言....................................................................................................................................1第一部分妊娠期糖尿病孕早期高危因素的调查研究....................................................3引言................................................................................................................................3材料与方法........................................................................................................................31.研究对象....................................................................................................................32.研究方法....................................................................................................................43.统计学方法................................................................................................................5结果................................................................................................................................51.GDM组与对照组各项危险因子的单因素分析......................................................52.GDM危险因素的多因素Logistic回归分析...........................................................7讨论................................................................................................................................8小结..............................................................................................................................10参考文献..........................................................................................................................11第二部分GDM孕妇孕早中期及孕中晚期血清差异蛋白筛查及分析.......................13引言..............................................................................................................................13材料与方法......................................................................................................................141.研究对象..................................................................................................................142.试剂和仪器..............................................................................................................143.实验方法....................................................................................................................17结果..............................................................................................................................241.SDS-PAGE考马斯亮蓝染色...................................................................................242、iTRAQ实验差异蛋白质鉴定结果........................................................................253.生物信息学分析......................................................................................................30讨论..............................................................................................................................49小结..............................................................................................................................51 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究参考文献..........................................................................................................................52第三部分APOE、F9、FGA在妊娠早期对GDM的预测价值研究........................55引言..............................................................................................................................55材料与方法......................................................................................................................551.研究对象..................................................................................................................552.试剂与仪器................................................................................................................563.实验方法及操作步骤................................................................................................564.统计学分析................................................................................................................58结果..............................................................................................................................581.GDM组与非GDM组APOE、F9、FGA比较结果............................................582.AOPE、F9、FGA的ROC曲线.............................................................................59讨论..............................................................................................................................60小结..............................................................................................................................63参考文献..........................................................................................................................64全文总结..............................................................................................................................66创新、不足与展望..............................................................................................................67综述..................................................................................................................................68参考文献..........................................................................................................................75就读期间发表的论文..........................................................................................................84缩略语表..............................................................................................................................85致谢..................................................................................................................................86 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究序言序言糖尿病已成为危害人类健康的主要慢性非传染性疾病之一，全球的糖尿病发生率逐年升高，尤其是发展中国家，而且年轻化成为趋势，随着社会经济发展、生活方式改善、肥胖妇女增加，相当一部分年轻的育龄妇女在孕前存在糖代谢异常或者在妊娠期发生严重的糖代谢问题。在中国，随着二胎政策的放开，高龄孕妇呈现井喷的趋势，愈来愈多的妊娠并发症随之发生率明显增加，这其中包括妊娠期糖尿病的发生率明显增加。在中国，妊娠期糖尿病已经成为最常见的妊娠并发症。妊娠期糖尿病(gestationaldiabetesmellitus，GDM）是妊娠期首次发生或发现的不同程度糖代谢异常的内分泌代谢疾病，对母亲和婴儿健康造成严重危害，根据糖尿病的严重程度、孕妇出现血糖升高的时间以及孕期血糖控制水平等因素，母儿不良预后的程度不等。对于母亲近期的不良影响主要是子痫前期、羊水过多、感染、胎膜早破、早产、剖宫产术发生率增加、肩难产发生率增加；对胎儿及新生儿的影响包括：自然流产、胎儿畸形、胎儿生长受限、大于胎龄儿、胎肺功能发育迟缓、新生儿呼吸窘迫综合症、新生儿中枢神经发育异常、胎儿心脏发育异常、新生儿低血糖等，远期的影响包括母亲心血管疾病发生率增加、子代代谢综合症发生率增加、女性子代妊娠时GDM发生率增加等。国内外的GDM诊治指南将其诊断时间定位在妊娠24-28周。由于GDM明确诊断时间较晚，胎儿已经受到不良的宫内环境影响，并且，由于临床营养指导及胰岛素治疗的疗程短，母儿结局的改善的程度并不满意。所以尽可能发现妊娠早期或者妊娠前的致病高危因素，对改善GDM的妊娠结局具有重大的意义。GDM的病因和发病机制复杂，目前为止，并没有了解清楚，更多的研究认为，GDM与胰岛素抵抗、胰岛素分泌异常、炎症反应、脂肪因子相关。蛋白质组指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质，蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变.。在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰.故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目。随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构1 序言妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质是生理功能的执行者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足需要。蛋白质组学本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白-蛋白之间的相互关系，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体全面的认识。其中差异蛋白组学能通过比较样本间蛋白质水平的变化寻找差异分子，从整体上研究与疾病相关的差异蛋白质组，寻找疾病的标记蛋白，具有大规模、高通量、高灵敏度的特点，已经应用于临床上针对疾病早期筛查和诊断的研究。近年来，蛋白质组学技术也在不断进步，本研究拟采用的同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术，是一个新的、功能强大的研究方法。相对于早期的双向凝胶电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）技术，具有以下特点：1.分离能力强、分析范围广；2.定性分析结果可靠；3.灵敏度高、检测限低；4.分析时间快，分离效果好；5.自动化程度高；6.iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白；7.可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。本课题应用iTRAO的方法对妊娠早中期及中晚期的血清标本进行差异蛋白的筛查，试图从生物体功能执行者----蛋白质水平上来探讨GDM的发病机制和寻找可能的GDM早期诊断标志物。研究共分为三部分：（一）妊娠期糖尿病孕早期高危因素的调查研究；（二）GDM孕妇孕早中期及孕中晚期血清差异蛋白筛查及分析；（三）APOE、F9、FGA在妊娠早期对GDM的预测价值研究。从患者的临床基本资料和血液标本的生物学指标分析共同、有序地分析GDM的危险因素和可能的早期诊断因子，并且为进一步深入了解GDM的致病机制提供思路。2 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第一部分第一部分妊娠期糖尿病孕早期高危因素的调查研究引言妊娠期糖尿病(gestationaldiabetesmellitus，GDM）是妊娠期首次发生或发现的不[1]同程度糖代谢异常的内分泌代谢疾病，对母亲和婴儿健康造成严重危害，根据糖尿病的严重程度、孕妇出现血糖升高的时间以及孕期血糖控制水平等因素，母儿不良预后的程度不等。对于母亲近期的不良影响主要是子痫前期、羊水过多、感染、胎膜早破、早产、剖宫产术发生率增加、肩难产发生率增加；对胎儿及新生儿的影响包括：自然流产、胎儿畸形、胎儿生长受限、大于胎龄儿、胎肺功能发育迟缓、新生儿呼吸窘迫综合症、新生儿中枢神经发育异常、胎儿心脏发育异常、新生儿低血糖等，远期的影响包括母亲心血管疾病发生率增加、子代代谢综合症发生率增加、女性子代妊娠时GDM发生率增加等。国内外的GDM诊治指南将其诊断时间定位在妊娠24-28周。由于GDM明确诊断时间较晚，胎儿已经受到不良的宫内环境影响，并且，由于临床营养指导及胰岛素治疗的疗程短，改善母儿预后的程度并不满意，研究发现，血糖浓度在正常范围内的GDM孕妇分娩巨大儿、大于胎龄儿等并发症的风险仍高于正常[2]孕妇。所以在妊娠早期寻找GDM的高危因素，纠正不良生活习惯，及时营养指导，可以在一定程度上减少GDM的发生及发病程度。本文的第一部分主要针对GDM的临床高危因素进行总结分析。材料与方法1.研究对象研究对象选自2015年2月-2015年10月在贵州医科大学附属医院门诊建卡并在本院完成妊娠24-28周OGTT的孕妇。1.1入组条件：a.建卡时间：11-16周；b.孕前无合并内外科疾病，尤其包括糖尿病、高血压、多囊卵巢综合症、高脂血症、心脏病、肝病、肾病、血液系统疾病；c.自然受孕；3 第一部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究d.单胎；e.无抽烟酗酒史；1.2排除条件：a.因胎儿畸形行引产术；b.未规范产检者；最终纳入研究范围的孕妇697人。2.研究方法采用前瞻性研究。2.1基本情况调查2.1.1调查方法所有入组孕妇建卡时在知情同意的情况下填写基本情况调查表。调查表由专业人员完成收集并建档。调查的主要内容包括：姓名、年龄、文化程度、孕次、产次、家族史（包括孕妇父母、孕妇外祖父母及祖父母、孕妇父母的兄弟姐妹）、既往病史、既往不良孕产史、既往妊娠合并症及并发症史、建卡孕周（需由早期超声核对）、抽烟酗酒史、身高、孕前体重、孕期增重（OGTT测试时的体重比较孕前体重）、血压等；根据孕妇的门诊登记号码登录医院HIS系统查询常规建卡实验室检查结果。2.2诊断标准根据2014年妊娠合并糖尿病诊治指南，所有孕妇在妊娠24-28周完成75g葡萄糖耐量试验(Oralglucosetolerancetest,OGTT)。75gOGTT方法：OGTT前禁食至少8h，试验前连续3d正常饮食，即每日进食碳水化合物不少于150g，检查期间静坐、禁烟。检查时，5min内口服含75g葡萄糖的液体300ml，分别抽取孕妇服糖前及服糖后1、2h的静脉血（从开始饮用葡萄糖水计算时间），放人含有氟化钠的试管中，采用葡萄糖氧化酶法测定血糖水平。75gOGTT的诊断标准：服糖前及服糖后1、2h，3项血糖值应分别低于5.1、10.0、8.5mmol/L(92、180、153mg/dl)。任何一项血糖值达到或超过上述标准即诊断为GDM。22孕前体重指数（BodyMassIndex,BMI)=孕前体重(kg)／身高(m)，参照2001[3]年中国肥胖问题工作组制定的中国成人体质指数分类建议，将BMI分为如下四类：4 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第一部分22低体重：BMI<18．5kg／m；正常体重：BMll8．5~23．9kg／m；超重：BMl24~27．922kg／m：肥胖：BMI>28kg／m。3.统计学方法采用SPSS19.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布时，采用x±s描述，组间比较采用两独立样本ｔ检验，不符合正态分布采用M（P25，P75)描述，组间比2较采用秩和检验；计数资料用率表示，统计分析采用检验。采用二项logistic回归进行多因素分析，计算OR值及其95％CI。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.GDM组与对照组各项危险因子的单因素分析按照入组条件，纳入研究孕妇697例，诊断为GDM207人，GDM的发病率为29.61%。GDM孕妇中，其中一点指标异常（三个诊断点之一为异常，后述以此类推）的占62.38%（131/207)，两点指标异常的占22.71%（47/207），三点异常的占14.01%（29/207）。2所有危险因素指标根据资料类型及分布情况，分别采用t检验、秩和检验、检验在GDM组和非GDM组之间作单因素比较分析，结果显示：(1)孕妇年龄、孕前BMI、收缩压、舒张压均以GDM组高于非GDM组（P<0.05），见表1；（2）两组家族史、产次情况分布差异具有显著性（P<0.05），具体为GDM组有家族史者和分娩次数大于0次者的检出率大于非GDM组，见表2；（3）孕期增重、早期空腹血糖、尿酸、白细胞计数组均以GDM组高于非GDM组（P<0.05），见表3。表1GDM组与非GDM组年龄、BMI、血压比较(建卡时）Tab.1Comparisonofage,BMIandhypertentionbetweenGDMgroupandnon-GDMgroup指标GDM组（n=207）非GDM组（n=490）tP值年龄(岁）30.14±4.5128.44±4.115.5220.000孕前BMI22.18±6.2420.42±2.103.9510.0002（kg/m)收缩压(mmHg)107.71±10.34105.63±10.732.3600.017舒张压(mmHg)69.35±6.7167.38±9.152.5570.0055 第一部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究表2GDM组与非GDM组家族史、教育程度、妊娠次数、分娩次数分布比较n（%）Tab.2Comparisonofdistributionaboutfamilyhistory,educationlevel,gravidity,anddeliverytimesbetweenGDMgroupandnon-GDMgroup2项目GDM（n=207）非GDM（n=490）X值P值家族史（n,%）有113（54.59）127（25.92）52.9860.000无94（45.41）363（70.08）教育程度（n,%）大专以上128（61.84）299（61.06）1.3430.511高中62（29.95）161（32.86）初中以下17（8.21）30（6.12）妊娠次数651（24.64）134（27.35）1.6520.895（次）578（37.68）194（39.59）451（24.64）112（22.86）316（7.73）41（8.37）23（1.45）6（1.22）13（1.45）3（0.612）分娩次数22（0.966）0（0）19.1460.000（次）161（29.47）83（16.94）0144（69.57）407（83.06）表3GDM组与非GDM妊娠期增重及实验室检查指标比较Tab.3CopmparisonofpregnancyweightgainandindexoflaboratoryexaminationbetweenGDMgroupandnon-GDMgroupGDM组（n=207）非GDM组（n=490）指标Z值P值M(P25，P75)M(P25，P75)增重(kg)9.50(8.00，12.00)8.50(7.00,9.50)-7.429<0.001孕早期空腹血糖值(4.85，5.42)5.104.84(4.605.08)-7.826<0.001(mmol/L)OGTT值(空腹)(mmol/L)5.26(4.97，5.56)4.65(4.45,4.84)-15.291<0.001OGTT值(餐后1小(8.10，10.70)9.627.28(6.11,8.36)-13.080<0.001时)(mmol/L)OGTT值(餐后2小(6.76，8.98)7.906.38(5.67,7.16)-12.347<0.001时)(mmol/L)6 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第一部分促甲状腺素(mIU/L)1.52(0.82，2.68)1.58(0.92,2.39)-0.0940.925血红蛋白(g/L)133.00(127.00,140.00)132.00(126.00,138.00)-1.8470.065尿酸（µmol/L)226.86210.40(185.29,238.48)-4.469<0.001(201.27,261.35)白细胞计数(G/L)9.04(7.55,10.24)8.45(7.36,9.75)-3.1050.002(11.56,26.83)谷丙转氨酶(U/L)15.9614.49(10.78,21.96)-1.7670.077谷草转氨酶(U/L)17.7917.50(14.81,22.04)-0.0200.984(14.67,21.64)尿素氮(mmol/L)2.89(2.37,3.29)2.81(2.42,3.29)-0.4590.646(43.79,50.40)肌酐(µmol/L）46.9046.97(43.56,50.44)-0.1010.9192.GDM危险因素的多因素Logistic回归分析将组间比较有差异的变量进一步做二分类多因素Logistic回归分析，结果显示：影响妊娠期糖尿病的危险因素有早期空腹血糖、BMI、年龄、家族史、孕期增重、血尿酸，见表4。表4影响妊娠期糖尿病的危险因素的二分类Logistic回归分析Tab.4BinaryLogisticanalysisonriskfactorsimpactingGDMEXP(B)的95%CIBS.EWalsdfSig.EXP(B)下限上限年龄（岁）0.0590.0284.55610.0331.0611.0051.1192BMI（kg/m)0.1930.04518.41510.0001.2131.1111.325增重(kg)0.3020.04938.77310.0001.3531.2301.488收缩压0.0000.0110.00010.9881.0000.9791.021(mmHg)舒张压0.0260.0152.91410.0881.0270.9961.058(mmHg)FPG(mmol/L)1.1020.24120.88610.0003.0091.8764.826尿酸0.0060.0026.90810.0091.0061.0021.022（µmol/L)家族史（n,%）1.0530.20127.49410.0002.8671.9344.250产次（次）0.1970.2490.62410.4301.2170.7471.9827 第一部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究讨论妊娠期糖尿病(GDM)是一种在妊娠期首次发生或发现不同程度糖代谢异常的内分泌代谢疾病。发病率存在种族和地域差异，在中国，由于地域广，各个地区的饮食文化、生活习惯不同，带来不同地区的GDM发生率亦有较明显的差异。GDM会对母亲和婴儿健康造成严重危害，患病近期对母儿带来的影响包括：胎儿发育异常、巨大儿、死胎、肩难产、新生儿低血糖和高胆红素血症、产程延长、难产率增加、剖宫产率增加、先兆子痫、妊娠期高血压、羊水过多等；从远期角度讲，GDM的子代在青春期发生肥胖和糖尿病、高脂血症的机会明显增加，并且GDM孕妇产后发展成II[4]型糖尿病的发病风险是非GDM孕妇的6.8倍。由于确诊、干预的时间较晚，母儿预后的改善并不令人满意，所以针对该病的早期干预早期预防成为学者们研究的重点。1.年龄曾有学者以36056例单胎妊娠妇女为研究对象，进行前瞻性的GDM风险评估，所有孕妇分为3个年龄组，比较三组GDM的发生率。结果发现，GDM的发生率随[5]着孕妇年龄增长而逐渐上升。本研究结果显示，年龄因素是GDM发病的独立危险因素。随着孕妇年龄增加，患GDM的风险逐渐增加，每长一岁，GDM的风险相当于对照组的1,1倍（OR=1.061，95%CI:1.005~1.119），单独将年龄超过35岁的孕妇做单因素Logistic回归分析显示，每增加一岁，GDM的发生风险是对照组的1.2倍（OR=1.178，95%CI：0.908~1.528）。目前随着国内二胎政策的执行，高龄孕妇比率明显上升，GDM发生比率增加已成为严峻的问题，对于年龄≥35岁的孕妇门诊就诊，应视为GDM高危人群，及早予以相应指导和干预，改善预后。2.糖尿病家族史流行病学研究表明，GDM是2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)的高危因素，罹患GDM的妇女远期发生T2DM风险明显增高。同样，具有T2DM家族史的妇女更易发生GDM，故有学者认为GDM可能与T2DM具有某些共同的遗传背景。GDM与T2DM一样都是遗传因素和环境因素共同作用的多基因遗传疾病，遗传因素来自于疾病的易感基因，环境因素来自于一个家族中的生活习惯和饮食文化。本研究发现GDM组有约一半的孕妇有家族史54.59%，而非GDM组的孕妇有家族史的占8 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第一部分25.92%；另外一方面，有糖尿病家族史的孕妇发生GDM的比率为47.08%（113/240)，否认糖尿病家族史的孕妇发生GDM的比率为21.23%(97/457)。经过Logistic回归分析，如果孕妇具有糖尿病的家族史，其患GDM的风险增加1.9倍（OR=2.867，95%CI：1.934~4.250）。3.孕前BMI与孕期增重[6]Ogonowski等以孕前BMI值22.85kg/m2作为预测GDM的风险值，其研究结果显示，孕前BMI每增加1kg/m2，GDM的发病风险增高11.6%，在需要胰岛素治疗的妊娠妇女中这种情况更明显。校正妊娠妇女年龄、GDM史和产次等因素的影响后仍呈现出这种相关性，因此，研究者认为，妊娠前不管BMI正常还是超重，GDM的发生风险都会随着妊娠前BMI的增加而增加；妊娠前BMI的大小是GDM患者是否需要胰岛素治疗的预测指标。另一项研究也证明，在校正了孕妇年龄、种族和妊娠前BMI等因素后，GDM的发生风险随着妊娠期BMI的增加而增加。研究者将研究对象分为3组，分别是妊娠期体质量每周增加小于0.27kg组、每周增加在0.27~0.40kg组和每周增加0.41kg以上组，每周增加在0.27~0.40kg组和每周增加[7]0.41kg以上组的GDM发生风险均会增加。在我们的研究中也得到类似的结果，孕前BMI在GDM与非GDM组间比较，P<0.001，两组之间差异有统计学意义，在进2一步做GDM危险因素的Logistic回归分析中发现，孕前BMI每增加1kg/m，GDM的发生风险增加1.2倍，按照2001年中国肥胖问题工作组制定的中国成人体质指数[7]分类建议，将BMl分为如下四类：低体重：BMI<18．5kg／m2；正常体重：BMIl8．5~23．9kg／m2；超重：BMl24~27．9kg／m2：肥胖：BMI>28kg／m2，将研究对象分为四组发现：随着孕前BMI的增加，GDM的发生率呈上升趋势。并且，本研究将入组孕妇在24-28周之间做OGTT时所测体重较孕前体重之间的增值进行研究，发现GDM组与非GDM组之间的体重增值比较，P<0.05，差异有统计学意义，进一步在GDM危险因素的Logistic回归分析中发现，随着增重增加，GDM的发生风险随之增加（OR=1.353，95%CI：1.230~1.488）。由此看来，对于备孕的妇女，如果体重指数超标，应该进行体重管理，将体重控制在标准范围，并且，对于所有首次建卡的孕妇均应该进行健康宣教，营养指导，控制孕期体重不合理的增长。4.空腹血糖(fastingbloodglucose,FPG)国内有研究针对5299例已经分娩的产妇病例做回顾性研究，将所有入组人员分9 第一部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究为3组：A组：FPG<5.1mmol／L，B组：5.1mmol≤FPG<5.8mmol／L，C组：5.8mmol/L≤FPG<7.0mmoI／L，三组的GDM发生率分别为：10.69%、26.11%、54.55%，[7]提示随着早期空腹血糖的增高，糖尿病的发生率随之增高。在一个全国多中心研究中，针对17186例孕妇初次产检FPG水平的研究中发现，FPG在6.10~6.99mmol/L范围内，应将孕妇等同于GDM进行管理，FPG在5.10~6.09的孕妇应该给与饮食和[8]营养管理，控制体重，可以减少GDM的发生率。本研究再次肯定了初次建卡的孕妇其早中孕期的空腹血糖对GDM的发生呈正相关，随着FPG增加，GDM的发生率上升，GDM组与非GDM组之间的差异有统计学意义，P<0.05。将所有孕妇按照FPG≥5.1mmol/L和FPG<5.1mmol/L分为两组，两组的GDM的发生率分别为48.43%和19.72%。Logistic回归分析发现，FPG每增加1mmol/L，GDM的发生风险相当于对照组的3倍（OR=3.009，95%CI：1.876~4.826）。5、尿酸血尿酸与胰岛素抵抗相关。已经有研究证实，高水平的血液尿酸与妊娠期高血压[9-10]疾病相关，妊娠24-28周的高水平的尿酸与GDM相关。有前瞻性研究对比了妊娠15周以前和妊娠24-28周间的血尿酸水平，发现在妊娠15周之前的血尿酸水平比[11]妊娠24-28周之间的血尿酸水平更具有预测价值。本研究发现，GDM组与非GDM组之间尿酸值比较，GDM组的孕妇的尿酸中位数为226.86（201.27-261.35）umol/L，非GDM组的孕妇尿酸为210.40（185.29-238.48）umol/L，差异有统计学意义。Logistic回归分析发现，尿酸是一个GDM的独立危险因素，（OR=1.006，95%CI：1.002~1.022）。小结1、年龄是GDM的独立危险因素，超过35岁以后，每增1岁，GDM的发生风险提高1.2倍；有糖尿病家族史的孕妇，GDM的患病风险增加1.9倍；孕前BMI每2增加1kg/m,孕妇患GDM的风险增加1.2倍；孕期体重增加过快亦导致GDM的发生风险增加；2、妊娠早期空腹血糖≥5.1mmol/L的孕妇，妊娠后期发生GDM的比率为48.4%。3、对于高龄、有糖尿病家族史、孕前超重或者肥胖、孕期体重增长过快、早期空腹血糖≥5.1mmol/L的孕妇要及时开始饮食管理和运动指导，有助于控制GDM的发生及发生程度。10 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第一部分参考文献[1]OvesenPGJensenDM，DammP,RamussenS，KesmodelUS．Matermalandneonataloutcomeinpregnanciescomplicatedbygestationaldiabetes.Anational-videstudy.Thejournalofmaternal-fetal&neonatalmedicine:theofficialjournaloftheEuropeanAssociationofPerinatalMedicine,thefederationofAsiaandOceaniaPerinatalSocieties,theInternationalSocietyofPerinatalObstet.2015:1-5[2]Gonzalez—QuinteroVH，IstwanNB，RheaDJ，eta1．Theimpactofglycemiccontrolonneonataloutcomeinsingletonpregnanciescomplicatedbygestationaldiabetes[J]．DiabetesCare，2007，30：467—470．[3]中华人民共和国卫生部.中华人民共和国卫生行业标准----WS331-2011妊娠期糖尿病诊断.2011.[4]NoctorE，DunneFP．Type2diabetesaftergestationaldiabetes：theinfluenceofchangingdiagnosticriteria．Worldjournalofdiabetes．2015；6(2)：234-244.[5]Cleary—GoldmanJ．Impactofmaternalageonobstetricoutcome[J]．ObstetGynecol，2005，105：983-990．[6]OgonowskiJ，MiazgowskiT，KuczyńskaM，etal.Pregravidbodymassindexasapredictorofgestationaldiabetesmellitus[J].DiabetMed，2009，26（4）：334-338.[7]陈春明国际生命科学学会中国办事处中国肥胖问题工作组联合数据汇总分析协作组.中国成人体质指数分类的推荐意见简介.中华预防医学杂志.2001,35(5).[8]赵丹青、杨慧霞，妊娠早期空腹血浆血糖与妊娠期糖尿病诊断的相关性.中华围产医学杂志，2011,14：210-214.[9]Wei-weiZhu,Hui-xiaYang,et.EvaluationoftheValueofFastingPlasmaGlucoseintheFirstPrenatalVisittoDiagnoseGestationalDiabetesMellitusinChina.2013Mar;36(3):586–590.[10]WeiszB,CohenO,HomkoCJ,SchiffE,SivanE.Elevatedserumuricacidlevelsingestationalhypertensionarecorrelatedwithinsulinresistance.AmJPerinatology.2005;22:139–144.[11]GungorES,DanismanN,MollamahmutogluL.Relationshipbetweenserumuricacid,creatinine,albuminandgestationaldiabetesmellitus.ClinChemLabMed.2006;44:11 第一部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究974–977.[12]CR,SamalS,GhoseS.AssociationofElevatedfirstTrimesterSerumUricAcidLevelswithDevelopmentofGDM.JClinDiagnRes.2014Dec;8(12):OC01–OC05.12 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分第二部分GDM孕妇孕早中期及孕中晚期血清差异蛋白筛查及分析引言迄今为止，GDM的发病机制并没有阐述清楚，众多的研究提示GDM可能与炎症反应、脂质代谢、胰岛素抵抗、氧化应激反应等过程有关。这使得临床上除了使用OGTT的血糖截断值来诊断该病，继而通过饮食运动干预和药物治疗使得血糖值控制在正常范围以内，从而避免不良母儿预后以外，并没有很好的方法来早期预测糖尿病的发病风险。国内外通行的诊断方法是在24-28周行75克葡萄糖耐量试验，根据不同时间点的血糖值与截断值相对比而判断是否为GDM，从而对血糖进行控制，改善胎儿的宫内环境。此时，虽经严格的饮食管理及运动指导，或者药物治疗，母儿预后能得到相当程度的改善，但是纠正得并不彻底。因此，对妊娠早期诊断标志物的研究成为非常重要的课题，以期得到可靠的早期诊断标志物，对GDM进行早期诊断或预测，从而更早的对该病进行预防或者干预。所有生物体的细胞器、细胞、组织中，各种复杂的生理活动和代谢反应都是各个组成部分的内部和表面的蛋白质所维持。蛋白质和基因组序列信息之间并非一一对应，转录后加工、翻译调节以及翻译后修饰加工使得人体总蛋白质数量远远超过有活性的基因数目。蛋白质组学是一套基因所表达的全套蛋白质，本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白-蛋白之间的相互关系，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体全面的认识。其中差异蛋白组学能通过比较样本间蛋白质水平的变化寻找差异分子，从整体上研究与疾病相关的差异蛋白质组，寻找疾病的标记蛋白，具有大规模、高通量、高灵敏度的特点，已经应用于临床上针对疾病早期筛查和诊断的研究。近年来，蛋白质组学技术也在不断进步，本研究拟采用的同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术，是一个新的、功能强大的研究方法。相对于早期的双向凝胶电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）技术，具有以下特点：1.分离能力强、分析范围广；2.定性分析结果可靠；3.灵敏度高、检测限低；4.分析13 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究时间快，分离效果好；5.自动化程度高；6.iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白；7.可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10kD或大于200kD的蛋白。蛋白组学在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等的早期诊断已经取得一[1,2]定成绩。近年来，在产科领域已经开始相关的研究，通过对孕妇体液或者胎儿附属物，如羊水、胎盘、尿液、唾液等的差异蛋白质谱的分析，有望阐明妊娠以及妊娠并发症的相关分子生物学基础，通过比较正常妊娠妇女与患有妊娠合并症妇女相同来源标本的差异蛋白质谱，能够发现潜在的具有特异性的分子生物学标志蛋白。本研究拟使用蛋白质组学的研究手段针对GDM进行研究，期望在蛋白质水平对GDM的发病机制有一个系统的了解，同时获得有价值的GDM早期诊断标志物。材料与方法1.研究对象选择2015年3月--2015年9月在贵州医科大学附属医院产科门诊建卡并定期产检的妊娠11-16周孕妇、单胎、自然受孕、无其他孕前合并症，如糖尿病、高血压、心脏病、高脂血症、肾病、肝病等。所有入组人群在妊娠11-16周收集一次血清标本，用血清分离管收集血液5ml，室温静置1小时，4℃、4000转离心15分钟，200μLEP管分装、编号，快速冷冻，贮于-80℃冰箱备用。入组人群在妊娠24-28周产检时行75g葡萄糖耐量试验同时再次收集一次血清标本，方法同前。按照IADPSG诊断标准将人群分成GDM组与非GDM组。按照GDM诊断标准选择10例患者，另以年龄、BMI、文化程度与患病组接近的10例健康孕妇作为非GDM组。两组组间分别进行孕11-16周对比、孕24-28周对比。本研究经贵州医科大学附属医院伦理委员会批准同意，每个受试者均知情同意并愿意参与此项研究。14 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分2.试剂和仪器2.1主要试剂表2-1主要实验试剂试剂、试剂盒来源Na2HPO4、KH2PO4、NaOH（分析纯）广州化学试剂厂SDS蛋白质裂解液上海碧云天生物技术有限公司Bradford法蛋白定量试剂盒上海碧云天生物技术有限公司蛋白上样缓冲液（2×）博士德公司ELISA试剂盒武汉云克隆公司甘氨酸、TrisAmresco公司丙烯酰胺Sigma公司过硫酸铵上海生工无水乙醇天津市大茂化学试剂厂碘乙酰胺Amresco公司二硫苏糖醇Amresco公司考马斯亮蓝Amresco公司PMSFSigma公司胰蛋白酶Sigma公司10kD超滤管millipore公司异丙醇Sigma公司乙腈Sigma公司甲酸胺Sigma公司iTRAQ®试剂盒(8标)ABSciex公司2.2主要实验仪器表2-2主要实验仪器仪器型号生产厂家电子天平T-203北京赛多利斯仪器pH检测仪Mi150意大利Milwaukee公司数显电热恒温水浴锅H.H.S2上海浦东荣丰科学仪器有限公司水浴锅SB-2000上海爱郎仪器有限公司15 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究磁力加热搅拌器85-2型上海东荣丰科学仪器有限公司超纯水系统HF-superPW上海康雷分析仪器有限公司电热鼓风干燥箱DHG-9145A上海一恒科技有限公司冷冻干燥机FreeZone6美国Labconco公司紫外分光光度计Lambda25美国PerkinElmer公司超低温冰箱FormaScientific美国Thermo公司海尔宇航冰箱BCD-539WF青岛海尔股份有限公司超低温冰箱725美国Thermo公司高效液相色谱仪ProminenceSHIMADZU公司LC-20A脱色摇床TS-2000A海门其林贝尔仪器制造有限公司蛋白电泳仪POWER/PAC美国Bio-RAD公司300酶标仪SpectraMax190美国MolecularDevices公司胶片扫描图MP145日本佳能公司ABSciexMALDITOF/TOFABSciex公司5800ABSciexLCTOF/TOFABSciex公司2.3主要试剂配方a.1×PBS：在400mLddH2O中溶解4.0gNaCl、0.15gKCl、0.72gNa2HPO4和0.12gKH2PO4，HCl调节pH值至7.4，加水定容至500mL。121℃高温蒸汽灭菌20min放冷，4℃保存。b.10%AP：1.0g过硫酸铵，加少量ddH2O溶解之后定容至10mL，配好后500uL每管分装后储存-20℃。c.1.5mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.8）：18.15gTris，加80mLddH2O溶解后，用HCl，调pH至8.8，定容至100mL。d.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）：12.1gTris，加80mLddH2O溶解后，加HCl，调pH至6.8，定容至100mL。e.10%SDS溶液：10gSDS加ddH2O溶解定容至100mL，放于37℃水浴溶解。16 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分f.10×电泳缓冲液：于400mLddH2O中加入15.15gTris（121.1）、72.05g甘氨酸（75.7）、5gSDS（288.38），混匀后加ddH2O定容至500mL，37℃水浴加速溶解，SDS容易产生泡沫，不易剧烈摇晃混匀。g.200mM甲酸胺(pH10)：12.6g甲酸胺，溶于800mLddH2O，用氨水调PH至10，定容到1L。h.20mM甲酸胺(pH10)，80%CAN：20mLpH=10的200mM甲酸胺，800mLCAN，用氨水调pH至10，定容到1L。i.100mMNH4HCO3：0.395gNH4HCO3溶于50mLddH2O。j.40mMNH4HCO3/10%CAN：4mL100mMNH4HCO3，1mLCAN，溶于5mLddH2O。k.SDS胶染色考马斯亮蓝染色液：100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，再用ddH2O定容到1000mL。k.脱色液：醋酸100ml，乙醇50mL，ddH2O850mL。3.实验方法3.1蛋白样品的制备TM本研究利用Biorad公司的ProteoMiner对血清蛋白进行富集，主要操作步骤如下：3.1.1样品分组a.GDM早期组：随机提取三点血糖值都高的10例GDM患者妊娠11-16周血清等体积混合。b.GDM后期组：a组孕妇在妊娠24-28周的血清，等体积混合。c.对照早期组：按照与GDM组相似的年龄、孕产次、文化程度接近，取10例健康对照孕妇妊娠11-16周血清等体积混合。d.对照后期组：c组孕妇在妊娠24-28周的血清，等体积混合。3.1.2柱的准备a.去掉柱子顶端和底端的盖子。b.将柱子移入无盖的收集管，1000g离心60秒，弃去收集管里的液体。c.盖上柱子底部的盖子，增加200µL洗涤缓冲液，盖上顶部盖子。17 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究d.间隔一会，来回颠倒柱子几次（5分钟内）。e.去掉底部盖子，将柱子放回收集管，离心，1000g，60秒，弃去收集管内缓冲液。f.重复步骤3和4。g.去掉底部盖子，将柱子移回收集管，离心，1000g，30-60秒，弃去收集管内缓冲液。h.盖上柱子底部盖子。此时柱子已准备好。3.1.3样品结合a.将样品按体积混合（200µL/样，样品浓度大于50mg/mL）加至柱子中，盖上柱子顶部的盖子，室温在平台或者摇床上摇动2h。3.1.4样品冲洗a.去掉顶部的盖子，将柱子移回收集管，离心，1000g，60秒，弃去收集管内缓冲液。重复离心1000g，60秒一次。b.盖上底部的盖子，增加200µL洗涤缓冲液，盖上顶部盖子，间隔一会，5分钟内来回颠倒柱子几次。c.去掉底部的盖子，将柱子移回收集管，离心，1000g，60秒，弃去收集管内缓冲液。d.重复第2和第3步4次以上。3.1.5样品洗脱a.延柱子壁加入洗涤缓冲液200µL,此过程将所有的beads洗入柱里。b.去掉底部的盖子，将柱子移回收集管，离心，1000g，30-60秒，弃去收集管内缓冲液，更换新的收集管。c.盖上底部的盖子（确保盖紧了），加入20µL洗脱液，将柱子在室温放置10min，期间间隔时间轻轻蜗旋柱子几次。d.去掉盖子，移回干净的收集管，离心，1000g，30-60秒，收集管中即为洗脱的蛋白样品，管子可标为E1。e.重复第3和4步2次。f.盖上底部的盖子，加入100µL洗脱液，将柱子在室温放置10min，期间间隔时间轻轻蜗旋柱子几次。18 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分g.去掉盖子，移回干净的收集管，离心，1000g，30-60秒，收集管中即为洗脱的蛋白样品，管子可标为E2。h.重复第6和7步2次。i.将E1和E2样品混合在一起，混匀后分装，冻存于-80℃。3.2蛋白定量3.2.1Bradford法蛋白质浓度测定a.蛋白标准品室温放置至完全溶解后，取50μL稀释至200μL，使其终浓度为0.5mg/mL。标准品的稀释液与蛋白样品的稀释液相同。常用ddH2O或0.01mol/LPBS稀释标准品。b.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，加ddH2O或0.01mol/LPBS稀释液补足到20μL，每个单位浓度做两个复孔。c.样本稀释到适宜的浓度后，混匀备用，加适当体积样品到96孔板的样品孔中，用ddH2O或0.01mol/LPBS稀释液补齐到20μL，每个样品做两个复孔。d.将G250工作液从冰箱拿出放置室后，再向标准品及样品每孔加入200μLG250工作液，室温放置3-5分钟。e.用特定的酶标仪在595nm波长下测定吸光度。f.对标准品浓度与吸光度进行线性回归，得出标准曲线，然后计算样品的浓度。3.2.2BCA法测定蛋白质浓度a.BCA试剂A与试剂B按50：1的体积配制成适量的BCA工作溶液，充分混匀备用。b.蛋白标准品完全溶解，取50uL用ddH2O或0.01mol/LPBS稀释至200μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的标准品孔中，用同样的稀释液补足到20μL，每个浓度梯度做三个复孔。c.将待测样品稀释适宜倍数，混匀后各加20μL到96孔板中，每个样本做两个复孔。d.各孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育2h。e.用特定的酶标仪在595nm波长下测定吸光度。f.对标准品浓度与吸光度进行线性回归，得出标准曲线，然后计算样品的浓度。19 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究3.3SDS-PAGE考马斯亮蓝染色a.将玻璃板洗净放置通风处晾干后，将薄板及厚板对其后放入玻璃板夹中夹紧，然后放于配胶的架子上，轻压玻璃板，使其两端放平，后用双纯水来检漏。b.不同大小的目的蛋白配制不同浓度的分离胶，分子量大的蛋白用胶浓度越小，反之，分子量小的蛋白用浓度较大的分离胶。分离胶配方如下表。加入AP和TEMED后立即摇匀即可灌胶。在分离胶顶部加入乙醇或者双纯水来封胶，使分离胶两端平齐。表2-3分离胶配方(10mL)1.5MTrisHCl胶浓度ddH2O30%Acr/Bis10%SDS10%APTEMED（pH8.8）6%5.3mL2.0mL2.5mL100μL100μL8μL8%4.6mL2.7mL2.5mL100μL100μL6μL10%4.0mL3.3mL2.5mL100μL100μL4μL12%3.3mL4mL2.5mL100μL100μL4μL15%2.3mL5mL2.5mL100μL100μL4μLc.分离胶配完后大约凝固半小时后，倒去封胶的乙醇，并用双纯水将乙醇冲洗干净。根据所需的体积配制浓缩胶，最后加入AP和TEMED后，立即混匀后将加入分离胶后剩余空间灌满，然后将梳子插入浓缩胶中。表2-4浓缩胶(5%)配方1.0MTrisHcl胶体积ddH2O30%Acr/Bis10%SDS10%APTEMED（pH6.8）2mL1.4mL0.33mL0.25mL20μL20μL2μL4mL2.7mL0.67mL0.5mL40μL40μL4μL6mL4.1mL1.0mL0.75mL60μL60μL6μL8mL5.5mL1.3mL1.0mL80μL80μL8μL10mL6.8mL1.7mL1.25mL100μL100μL10μLd.取出上样蛋白样品至200μLEP管中，按比例加入5×LoadingBuffer(ThermoScientific)，涡旋混匀并短暂离心。将样品于沸水中煮10min，使蛋白彻底变性。e.加满电泳液后，缓慢拔除梳子，使上样孔保持垂直，即可上样进行电泳，在适宜的孔道上5μL蛋白预染Marker。电泳条件为：浓缩胶80V，30min，将样品压缩成线；分离胶120V，跑到分离胶底部。f.电泳结束后，立即将凝胶取下放入染色盒中，加入适量考马斯亮蓝染液染色20 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分2h以上，或在加热的条件下，染色30min即可。g.染色结束后，倒掉染液，用ddH2O将蛋白胶清洗2次，加入事先配好的脱色液脱色，每半小时换一次脱色液，直到凝胶上的考马斯亮蓝洗净为止。h.扫描分析。3.4酶解步骤a．按蛋白定量结果向0.5mL的离心管中加入100μg定容体积至30μL，并做好标记。向每管样品中加入4倍体积（120μL）的还原剂，充分涡旋混匀，短时离心将粘在管壁上的蛋白溶液离到管底，然后37℃水浴1.5h。b．取出样品后进行短时离心，加入与还原剂等体积（120μL）的烷基化试剂，涡旋混匀，室温避光放置10-15min。c．取新的超滤管做好标记，然后将烷基化后的样品转移至对应的超滤管中，4℃，11500rpm，离心30min,将未反应液体全部离心下去（废液）。d．向每个超滤管中加入150μL的Buffer1，4℃，11500rpm，30min，直至超滤管中的液体全部离心下去。e．取出超滤管用枪吸尽管底的废液，然后向每管中加入150μL的Buffer2，4℃，11500rpm，30min。f．向每个超滤管中加入150μL的250mMTEAB，4℃，12000rpm，30min，重复3次。（每离心两次用枪吸掉管底废液）g．吸尽管底的废液，加入400μLH2O（FASP）将超滤管洗净，然后倒掉液体，向每管中加入100μL配制好的酶解液，37℃水浴过夜或14h-16h。3.5蛋白标记步骤a.取出酶解好的蛋白样品，室温下11500rpm，离心10min,然后再加入50μLTEAB，室温下11500rpm，离心5min。重复一次。b.将过滤得到的液体转移的干净新离心管中，做好标记，封口膜封好，再用针在膜上扎些小孔。将其置于-40℃冰箱或干冰中冷冻，然后转移至冷冻干燥机中过夜冻干。c.取出冻干的样品，向其中加入40μLTEAB（不含尿素）使其浓度为1μg/μL，并充分涡旋混匀。d.iTRAQ试剂的准备：确保样品的pH呈碱性一般为8左右，用异丙醇溶解iTRAQ试剂，使最终的反应体系中有机溶剂的比例大于65%，一般为70%。从-20℃21 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究冰箱中取出试剂，向每管中加入93μL异丙醇，充分涡旋混匀，离心，重复1次。e.取混匀离心后的iTRAQ试剂分别加入到含30μL蛋白样品的离心管中，涡旋混匀，离心，于室温下放置2h。f.反应结束后向每管中加入100μL色谱纯水终止反应30min。g.冻干：将终止反应的液体离心后转移至一个管中混匀，然后平均分装到4个管中，再加入200μL色谱纯水。先将其置于-40℃冰箱或干冰中冷冻，然后转移至冷冻干燥机中过夜冻干。3.6高pH反相分级。a.使用BSA混合物进行分离，检测系统情况。b.将标记抽干后的样品用100μL20mM甲酸胺(pH10)复溶，涡旋振荡，12,000转离心20min，吸取上清上样。c.准备16个空白1.5mL离心管，依次做好标记后，用于收集分离得到的组份。d.流速0.8mL/min，分离梯度如下：B：20mM甲酸胺(pH10)，80%CAN。表2-5高效液相色谱过程时间（分钟）B%055530154538469054.590555655e.从第5分钟开始，依次收集每分钟洗脱物到1-16号离心管中。f.真空冷冻干燥，冻干后的样品后﹣80℃保存备用。3.6纳升级反相色谱-TripleTOFTM5600进行蛋白质分析a.根据紫外监测情况，将高pH反相分离得到的16个组份合并为10个组份，合并时采用30μL2%ACN，0.1%FA，合并时，首尾合并成一管。b.12,000转离心10min，吸取上清上样。c.上样体积18μL，采取夹心法上样。22 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分d.LoadingPump流速2μL/min，15min。e.分离流速0.3μL/min，分离梯度根据组份1-4和5-10稍作调整，具体梯度如下：表2-6.程序设定时间（分钟）B%（组份1-4）B%（组份5-10）0550.1106602522854843868080908080915510155质谱参数设置：(1)源气参数：Ionsprayvoltage：2.3kv；GS1：4；Curtaingas：30或35；DP：100或80。(2)TOFMS：m/z：350-1250；accumulationtime：0.25s。(3)productionscan：IDAmumber：30；m/z：100-1500；accumulationtime：0.1s；Dynamicexclusiontime：25s；RollingCE：enabled；AdjustCEwhenusingiTRAQ®reagent：enabled；CES：5。3.7数据处理TM采用高分辨质谱仪(ABSciexTripleTOF5600)进行检测。所得质谱数据在TMuniprot数据库进行蛋白检索鉴定，用ProteinPilot4.5软件对报告离子峰面积积分进行相对定量分析，获得各组表达差异蛋白。3.8生物信息处理应用OmicsBean(http://www.omicsbean.com:88/)数据库对差异蛋白进行GO分类(GeneOntology)，生物学过程（biologicalprocesses,BP）、细胞成分（cellularcomponents,CC）及分子功能（molecularfunction,MF）分类，相互作用网络（Protein-proteininteraction,PPI）、信号转导通路分析。功能交互网络分析使用Cytoscape软件进行分析。GO分类和信号转导通路的分析包括：生物学过程，分子功能，KEGG、REACTOME和Wiki信号转导通路。23 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究结果1.SDS-PAGE考马斯亮蓝染色1.1SDS-PAGE考马斯亮蓝染色验证试剂盒的有效性TMProteoMinerProteinEnrichmentSystemkit含有许多结合蛋白的珠子，每个珠子都有不同的六肽配基，它们与样本的某类蛋白具有特定的亲和性。血浆中含有丰富的蛋白质，当它与试剂盒中蛋白质结合珠子的六肽配基共同孵育的时候，样品的低丰度蛋白质会优先找到其结合位点而被蛋白珠子捕获。而高丰度蛋白质因为没有那么多结合位点与其结合不被珠子捕获，在后面的洗脱过程中被洗脱除去。为了验证TMProteoMinerProteinEnrichmentSystemkit的有效性，我们运用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法对低丰度蛋白富集过的样品进行了验证，结果如图2-1，经过TMProteoMinerProteinEnrichmentSystemkit去除血浆样品中高丰度和对低丰度蛋白富集以后，treatsample泳道相比于originalsample泳道的高丰度蛋白条带明显变浅，TM蛋白丰度明显变低，说明在经过ProteoMinerProteinEnrichmentSystemkit处理后，样品中的低丰度蛋白被富集，高丰度蛋白的丰度降低（图2-1）。图2-1去高丰度蛋白前后蛋白SDS-PAGE考马斯亮蓝染色1.2SDS-PAGE考马斯亮蓝染色验证蛋白定量用BCA定量的方法对2.2.1.3血浆样品蛋白富集后的蛋白质的浓度进行定量。用考马斯亮蓝染色的方法来鉴定不同组之间蛋白质定量结果的准确性（如图2-2所示），24 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分从图上可以清晰看到，各样本的浓度基本一致，可以用于后续实验。对照早期对照后期GDM早期GDM后期图2-2各组样品SDS-PAGE电泳图2、iTRAQ实验差异蛋白质鉴定结果2.1实验标记信息如表：各组同位素标签信息见表1，每组包括2个混合样品，用iTRAQ试剂将样品按照表2-7依序标记。表2-7各组样品iTRAQ标记信息样品组别同位素标签11-16周GDM组111411-16周GDM组211911-16周对照组111311-16周对照组211724-28周GDM组111624-28周GDM组212124-28周对照组111524-28周对照组211825 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究2.2血清差异蛋白分析2.2.1妊娠11-16周的GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白根据检测蛋白质结果,统计每组肽段数大于或等于1的蛋白数计为总蛋白数量，两组实验的总蛋白数量均为429;对肽段数大于或等于2的蛋白进行统计学分析，两组实验肽段数大于或等于2的数量均为316个;当差异倍数大于或等于±1.5倍，且经过统计学检验p-value大于0.05、肽段大于等于2时，可将其视为差异蛋白。经过筛选最终能达到严格定量标准的蛋白数有33个，上调蛋白有14个，下调蛋白19个。表2-8GDM11-16周与相应对照组比较筛选出的差异蛋白Accession#UniportnameGenenamePeptides%CovabNameFoldFunction(95%)(95)AdipocyteplasmamembraneQ9HDC9APMAPAPMAP36.52.09Adipocytedifferentiation-associatedAntithrombin-IIIP01008ANT3SERPINC113063.40.41C,WApolipoproteinA-VQ6Q788APOA5APOA52249.52.28H,WApolipoproteinEP02649APOEAPOE24884.23.21HC4b-bindingproteinalphachainP04003C4BPAC4BPA2420.60.42D,IM,IR,P,WCoagulationfactorIXP00740FA9F9510.22.32C,P,WCoagulationfactorVP12259FA5F568230.54C,WCoagulationfactorXP00742FA10F10713.72.62C,P,WCoagulationfactorXIIP00748FA12F1258.12.39C,D,IM,IR,P,WComplementC1ssubcomponentP09871C1SC1S3336.32.38CA,D,P,IM,IR,WComplementcomponentC6P13671CO6C61514.90.32CA,D,P,IM,IR,WComplementcomponentC7P10643CO7C71514.70.35CA,D,H,IM,IR,P,WComplementcomponentC8betaP07358CO8BC8B1621.20.35CA,D,IM,IR,P,Wchain26 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分ComplementcomponentC8gammaP07360CO8GC8G840.10.41CA,D,IM,IR,P,WchainComplementcomponentC9P02748CO9C92926.30.32C,CA,D,H,IM,IR,P,WComplementfactorBP00751CFABCFB1416.50.27C,CA,D,IM,IR,P,WComplementfactorHP08603CFAHCFH5024.50.56CA,D,IM,IR,P,WEndoplasminP14625ENPLHSP90B111120.53H,PFibrinogenalphachainP02671FIBAFGA4132.916.33C,H,WGalectin-3-bindingproteinQ08380LG3BPLGALS3BP4527.23.94DGelsolinP06396GELSGSN2227.60.52IR,WGlyceraldehyde-3-phosphateP04406G3PGAPDH518.51.9MetabolicprocessdehydrogenaseIgmuchainCregionP01871IGHMIGHM8851.80.33IMInsulin-likegrowthfactor-bindingP24593IBP5IGFBP526.61.67IMprotein5Inter-alpha-trypsininhibitorheavyP19827ITIH1ITIH17039.60.45HyaluronanmetabolicprocesschainH1Inter-alpha-trypsininhibitorheavyQ14624ITIH4ITIH44236.30.11D,IR,WchainH4MyeloperoxidaseP05164PERMMPO1213.33.39DPregnancyzoneproteinP20742PZPPZP10939.70.24ProteininhibitorProteindisulfide-isomeraseP07237PDIA1P4HB613.40.45HProteoglycan4Q92954PRG4PRG4156.74.11IMProthrombinP00734THRBF210649.20.59C,H,IR,P,WSerumparaoxonase/arylesterase1P27169PON1PON12936.62.5VitaminK-dependentproteinCP04070PROCPROC7100.49C,H,P,WaP<0.05versusthecontrol.FoldisanaverageofE1andE2.bC:coagulation,CA:complementactivation,D:defenseresponse,H:hemostasis,IM:immuneresponse,IR:inflammatoryresponse,P:proteolysis/proteinprocessing,W:woundhealing.27 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究2.2.2妊娠24-28周的GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白根据检测蛋白质结果,统计每组肽段数大于或等于1的蛋白数计为总蛋白数量，两组实验的总蛋白数量均为429,对肽段数大于或等于2的蛋白进行统计学分析，两组实验肽段数大于或等于2的数量均为316个;当差异倍数大于或等于±1.5倍，且经过统计学检验p-value小于0.05、肽段大于等于2时，可将其视为差异蛋白。经过筛选最终能达到严格定量标准的蛋白数有32个，上调蛋白26个，下调蛋白有6个。表2-9GDM24-28周与相应对照组比较筛选出的差异蛋白%aUniprotGenePeptidesCovFoldbNameAccession#nameName(95%)(95)FunctionApolipoproteinL1O14791APOL1APOL12336.22.03lipidbindingCentrosomalproteinof2903.64TransportkDaO15078CE290CEP29020.5CD5antigen-likeO43866CD5LCD5L7170.37IM,IRComplementC1r2.68CA,IMsubcomponentP00736C1RC1R1115.5CoagulationfactorIXP00740FA9F9510.22.53C,P,WCoagulationfactorXP00742FA10F10713.72.40C,P,WComplementC5P01031CO5C539210.25CA，IRApolipoproteinEP02649APOEAPOE24884.27.94HApolipoproteinC-IP02654APOC1APOC11249.410.86fattyacidbindingApolipoproteinC-IIP02655APOC2APOC22271.310.34lipidbindingApolipoproteinC-IIIP02656APOC3APOC34875.82.87cholesterolbindingFibrinogenalphachainP02671FIBAFGA4132.921.32C,H,WFibrinogenbetachainP02675FIBBFGB2731.423.92proteinbindingFibrinogengammachainP02679FIBGFGG1818.822.09C,PC-reactiveproteinP02741CRPCRP1134.85.02IM,IRComplementcomponent0.42C,CA,D,H,IM,IR,P,WC9P02748CO9C92926.328 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分PlasmakallikreinP03952KLKB1KLKB1914.12.15cC4b-bindingproteinalpha0.41D,IM,IR,P,WchainP04003C4BPAC4BPA2420.6Keratin,typeIIcytoskeletal2.04CA,D,H,IR1P04264K2C1KRT13443.3PlasmaproteaseC1SERPING12.46C,CA,IMinhibitorP05155IC1811.6VitaminK-dependent3.29C,CA,PproteinSP07225PROSPROS12022Alpha-2-antiplasminP08697A2APSERPINF23158.32.08PComplementC1s2.31CA,D,P,IM,IR,WsubcomponentP09871C1SC1S3336.3SerumamyloidA-1proteinP0DJI8SAA1SAA1654.19.37P,IRComplementcomponent0.42CA,D,H,IM,IR,P,WC7P10643CO7C71514.7Complementcomponent0.27CA,D,P,IM,IR,WC6P13671CO6C61514.9Serum2.32Oxidativestressparaoxonase/arylesterase1P27169PON1PON12936.6Mannan-bindinglectin2.04CAserineprotease1P48740MASP1MASP11522.8ApolipoproteinC-IVP55056APOC4APOC4529.12.82lipidtransporteractivityInter-alpha-trypsininhibitor3.45PheavychainH3Q06033ITIH3ITIH33424.6ApolipoproteinA-VQ6Q788APOA5APOA52249.56.41H,WProteoglycan4Q92954PRG4PRG4156.74.56IMaP<0.05versusthecontrol.FoldisanaverageofE1andE2.bC:coagulation,CA:complementactivation,D:defenseresponse,H:hemostasis,IM:immuneresponse,IR:inflammatoryresponse,P:proteolysis/proteinprocessing,W:woundhealing.29 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究2.2.3前期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同差异蛋白将前期组（11-16周）与后期组（24-28周）的差异蛋白进行比较分析，发现共同差异蛋白11个，分别是FA9、FA10、AOPE、FIBA、CO9、C4BPA、C1S、CO7、CO6、PON1、APOA5。具体见表2-10。表2-10GDM前期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同差异蛋白AccessionUniprotName#nameGenenameFunctionCoagulationfactorIXP00740FA9F9C,P,WCoagulationfactorXP00742FA10F10C,P,WApolipoproteinEP02649APOEAOPEHFibrinogenalphachainP02671FIBAFGAC,H,WComplementcomponentC9P02748CO9C9C,CA,D,H,IM,IR,P,WC4b-bindingproteinalphachainP04003C4BPAC4BPAD,IM,IR,P,WComplementC1ssubcomponentP09871C1SC1SCA,D,P,IM,IR,WComplementcomponentC7P10643CO7C7CA,D,H,IM,IR,P,WComplementcomponentC6P13671CO6C6CA,D,P,IM,IR,WSerumparaoxonase/arylesterase1P27169PON1PON1OxidativestressApolipoproteinA-VQ6Q788APOA5APOA5H,W3.生物信息学分析3.1差异蛋白功能分类3.1.1妊娠11-16周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白功能分类a.生物学过程（BP）分类结果利用OmicsBean数据库对筛选出来的妊娠11-16周阶段的血清差异蛋白进行蛋白质体内的生物学过程分析，发现这些蛋白在体内的生物学过程主要包括血液凝集、损伤应答、急性炎症反应、补体激活等，相关结果如图2-3所示。30 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分图2-3妊娠11-16周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白BP分析b.细胞成分分析（CC）结果利用OmicsBean数据库对差异蛋白进行细胞组分分析，发现这些蛋白质主要定位于细胞外的区域，在孔隙复合物、膜攻击复合物上，以及在脂蛋白颗粒、微粒体上，如图所示。图2-4妊娠11-16周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白CC分析c.分子功能分类结果利用OmicsBean数据库对筛选出来的差异蛋白质在体内的分子生物学功能进行31 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究分析，发现这些蛋白质在体内主要承担着一些内肽酶抑制剂的活性、酶抑制剂的活性、脂蛋白的受体结合、钙离子结合等分子生物学功能，如图所示。图2-5妊娠11-16周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白MF分析3.1.2妊娠24-28周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白功能分类a.生物学过程（BP）分类结果利用OmicsBean数据库对筛选出来的妊娠24-28周阶段的血清差异蛋白进行蛋白质体内的生物学过程分析，发现这些蛋白在体内的生物学过程主要包括损伤应答、凝集过程的负调节、体液免疫反应等，具体见图2-8。32 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分图2-8妊娠24-28周GDM组与非GDM组血清差异蛋白生物学过程分析b.细胞成分分析（CC）结果利用OmicsBean数据库对差异蛋白进行细胞组分分析，发现这些蛋白质主要为血液微粒子、胞外体、脂蛋白微粒、囊泡等，如图2-9所示。图2-9妊娠24-28周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白细胞成分分析c.分子功能分类结果33 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究利用OmicsBean数据库对筛选出来的差异蛋白在体内的分子生物学功能进行分析，发现这些蛋白质在体内主要承担着一些内酶抑制剂的活性、肽酶调节活性、乙醇结合、丝氨酸水解酶等分子生物学功能，结果如图2-10所示。图2-10妊娠24-28周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白分子功能分析3.1.3GDM组的前期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白功能分类a.差异蛋白生物学过程分类结果利用OmicsBean数据库对筛选出来的GDM组的前期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白进行蛋白质体内的生物学过程分析，发现这些蛋白在体内的生物学过程主要包括脂质转运的正向调节、损伤应答、体液免疫反应、脂蛋白小体的血浆调节等，具体见图2-12。34 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分图2-12GDM组的前期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白生物学过程分析b.差异蛋白细胞组分分类结果利用OmicsBean数据库对差异蛋白进行细胞组分分析，发现这些蛋白质主要为血液微粒子、脂蛋白微粒、胞外体等，如图2-13所示。图2-13GDM组的早期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白细胞成分分析c.差异蛋白分子功能分类结果利用OmicsBean数据库对筛选出来的差异蛋白质在体内的分子生物学功能进行富集，发现这些蛋白质在体内主要承担着一些内甾族化合物结合、乙醇结合、脂质转运活性等分子生物学功能，如图2-14所示。35 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究图2-14GDM组的早期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白分子功能分析3.2差异蛋白质与疾病的相关性3.2.1妊娠11-16周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白与疾病相关性a.由图2-15和表2-11可知，妊娠11-16周GDM组与非GDM组血清差异蛋白参与的相关疾病有静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺血性心脏病、子痫前期、1型糖尿病、2型糖尿病等。图2-15妊娠11-16周GDM组与非GDM组血清差异蛋白相关的疾病36 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分表2-11妊娠11-16周GDM组与非GDM组血清差异蛋白相关的疾病PathwayDisease/PathwaysRelatedproteinP-valueGENETIC_ASSOCIATIONPreeclampsiaAPOE,F2,FA5,MPO,PON11.30E-03_DB_DISEASEPregnancyloss,recurrentAPOE,FA5,FA12,THRB6.60E-03Fetalloss,lateAPOE,FA5,THRB5.20E-03Diabetes,type1APOE,CFH,PON1,IGFBP5,1.50E-01Diabetes,type2APOE,CFB,PON16.10E-01Thromboembolism,venousANT3,F2,FA5,FA12,FGA,PROC6.10E-06MyocardialinfarctAPOE,F2,FA5,FGA,PON11.20E-04Atherosclerosis,coronaryAPOA5,APOE,CFH,F2,FA5,FA12,PON14.70E-04Heartdisease,ischemicAPOA5,APOE,CFH,FA5,PON11.80E-04HypercholesterolemiaAPOA5,APOE,ITIH4,PON15.30E-04CardiovasculardiseaseAPOA5,APOE,MPO,PON15.40E-03BIOCARTAAcutemyocardialinfractionANT3,F2,FA10,FGA,PROC6.9E-06AlternativecomplementpathwayC6,C7,C9,CFB1.30E-04ClassicalcomplementpathwayC1S,C6,C7,C92.30E-04ComplementpathwayC1S,C6,C7,C9,CFB2.20E-05ExtrinsicprothrombinactivationpathwayANT3,F2,FA5,FA10,FGA,PROC,3.8E-08LetinInducedcomplementpathwayC6,C7,C97.20E-03IntrinsicprothrombinactivationpathwayANT3,F2,FA5,FA9,FA10,FA12,FGA,PROC8.5E-11PANTHER_PATHWAYBloodcoagulationANT3,F2,FA5,FA9,FA10,FA12,FGA,PROC,PZP4.9E-13REACTOME_PATHWAYHemostasisANT3,F2,FA9,FA5,FA10,FA12,FGA,PROC1.7E-04MetabolismofproteinsF2,FA9,FA10,PROC1.20E-01SignalinginimmunesystemC1S,C6,C7,C8B,C8G,C9,CFB,F2,PROC7.60E-0537 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究3.2.2妊娠24-28周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白与疾病相关性b.由图2-16和表2-12可知，妊娠24-28周GDM组与非GDM组血清差异蛋白参与的相关疾病有心血管疾病、胰岛素抵抗、心肌梗死、高血压、肾病等。图2-16妊娠24-28周GDM组与非GDM组血清差异蛋白相关的疾病表2-12妊娠24-28周GDM组与非GDM组血清差异蛋白相关的疾病PathwayDisease/PathwaysRelatedproteinP-valueGENETIC_ASSOCIACardiovasculardiseasesCRP,APOA5,2.8E-1TIONAPOC1,APOC3,APOE,F10,4_DB_DISEASEFGA,FGB,FGG,PON1CoronaryheartdiseaseCRP,APOA5,APOC2,APOC4,2.4E-9APOE,FGB,PON1InsulinresistanceCRP,APOA5,APOC3,APOC4,4.6E-9APOE,APOL1，PON1Type2diabetesCRP,APOA5,APOC1,APOC2,6.3E-9APOC3,APOC4,APOE,C5,FGA,FGB,PON1myocardialinfarctCRP,APOC3,APOE,FGA,FGB,1.1E-8FGG,ITIH3，PON1atherosclerosisCRP,APOA5,APOC1,APOC2,3.7E-8APOC3,APOE,FGB,PON138 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分stroke,ischemicCRP,APOA5,APOE,FGA,FGB,2.1E-7PON1CoronaryarterydiseaseCRP,FGA,FGB,FGG4.3E-7HypertensionAPOC3,APOE,C5,FGB,PON11.5E-5kidneyfailure,chronicCRP,APOA5,APOC3,APOE,FGB,5.7E-5PON1nephropathyAPOC3,APOE,PON12.8E-3IntrinsicrrothrombinF9,F10,FGA,FGB,FGG,1.4E-1BIOCARTAactivationpathwayKLKB1,PROS1,SERPING10ComplementpathwayC1R,C1S,C5,C6,C7,C9,MASP14.3E-9ClassicalcomplementC1R,C1S,C5,C6,C7,C96.1E-8pathwayExtrinsicprothrombin2.4E-6F10,FGA,FGB,FGG,PROS1activationpathwayLectininducedC5,C6,C7,C9,MASP12.4E-6complementpathwayAcutemyocardialF10,FGA,FGB,FGG,PROS11.9E-5infarction4.2E-5AlternativecomplementC5,C6,C7,C9pathwayFGA,FGB,FGG5.1E-3FibrinolysispathwayCellsandmoleculesC5,C6,C7involvedinlocalacute8.7E-3inflammatoryresponseKEGG_PATHWAYComplementandF9,F10,C1R,C1S,C5,C6,C7,C9,7.1E-3coagulationcascadesC4BPA,FGA,FGB,FGG,0KLKB1,MASP1PROS1,SERPINF2,SERPING1RegulationofREACTOME_PATHComplementcascadeC5,C6,C7,C9,C4BPA,PROS19.8E-9WAYTerminalpathwayofC5,C6,C7,C9,1.0E-6complement3.2.3GDM组的早期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白与疾病相关性由图2-17和表2-13可知，GDM组的早期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白参与的相关疾病有心血管疾病、心肌梗死、静脉血双形成、2型糖尿病等。39 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究图2-17GDM组的早期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白相关的疾病表2-13GDM组的早期组（11-16周）与后期组（24-28周）共同血清差异蛋白相关的疾病PathwayDisease/PathwaysRelatedproteinP-valueGENETIC_ASSOCIATIONCardiovasculardiseasesAPOA5,APOE,F10,FGA,FGB,7.3E-11_DB_DISEASEFGG,PON1stroke,ischemicAPOA5,APOE,FGA,FGB,4.4E-7PON1lipidmetabolismAPOA5,APOE,FGB,PON12.8E-6myocardialinfarctAPOE,FGA,FGB,FGG,PON19.1E-6VenousthrombosisF9,FGA,FGB,FGG,1.2E-5fibrinogenheartdiseaseFGA,FGB,FGG1.2E-5HemorrhageAPOE,FGA,FGB1.9E-5Type2diabetesAPOA5,APOE,F9,F10,C6,C7,2.5E-5C9,FGA,FGB,FGG,PON1CoronaryarterydiseaseAPOA5,APOE,FGB,PON12.7E-5ChronicrenalfailureAPOA5,APOE,F10,FGB,FGG,3.3E-4PON1，SERPING1hypertensionAPOE,F10,FGA,FGB,FGG,8.9E-4PON1BIOCARTAIntrinsicprothrombinF9,F10,FGA,FGB,FGG,8.6E-8activationpathwaySERPING140 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分ClassicalcomplementC1R,C1S,C6,C7,C99.6E-7pathwayComplementpathwayC1R,C1S,C6,C7,C93.4E-6ExtrinsicprothrombinF10,FGA,FGB,FGG,4.7E-5activationpathwayAcutemyocardialF10,FGA,FGB,FGG2.1E-4infarctionAlternativecomplementC6,C7,C91.2E-3pathwayFGA,FGB,FGG,2.6E-3FibrinolysispathwayC6,C7,C92.6E-3LectininducedcomplementpathwayF9,F10,C1R,C1S,ComplementandKEGG_PATHWAYC6,C7,C9,C4BPA1.5E-20coagulationcascadesFGA,FGB,FGG,SERPING1RegulationofREACTOME_PATHWAYC6,C7,C9,C4BPA7.4E-6complementcascadeTerminalpathwayofC6,C7,C95.3E-5complement3.3差异蛋白相互作用分析3.3.1妊娠11-16周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白相互作用分析为研究实验所得的差异蛋白之间是否具有相互作用，我们对妊娠11-16周GDM组与正常对照相比得到的差异蛋白进行了相互作用分析，结果如图2-18所示。图2-18A以已知的妊娠糖尿病相关基因，包括CDKAL1,MTNR1B和IGF2BP2基因为靶基因，检测到的差异蛋白为候选基因，共同分析相互作用网络。结果显示，除PRG4以外，其余蛋白处于一个网络之中，互相之间有联系。图2-18B以已知的2型糖尿病相关基因为靶基因,共19个，包括CDKN2A,CDKN2B,HHEX,KCNJ11,KCNQ1,MTNR1B,NOTCH2,ENPP1,PPARG,HNF1B,TCF7L2,WFS1,IGF2BP2,CAPN10,CDKAL1,ADAMTS9,FTO,SLC30A8，JAZF1，检测到的差异蛋白为候选基因，共同分析其相互作用。结果显示，所有蛋白处于同一网络。这些结果表明，检测的差异蛋白与糖尿病的发生存在关联。41 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究AB图2-18妊娠11-16周GDM组与非GDM组血清差异蛋白相互作用分析。A.差异蛋白与妊娠糖尿病相关基因相互作用网络图。图中蓝色为已知的妊娠糖尿病相关基因，包括CDKAL1,MTNR1B和IGF2BP2基因，红色为检测到的差异蛋白。B.差异蛋白与二型糖尿病相关基因相互作用网络图。图中蓝色为已知2型糖尿病相关基因,包括CDKN2A,CDKN2B,HHEX,KCNJ11,KCNQ1,MTNR1B,NOTCH2,ENPP1,PPARG,HNF1B,TCF7L2,WFS1,IGF2BP2,CAPN10,CDKAL1,ADAMTS9,FTO,SLC30A8,和JAZF1,红色为检测到的差异蛋白。42 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分3.3.2妊娠24-28周GDM组与非GDM组的血清差异蛋白相互作用分析我们对妊娠24-28周GDM组与正常对照相比得到的差异蛋白进行了相互作用分析，结果如图2-19所示。图2-19A以已知的妊娠糖尿病相关基因，包括CDKAL1,MTNR1B和IGF2BP2基因为靶基因，检测到的差异蛋白为候选基因，共同分析相互作用网络。结果与11-16周相似，除PRG4以外，其余蛋白处于一个网络之中，互相之间存在联系。图2-19B以已知的2型糖尿病相关基因为靶基因,如上所述，共19个，检测到的差异蛋白为候选基因，共同分析其相互作用。结果与11-16周结果相似，所有蛋白处于同一网络。这些结果表明，检测到的差异蛋白与糖尿病的发生存在关联。AB图2-19妊娠24-28周GDM组与非GDM组血清差异蛋白相互作用分析。A.差异蛋白与妊娠糖尿病相关基因相互作用网络图。图中蓝色为已知的妊娠糖尿病相关基因，包括CDKAL1,MTNR1B和IGF2BP2基因，红色为检测到的差异蛋白。B.差异蛋白与二型糖尿病相关基因相互作用网络图。图中蓝色为已知2型糖尿病相关基因，包括CDKN2A,CDKN2B,HHEX,KCNJ11,KCNQ1,MTNR1B,NOTCH2,ENPP1,PPARG,HNF1B,TCF7L2,WFS1,IGF2BP2,CAPN10,CDKAL1,ADAMTS9,FTO,SLC30A8,和JAZF1,红色为检测到的差异蛋白。43 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究3.3.3GDM前期组（11-16周）与对照血清差异蛋白Cytoscape功能网络分析我们用Cytoscape软件对GDM前期组与对照血清差异蛋白进行了功能网络分析。图2-20A为对这些差异蛋白进行的GO分析，包括生物学过程及分子功能分析。图2-20B为网络结果条形图，显示了每一种分类所包含的名称及差异蛋白数量。结果显示，前期组差异蛋白主要参与了血液凝集、纤维蛋白凝块的形成、血浆脂蛋白颗粒组织、蛋白成熟调控等。图2-21为前期组与对照血清差异蛋白基于Cytoscape软件的信号转导分析网络图，图A包括KEGG、REACTOME和Wiki信号转导通路综合分析。图B为网络结果条形图，显示了每一种分类所包含的通路名称及差异蛋白数量。结果显示，这些蛋白主要参与了补体与凝血级联、维生素B12代谢、ABC转运蛋白在脂质内稳态、纤维蛋白凝块形成的内在途径等信号转导通路。A44 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分B图2-20GDM前期组与对照血清差异蛋白基于Cytoscape的功能网络分析.A.GO分析，包括生物学过程及分子功能分析。B.网络结果条形图。B中颜色与图A相对应，显示了每一种分类的所包含的通路名称及差异蛋白数量。图B中颜色所示与图A一致，相同颜色为同一组分类。45 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究AB图2-21GDM前期组与对照血清差异蛋基于Cytoscape的功能网络分析.A.信号转导分析网络图，包括KEGG、REACTOME和Wiki信号转导通路分析。B.网络结果条形图。B中颜色与图A相对应，显示了每一种分类的所包含的名称及差异蛋白数量。图B中颜色所示与图A一致，相同颜色为同一组分类。46 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分3.3.4GDM后期组（24-28周）与对照血清差异蛋基于Cytoscape的功能网络分析我们用Cytoscape软件对GDM后期组与对照组血清差异蛋白进行功能网络分析。图2-22A为GO分析，包括生物学过程及分子功能分析。图2-20B为网络结果饼图，显示每一种分类所包含的名称及差异蛋白数量。结果显示，后期组差异蛋白主要与急性期反应，血液凝集，蛋白激活级联，极低密度脂蛋白清除有关。图2-23为后期组与对照血清差异蛋白基于Cytoscape软件分析的信号转导网络图，图A包括KEGG、REACTOME和Wiki信号转导通路综合分析。图B为网络结果条形图，显示了每一种分类所包含的通路名称及差异蛋白数量。结果显示，这些蛋白主要参与了维生素B12代谢，纤维蛋白凝块的形成，补体和凝血级联等信号转导通路。AAB图2-22GDM晚期组与对照血清差异蛋基于Cytoscape的功能网络分析.A.GO分析，包括生物学过程及分子功能分析。B.网络结果饼图。B中颜色与图A相对应，显示了每一种分类的所包含的名称及差异蛋白数量。图B中颜色所示与图A一致，相同颜色为同一组分类。47 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究AB图2-23GDM后期组与对照血清差异蛋基于Cytoscape的功能网络分析.A.信号转导分析网络图，包括KEGG、REACTOME和Wiki信号转导通路分析。B.网络结果条形图。B中颜色与图A相对应，显示了每一种分类的所包含的名称及差异蛋白数量。图B中颜色所示与图A一致，相同颜色为同一组分类。48 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分讨论GDM的病因不明确，目前认为与胰岛素抵抗(insulinresistanceIR)有关，每个孕妇均存在生理性胰岛素抵抗，但是抵抗达到一定程度则发生GDM，GDM产后有发展成为T2DM的趋势，所以也可以认为二者的病因存在一定的相似之处。导致胰岛素抵抗的因素包括妊娠期激素水平变化、自身免疫、遗传等导致胰岛分泌胰岛素的功能下降以及机体组织器官对胰岛素敏感性下降、血中游离脂肪酸水平变化、胰岛素受体信号传导功能异常等。为了寻找GDM早期诊断的潜在血清标志物，阐明GDM的分子机制，我们对妊娠期糖尿病孕妇与健康对照组血清差异表达蛋白进行了鉴定和定量分析。通过对妊娠11-16周的血清差异蛋白组学的分析发现，妊娠11-16周GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白数有33个，下调蛋白有14个，上调蛋白19个。经过生物信息学分析发现，这些蛋白在体内的生物学过程主要包括血液凝集、损伤应答、急性炎症反应、补体激活等；而且，与静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺血性心脏病、子痫前期、1型糖尿病、2型糖尿病等疾病相关。再对妊娠24-28周的GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白进行分析，发现经过筛选最终能达到严格定量标准的蛋白数有32个，下调蛋白有6个，上调蛋白26个。这些差异蛋白在体内的生物学过程主要包括损伤应答、凝集过程的负调节、血凝、体液免疫反应、极低密度脂蛋白清除等。并且与心血管疾病、胰岛素抵抗、心肌梗死、高血压、肾病等相关。继而，我们再将两个时间段的共同差异蛋白提出来，有11个，将这11个共同的差异蛋白做进一步的生物学分析提示：这些蛋白在体内的生物学过程主要包括脂质转运的正向调节、损伤应答、体液免疫反应、脂蛋白小体的血浆调节、凝血等，主要与心血管疾病、心肌梗死、静脉血栓形成、2型糖尿病有关。这些差异蛋白质涉及不同的生物学过程及信号转导通路，提示各种机制和蛋白可能参与了妊娠期糖尿病的发展，其中包括凝血、炎症反应、免疫反应、补体激活、氧化应激等。有趣的是，这些生物学过程已经被研究者发现参与了GDM的病理生理过[3、4-8]，而且，因为在前期（11-16周）就表现出明显的差异，因而这些蛋白可能会成为GDM早期诊断的候选生物标志物。正常妊娠状态下，孕妇的凝血系统和纤溶系统功能相对于未孕的妇女会发生一定49 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究的改变以助于应对分娩，减少产后出血。众所周知，凝血因子Ⅷ和vWF（vonWillebrand[4]因子）在妊娠期间血液浓度增加，而纤溶系统的活性在糖尿病患者中受到相对抑制[9]。GDM孕妇的凝血和纤溶功能较正常孕妇变化更明显。据报道，相对于健康孕妇，GDM孕妇的凝血因子VIII和IXa的表达水平以及vWF活性均明显增加。GDM孕妇[10]的动静脉血栓形成的的风险较高，凝血因子IX是血栓形成的重要原因之一。同样，GDM孕妇的纤维蛋白原相对于健康孕妇而言水平较高，这使得GDM孕妇的血液高凝状态更明显。我们的研究结果表明，在妊娠早期，后期发展成为GDM的这一组孕妇，其凝血因子IX、X、XII，和FGA都明显增加，而凝血因子V明显降低，这个结果表明妊娠早期的血液高凝状态预示着后期发生GDM的可能性较大。此外，我们还发现，GDM组的妊娠早期血液中抗凝蛋白antithrombinIII（ANT3）和维生素K依[11]赖性蛋白C（PROC）下调。ANT3有抑制凝血酶和凝血因子IX，X，和XI的作用，从而抑制抗凝状态，使得GDM孕妇在妊娠早期更倾向于高凝状态。这个变化延续到妊娠后期，在后期的蛋白组学分析可以发现同样的问题。[6]氧化应激与妊娠糖尿病的发病机制以及并发症的发生发展有关。Myeloperoxidase（MPO）是由白细胞释放的血红素蛋白，在细胞水平的氧化应激和炎症中起着至关重要的作用。MPO是一种很有前途的心血管疾病风险预测生物标志物[12]。对氧磷酶和酯酶执行内源性自由基清除，它们与高密度脂蛋白和低密度脂蛋白联[6]合起来，使其免受水解活物磷脂和脂质过氧化产物的氧化。在本研究中，MPO水平和血清对氧磷酶/芳香酯酶1（PON1）的水平在GDM组的早期血清中高于对照组，我们推测，MPO和PON1水平升高可能是一种补偿行为，因为GDM患者处于氧化应激反应增强的状态，很有可能在GDM早期参与其发病机制。未来的研究将有助于阐明PON1和MPO在GDM的作用。正常孕妇的外周组织胰岛素抵抗以及炎症反应增加是其两个特征，对于GDM患者，这两个特征更为突出。在本研究中，我们发现一些补体蛋白和与炎症反应相关的凝血因子，包括C1S，C4BPA，C6、C7、C9、C8B、C8G、FA12、CFH，FA2。此外，还发现了四种与炎症相关的蛋白质，包括FGA、GSN、ITIH1和ITIH4。在既往的研[13-16]究中，这4种蛋白质与炎症过程有关，包括GDM相关的炎症反应。例如，纤维蛋白原水平在急性、慢性炎症反应以及癌症患者体内均升高。GSN作为可以具备调节好几个炎症通路的优势成为有前景的治疗候选者。ITIH1是一个丝氨酸蛋白酶抑制50 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分[15]剂，可在血浆中携带透明质酸，在炎症和癌变的过程中起到一定的作用。itih4是IL-6依赖的急性时相蛋白，可作为抗炎蛋白。在动物实验中，血清itih4可能有助于[16]预测亚临床胰腺移植后急性排斥反应。。由于GDM与炎症增加有关，孕妇血清补体蛋白浓度有望增强。然而，除了C1s，我们的结果显示这7个补体蛋白，即C6、C7、C9、C8B、C8G，CFB，和CFH在GDM孕妇的早期血清标本中显著下调。同样，最近的一项研究表明，在分娩时，GDM[7][17,18]母血中的C3a和C4a水平相比对照组明显下调。其他研究也报告了类似的结果。GDM孕妇血浆补体蛋白减少的实际机制尚不清楚。观察到的补体蛋白水平低可能导致病毒中和或细胞裂解缺陷，并增加GDM妇女的感染风险。它也可能导致免疫复合物的清除缺陷并引起炎症反应。仍然需要进一步的研究来阐明补体蛋白在妊娠和妊娠糖尿病中的作用。体液免疫的主要成分是补体和循环免疫球蛋白。母源抗体G通过胎盘传播，保护新生儿。这种被动免疫的获得对于胎儿适应子宫外环境至关重要，提供保护以防止[19]感染。高血糖改变免疫球蛋白在胎盘中的转移，降低母体血液和初乳中的免疫球蛋[20]白水平。在我们的研究中，GDM孕妇的早期妊娠血清中IGHM水平较正常孕妇明显下调患者。在未来的研究将进一步阐明IGHMGDM的发病机制中的作用。同样的，半乳糖凝集素结合蛋白3（lg3bp），是随后发生GDM的孕妇血清中亦检测上升现象。现有的证据表明，伴随着妊娠的发展，脂质代谢发生更深入地变化，而GDM的[21]特征之一就是碳水化合物——脂肪平衡的破坏。有研究显示妊娠12-16周阶段的ApolipoproteinCIII可被确定为候选生物标记物。GDM孕妇的血浆载脂蛋白A-II浓度[8]从妊娠4–12周阶段到24-28周阶段是呈上升趋势的。在本研究中，两个载脂蛋白：APO5和APOE，在GDM孕妇的早期血清较正常孕妇升高，这提示受损的脂质转运和代谢在GDM中发挥作用。小结1、妊娠11-16周的GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白数有33个，上调蛋白有14个，下调蛋白19个。这些蛋白在体内的生物学过程主要包括血液凝集、损伤应答、急性炎症反应、补体激活等，在体内主要承担内肽酶抑制剂的活性、酶抑制剂的活性、脂蛋白的受体结合、钙离子结合等分子生物学功能，与静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺51 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究血性心脏病、子痫前期、1型糖尿病、2型糖尿病等疾病相关；2、妊娠24-28周的GDM组与非GDM组之间的血清差异蛋白数有32个，上调蛋白26个，下调蛋白有6个。这些蛋白在体内的生物学过程主要包括损伤应答、凝集过程的负调节、体液免疫反应等，在体内主要承担内酶抑制剂的活性、肽酶调节活性、乙醇结合、丝氨酸水解酶等分子生物学功能。与心血管疾病、胰岛素抵抗、心肌梗死、高血压、肾病等疾病有关；3、妊娠前期与后期共同存在的差异蛋白11个，分别是FA9、FA10、AOPE、FIBA、CO9、C4BPA、C1S、CO7、CO6、PON1、APOA5。这些共同的差异蛋白在体内的生物学过程主要包括脂质转运的正向调节、损伤应答、体液免疫反应、脂蛋白小体的血浆调节，在体内主要承担内甾族化合物结合、乙醇结合、脂质转运活性等分子生物学功能。这些共同的差异蛋白与心血管疾病、心肌梗死、静脉血栓形成、2型糖尿病等相关；参考文献[1]WeiYS，ZhengYH，LiangWB，eta1．Identificationofserumbiomarkersfornasopharyngealcarcinomabyproteomicanalysis[J]．Cancer，2008，112(3):544—551．[2]SuzukiM，RossGF，WiersK，eta1．Identificationofaurinaryproteomicsignatureforlupusnephritisinchildren[J]．PediatrNephrol，2007，22(12)：2047-2057．[3]Abell,S.K.,DeCourten,B.,Boyle,J.A.,etal.Inflamatoryandotehrbiomarkers:roleinpathophysiologyandpredictionofgestationaldiabetesmellitus.Int.J.Mol.Sci.2015,1613442-13473.[4]DeitcherSR,GardnerJF(1999)Physiologicchangesincoagulationandfibrinolysisduringnormalpregnancy.Clinicsinliverdisease3(1):83-96[5]BekdemirH,BerberogluZ,GorarS,etal(2015)Hemostaticchangesingestationaldiabetesmellitus.InternationalJournalofDiabetesinDevelopingCountries1-5.[6]LappasM,HidenU,DesoyeG,etal(2011)Theroleofoxidativestressinthepathophysiologyofgestationaldiabetesmellitus.AntioxidRedoxSignal15(12):3061-100.[7]LappasM(2011)LowercirculatinglevelsofcomplementsplitproteinsC3aandC4ainmaternalplasmaofwomenwithgestationaldiabetesmellitus.DiabetMed52 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第二部分28(8):906-11.[8]FloodNicholsSK,LutgendorfMA,MesngonMT,etal(2013)Impairedlipidtransportingestationaldiabetesmellitus.JDiabResClinMet2:22.[9]KruszynskaYT,YuJG,OlefskyJM,etal(2000)Effectsoftroglitazoneonbloodconcentrationsofplasminogenactivatorinhibitor1inpatientswithtype2diabetesandinleanandobesenormalsubjects.Diabetes49(4):633-639.[10]LoweGD(2001)FactorIXandthrombosis.BrJHaematol115(3):507-513[11]van'tVeerC,MannKG(1997)Regulationoftissuefactorinitiatedthrombingenerationbythestoichiometricinhibitorstissuefactorpathwayinhibitor,antithrombin-III,andheparincofactor-II.JBiolChem272(7):4367-4377.[12]AnatoliotakisN,DeftereosS,BourasG,etal(2013)Myeloperoxidase:expressinginflammationandoxidativestressincardiovasculardisease.CurrTopMedChem13(2):115-138[13]DavalosD,AkassoglouK(2012)Fibrinogenasakeyregulatorofinflammationindisease.SeminImmunopathol34(1):43-62[14]BuckiR,LeventalI,KulakowskaA,etal(2008)Plasmagelsolin:function,prognosticvalue,andpotentialtherapeuticuse.CurrProteinPeptSci9(6):541-551[15]ScottLJ,MugliaP,KongXQ,etal(2009)Genome-wideassociationandmeta-analysisofbipolardisorderinindividualsofEuropeanancestry.ProcNatlAcadSciUSA106(18):7501-7506[16]García-GilFA,LampreaveF,Fuentes-BrotoL,etal(2010)Inter-alpha-trypsininhibitorheavychain4asamarkerofacuterejectioninpancreasallotransplantationinpigs.TransplantProc42(8):3063-3069[17]SotoE,RomeroR,RichaniK,etal(2005)Anaphylatoxinsinpretermandtermlabor.JPerinatMed33:306-313[18]SotoE,RomeroR,RichaniK,etal(2010)Preeclampsiaandpregnancieswithsmall-for-gestationalageneonateshavedifferentprofilesofcomplementsplitproducts.JMaternFetalNeonatalMed23(7):646-657[19]GorusFK,VandewalleCL,WinnockF,etal(1998)IncreasedprevalenceofabnormalimmunoglobulinM,G,andAconcentrationsatclinicalonsetofinsulin-dependentdiabetesmellitus:aregistry-basedstudy.TheBelgianDiabetesRegistry.Pancreas16(1):50-5953 第二部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究[20]FrançaEL,CalderonIdeM,VieiraEL,etal(2012)Transferofmaternalimmunitytonewbornsofdiabeticmothers.ClinDevImmunol2012:928187[21]EbtesamA.AL-Suhaimi,FadwaM.AL-Kulaifi,VijayaRavinayagam,etal(2012)Serumadipocytokines,metabolicandimmunologicalcorrelationsintype1diabetesmellitus(T1DM)children.TheOpenEndocrinologyJournal6:110-11654 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第三部分第三部分APOE、F9、FGA在妊娠早期对GDM的预测价值研究引言对疾病早期诊断标志物的识别有助于认识疾病的发病机制和早期识别和干预疾病。GDM的诊断时间在孕周24-28周，诊断明确以后开始干预，虽然已经明显改善母儿的预后，但是改善的并不完全。临床上通过寻找和总结在妊娠早期甚至未孕时危险因子，比如孕妇肥胖、嗜糖的饮食习惯、糖尿病家族史等，从而进行早期饮食管理和运动指导，有助于控制孕期血糖，但是作用缺乏很好的指向性，并且GDM的发病机制并不明确，所以对GDM妊娠早期的生物标志物的寻找成为热点。既往的研究大多数都是针对可能的致病因子去单个的验证，本研究利用蛋白组学的优点，从蛋白质组整体方面来发现GDM与正常妊娠之间的差异蛋白，分析其可能涉及的致病通路，从而了解GDM的致病环节，同时鉴定早期诊断标志物。在第二部分，通过分别对妊娠11-16周、妊娠24-28周两个阶段的血清差异蛋白组学的研究分析，以及两个时间段共同的差异蛋白组学的研究分析，发现凝血、炎症反应、免疫反应、补体激活和胆固醇代谢参与了GDM的发病机制，我们先选择了APOE、F9、FGA三个蛋白，它们在两个阶段表现一致，主要涉及凝血机制和脂肪代谢，在本部分中，采用ELISA分析验证，了解这三个蛋白可否成为GDM的早期诊断标志物。材料与方法1.研究对象选自2015年2月-2015年10月在贵州医科大学附属医院产科门诊建卡并在本院完成妊娠24-28周OGTT的孕妇，入组条件及排除条件同第一部分。建卡时所采血样处理及储存方法同第二部分。此部分研究用妊娠11-16周时间段的血清做验证。孕妇在妊娠24-28周经过75gOGTT，分为两组：GDM组与非GDM组，抽取30例GDM55 第三部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究患者，按照基本资料接近的原则，选取30例非GDM的孕妇做对照组，进一步行酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)验证。2.试剂与仪器2.1主要试剂人凝血因子IX（F9）酶联免疫分析（96孔）试剂盒BioTsz,SanFrancisco,CA,USA人纤维蛋白原A（FGA）酶联免疫分析（96孔）试剂盒BioTsz,SanFrancisco,CA,USA人载脂蛋白E（APOE）酶联免疫分析（96孔）试剂盒BioTsz,SanFrancisco,CA,USA2.2主要仪器仪器型号生产厂家酶标仪MultiskanGO美国ThermoScientific公司洗板机DNX-9620G北京普朗新技术有限公司低速离心机KDC-40科大创新股份有限公司中佳分公司电热恒温培育箱HPX-9052MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂低温冰箱MDF-U5411SANYO3.实验方法及操作步骤采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测APOE、F9、FGA，按照试剂盒说明书操作。具体操作步骤如下：a.将所需要用的试剂和样品放置室温后，试剂和样本不能直接在37℃中溶解，以防失试剂失效和样品变性。b.标准品：蛋白质标准品放置室温后，加入适量的标准品稀释液，反复颠倒来促进溶解，室温静置10min。取7个干净的1.5mLEP做好标记，用于标准品稀释，依次向每个EP管中加入500uL的标准品稀释液，梯度稀释标准品，空白孔用标准品稀释液。每次实验用新的标准品来保证实验结果的准确及有效性。56 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第三部分蛋白标准品梯度稀释c.加样：实验过程中分别设置标准品孔、样品孔、空白孔。设标准品孔共设7个，按浓度梯度依次加入100μL(见步骤2)，每个标准品浓度梯度设置三个复孔。试剂空白孔加100μL(见试剂准备第二步最后一管)，待测样品每孔加入100μL，每个样品设三个复孔，加完样品后，将酶标板用覆膜盖紧后，放置37℃温育箱中，2小时。d.弃去孔内液体，在吸水纸上甩干，不用洗涤。e.计算好检测溶液A的体积，以A液：A液稀释液体积比为1:100的比例临用前配制检测溶液A工作液，每孔加入100μL，将酶标板用覆膜盖紧，放置37℃温育箱中，1小时。f.将孔内的液体甩掉，每孔加入350μL洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟后，轻轻甩掉酶标板内的洗涤液，酶标板向下用力将孔内残留的液体拍在预先放置在实验台面吸水纸上，重复洗涤上述步骤3次。最后一次洗涤完成后，要将孔内所有的洗涤液全部甩干。自动洗板机亦可。g.计算好检测溶液B的体积，以B液：B液稀释液体积比为1:100的比例临用前配制检测溶液B工作液，每孔加入100μL，将酶标板用覆膜盖紧，放置37℃温育箱中，30min。h.将孔内的液体弃去并甩干，按步骤6的方法洗板5次。i.甩干孔内的洗涤液后，向每个孔中加反应底物90μL，用覆膜将酶标板盖紧，37℃温育箱中避光显色(反应时间大约15-25min，不超过30min。当标准样品孔的前3-4浓度梯度出现明显的蓝色梯度，后3-4浓度梯度的颜色变化不明显时，反应就可以终止)。j.向每个孔中加反应终止液50μL，终止颜色反应，溶液颜色由蓝色立转黄色。终止液加入次序须与底物溶液的加入次序相一致。如样品或标准孔中出现颜色变化不57 第三部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究均匀的情况，则需要将酶标板轻轻晃动，使溶液混合均匀。k.观察酶标板底部没有水滴及孔内没有气泡后，在450nm波长的酶标仪中测量各孔的光密度(O.D.值)。l.绘制标准曲线：将标准品的浓度值作为纵坐标(或其取对数做纵坐标)，测得的2光密度值（OD值）作为横坐标(或取其对数做横坐标），以回归方程R值来确定曲线2的好坏，R值越接近于1，表示曲线越好，结果越可信。或者使用专业制作曲线软件来绘制标准曲线，如curveexpert1.30，得到曲线后，将样品O.D.值代入前面所绘制的标准曲线中计算出样品的浓度，再乘以样本准备时稀释的倍数，就可以得到样品实际的浓度。4.统计学分析数据录入Excel表格，采用SPSS19.0进行统计分析。两组间的比较采用t检验，并对数据进行ROC分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.GDM组与非GDM组APOE、F9、FGA比较结果ELISA结果显示，妊娠11-16周GDM组APOE、F9、FGA结果均高于同期非GDM组（P<0.05），具体见表3-1和图3-1。表3-1AOPE、F9、FGA在妊娠11-16周GDM组与非GDM组中ELISA验证结果组别APOE（ng/ml）F9（ng/ml）FGA（ng/ml）GDM组10.07±5.9217.02±7.7597.21±49.51对照组6.21±4.2611.28±3.1147.80±34.57t值3.6593.0692.908P值0.0010.0050.00958 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第三部分图3-1AOPE、F9、FGA在妊娠11-16周GDM组与非GDM组中的ELISA验证结果2.AOPE、F9、FGA的ROC曲线由表3-2和图3-2可知，AOPE、F9、FGA的曲线下面积均大于0.5(P<0.05)，表明对GDM均有较高诊断价值，其中APOE的曲线下面积最高（0.965，P<0.05）。表3-2AOPE、F9、FGAROC曲线下面积相关参数标志物曲线下面积95%可信限P值APOE0.9650.918-1.0120.000F90.7790.630-0.9280.003FGA0.7930.647-0.9380.00259 第三部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究图3-2AOPE、F9、FGA在妊娠11-16周对GDM诊断价值的ROC曲线讨论根据第二部分血清差异蛋白组学鉴定的结果，我们在前期组（妊娠11-16周）和后期组（妊娠24-28周）共同变化的差异蛋白质里，先选择牵涉到脂质代谢和凝血机制的APOE、F9、FGA做进一步验证，验证的结果与蛋白组学的结果一致。载脂蛋白Ｅ（apolipoproteinE，ApoE）是一种富含精氨酸的糖基化分泌蛋白，分[1]子量为34.2kDa，基因位于人类第19号染色体长臂13区2带，由4个外显子和3[2]个内含子，共3597个核苷酸组成。其cDNA长1163kb，翻译最初产物为含317个[3]氨基酸的蛋白质，后被信号肽裂解，变成由299个氨基酸组成的成熟蛋白。ApoE是一种多态性蛋白质，人类ApoE主要有3种等位基因：E2、E3、E4，分别由位于[10]19号染色体单一位点的三个等位基因编码，ApoE3被认为是母体型或野生型，ApoE2、ApoE4是ApoE3突变而来，它们的密码子分别是E3(112TGC,158CGC)、E260 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第三部分（112TGC,158TGC)、E4（112CGC、158CGC），分别编码ApoE的三种等位基因：ApoE3(cys112和arg158)、ApoE2(cys112、cys158)和ApoE4（arg112、arg158).在血清中形成3种同质合子表型(ApoE2/E2、ApoE3/E3和ApoE4/E4)和3种杂合子表型[11](ApoE2／E4、ApoE3／E4和ApoE2/E3)。哺乳动物体内约有3/4的ApoE由肝脏实质细胞产生，其余由脾、脑、肺、肾、卵巢、肾上腺及肌肉的细胞或组织产生。ApoE存在于乳糜颗粒（chylomiron,CM)、极低密度脂蛋白（verylowdensirylipoprotein,VLDL)和部分高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein,HDL)中，可以与其受体结合，通过低密度脂蛋白受体（LDL-R)途径和非LDL-R途径发挥清除血脂的作用[4]。ApoE蛋白质分子可以被凝血酶水解为两个区域，N端（1～191）为22KD的可溶性球蛋白，此区域较稳定。其中136~158位肽段是受体结合位点，构成反平行的四螺旋束。该区域的碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）在受体结合中起重要作用，一旦被修饰，与受体结合能力显著下降；由209~299氨基酸残基组成的C端结构域螺旋程[5]度很不稳定，是主要的脂质结合区域。既往研究显示ApoE在脂质代谢过程中发挥重要作用，影响富含甘油三酯(TG)、胆固醇的脂蛋白，乳糜微粒、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)等的清除。如果功能异常可能导致动脉粥样硬化和心血管疾病。而且，ApoE在损伤后修复、免疫调节、抑制血小板聚集等方面也有一定作用，作为低密度脂蛋白受体(LDLR)的配体，能够提高机体对多种微生物感染所致机体的[6]免疫反应，如提高NKT数量、增殖、运输和后续的免疫反应。ApoE结合免疫细胞上高亲和力受体，激活Ca2+依赖的信号传导，在免疫反应中发挥重要作用，如抑制T细胞增殖活性、激活中性粒细胞、调节巨噬细胞功能、介导NKT细胞脂质抗原提[12]呈、调节炎症和氧化作用，从而在多层次介导各种病理生理过程。II型糖尿病是多种致病因子作用于机体导致的胰岛素减退和胰岛素抵抗，进而引发的糖、脂肪、蛋白质、电解质代谢紊乱。发病机制涉及遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染、毒素、自由基以及精神刺激等多方面。ApoE异常与糖尿病的之间的关系不断被学者研究和发现，其数量上的异常、基因多态性所导致的蛋白结构异常以及ApoE在脂蛋白分布失衡都可能引起血脂代谢异常，继之发生糖尿病。大量实验证明，由甘油三酯、VLDL水平升高和HDL水平的降低引起的血脂异常是糖尿病的危险因[7、8]素之一。LDL可通过降低胰岛素分泌及限制胰岛β细胞增殖发挥潜在的致糖尿病61 第三部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究[9]作用，而HDL可通过抑制胰岛β细胞凋亡发挥潜在的抗糖尿病作用。大多数的研究认为妊娠期糖尿病的发病机制和II型糖尿病相似，以胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足为主。其中涉及到氧化应激过程、炎症反应、脂肪代谢紊乱、铁蛋白代谢异常等通路。ApoE在GDM中的作用目前尚不清楚，国内外展开的研究尚未见报道。本研究针对妊娠11-16周，GDM组与非GDM组间的蛋白组学分析发现ApoE在患病组的表达明显高于对照组，通过同组孕妇妊娠进展到24-28周，GDM组与非GDM组间的再次差异蛋白组学分析，ApoE在患病组的表达仍然明显高于对照组，充分说明ApoE参与妊娠期糖尿病的发病过程，尤其是妊娠早期的结果提示该蛋白可能成为GDM新的诊断标志物。为了验证蛋白组学的结果，在这一部分，我们采用了ELISA检测手段，用30例GDM孕妇的11-16周血清和30例正常对照的同孕周血清标本来验证，验证结果符合蛋白组学的结果。进一步绘制ROC曲线发现，ApoEde曲线下面积为0.965，说明ApoE具有较高的诊断价值，有望成为GDM早期诊断因子。凝血因子，是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分，它的生理作用是在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口，这个过程被称为凝血。为统一命名，世界卫生组织按其被发现的先后次序用罗马数字编号，有凝血因子Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ，Ⅻ，Ⅻi等。凝血因子I即纤维蛋白原Fg，凝血因子IX被称为抗血友病球蛋白B。纤维蛋白原(因子Ⅰ)为一分子量约34万的糖蛋白，是由两个完全相同的亚基所组成，每一亚基又含有三条肽链，即α、β、γ链，彼此通过二硫键相互连接。此三条肽链分别含610、461及410个氨基酸残基。两个亚基在肽链N端附近再通过三对二硫键将对称的二亚基连结起来。因此整个纤维蛋白原分子可用(Aα，Bβ，γ)来表示，A、B分别代表被凝血酶自α、β肽链N末端水解释放的肽段，形成纤维蛋白后则用(α、β、γ)2来表示。当凝血酶作用于纤维蛋白原时首先自α链的N端处释放出一16肽的肽段A，经过一滞后期后自β链的N端开始加速释放出一14肽的肽段B,剩下的部分即为纤维蛋白的单体。不同种属的纤维蛋白原A、B肽段的水解位置都在Arg(精)-Gly(甘)肽键上。因子Ⅸ（F9）由416个氨基酸残基所组成，激活时释放出一肽段，形成由二硫键连结的两条肽链。与磷脂结合的部位在轻链，而酶的催化活性部位则在重链。活化的因子Ⅸa在Ca2+与磷脂存在下与因子Ⅷ形成复合物，使因子Ⅹ激活为因子Ⅹa。在正常生理条件下磷脂由血小板提供，在此反应中因子Ⅸa起酶催化作用，而因子Ⅷ只是起调节作用，由于它也能与因子Ⅹ62 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第三部分结合，从而使局部的底物浓度增高。事实上单独因子Ⅸa也能使因子Ⅹ激活，但在因子Ⅷ参与下反应速度可增加数千倍以上。生理妊娠是一个特殊的时期，妊娠期间孕妇体内各系统发生一系列适应性的变化，凝血系统变化尤为明显。妊娠期凝血系统处于高凝状态，以保证分娩后胎盘剥离创面迅速愈合及防止产后大出血。有研究证实，妊娠时凝血系统和纤溶系统均呈激活状态，这种改变处于平衡状态，在病理妊娠的情况下，这种平衡被打破则可能产生出13、14]血倾向或者血栓前状态[。高血糖已被证明可刺激健康人凝血功能异常，而高胰[15]岛素血症与纤溶受损有关。糖尿病患者的凝血因子水平升高，纤溶活性下降，引起[16]血液的高凝状态，导致心血管疾病和静脉血栓栓塞的风险增加。有研究针对GDM与正常对照之间的胎盘组织进行差异蛋白组学研究，利用质谱技术成功鉴定了十五个差异表达蛋白。这些蛋白质分子的功能涉及凝血、抗细胞凋亡、信号转导、ATP结合，[17]活化血小板磷脂和钙离子结合，色氨酸-tRNA连接酶的活性。并且发现FGB纤维蛋白原β链在GDM组的含量高于对照组，说明凝血/纤溶过程参与GDM的发病过程。更多的学者认为是因为GDM的状况下，孕妇血管内皮细胞发生病变，从而促使患者的凝血/纤溶失去平衡，导致血栓前状态以及一系列并发症。而我们的研究主要针对妊娠早期，取标本的时间是妊娠11-16周，即使患者在孕24-28周诊断为GDM，早期对血管内皮发生破坏的可能性很小，所以，我们推测，凝血功能异常或许是GDM的发病前信号，其参与了GDM的致病机制。糖尿病与妊娠都是慢性炎症状态，这已经被公认，而纤维蛋白原在多个研究中被认为与炎症有关，所以，凝血因子很可能是介导炎症反应而成为GDM的致病因子。在我们的研究中，妊娠早中期（妊娠11-16周）GDM组与非GDM组间的差异蛋白组学分析得出，在GDM组，F9与FGA明显高于对照组，并且在后期的分组验证中进一步得到证实。小结妊娠11-16周GDM组APOE、F9、FGA结果均高于同期对照组（P<0.05），AOPE、F9、FGA的曲线下面积均大于0.5(P<0.05)，提示这三个因子可能成为新的GDM早期诊断标志物。63 第三部分妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究参考文献[1]MAHLEYRW.ApolipoproteinE：cholesteroltransportproteinwithexpandingroleincellbioligy[J].Science，1998,240（4852）：622-630.[2]RALLSCJr，WEISGRABERKH，MAHLEYRW.HumanapolipoproteinE.Thecompleteaminoacidsequence[J].JBiolChem，1982,257（8）：4171-4178.[3]JAWIENJ，NASTALEKP，KORBUTR.Mousemodelofexperimentalatherosclerosis[J].PhysiolPharmacol，2004,55（3）：503-517.[4]EIJIM,KAUZUKOK,MASAKOT,etal.Oxidativemodificationoflow-densitylipoproteinandimmuneregulationofather-osclerosis[J].ProgLipidRes,2006,45（6）：466-486.[5]SEGRESTJP,JONESMK,DELOOFH,etal.Theamphipathichelixintheexchangeableapolipoproteins:areviewofsecondarystructureandfunction[J].LipidRes,1992,23,33(2):141-166[6]SEGALLML,DHANASEKARANP,BALDWINF,etal.InfluenceofapoEdomainstructureandpolymorphismonthekineticsofphosphovesiclesolubilization[J].LipidRes,2002,43(10):1688-1700.[7]VERGESB.Lipidmodificationintype2diabetes:theroleofLDLandHDL[J].FundamClinPharmacol,2009,23(6):681-685.[8]VonECKARDSTEINA,SCHULTEH,ASSMAMMG,Riskfordiabetesmellitusinmiddle-agedCaucasianmaleparticipantsofthePROCAMstudy:implicationsforthedefinitionofimpairedfastingglucosebytheAmericanDiabetesAssociation.ProspectiveCardiovascularMunster[J].ClinEndocrinolMetab,2000,85(9):3101-3108.[9]RUTTIS,EHSESJA,SIBLERRA,etal.Low-andhigh-densitylipoproteinsmodulatefunction,apoptosis,andprolifierationofprimaryhumanandmurinepancreaticβ-cells[J].Endocrinology,2009,(10):4521-4530.[10]RichardP，ThomasG，ZuluetaM.etal．CommonandgenotypesofhumanapolipoproteinEdeterminedbyspecificrestrictionprofilesofpolymeraseChainreactionamplifiedDNA．clinchem，1994，40(i)：24-29．[11]AngelopoulosTJ，IowndesJ．ApoEGenotype：ImpactonHealth，Fitnessand64 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究第三部分Nutrition．WorldRevNutrDiet．2008，98：77-93．[12]ZhangHL，WuJ，ZhuJ．TheRoleofApolipoproteinEinGuillain-BarreSyndromeandExperimentalAutoimmuneNeuritis．JBiomediBiotechnol，2010,2010：357412．Epub2010Febl6．[13]CernecaF，RicciG，SimeoneR，etal.Coagulationandfibrinolysischangesinnormalpregnancy.Increasedlevelsofprocoagulantsandreducedlevelsofinhibitorsduringpregnancyinduceahypercoagulablestate，combinedwithareactivefibrinolysis[J].EurJObstetGynecolReprodBiol，1997，73（1）:31-36.[14]UchikovaEH，LedjevII.Changesinhaemostasisduringnormalpregnancy[J].EurJObstetGynecolReprodBiol，2005，119（2）:185-188.[15]StegengaME,vanderCrabbenSN,LeviM,etal..Hyperglycemiastimulatescoagulation,whereashyperinsulinemiaimpairsfibrinolysisinhealthyhumans.Diabetes.2006;55:1807–1812.doi:10.2337/db05-1543.[16]LemkesBA,HermanidesJ,DevriesJH,etal.Hyperglycemia:aprothromboticfactor?JThrombHaemost.2010;8:1663–1669.doi:10.1111/j.1538-7836.2010.03910.x.[17]BinLiu,YunXu,CourtneyVoss,etal.AlteredProteinExpressioninGestationalDiabetesMellitusPlacentasProvidesInsightintoInsulinResistanceandCoagulation/FibrinolysisPathways.PLoSOne.2012;7(9):e44701.Publishedonline2012Sep7.doi:10.1371/journal.pone.0044701.65 全文总结妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究全文总结1、对于高龄、有糖尿病家族史、孕前超重或者肥胖、孕期体重增长过快、早期空腹血糖≥5.1mmol/L的孕妇要及时开始饮食管理和运动指导，有助于控制GDM的发生及发生程度。2、GDM的疾病发生可能涉及凝血/纤溶系统、脂肪代谢、补体激活、损伤应答等生物学功能；3、APOE、F9、FGA有望成为GDM的早期诊断因子。66 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究创新、不足与展望创新、不足与展望一、创新点1、基于iTRAQ技术对妊娠期糖尿病做差异蛋白组学研究，在蛋白质的水平上对妊娠期糖尿病的发病机制做一个相对全面的阐述；2、在妊娠11-16周与24-28周两个时间段分别作差异蛋白组学分析，寻找共同的差异蛋白，更有利于妊娠期糖尿病的重要相关因子的分析；3、本研究找到的差异蛋白相关的机制比较集中，有利于寻找妊娠期糖尿病的诊断标志物。二、不足1、在第一部分里，没有把孕妇建卡时的血脂指标纳入研究，因为2015年12月以前，医院还没有把血脂作为常规产检内容，大部分建卡孕妇没有此项检测指标，此后可以再针对孕妇的血脂指标分析其与妊娠期糖尿病的相关性；2、第三部分验证的病例数少，验证的结果并不能有力地说明三个因子的早期诊断价值，所以在今后的研究中要扩大样本量，再次验证这三个因子。3、妊娠11-16周的差异蛋白还有其他的因子，因为经费的原因，未能全部验证，在后续的研究中将一一验证，先小样本，有价值，则扩大样本再验证。三、展望1、这个课题利用蛋白组学技术在蛋白质水平对GDM有了相对全面的了解，对该病的发病机制有了一个初步的整体观，对于发现的差异蛋白需要进一步延伸到基因组学、代谢组学的研究层面，会对GDM的致病原理更深入了解，发现更多可靠的诊断、干预标志物，以及有助于更多的药物研发；2、因为有些差异蛋白质还没有商业化的试剂盒，在将来的研究中陆续将研究中的差异蛋白一一验证，扩大验证的样本量。3、本研究用的是血清标本，在今后的研究中，差异蛋白组学的标本来源可以延伸到胎盘、脐血或者羊水，更有利于全面了解GDM与母儿之间的相互影响。67 综述妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究附录1综述妊娠期糖尿病的早期诊断研究进展妊娠期糖尿病（gestationaldiabetesmellitus,GDM)是妊娠期间发生的不同程度的糖代谢异常，不包括妊娠前已经存在的糖尿病。GDM是妊娠期最常见的并发症之一。自2011年以来，美国糖尿病协会(AmericanDiabetesAssociation，ADA)以国际糖尿病与妊娠研究组(InternationalAssociationofDiabeticPregnancyStudygroup，IADPSG)的[1]标准作为GDM的筛查和诊断标准，GDM的发生率明显增加。这项最新的GDM诊断标准是基于高血糖与妊娠不良结局关系的研究(hyperglycemiaadversepregnancy[2]outcomestudy,HAPO)，HAPO研究是一项来自9个国家、15个研究中心的25505例孕妇及新生儿的大型国际多中心前瞻性临床研究，根据各个分中心的数据显示，GDM的发生率在9.3~25.5%不等，整体发病率接近21%，几乎每5个孕妇中会发生[3]一例GDM患者。Zhu等按照IADPSG标准对国内13家医院2010-2011年间的17186例孕妇进行评估，结果显示，我国的GDM发病率为17.5％。GDM常常伴发先兆子痫、巨大儿、剖宫产率增加、肩难产率增加、胎儿发育畸形、围产儿死亡等不良妊娠结局，并且与子代发生代谢综合征、母亲产后发生2型糖尿病有关。与健康孕妇的子代相比，GDM孕妇的子代发生肥胖、高血压、高血脂、高血糖、2型糖尿病等代谢综合征以及神经系统症状的风险增加，国内外学者将此现象界定为―胎源性疾病‖。处在不良子宫环境的胎儿与出生后至成年发生各种疾病均有一定关系。临床诊断GDM的时间在妊娠24-28周，通过75g葡萄糖耐量试验（OGTT)确定。尽管我们已经在诊断明确后积极干预使得GDM的母儿预后得到很大改善，但是因为临床上不能做到早期诊断，干预之前母儿已经受到程度不等的不良影响，所以现阶段对GDM的早期诊断成为研究热点，发布IADPSG共识的小组成员建议可根据妊娠早期空腹血糖（fastingplasmaglucose,FPG)诊断GDM，但是在妊娠早期，胎儿和母体激[4、5]素未出现明显变化，孕妇的激素水平与非妊娠状态下并无明显不同。有研究认为妊娠早期空腹血糖并不能诊断GDM，其与妊娠24～28周的75gOGTT检测值对于68 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究综述GDM的诊断不完全一致，可以作为GDM的一个预测因子，但不应成为GDM的诊[6]断标准。国内一项回顾性分析显示，妊娠早期FPG≥5．1mmol／L的孕妇中仅有部分在妊娠中晚期发展为GDM，且妊娠早期FPG与妊娠结局无明显相关。到目前为止，针对GDM早期诊断标志物的研究逐渐成为热点，本文就这一类相关研究做一个综述。脂肪因子脂肪组织是机体储备能量的器官，也是一个重要的功能活跃的内分泌器官，它合成并分泌多种生物活性因子，调节脂肪本身的功能，同时调节全身的组织器官功能[18-20]。妊娠以后，胎盘成为一个重要的内分泌器官，其可以合成及分泌大部分已知的脂肪因子，通过内分泌的方式进入胎儿和母体的血液循环内，参与母体妊娠期的适应[21、22]性变化反应和胎儿的生长发育。妊娠期各种脂肪因子相互影响、相互制约，脂[23、24]肪因子网络的平衡对维持妊娠正常的代谢状态至关重要。瘦素瘦素由ob基因编码，是一种主要由白色脂肪细胞分泌的反馈性抑制脂肪的激素样蛋白质。血液循环中的瘦素为146个氨基酸的蛋白质，分子量为16KD，以单体存在于血浆中。瘦素具有1级细胞因子家族特有的四螺旋束结构，该结构使其疏水性残基大量暴露在外，部分残基在识别受体上起着重要作用。瘦素是一种蛋白质激素，在[25]机体代谢的调节中起着重要作用。它已被证明影响胰岛素分泌，葡萄糖的利用，促[26,27]进糖原合成和脂肪酸代谢。瘦素通过脂肪组织与脂质储存的比例被释放到血液循环中。肥胖和妊娠是瘦素抵抗状态，与下丘脑瘦素信号受损有关。产妇瘦素水平从妊娠早期增加，这意味着瘦素增加不仅是由于产妇体重增加，胎盘也参与了瘦素合成与分泌，研究表明胎盘表达了大量的瘦素信使RNA和蛋白质，胎盘中有丰富的瘦素受[28]体。瘦素可能通过抑制胰岛β细胞分泌胰岛素而促进GDM的病理生理发展，另外通过调节食欲、体重和能量消耗等相关的其他效应同时影响GDM的发病。GDM的疾病状态下，瘦素合成的增加通过刺激促炎性细胞因子如IL-6和TNF-α的产生来增强炎症反应，从而进一步增强瘦素的产生。一个包括18项观察性研究在内的荟萃分析发现，GDM患者与对照组相比，瘦素浓度显著升高，而与BMI匹配的对照相比，[29]瘦素浓度仍然明显升高。另外，一个大样本的前瞻性队列研究发现，在孕周小于16周的高瘦素血症是GDM发生的风险因素，并且线性相关性很明显，瘦素浓度每增加10毫微克，GDM风险增加20%，这个风险因素独立于孕妇孕前肥胖和其他混杂69 综述妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究[30]因素。最近的一项荟萃分析对八项前瞻性研究进行了评估，结果发现，GDM孕妇的妊娠早中期瘦素水平显著高于对照组，尽管在研究中阐明收集血液时间、检测方法[31]或GDM诊断标准方面一致，但是BMI和肥胖的评估各不相同，并且没有关于瘦素对肥胖预测GDM的作用的结论。所以瘦素可以成为一个GDM的预测因子，但是仍然需要进一步的前瞻性研究来明确GDM的预测能力。脂联素人体内的脂联素由244个氨基酸组成，分子量为30KD。由氨基末端的分泌信号序列(aa1-18)，一段特异序列(aa19-41),一组由22个氨基酸组成的胶原重复序列(aa42-107)，一段球状序列(aa108-244)组成。其中球状区是脂联素生物活性的关键部位，和TNF-α的结构相似，脂联素与胶原Ⅷ、X和补体C1q高度同源。脂联素是脂肪组织分泌的细胞因子，分子量为30kDa，由244个氨基酸组成，并且编码脂联素的基因位点与糖尿病和心血管疾病的易患性相关。具有胰岛素增敏，抗炎和抗动脉粥样硬化的作用。脂联素通过AMP激活的蛋白激酶刺激骨骼肌摄取葡萄糖同时降低肝脏葡萄[32,27,33]糖的生产。在正常妊娠期，母体脂联素分泌逐渐下降，与BMI和肥胖呈负相[25][34]关。低脂联素水平会加重胰岛素抵抗和β细胞功能障碍，进而导致GDM的发生。研究发现妊娠期妇女胎盘组织脂联素mRNA也下调，而且妊娠期糖尿病患者分泌的[27]TNF-α和其他促炎症介质抑制脂肪细胞脂联素的转录，进一步加重GDM的慢性炎症过程。最近对15项横断面和病例对照研究的系统回顾和荟萃分析发现，与对照组相比，GDM患者的脂联素水平显著低于对照组，与对照组相比，GDM患者的脂联[29]素水平仍显著低于对照组。对九项前瞻性研究的进一步meta分析一致显示，GDM[31]孕妇妊娠早中期的脂联素水平明显低于健康孕妇。Williams等在一项前瞻性巢式病例对照研究中发现，GDM孕妇早期妊娠时脂联素浓度只有4．4µg／ml，低于对照组的8．1µg／ml。约73％的GDM孕妇妊娠早期脂联素浓度<6．4µg／ml，而此时脂联素浓度<6．4µg／ml的孕妇发生GDM的危险程度是其他孕妇的4．6倍。Lacroix[35]等在一项前瞻性队列研究中测定了445例受试者妊娠早期(6～13周)和妊娠中期(24～28周)脂联素浓度，结果发现，38例最终发生GDM的孕妇妊娠早期脂联素浓度只有(9．67±3．84)µg／ml，而糖耐量正常的孕妇脂联素浓度则为(11．92±4．59)µg／ml。校正BMI和糖化血红蛋白后，发现妊娠早期的脂联素浓度每下降1µg／ml，患GDM的概率就增加了12％。该研究表明，妊娠早期脂联素浓度越低，孕妇的胰岛70 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究综述素抵抗程度就越高，妊娠中后期发生GDM的风险也越高。脂联素是独立于母体肥胖程度和血糖浓度以外的GDM预测因子。由此可见，早期妊娠时低浓度脂联素对GDM的发生有一定的预测作用。内脂素[26]内脂素在内脏脂肪组织中高表达，促进脂肪细胞产生胰岛素类似物的影响。研究证据表明内脂素与胰岛素一样具有降血糖的作用：给予有胰岛素抵抗的肥胖小鼠KKAy小鼠注射重组内脂素后，血糖水平显著下降，其效应与注射胰岛素类似，其可能与胰岛素受体结合，增加了脂肪组织和肌肉组织对葡萄糖的摄取，但是内脂素的结合位点与胰岛素不同。进一步的体外实验表明，内脂素能使靶细胞胰岛素受体、胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2磷酸化增加，PKB／Akt、MAPK磷酸化增加而模[36]拟胰岛素发挥作用，因此很有可能和胰岛素以同样的方式促进糖摄取。体内血循环[26]的内脂素水平被认为在肥胖和胰岛素抵抗的状态下明显增高，在2型糖尿病的患者体内也明显升高。在妊娠的中晚期，研究发现，内脂素可以改善胰岛素的敏感性，在与胰岛素抵抗相关的妊娠并发症通过生理负反馈调节机制上调内脂素的表达。在一个横断面的研究中发现内脂素水平与GDM孕妇妊娠后期的空腹血糖、糖负荷后的胰岛[37]素水平呈正相关。但是Krzyzanowska等人的巢式病例对照研究中发现，GDM孕妇血浆内脂素水平高于正常糖耐量对照组，但与空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗或体[38]重指数无相关性。Ferreira等人在一项前瞻性研究中发现，GDM孕妇的前三个月内脂素水平高于对照组，表明它有可能是GDM的潜在生物标志物，然而，需要进一步[39]的研究来评估肥胖的关系，以及与胰岛素抵抗和GDM的因果关系。抵抗素抵抗素（Resistin），是RSTN基因编码的产物，是一种肽激素，富含半胱氨酸的分泌蛋白，属于RELM家族。抵抗素是一种由单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞中[26][40-42]表达的激素，其在体内的水平与脂肪组织的质量呈平行关系。它可能具有诱导[46]炎症、内皮功能障碍、血栓形成、血管生成和平滑肌功能障碍的作用，尽管它的功能与糖耐量受损有关，但是在肥胖和胰岛素抵抗的效应中，抵抗素的作用仍然备受争[43,44]议。研究证实，孕妇的胎盘组织表达抵抗素，并且血浆抵抗素水平相对于未孕妇[45]女明显增高，随着孕周增加，抵抗素的血浆水平随之上升，也可能是由于体重增加和肥胖增加，循环水平随着妊娠的进展而增加，随着体重的增加而增加。有些研究认71 综述妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究为抵抗素会影响怀孕状态的葡萄糖耐量，与孕期肥胖、胰岛素抵抗呈正相关，但是等多的研究认为抵抗素与孕期糖代谢没有直接关系。在一个针对10项研究的荟萃分析[47]中也没有发现GDM孕妇血浆中的抵抗素水平与正常孕妇之间的差异。有三个前瞻[48-50]性研究也显示，在调整BMI之后，抵抗素并不能显示其对GDM的预测能力。抵抗素可能介导胰岛素抵抗，但是具体的致病通路如何还需要很多的研究来证实。炎性因子所谓胰岛素抵抗就是外周组织对胰岛素的反应差，从而胰腺β细胞需要分泌更多的胰岛素以弥补这样的功能缺陷，因为妊娠期胰岛素抵抗明显，而胰腺β细胞额外分泌更多的胰岛素仍然不能使血糖在正常范围，GDM就此发生。氧化应激是胰岛素抵抗的原因之一，而炎症反应则是氧化应激反应的一个表现，在众多炎症通路中产生炎症介质，如黏附因子、白介素等均参与氧化应激反应。有研究认为急性或者慢性炎症的长期刺激可能参与氧化应激反应。妊娠是一个低度炎症的状态，GDM则是将这个低度炎症进一步放大。虽然GDM与氧化应激反应的联系还没有完全阐明，但是已经有相当的研究显示参与氧化应激反应的炎症标志物对GDM有一定的预测能力。TNF-α人TNF-α前体由233个氨基酸组成（26kDa），其中包含由76个氨基酸残基组成的信号肽，在TNF转化酶TACE的作用下，切除信号肽，形成成熟的157个氨基酸残基的TNF-α（17kDa）。由于没有蛋氨酸残基，故不存在糖基化位点，其中第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。人类TNF-α与小鼠TNF-α有79%氨基酸组成同源性，TNF-α的生物学作用似无明显的种属特异性。TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，其可以导致胰岛素抵抗。妊娠状态下，胎盘分泌的参与胰岛素抵抗的细胞因子包括TNF-α，其破坏胰岛素信号和β细胞功能，这可能直[51]接导致GDM，也可能是因为GDM的氧化应激反应和炎症反应导致了循环中[26]TNF-α的水平升高。脂肪组织中，TNF-αmRNA和蛋白表达与肥胖程度呈正相关，而且，体重下降后，TNF-αmRNA和蛋白表达会相应下调。对一个集合十项观察性研[29]究的荟萃分析中，GDM的血清TNF-α浓度明显高于对照组的正常孕妇。Korkmazer[52]等在关于炎症因子及孕期IR相关性的研究中发现GDM患者妊娠24～28周血TNF-α水平较非GDM孕妇显著上升。妊娠期TNF-α主要由胎盘和脂肪组织合成和分[53]泌，随着孕周的增加胎盘逐渐发育成熟，释放入血的TNF-α量也逐渐增加。研究72 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究综述发现，GDM孕妇体内TNF-α浓度在妊娠14～20周和24～32周都明显高于正常对照[54、55][56]组，并且TNF-α的浓度变化发生在母体血糖出现异常变化之前。刘陶等前瞻性研究中发现，妊娠10～12周GDM孕妇的TNF-α浓度为(10.0±3．4)ng／L，明显高于对照组的(4．6±2.7)ng／L，通过受试者工作特征(ROC)曲线计算分析，妊娠早期TNF-α≥5．45ng／L预测GDM的敏感性为86．2％，特异性为77．5％；阳性预测值为88．5％，阴性预测值为73．8％。由此可见，妊娠早期TNF-α可能成为一个GDM的预测因子。CRPCRP是一种环状五聚体蛋白，其一级结构包含5个相同的亚单位，亚单位间以非共价键相结合，每个亚单位在其表面都含有CRP配体结合位点。这种五聚体蛋白具有显著的耐热及抗蛋白酶降解的能力。白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是CRP合成的主要刺激因子。CRP属于急性时相反应蛋白，是一种炎症标志物，也是机体先天性免疫系统的一个重要组成部分，同时也是许多病理状态下炎症反应的敏感指标，其与胰岛素抵抗、高血糖、T2DM等代谢异常有关。非孕状态时，肥胖的妇女相比正[57、58]常妇女的CRP水平轻度升高，当正常BMI的妇女和肥胖的妇女怀孕以后，CRP[59、60]会上升，但是随着妊娠进行，CRP水平会逐渐下降，而GDM的孕妇CRP的水平会继续增加，尤其是在妊娠晚期。可见CRP参与了GDM的发病。Makrina等的一项前瞻性研究显示，IGT（葡萄糖耐量受损）的孕妇其妊娠早期的hsCRP水平明显高[61]于对照组，但是对于IGT的预测能力不及BMI。Retnakaran等人发现hsCRP与BMI[62]的关系相比与OGTT的任何一点血糖都更紧密。Smirnakis等一项前瞻性研究发现[63]GDM孕妇在妊娠早期的非空腹hsCRP明显高于对照组。但是这一类研究都存在一个共同问题——样本量小，对于CRP或者hsCRP是否可以成为GDM在让妊娠早期的一个可靠地诊断标志物，尚需要更多更大样本量的临床研究。白介素6白细胞介素（interleukin，IL），简称白介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素-6，简称白介素6(IL-6)，是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种。白介素6是一种多肽。IL-6由2条糖蛋白链组成；1条为α链，分子量80kd；另1条为β链，分子量130kd。α链缺少胞内区，只能以73 综述妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究低亲合性与Il-6结合，所形成的复合物迅即与高亲和性的β链结合，通过β链向细胞内传递信息。白介素6是由纤维母细胞、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、以及多种瘤细胞所产生。IL-1、TNF-a,PDGF、病毒感染、双链RNA及cAMP等，均可诱导正常细胞产生白介素6。在一项包含25个前瞻[64]性研究的荟萃分析里，IL-6是其中一个GDM的可能妊娠早期诊断标志物。另外一系列研究显示GDM孕妇血浆中或者血清中的IL-6的水平都一致地表现增高，无论该[65-69]孕妇是否存在肥胖。而且进一步的研究显示GDM孕妇的皮下脂肪组织的[70]IL-6mRNA的表达也明显增加。IL-6诱发急性炎症反应，其特点是造成肝脏释放[71]CRP，所以，肥胖的孕妇的外周血往往同时出现CRP及IL-6的增加。其他铁蛋白铁蛋白(SF)是在肝内合成的糖蛋白，是人体内主要的储铁蛋白，其浓度常用于评价体内储铁情况。铁作为人体必需的微量元素，以多种形式保持机体的动态平衡，但过多的铁能通过促进和放大自由基对组织、器官的损伤导致多种脏器病变。高浓度的[72-76]血清铁蛋白已被证实与很多慢性生理功能失调和血管炎症有关。伊朗的一项前瞻性研究，针对1358例孕妇，采集12-16周血清标本，根据孕24-28周OGTT的结果分为患病组和对照组。研究发现两组间血清铁和血红素的浓度相比，差异均无统计学[77]意义，而GDM组的铁蛋白浓度比较于对照组，明显增高，差异有统计学意义。Shimin[78]和他的团队通过一项回顾性研究亦证实增高的铁蛋白浓度与GDM的发生相关。Zein等的针对104名孕妇的前瞻性研究发现在妊娠早期的铁蛋白浓度增加与OGTT[79]的餐后一小时和餐后两小时的血糖浓度相关。Amiri等的研究显示，铁蛋白的浓度超过80ng/ml，其GDM的风险增加2.4倍，而每降低20ng/ml，其GDM的发生风险[80]下降82%。一般认为，增加的血清铁蛋白浓度和胰岛素抵抗和糖尿病有关，近来[81-84]认为与GDM有关。额外的铁与氧化应激反应增加了糖尿病的发生风险。研究揭示人体的铁储备涉及到糖耐量受损、糖尿病，因为铁元素能够改变胰岛素的合成和分[80、85、86]泌，增加脂质代谢，降低肌肉的葡萄糖转换，组织中的胰岛素抵抗。[7-15]GDM的发病机制并不清楚，国内外学者针对一系列研究不断发现认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果,妊娠期间胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足，其中炎症反应参与其中，和成人2型糖尿病的发病机制有一定的相似性,研究比较集中的是74 妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究综述瘦素、脂联素、抵抗素、肿瘤坏死因子、黄醇结合蛋白等与胰岛素抵抗密切相关的蛋白质以及C-反应蛋白、白细胞介素6等与炎症答应密切相关的蛋白质，均提示这些因素可能与GDM的发病有关，并且有希望成为GDM的预测指标。但是大部分的研究选择的时间在妊娠24周以后，即诊断GDM之后，虽然证实与GDM有关，但是能不能够作为早期诊断的指标，有待商榷，而且都存在样本量小的不足，有待更多妊娠早期的大样本的研究来验证。另外，是否还有其他的在妊娠早期影响糖代谢发生异常的致病因素，来让我们更进一步了解GDM的发病机制，还有待更多的研究去发现。参考文献[1]BaseviV，DiMorcianoC，eta1．CommentOn：AmericanDiabetesAssociation.Standardsofmedicalcareindiabetes一-2011[J]．DiabetesCare，201l，34：53．[2]MetzgerBE，LoweLP，DyerAR，eta1．Hyperglycemiaandadversepregnancyoutcomes．NEnglJMed，2008，358：1991-2002．[3]ZhuWW,YangHX,WeiYM,eta1．Evaluationofthevalueoffastingplasmaglucoseinthefirstprenatalvisittodiagnosegestationaldiabetesmellitusinchina[J]．DiabetesCare，2013，36：586-590．[4]RyanE．Diagnosinggestationaldiabetes[J]．Diabetologia，2011，54(3)：480-486．[5]CorradoF，D’AnnaR，CannateML，eta1．Correspondencebetweenfirst·trimesterfastingglycaemia，andoralglucosetolerancetestingestationaldiabetesdiagnosis[J]．DiabetesMetab，2012，38(5)：458461．[6]杨慧霞．妊娠期糖尿病筛查和诊断策略的变迁[J]．实用妇产科杂志，201l，27(7)：482484．[7]RasanenJP1,SnyderCK,RaoPV,MihalacheR,HeinonenS,GravettMG,RobertsCTJr,NagallaSR.Glycosylatedfibronectinasafirst-trimesterbiomarkerforpredictionofgestationaldiabetes.ObstetGynecol.2013Sep;122(3):586-94.doi:10.1097/AOG.0b013e3182a0c88b.[8]GomesCP1,TorloniMR,Gueuvoghlanian-SilvaBY,AlexandreSM,MattarR,DaherS.Cytokinelevelsingestationaldiabetesmellitus:asystematicreviewoftheliterature.AmJReprodImmunol.2013Jun;69(6):545-57.doi:10.1111/aji.12088.Epub201375 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妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究缩略语表附录3缩略语表英文缩写英文全称中文名称GDMgestationaldiabetesmellitus妊娠期糖尿病iTRAQisobarictagsforrelativeandabsolute同位素标签相对绝对quantitation定量2-DEtwo-dimensionalelectrophoresis双向电泳OGTToralglucosetolerancetest葡萄糖耐量试验BMIBodyMassIndex体重指数T2DMtype2diabetesmellitus二型糖尿病FPGfastingbloodglucose空腹血糖IRinsulinresistance胰岛素抵抗ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定法ApoEapolipoproteinE载脂蛋白EPAGEpolyacrylaminegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠PMSFphenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟APammoniumpersulphate过硫酸铵BPbiologicalprocesses生物过程CCcellularcomponents细胞组分MFcellularcomponents分子功能PPIProtein-proteininteraction蛋白-蛋白相互作用CMchylomiron乳糜颗粒VLDLverylowdensirylipoprotein极低密度脂蛋白HDLhighdensitylipoprotein高密度脂蛋白85 致谢妊娠期糖尿病的血清差异蛋白组学研究致谢4年前我的小孩二年级，今年他六年级，我马上就要博士毕业。除了感叹时间走得太匆匆以外，还要感谢我人生中这不平静的4年里所有的幸运。我幸运地师从尊敬的吴浩荣老师，谦谦君子，大家风范，您严谨的治学态度，时刻想着为患者解除病痛的善良之心，精湛的专业技术时时告诉我今后应该怎么做一名合格的医生，谢谢您一直的关心、帮助和鼓励，把我领进一个不一样的殿堂；感谢我的赵淑云老师，美丽知性，对工作一丝不苟，让我明白科研的辛苦与快乐；感谢命运让我拥有两个好朋友韦艳老师、沈立明老师，陪我哭陪我笑的同时，拉着我跨过一道道沟壑，度过无数难眠的夜。感谢我的父母，一直给与女儿这世上最无私地帮助，尽管白发更白皱纹更深；感谢我的爱人，感谢你总是包容我的坏毛病和坏脾气，更要感谢我的好孩子逗豆，时刻让我觉得自己是最幸运的妈妈。感谢我的领导黄林主任、肖子文主任、雷后康主任、李琴芬主任，在临床工作压力巨大的情况下，仍然支持我完成我的课题；感谢我的小伙伴们，金年、秀桃、晓晓、耀文，帮助我分担了无数的工作，特别谢谢你们。要感谢的人太多了，人们总说，上帝为你关上一扇门的同时，一定会开一扇窗；可是我总觉得自己似乎又有门又有窗。此刻脑海里全是你们盈盈的笑容，祝所有的人永远幸福健康。86 ５＝论文（专业学位）苏州大学研究生院统一印制一＇，—一一阶＾ｖ：ｒ：二二ｖ＇＇，广二忘：二一。“：二，二了广